CN111419869A - 枸杞多糖在制备防治眼部疾病的药物中的应用 - Google Patents

枸杞多糖在制备防治眼部疾病的药物中的应用 Download PDF

Info

Publication number
CN111419869A
CN111419869A CN201910014332.8A CN201910014332A CN111419869A CN 111419869 A CN111419869 A CN 111419869A CN 201910014332 A CN201910014332 A CN 201910014332A CN 111419869 A CN111419869 A CN 111419869A
Authority
CN
China
Prior art keywords
lycium barbarum
cells
barbarum polysaccharide
medicine
cell
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201910014332.8A
Other languages
English (en)
Inventor
于哲雄
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Ningxia Tianren Wolfberry Biotechnology Co ltd
Original Assignee
Ningxia Tianren Wolfberry Biotechnology Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Ningxia Tianren Wolfberry Biotechnology Co ltd filed Critical Ningxia Tianren Wolfberry Biotechnology Co ltd
Priority to CN201910014332.8A priority Critical patent/CN111419869A/zh
Publication of CN111419869A publication Critical patent/CN111419869A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/715—Polysaccharides, i.e. having more than five saccharide radicals attached to each other by glycosidic linkages; Derivatives thereof, e.g. ethers, esters
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A61P27/06—Antiglaucoma agents or miotics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A61P27/12—Ophthalmic agents for cataracts

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Ophthalmology & Optometry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Abstract

本发明涉及医药领域，具体为枸杞多糖在制备防治眼部疾病的药物中的应用，其目的在于提供枸杞多糖在制备防治眼部疾病的药物中的应用，该药物具有缓解视力疲劳和防治眼部疾病的功能；其包括：所述枸杞多糖与药学上可接受的辅料或辅助性成分混合制备成各种形式的片剂、粉剂、颗粒、丸剂、膏剂、胶囊或滴眼液；其有益效果在于：由枸杞多糖组成的药物或保健品，具有缓解视力疲劳和防治白内障、青光眼、眼部退行性病变等眼部疾病的作用，药效明确，安全性高，为临床提供了一种新的用药选择。

