CN113230276A - 一种用于治疗卵巢早衰的干细胞制剂及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明创造提供了一种用于治疗卵巢早衰的干细胞制剂及其制备方法和应用，其包括：i)经血间充质干细胞；ii)表儿茶素没食子酸酯或其可药用盐；iii)盐酸川芎嗪，所述干细胞制剂为将上述组分溶解于0.9％的氯化钠溶液中制得。本发明的发明人在研究过程中发现单独的经血间充质干细胞注入小鼠体内对抑制卵巢颗粒细胞的凋亡的效果较差，但是研究人员意外发现将经血间充质干细胞与表儿茶素没食子酸酯、盐酸川芎嗪混合作为细胞制剂注入小鼠体内发现能提高经血间充质干细胞的活性，显著减少卵巢颗粒细胞的凋亡，改善小鼠的技术水平和发情周期等指标，为治疗卵巢早衰提供可能。
Description
技术领域
本发明创造属于干细胞制剂领域，尤其是涉及一种用于治疗卵巢早衰的干细胞制剂及其制备方法和应用。
背景技术
女性在40岁以前出现闭经、FSH＞40IU/L、雌激素水平降低并伴有不同程度的围绝经期症状以及不孕等症状基本会被诊断为卵巢早衰(premature ovarian failure，POF)。据统计，30-40岁女性发病率约为1％左右，近年来呈上升趋势。其病因多种多样，其中37％的POF因手术及放化疗损伤等医源性因素引起，而遗传、代谢、免疫、环境及氧化应激、不规律的生活习惯等都会成为卵巢早衰的诱因。目前，医学界针对卵巢早衰的主要的治疗方法为激素替代治疗(Hormone replacement therapy，HRT)，但是HRT仅能缓解围绝经期症状，通过外源性的激素提高机体的激素水平，无法从根本上治疗早衰的卵巢，且长期外源性激素的作用下可增加血栓性疾病及肿瘤等相关疾病的发病率。
除了激素替代治疗方法以外，间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)作为一种成体干细胞在POF的治疗上有着巨大的潜力。目前，学界对于MSCs在治疗卵巢早衰的原理存在如下观点：MSCs能直接分化为颗粒细胞或者是抑制其凋亡，促进其再生，改善其功能；MSCs可诱导、分化为原始生殖细胞；MSCs可促进卵巢血管的生成；上述研究和观点使MSCs直接或间接治疗POF成为可能。中国专利申请CN201811568552.7-《用于治疗卵巢早衰的胎盘间充质干细胞制剂》公开了一种应用胎盘间充质干细胞制得的干细胞制剂，应用该申请中的间充质干细胞的制备方法能得到大量的间充质干细胞，分化性能好，具有向成骨细胞、脂肪细胞、软骨细胞、内皮细胞、神经细胞等细胞分化的能力。将制得的间充质干细胞与氯化钠溶液、枸橼酸镁和磷脂混合制得干细胞制剂，试验可得胎盘间充质干细胞组小鼠血清中E2水平在各时间点均升高、FSH水平均下降，同时胎盘间充质干细胞治疗后28天，各级卵泡数均有不同程度的恢复，颗粒细胞生长增加，凋亡减少，卵巢上皮细胞形态稳定，初级卵泡、次级卵泡和成熟卵泡数量明显增加，闭锁卵泡数量明显减少。但经过验证发现上述发明公开的制备方法工序复杂，对于规模生产有极大的限制，故如何完善间充质干细胞的制备方法得到高效的干细胞制剂时本领域亟待解决的技术问题。
发明内容
有鉴于此，本发明创造旨在克服现有技术中的缺陷，提出一种用于治疗卵巢早衰的干细胞制剂及其制备方法和应用。
为达到上述目的，本发明创造的技术方案是这样实现的：
一种用于治疗卵巢早衰的干细胞制剂，其包括：i)经血间充质干细胞；ii)表儿茶素没食子酸酯或其可药用盐；iii)盐酸川芎嗪，所述干细胞制剂为将上述组分溶解于0.9％的氯化钠溶液中制得。
优选的，所述经血间充质干细胞的浓度为1-8×106个/ml。
优选的，所述经血间充质干细胞的浓度为3×106个/ml。
优选的，所述表儿茶素没食子酸酯或其可药用盐的质量浓度以表儿茶素没食子酸酯计为0.1-0.5mg/ml。
优选的，所述表儿茶素没食子酸酯或其可药用盐的质量浓度以表儿茶素没食子酸酯计为0.2mg/ml。