Description

枸杞多糖在制备防治眼部疾病的药物中的应用
技术领域
本发明涉及医药领域，具体为枸杞多糖在制备防治眼部疾病的药物中的应用。
背景技术
枸杞子是茄科植物宁夏枸杞的干燥成熟果实，主要分布在我国新疆、宁夏、青海等地区。枸杞子不仅是一味名贵的中药材，因其独特的滋补作用，也是众多的营养和保健食品之一。药典记载，枸杞具有益精明目、滋补肝肾的功效。枸杞多糖(LBP)是枸杞提取物的主要化学成分，是由葡萄糖、阿拉伯糖、鼠李糖、甘露糖、木糖和半乳糖6种单糖组成的水溶性多糖类化合物。枸杞多糖具有调节机体免疫、清除氧自由基、抑制肿瘤、延缓衰老、降血脂、降血糖和抗疲劳等作用，具有广阔的开发应用前景。枸杞多糖对调节机体免疫、清除氧自由基、抑制肿瘤、延缓衰老、降血脂、降血糖和抗疲劳的报道较多，但枸杞多糖对缓解视力疲劳和防治眼部疾病的报道较少。
发明内容
本发明的目的在于提供枸杞多糖在制备防治眼部疾病的药物中的应用，该药物具有缓解视力疲劳和防治眼部疾病的功能。
为了实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案：
本发明用枸杞的提取物—枸杞多糖为活性成分，加入药学上可接受的辅料或辅助性成分制备成药剂或保健品。
本发明所述的枸杞多糖与药学上可接受的辅料或辅助性成分混合制备成各种形式的片剂、粉剂、颗粒、丸剂、膏剂、胶囊或滴眼液。
进一步的，所述枸杞多糖为成分为中性糖含量≥30％，糖醛酸含量≥5％，蛋白含量22-38％的粉末。
进一步的，由枸杞多糖与药学上可接受的辅料或辅助性成分混合制备而成的各种形式的片剂、粉剂、颗粒、丸剂、膏剂、胶囊或滴眼液，按照其制药工艺所属的制药单位计，每单位中枸杞多糖的含量为20-200mg。
本发明的有益效果在于：由枸杞多糖组成的药物或保健品，具有缓解视力疲劳和防治白内障、青光眼、眼部退行性病变等眼部疾病的作用，药效明确，安全性高，为临床提供了一种新的用药选择。
附图说明
图1为LBP的提取工艺图；
图2为不同浓度H2O2对ARPE-19细胞增殖的影响；
图3为LBP对ARPE-19细胞增殖的影响；
图4为LBP对H2O2诱导的氧化损伤的影响；
图5为LBP对ARPE-19细胞形态的影响；
图6为LBP对ROS的影响；
图7为LBP对细胞凋亡的影响；
图8为LBP对MDA的影响；
图9为LBP对NMDA大鼠视网膜损伤的影响；
图10为LBP对NMDA大鼠视网膜NMDAR2A表达的影响；
图11为LBP对NMDA大鼠视网膜eNOS和iNOS表达的影响。
具体实施方式
下面结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例1：LBP对人视网膜色素上皮细胞(ARPE-19)的影响；
1、实验材料
细胞系：人视网膜色素上皮细胞(ARPE-19)，购自于中国科学院上海细胞库，培养传代稳定后一部分保存于液氮备用。
原材料枸杞产自宁夏，枸杞、枸杞酒浸膏由森淼公司提供。
试剂与仪器：BPMI1640、DMEM细胞培养液购自GIBCO公司；胎牛血清、小牛血清购自四季青；Annexin V-FITC凋亡试剂盒、CCK-8试剂盒、细胞裂解液、DCFH-DA试剂盒购自于Abcam公司、MDA试剂盒购自于南京建成生物工程研究所。其他化学试剂，如Tris-base(PH＝0.5)、H2O2等均为分析纯。二氧化碳培养箱购自日本NU8500E；倒置显微镜购自美国AO公司；96孔板、6孔板购自美国Thermo Scientific；酶标仪购自BIO-RAD公司；高速台式离心机购自Sigma公司。
2、实验方法
(1)细胞培养、复苏与冻存
细胞培养：新购进的ARPE-19(人视网膜色素上皮细胞)细胞在收到细胞后先置于5％CO2、37℃恒温培养箱中培养4-6小时之后立即换成新鲜的已加入GIBO双抗溶液(青霉素+链霉素)的DMEM培养基和已灭活的胎牛血清(9:1)共计10ml的完全培养基，然后放进5％CO2、37℃恒温培养箱中培养过夜培养，第二天立即进行消化传代，将细胞瓶中的培养基倒掉，然后加入3mL的PBS轻轻转动培养瓶将其四面瓶壁上残留的血清(血清会影响胰霉的消化功能)全部洗掉之后弃掉PBS加入2-3mL胰霉进行消化细胞，然后边观察边消化，当细胞的形态变圆有极少量游离的细胞时记下消化时间并终止消化，弃掉胰霉将培养瓶静置于超净工作台，观察细胞培养瓶的瓶底不再光滑有絮状物时加入2mLDMEM培养基采取半分钟间隔轻轻吹打细胞边缘(以免对细胞造成机械损伤)，在显微镜下观察所有细胞都已悬浮起来时停止吹打，回到超净台按9:1的比例加入DMEM培养基和胎牛血清共10mL，然后做好标记并放入5％CO2、37℃恒温培养箱中培养，待细胞量达到80％-90％之后进行实验和再传代培养。