优选的，所述盐酸川芎嗪的质量浓度为0.1-0.3mg/ml。
优选的，所述盐酸川芎嗪的质量浓度为0.1mg/ml。
优选的，所述经血间充质干细胞为传代1-5次的传代细胞。
优选的，所述经血间充质干细胞为传代3次的传代细胞。
本发明还提供一种上述干细胞制剂的制备方法，包括如下步骤：
(1)培养基配制：配置含有胎牛血清(10％v/v)、双抗～青霉素+链霉素(1:100v/v)、L-谷氨酰胺(1:100v/v)、非必需氨基酸(1:100v/v)和β-巯基乙醇(1:1000v/v)的基础培养基，将上述原料混匀，4℃冰箱保存；
(2)将P0代经血间充质干细胞以1-5×104个/cm2的接种量接种于步骤(1)制得的培养基中，将接种了P0代经血间充质干细胞的培养皿于10-15％CO2，37℃的条件下培养,每2天更换一次培养基,共培养14天；
(3)培养完成后，离心去除培养基并收集细胞，用PBS清洗3遍，用质量百分含量为0.25％的胰蛋白酶消化收集细胞；用预冷的冻存液重悬细胞,用细胞计数仪计数，细胞密度达到要求后，将上述被冻存液重悬的细胞梯度降温后放入液氮中冻存；
(4)将冻存的细胞取出转移至37℃水浴中解冻后，加入PBS清洗细胞，之后放入离心管中，1500rpm离心5min，弃上清，加入0.9％氯化钠溶液以及表儿茶素没食子酸酯、盐酸川芎嗪重悬，制得细胞浓度为1-8×106个/ml的细胞制剂。
优选的，所述步骤(4)使用的冻存的细胞为重复步骤(2)和(3)获得传代1-5次的传代细胞。
本发明还提供一种上述细胞制剂在制备治疗卵巢早衰药物中的应用。
相对于现有技术，本发明创造具有以下优势：
本发明的发明人在研究过程中发现单独的经血间充质干细胞注入小鼠体内对抑制卵巢颗粒细胞的凋亡的效果较差，但是研究人员意外发现将经血间充质干细胞与表儿茶素没食子酸酯、盐酸川芎嗪混合作为细胞制剂注入小鼠体内发现能提高经血间充质干细胞的活性，显著减少卵巢颗粒细胞的凋亡，改善小鼠的技术水平和发情周期等指标，为治疗卵巢早衰提供可能。
具体实施方式
除有定义外，以下实施例中所用的技术术语具有与本发明创造所属领域技术人员普遍理解的相同含义。以下实施例中所用的试验试剂，如无特殊说明，均为常规生化试剂；所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
下面结合实施例来详细说明本发明创造。
具体实施方式中的实验小鼠选用6周的SPF雌性SD小鼠(购于SPF生物技术公司，中国北京)进行，体重200～300克。试剂购于美国Sigma公司。
本发明所述的干细胞制剂的制备方法，包括如下步骤：
(1)培养基配制：配置含有胎牛血清(10％v/v)、双抗～青霉素+链霉素(1:100v/v)、L-谷氨酰胺(1:100v/v)、非必需氨基酸(1:100v/v)和β-巯基乙醇(1:1000v/v)的基础培养基，将上述原料混匀，4℃冰箱保存；
(2)将P0代经血间充质干细胞以5×104个/cm2的接种量接种于步骤(1)制得的培养基中，将接种了P0代经血间充质干细胞的培养皿于15％CO2，37℃的条件下培养,每2天更换一次培养基,共培养14天；
(3)培养完成后，离心去除培养基并收集P1代细胞，用PBS清洗3遍，用质量百分含量为0.25％的胰蛋白酶消化收集细胞；用预冷的冻存液重悬细胞,用细胞计数仪计数，细胞密度达到要求后，将上述被冻存液重悬的细胞梯度降温后放入液氮中冻存；
(4)重复步骤(2)和步骤(3)得到P2代经血间充质干细胞；
(5)将步骤(4)的P2代经血间充质干细胞重复步骤(2)和步骤(3)得到P3代经血间充质干细胞；
(6)将冻存的P3代经血间充质干细胞取出转移至37℃水浴中解冻后，加入PBS清洗细胞，之后放入离心管中，1500rpm离心5min，弃上清，加入0.9％氯化钠溶液以及表儿茶素没食子酸酯、盐酸川芎嗪重悬，制得细胞制剂。