细胞冷冻：取状态良好的对数生长期的细胞消化后，转移至已灭菌10mL离心管，1200r/min、离心10min，弃上清；配置适量细胞冻存液(内含甘油血清各15％，DMEM培养基70％),以1mL细胞冷存液小心重悬离心管内的细胞然后加入已灭菌的细胞冷存管中并做相应信息标记；将冷存管转入程序冷存盒中放入-80℃冰箱进行程序降温，24小时后于程序冷存盒中取出冷存管，放至液氮中进行中长期保存。
细胞复苏：预先在烧杯中准备约37℃的蒸馏水并在无菌的细胞培养瓶中配置10mL的完全培养基，在液氮罐中根据所做记录找到目的细胞，用镊子取出细胞并迅速放入37℃的温水中，缓慢摇晃37℃温水中的细胞使其快速溶解(遵循慢冻速溶的原则)，最终将冷存管内完全溶解的细胞液加入已配置好培养也得培养瓶中，于37℃的CO2细胞培养箱进行恒温培养。
(2)LBP的提取
将枸杞酒固体浸膏用水溶解，上0.5L大孔吸附树脂(HP-20，载样量1:10kg/L)，先用5个柱体积的蒸馏水洗脱，洗脱液减压蒸馏得到多糖组分Gj1；95％乙醇洗脱5个柱体积，减压压缩后，得到Gj4；最后用丙酮洗脱2个柱体积，减压浓缩后，得到Gj5(实验过程中发现Gj2和Gj3效果不佳，所以选取Gj1、Gj4和Gj5进行后续实验)。分别用蒸馏水、50％乙醇、95％乙醇对地骨皮(枸杞皮)中的成分进行提起，得到D1，D2，D3(实验过程中发现D1和D3效果不佳，所以选取D2进行后续实验)(图1)。
(3)LBP工作液的配置
将已提取好的一定质量的LBP的冷冻样品在超净台中用DMOS溶解并按质量的不同分别制成储备液。Gj1、Gj4和Gj5配置为2mg/mL、D2配置成10mg/mL的储备液置于-20℃冰箱中密封保存备用，实验前将储备液置于常温环境中溶解后吸取一定量的储备液于已灭菌1.5mL离心管中，再按比例加入DEME完全培养基稀释成10－5mg/mL、10－4mg/mL、10－3mg/mL、10－2mg/mL、10－1mg/mL的工作液。
(4)H2O2工作液的配置
在超净台的避光环境下吸取10.2μL的H2O2原液于1.5mL离心管中，然后在离心管中加入989.9μL的DMEN细胞培养液制成100mmol/L的H2O2储备液，再10倍稀释成10mmol/L的溶液，最后按一定比例稀释成200μmol/L、300μmol/L、500μmol/L、800μmol/L的H2O2工作液备用。
(5)磺基罗丹明B(SRB)检测细胞毒性
将实验细胞人视网膜色素上皮细胞(ARPE-19)按上下板各10μL的量小心滴加在细胞计数板上，然后在显微镜下用计数器记下计数板上所有小方格的细胞数量利用公式计算出细胞总量然后再按5×104个/mL的细胞数量，按每孔10μL的量加入96孔板中，CO2培养箱培养24h后加入已用完全培养基稀释的枸杞工作液至每孔的终体积为200μL，继续共同培养48h后每孔每孔再加入80％的三氯乙酸(TCA)50μL，常温放置5min后转移至4℃工作环境下固定1h，时间结束后轻轻的倒掉液体，每孔每次用260μL的蒸馏水轻轻冲洗，重复4-5次(确保残留的TCA被完全洗掉)，轻轻甩干(避免已经固定的细胞被甩掉)，静置在干净的通风处晾干，确保晾干后每孔加入0.4％的磺基罗丹明B(SRB)100μL常温染色10min，之后弃去染液(染液可以重复利用)，每孔再用260μL的1％的冰醋酸冲洗5次，温室放置待完全风干后每孔加入100μL 10mol/L的Trisbase(PH＝10.5)溶液，震荡完全溶解后用酶标仪测定其在540nm处的吸光值(OD)进行数据的收集与统计。
(6)Annexin V-FITC/PI双染色法检测细胞凋亡
生长状态良好的实验所用细胞人视网膜色素上皮细(ARPE-19)计数按5×104个/mL的细胞数量每孔2mL加入六孔板37℃的CO2的培养箱培养24h之后，设置正常对照组、氧化损伤处理组合LBP处理组加入相应的工作液(正常对照组只需加完全培养基配平体积)37℃的CO2培养箱共孵育48h之后加入胰酶消化细胞转移至10mL离心管，500g离心5min收集细胞，用预冷的PBS洗涤细胞一次，再次500g离心5min收集细胞；
将收集好的细胞加入100μL 1×Annexin Binding Buffer重悬细胞后转移至已经做好标记的流式管(必须设置阴性管和单阳管，否则实验结果不可靠)中，然后在所有的样品管中分别加入5μL Annexin V-FITC和5μLPI染料轻轻混匀(阴性对照组中不加AnnexinV-FITC和PI，在两个单阳管中只需加入相应的一种染料)；
超净台放置避光(关掉所有的灯，黑布遮蔽)孵育15min后，加入300μL预冷的1×Annexin Binding Buffer。轻轻混匀，将样品置于冰上，染色结束后1h内用流式细胞仪进行测定。
(7)DCFH-DA检测细胞活性氧含量
取生长状态良好的细胞人视网膜色素上皮细(ARPE-19)，获取相应条件下的细胞悬浮培养液。计数得出相应的细胞密度；
接种适量的上述细胞悬浮培养液，使得终浓度为1×106个/mL，按每孔2mL的量加入六孔细胞培养板中，37℃5％CO2培养箱培养24h之后加入LBP预处理30min之后再加入300μmol/L的H2O2共孵育48h；
处理时间结束后闭关加入终浓度为5μmol/LROS的荧光针DCFH-DA，37℃工作环境中避光孵育45min后弃掉所有液体，加入PBS洗去残留在培养板中的血清(血清会影响胰酶的消化效果)，向6孔细胞培养液中每孔加入1mL胰酶消化液消化ARPE-19细胞。待所有细胞完全消化处于悬浮状态之后500g离心10min收集细胞；
离心结束后小心倒掉上清液，在上述离心管中缓慢加入适量PBS缓冲液，并用无菌移液管将沉淀在离心管壁和底部的细胞混合均匀，再一次500gl离心10min收集细胞；
二次离心结束后避光条件下在离心管中加入500μLPBS溶液吹匀所有的细胞，然后将细胞悬浮转移至流式细胞管中，用流式细胞仪检测ROS的水平。
(8)蛋白质的提取
将经过处理的ARPE-19细胞500g，离心10min收集细胞；
离心结束之后轻轻取出离心管，用200μL的移液枪小心地抽取上清液，并弃掉留在剩余沉淀细胞中加入适量裂解液(裂解液中加入100μg/mL PMSF，裂解30min，震荡一次/5min)；
裂解完成的细胞12000rpm/min，4℃离心15min，用200μL枪头小心吸取上清液，保存到干净的EP管中，弃掉沉淀(注意吸取上清液时一定要避免吸到底部沉淀中的物质)；
取4μL已提取的上清液，用去离子水稀释40倍。在96孔细胞培养板中，每孔加入200μL考马斯亮蓝液，之后再96孔板中加入分别4μL待测定的蛋白样品和用来制作标准曲线的标准品蛋白(设置5个以上的浓度梯度减小曲线误差)，使用酶标仪测定蛋白浓度。
(9)MDA含量的测定
取生长状态良好的ARPE-19细胞，获取相应条件下的而细胞悬浮培养液。计数得出相应的细胞密度；接种适量的上述细胞悬浮培养液，使得终浓度为接种适量的上述细胞悬浮培养液，使得终浓度为1×106个/mL，按每孔2mL的量加入六孔细胞培养板中，37℃5％CO2培养箱培养24h之后加入LBP预处理30min之后再加入300μmol/L的H2O2共孵育48h。孵育结束后MDA含量严格按照试剂盒说明书测定。
(10)数据统计分析方法
(11)所得数据求平均值，+/-SD表示，采用t检验进行样品组间比较，*P<0.05作为显著性差异的评价标准。
3、实验结果
(1)氧化损伤模型的建立
生长状态良好的ARPE-19细胞以1×106个/mL的量计入96孔细胞培养板中，每孔100μL，放置于37℃5％CO2的细胞培养箱中培养24h分别加入200μmol/L、300μmol/L、500μmol/L、800μmol/L H2O2处理48小时后，利用磺基罗丹明B(SRB)检测细胞的增殖率，(图2)。统计结果显示当H2O2的浓度为300μmol/L时细胞增殖率与对照组细胞相比降低了一半，即300μmol/L的浓度为半数致死浓度，以此浓度建立最佳的氧化损伤模型。
(2)LBP对ARPE-19细胞增殖的影响
生长状态良好的ARPE-19细胞加入不同稀释浓度(10－5mg/mL、10－4mg/mL、10－3mg/mL、10－2mg/mL、10－1mg/mL)的LBP(Gj1、Gj4、Gj5、D2、D3)48小时后，检测细胞增殖率的变化，发现当LBP的浓度为10－5mg/mL、10－4mg/mL、10－3mg/mL、10－2mg/mL时细胞的增值率与对照组细胞比没有统计学意义，p>0.05(图2)，即这些浓度的LBP对人视网膜色素上皮细胞不具有毒性作用。当LBP的浓度为10－1mg/mL时细胞的增值率与对照组细胞相比有统计学差异，p<0.05(图3)，即这一浓度的LBP对细胞有毒性作用。如图2所示，*P<0.05vs.正常对照组。
(3)LBP提高氧化损伤细胞的增殖率
根据图3的实现结果，选取10－5mg/mL、10－4mg/mL、10－3mg/mL、10－2mg/mL四个浓度梯度作为后续实验的处理组浓度。状态良好的ARPE-19细胞加入处理组浓度的LBP孵育半小时后再加入300μmol/L的H2O2之后共孵48小时，检测细胞增殖率。检测结果显示，与H2O2组细胞相比，处理组细胞的增殖率有明显的改善，P<0.05(图4)。如图4所示，*P<0.05vs.正常对照组，#P<0.05vs.正常对照组，**P<0.01vs.正常对照组，##P<0.01vs.正常对照组，***P<0.001vs.正常对照组，###P<0.001vs.正常对照组。
(4)LBP改善氧化损伤的ARPE-19细胞的形态