其中，制得的细胞制剂中的经血间充质干细胞的浓度为A×106个/ml,表儿茶素没食子酸酯的浓度为B mg/ml,盐酸川芎嗪的浓度为C mg/ml。
将上述原料配制为不同的实施例和对比例，各个实施例和对比例的原料浓度见表1。
表1实施例1-6和对比例1-8的原料浓度
效果验证试验：
一、细胞制剂对离体小鼠卵巢颗粒细胞增殖活性的影响
实验材料：实施例1-6和对比例1-8制得的细胞制剂；6周龄SD雌性小鼠。
实验方法：6周龄SD雌性小鼠脱颈处死后无菌摘取大鼠双侧卵巢，将采集的卵巢组织在无菌环境下用75％的酒精消毒液中浸泡20秒后取出移入到无菌的培养皿中，用无菌的PBS溶液洗5-6次。用一次性的5号针头的注射器抽吸直径为5-10mm卵泡的卵泡液到装有培养基的15mL离心管中，以转速为1000r/min离心5min，弃去上清，用细胞培养液吹打沉淀的颗粒细胞，再重复离心一次，弃去上清，用完全培养基重悬颗粒细胞，将颗粒细胞悬液接种于96孔细胞培养板，每孔50μl，再加150μl高糖DMEM培养液调整细胞浓度至200μl/孔，每组设6个重复，并设置三次独立重复。将细胞培养板置于37℃，5％CO2培养箱中培养24小时后，每组每孔分别加入生理盐水、实施例1-6溶液和对比例1-8溶液，平行设定对照组(生理盐水组)、实验组1-14组，培养20小时后每孔中加入5mg/ml MTT溶液20μl，继续培养4小时，弃上清，每孔中加入150μl DMSO，振荡10min后放置20min，在酶联免疫检测仪上570nm波长下测定各孔吸光度值(A)，取平均值，结果见表2。
表2各样品对大鼠离体卵巢颗粒细胞增殖活性的影响((means±s，n＝24)
*表示实验组与对照组相比差异显著，P<0.05；**表示实验组与对照组相比差异极显著，P<0.01。
表2的实验结果显示实施例1-6的细胞制剂在增强小鼠卵巢颗粒细胞增殖活性上与对照组相比有显著性提高(p<0.05)，而本发明实施例3的细胞制剂在增强卵巢颗粒细胞增殖活性上有极其显著性提高(p<0.01)。由此可以推断，表儿茶素没食子酸酯和盐酸川芎嗪组合与经血间充质干细胞的配合使用，可显著增强小鼠卵巢颗粒细胞增殖活性。
二、细胞制剂对卵巢早衰小鼠体内E2和FSH激素水平的影响
POF小鼠模型的建立：6周龄SD雌性小鼠腹腔注射CTX(环磷酰胺)(120mg/kg/d),连续注射15天，建立卵巢早衰小鼠模型。
实验分组：取10只未注射CTX的6周龄SD雌性小鼠作为正常对照组；取10只卵巢早衰模型小鼠尾静脉注射实施例1的细胞制剂溶液作为干细胞制剂治疗组(1mL注射器小心进针回抽见血后，将0.2mL细胞浓度为1x106/mL的细胞制剂溶液缓慢推入小鼠尾静脉)；取10只卵巢早衰模型小鼠尾静脉注射对比例1的细胞制剂溶液作为ECG治疗组；取10只卵巢早衰模型小鼠尾静脉注射对比例2的细胞制剂溶液作为盐酸川芎嗪治疗组；取10只卵巢早衰模型小鼠不采取任何救治措施作为空白对照组；取10只卵巢早衰模型小鼠尾静脉注射戊酸雌二醇作为激素治疗组。正常对照组、空白对照组的小鼠采用同等体积的生理盐水尾静脉注射，ECG治疗组、盐酸川芎嗪治疗组和激素治疗组的小鼠均注射同体积同浓度的相应的药物。
实验方法：(1)标本采集：于第0天、第2周、第4周和第6周将每组小鼠置于鼠笼上，左手拇指食指捏住从背部捏住小鼠颈部两侧，小指固定尾根部，使小鼠眼球突出，眶后静脉丛充血。右手持毛细玻璃管以45°旋转刺入小鼠眼角，至2-3mm有阻力时停止，使血液滴入EP管中。(2)标准品稀释：将各种试剂移至室温(18-25℃)平衡至少30min。取标准品于1.5mlEP管中稀释。(3)将酶标板取出，设一个空白对照孔，不加任何液体；每个标准点依次各设两孔，每孔加入相应标准品50μl；其余每孔加入待测样品50μl。(4)每孔加入酶结合物50μl(空白对照组除外)，充分混匀，贴上封板膜，37℃温箱孵育60min。(5)洗板：弃去孔内液体，注入洗涤液，静置10秒甩干，重复三次后拍干。(6)每孔加入显色剂A液50μl，显色剂B液50μl，震荡混匀后，37℃温箱避光显色15min，每孔加入终止液50μl。(7)用酶标仪在450nm波长处测定OD值。(8)结果判定：将每个标准品和样品的OD值减去空白孔OD值，设定标准品浓度为横坐标，OD值为纵坐标，绘制标准曲线，根据OD值查出相应的浓度。具体实验结果见表3。
表3各组小鼠血清中E2和FHS水平(n＝10)
*表示与空白对照组相比差异显著，P<0.05；**表示与空白对照组相比差异极显著，P<0.01；△表示与空白对照组相比差异极显著，P<0.01。
结果显示：与空白对照组小鼠相比，干细胞制剂治疗组和激素治疗组小鼠血清中E2浓度明显提高，干细胞制剂治疗组和激素治疗组小鼠血清FSH浓度均显著下降，同时，本发明实施例1的干细胞制剂想比与单独的对比例1和对比例2的细胞制剂显示出更明显的效果。
以上所述仅为本发明创造的较佳实施例而已，并不用以限制本发明创造，凡在本发明创造的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明创造的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种用于治疗卵巢早衰的干细胞制剂，其特征在于：其包括：i)经血间充质干细胞；ii)表儿茶素没食子酸酯或其可药用盐；iii)盐酸川芎嗪，所述干细胞制剂为将上述组分溶解于0.9％的氯化钠溶液中制得。
2.根据权利要求1所述的干细胞制剂，其特征在于：所述经血间充质干细胞的浓度为1-8×106个/ml。
3.根据权利要求1所述的干细胞制剂，其特征在于：所述经血间充质干细胞的浓度为3×106个/ml。
4.根据权利要求1所述的干细胞制剂，其特征在于：所述表儿茶素没食子酸酯或其可药用盐的质量浓度以表儿茶素没食子酸酯计为0.1-0.5mg/ml。
5.权利要求1所述的干细胞制剂，其特征在于：所述表儿茶素没食子酸酯或其可药用盐的质量浓度以表儿茶素没食子酸酯计为0.2mg/ml。
6.根据权利要求1所述的干细胞制剂，其特征在于：所述盐酸川芎嗪的质量浓度为0.1-0.3mg/ml。
7.根据权利要求1所述的干细胞制剂，其特征在于：所述盐酸川芎嗪的质量浓度为0.1mg/ml。
8.权利要求1所述的干细胞制剂，其特征在于：所述经血间充质干细胞为传代1-5次的传代细胞；优选的，所述经血间充质干细胞为传代3次的传代细胞。
9.权利要求1-8任一所述的干细胞制剂的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：
(1)培养基配制：配置含有胎牛血清(10％v/v)、双抗～青霉素+链霉素(1:100v/v)、L-谷氨酰胺(1:100v/v)、非必需氨基酸(1:100v/v)和β-巯基乙醇(1:1000v/v)的基础培养基，将上述原料混匀，4℃冰箱保存；
(2)将P0代经血间充质干细胞以1-5×104个/cm2的接种量接种于步骤(1)制得的培养基中，将接种了P0代经血间充质干细胞的培养皿于10-15％CO2，37℃的条件下培养,每2天更换一次培养基,共培养14天；
(3)培养完成后，离心去除培养基并收集细胞，用PBS清洗3遍，用质量百分含量为0.25％的胰蛋白酶消化收集细胞；用预冷的冻存液重悬细胞,用细胞计数仪计数，细胞密度达到要求后，将上述被冻存液重悬的细胞梯度降温后放入液氮中冻存；
(4)将冻存的细胞取出转移至37℃水浴中解冻后，加入PBS清洗细胞，之后放入离心管中，1500rpm离心5min，弃上清，加入0.9％氯化钠溶液以及表儿茶素没食子酸酯、盐酸川芎嗪重悬，制得细胞浓度为1-8×106个/ml的细胞制剂；
优选的，所述步骤(4)使用的冻存的细胞为重复步骤(2)和(3)获得传代1-5次的传代细胞。
10.一种权利要求1-8任一所述的细胞制剂在制备治疗卵巢早衰药物中的应用。
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