倒置显微镜下观察到，正常生长的人视网膜色素上皮细胞(ARPE-19)呈多边形或者梭形，细胞轮廓清晰且呈单层贴壁状态，当300μmol/L的H2O2损伤ARPE-19细胞48小时后，发现细胞形态发生了很大的变化，具体表现为：细胞皱缩、变小、变圆，失去正常的形态，且部分细胞不能正常贴壁生长处于悬浮状态。用10－3mg/mL的Gj5预处理ARPE-19细胞30min后再经300μmol/L的H2O2损伤处理48小时，发现ARPE-19细胞形态得到改善，细胞大小基本一致，形态与正常组ARPE-19细胞相仿，并且能够单层贴壁生长。(图5)
(5)LBP抑制ROS的产生
流式细胞术测定细胞内ROS的变化，H2O2损伤组细胞内ROS的含量上升，LBP处理组细胞抑制了氧化损伤引起的ROS的含量的上升(图6)。如图6所示，***P<0.001vs.正常对照组，#P<0.05vs.正常对照组，##P<0.01vs.正常对照组。
(6)LBP抑制氧化损伤诱导的细胞凋亡
生长状态良好的ARPE-19细胞经LBP和300μmol/L的H2O2处理，流式细胞仪检测细胞凋亡发现，与正常对照组细胞相比H2O2处理组细胞凋亡率明显上升，LBP预处理组细胞的凋亡与H2O2处理组细胞的凋亡相比，LBP预处理组细胞的凋亡明显降低(图7)，证明LBP对氧化损伤的ARPE-19细胞具有保护作用。
(7)LBP对MDA含量的影响
与正常对照组相比，H2O2氧化损伤处理组的MDA的含量上升(图8)，LBP预处理组MDA的含量降低。如图8中所示，***P<0.001vs.正常对照组，#P<0.05vs.正常对照组，##P<0.01vs.正常对照组。
综上所述，枸杞多糖对人视网膜色素上皮细胞(ARPE-19)的氧化损伤具有保护作用，所以枸杞多糖可用于防治年龄相关性黄斑变性(ADM)引起的眼部疾病。
实施例2：LBP对NMDA致大鼠视网膜损伤的影响
1、实验材料
实验动物：清洁级Sprague-Dawley大鼠，7-8周龄，体重120～150g，由宁夏医科大学实验动物中心提供，动物合格证号：SCXK(宁)2012-0006
药品与试剂：LBP购自宁夏沃富百瑞生物食品有限公司，含量≥30％，批号：64WFBR100501；戊巴比妥钠、NMDA、氯化钠、多聚甲醛购自Sigma公司；凯基全蛋白提取试剂盒、凯基BCA蛋白含量检测试剂盒购自南京凯基生物科技发展有限公司；兔抗大鼠eNOS、iNOS抗体购自Abcam公司；兔抗大鼠NMDAR2A抗体、兔抗β-actin抗体购自Cell Signaling公司；山羊抗兔二抗购自北京中杉金桥生物技术公司；Suoer Signal West PicoChemiluminescent Substrate购自Thermo Scientific公司；实验用水为超纯水。
仪器TY96-ⅡN型超生细胞粉碎机(宁波新芝生物科技股份有限公司)；H1850R型台式高速冷冻离心机(长沙湘仪离心机仪器有限公司)；5μl微量注射器(上海安亭微量进样器厂)；Mutiskan Go酶标仪(美国Thermo Fisher公司)；PowerPac Basic电泳仪(美国BIO-RAD公司)；培清JS-860B凝胶成像分析仪(上海培清科技有限公司)。
2、实验方法
(1)实验动物分组及模型的建立：56只清洁级Sprague-Dawley大鼠随机分为4组：NMDA组、NMDA+LBP(100、200、400mg·kg－1)组，每组14只大鼠。NMDA组大鼠的左眼为正常对照组。NMDA致大鼠视网膜神经元损伤模型，根据Kawasaki等采用的方法略为改进，具体方法：各组大鼠腹腔注射戊巴比妥钠40mg·kg－1麻醉，采用微量注射器在大鼠有眼玻璃球内注射2μl浓度为40nmol·L－1的NMDA。LBP分别按100、200、400mg·kg－1于NMDA注射前7天灌胃给药，共14天，模型组给予等体积生理盐水。注射NMDA后的第14天处死各组大鼠。每组取5只大鼠眼球剔除玻璃体纵切后浸入4％多聚甲醛固定，其余大鼠眼球剔除玻璃体后置液氮中速冻后放图-80℃冰箱中冷存。
(2)病理学组织观察：多聚甲醛固定24h后，用流水冲洗3h，然后梯度乙醇脱水、常规石蜡包埋、切片和苏木精-伊红(HE)染色处理，每张切片随机选取视神经根部周围5个圆形视野，于显微镜下观察视网膜内丛状层厚度并对视网膜神经细胞层的神经元进行计数。计数方法：同一倍率下，记录视野中神经节细胞层长100μm(长度以标尺为准，平行于神经节细胞层方向)的任意区域内神经元个数，取平均值。
(3)Western Blot检测：在约100mg经液氮研磨的视网膜组织中加入0.5ml冷裂解缓冲液，水浴下超声破碎细胞。4℃，10000r/min离心10min，取上清蛋白定量，剩余上清加入上样缓冲液100℃水浴10min，-20℃保存。取蛋白样本75μg上样，7.5％SDS-PAGE凝胶电泳(80V/120V电压)，200mA恒定电流转膜至硝酸纤维素膜，5％脱脂奶封闭1h后，分别用抗NMDAR2A抗体(1∶200)、抗eNOS抗体(1∶200)、抗iNOS抗体(1∶200)及抗β-actin抗体(内参，1∶1000)4℃孵育过夜。加入山羊抗兔二抗(偶联有HRP，1∶4000)常温孵育2h，加入超级化学发光底物反应液，曝光胶片。胶带扫描结果采用Quantity-one软件分析，将目的条带中的光密度值与其相对应的内参β-actin的光密度值相比以校正误差，所得壁纸代表该目的蛋白的相对含量。
(4)统计学处理：验结果
Figure BDA0001940047270000141
表示。用SPSS19.0软件包进行统计分析。多组间均数的比较采用One-way ANOVA分析。
2、结果
(1)视网膜组织学改变：光镜下正常对照组大鼠视网膜HE染色后各组织结构清晰，完整，染色均匀，清晰可见3个核层。由内向外依次为神经神经节细胞层(GCL)，内核层(INL)以及外核层(ONL)。神经节细胞呈多层分布，内丛状层(IPL)位于GCL与INL之间，外从状层(OPL)位于INL与ONL之间。NMDA组以GCL核IPL损伤最为明显，神经节细胞减少，胞内空泡样变性，核固缩浓染，IPL变薄，LBP(100、200、400mg·kg－1)均能抑制NMDA所致神经节细胞的凋亡和IPL的变薄。高剂量LBP(400mg·kg－1)对正常视网膜无影响(图9)。
如图9所示，A:大鼠视网膜HE染色影像，比例尺＝50μm；B:GCL的细胞形态学数量；C：IPL的细胞形态学厚度；数据以控制值的百分比表示(n＝5，
Figure BDA0001940047270000142
)，#P<0.05vs.正常对照组，##P<0.05vs正常对照组；*P<0.05vs.NMDA组，**P<0.05vs.NMDA组。
(2)视网膜NMDAR2A的表达：Western blot检测结果显示，正常对照组视网膜NMDAR2A蛋白表达较低。玻璃体内注射NMDA后，NMDAR2A蛋白表达明显增高(P<0.01)。LBP(100、200、400mg·kg－1)明显降低NMDA所致NMDAR2A蛋白表达增多(P<0.01)，并且NMDA+LBP200和400mg·kg－1组使NMDAR2A的蛋白表达基本降到正常水平。高剂量LBP(400mg·kg－1)对正常视网膜NMDAR2A的蛋白表达无影响(图10)。
如图10所示，A：NMDAR2A的Western blot分析，β-actin显示为负载控制；B：NMDAR2A的蛋白数值以控制值的百分比表示(n＝9，
Figure BDA0001940047270000151
)。##P<0.05vs正常对照组，**P<0.05vsNMDA组。
(3)视网膜eNOS和iNOS的表达：Western blot检测结果显示，与正常对照组比较，NMDA组eNOS的表达明显降低(P<0.01)。LBP(100、200、400mg·kg－1)可明显抑制NMDA致eNOS表达的减少(P<0.01)。高剂量LBP(400mg·kg－1)对正常视网膜eNOS蛋白表达无影响(Fig3B)。正常对照组视网膜组织中iNOS几乎不表达。玻璃体内注射NMDA后，视网膜组织中iNOS表达明显增高(P<0.01)。LBP(100、200、400mg·kg－1)可明显抑制NMDA致iNOS表达的增多(P<0.01)。高剂量LBP(400mg·kg－1)对正常视网膜iNOS蛋白表达无诱导作用(图11)。
如图11所示，A：eNOS和iNOS的Western blot分析，β-actin显示为负载控制；B：eNOS的蛋白数值按对照组大鼠的百分比显示；C：iNOS的蛋白数值以控制值的百分比表示(n＝9，
Figure BDA0001940047270000152
)；#P<0.05vs.正常对照组，##P<0.05vs正常对照组；**P<0.05vs.NMDA组。
综上所述，大鼠眼玻璃体内注射NMDA后，视网膜的厚度变薄，细胞数量减少。LBP能抑制NMDA所致神经节细胞的凋亡和IPL的变薄，LBP能抑制NMDA所致NMDAR2A蛋白表达的增高，LBP能抑制NMDA所致eNOS表达的减少，LBP能抑制NMDA所致iNOS表达的增多。即LBP可以减轻视网膜病理损伤，对NMDA诱导的大鼠视网膜损伤具有保护作用，以200、400mg·kg－1给药最为明显。
综上所述，枸杞多糖对NMDA诱导的视网膜损伤疾病具有防治作用。
在本发明的描述中，需要说明的是，术语“中心”、“上”、“下”、“左”、“右”、“竖直”、“水平”、“内”、“外”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制。此外，术语“第一”、“第二”、“第三”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性；最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换,凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (4)

1.枸杞多糖在制备防治眼部疾病的药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的枸杞多糖在制备防治眼部疾病的药物中的应用，其特征在于：所述枸杞多糖与药学上可接受的辅料或辅助性成分混合制备成各种形式的片剂、粉剂、颗粒、丸剂、膏剂、胶囊或滴眼液。
3.根据权利要求2所述的枸杞多糖在制备防治眼部疾病的药物中的应用，其特征在于：所述枸杞多糖为成分为中性糖含量≥30％，糖醛酸含量≥5％，蛋白含量22-38％的粉末。
4.根据权利要求3所述的枸杞多糖在制备防治眼部疾病的药物中的应用，其特征在于：由枸杞多糖与药学上可接受的辅料或辅助性成分混合制备而成的各种形式的片剂、粉剂、颗粒、丸剂、膏剂、胶囊或滴眼液，按照其制药工艺所属的制药单位计，每单位中枸杞多糖的含量为20-200mg。
CN201910014332.8A 2019-01-09 2019-01-09 枸杞多糖在制备防治眼部疾病的药物中的应用 Pending CN111419869A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910014332.8A CN111419869A (zh) 2019-01-09 2019-01-09 枸杞多糖在制备防治眼部疾病的药物中的应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910014332.8A CN111419869A (zh) 2019-01-09 2019-01-09 枸杞多糖在制备防治眼部疾病的药物中的应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN111419869A true CN111419869A (zh) 2020-07-17

Family

ID=71545617

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201910014332.8A Pending CN111419869A (zh) 2019-01-09 2019-01-09 枸杞多糖在制备防治眼部疾病的药物中的应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN111419869A (zh)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113599495A (zh) * 2021-06-04 2021-11-05 爱尔眼科医院集团股份有限公司 组合物及其在制备治疗视网膜色素变性的药物中的应用
CN115040471A (zh) * 2022-02-17 2022-09-13 张志昂 一种含枸杞多糖营养视网膜神经的产品及其制备方法
CN115317548A (zh) * 2022-08-02 2022-11-11 宁夏医科大学 一种增强枸杞子内治眼病功效的炮制方法及其应用

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1953761A (zh) * 2004-02-25 2007-04-25 港大科桥有限公司 使用宁夏枸杞提取物作为视网膜神经节细胞变性的神经保护剂的方法
CN104274484A (zh) * 2014-10-14 2015-01-14 广州中医药大学 枸杞多糖在制备治疗干眼病的药物中的应用
CN108299570A (zh) * 2018-04-28 2018-07-20 宁夏天仁枸杞生物科技股份有限公司 一种枸杞多糖的制备方法

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1953761A (zh) * 2004-02-25 2007-04-25 港大科桥有限公司 使用宁夏枸杞提取物作为视网膜神经节细胞变性的神经保护剂的方法
CN104274484A (zh) * 2014-10-14 2015-01-14 广州中医药大学 枸杞多糖在制备治疗干眼病的药物中的应用
CN108299570A (zh) * 2018-04-28 2018-07-20 宁夏天仁枸杞生物科技股份有限公司 一种枸杞多糖的制备方法

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
于国华等: "枸杞多糖的神经保护作用机制研究进展", 《中国实验方剂学杂志》 *
孟姣等: "枸杞多糖药理作用研究进展", 《时珍国医国药》 *
胡瑾等: "枸杞多糖对大鼠视神经损伤的保护作用", 《宁夏医科大学学报》 *
霍超等: "枸杞生理功效和活性成分的研究进展", 《中国食物与营养》 *

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113599495A (zh) * 2021-06-04 2021-11-05 爱尔眼科医院集团股份有限公司 组合物及其在制备治疗视网膜色素变性的药物中的应用
CN113599495B (zh) * 2021-06-04 2024-04-05 爱尔眼科医院集团股份有限公司 组合物及其在制备治疗视网膜色素变性的药物中的应用
CN115040471A (zh) * 2022-02-17 2022-09-13 张志昂 一种含枸杞多糖营养视网膜神经的产品及其制备方法
CN115317548A (zh) * 2022-08-02 2022-11-11 宁夏医科大学 一种增强枸杞子内治眼病功效的炮制方法及其应用
CN115317548B (zh) * 2022-08-02 2023-08-01 宁夏医科大学 一种增强枸杞子内治眼病功效的炮制方法及其应用

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN111419869A (zh) 枸杞多糖在制备防治眼部疾病的药物中的应用
CN105998014B (zh) 去氢骆驼蓬碱衍生物作为制备治疗囊型包虫病药物的应用
WO2017032277A1 (zh) 一种牛肺依诺肝素钠及其制备方法与应用
CN106038597B (zh) 间充质干细胞在制备治疗急性肺损伤制剂中的应用
CN115414397B (zh) 续断源性细胞外囊泡样纳米颗粒在制备预防或治疗骨科疾病药物中的应用
CN113908166B (zh) N-乙酰神经氨酸在制备用于促进Roseburia增殖的促进剂中的用途
CN108498468A (zh) 注射用甲泼尼龙琥珀酸钠
CN108403723A (zh) 一种干预ad用的美洲大蠊提取物及其提取方法和应用
WO2023137985A1 (zh) 一种调节骨骼肌糖代谢与线粒体生成的膳食营养补充剂及其应用
CN112641781B (zh) 含酯基芳香丙酰胺的SARMs类化合物及其代谢物在制备抗新冠病毒药物中的应用
CN108653322A (zh) 一种具有预防肿瘤转移的功能性保健品的组合物
CN111588763B (zh) 血栓通脉药物、制备方法及含量测定方法
CN104586865A (zh) 一种治疗心血管疾病的药物组合物
CN104586866A (zh) 一种治疗脑血管疾病的药物组合物
CN106214692A (zh) 芍药苷‑6‑o′‑苯磺酸酯治疗肝纤维化的应用及验证实验方法
CN113230276A (zh) 一种用于治疗卵巢早衰的干细胞制剂及其制备方法和应用
WO2020211511A1 (zh) 一种银杏内酯组合物在制备用于急性冠状动脉综合征的药物中的应用
CN103284943B (zh) 一种盐酸戊乙奎醚注射液的制备方法
CN115490778B (zh) 一种凤尾菇多糖提取物及其制备方法和应用
CN105769776B (zh) 一种治疗非霍奇金淋巴瘤的冻干组合物及其制备方法
CN103816172B (zh) 刺五加苷e在制备治疗类风湿性关节炎药物中的应用
CN116059229B (zh) 一种防治新冠病毒感染的药物组合物及其药物和应用
CN114848691B (zh) 赶黄草乙酸乙酯提取物在制备降脂、减肥的药物中的用途
CN104814955B (zh) 一种治疗脑水肿的药物组合物及其制剂
CN107837311B (zh) 红龙镇痛片在制备神经细胞保护制剂中的应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20200717

RJ01 Rejection of invention patent application after publication