CN104586866A - 一种治疗脑血管疾病的药物组合物 - Google Patents

Abstract

本发明涉及医药领域，公开了一种药物组合物及其用途，该组合物中包含曲札茋苷、虎杖苷和曲札茋苷衍生物。研究发现该组合物能够显著改善缺血再灌注后脑梗死面积和神经功能，从根本上改善脑血管疾病患者因缺血产生的各种损伤，对脑血管疾病具有优越的治疗作用，具有良好的临床应用前景。

Description

一种治疗脑血管疾病的药物组合物

技术领域

本发明涉及医药领域，具体涉及一种治疗脑血管疾病的药物组合物。

背景技术

脑缺血相当于中医学上的“中风”、“脑卒中”，临床分为短暂性、持续性脑缺血发作，后者包括脑血栓生成、脑栓死、血管痉挛等。脑缺血可导致神经元损伤，神经功能障碍，其神经元损伤包括急性神经元坏死以及延迟性神经元细胞凋亡是世界范围内危害人民健康的重大疾病之一，备受国际社会的广泛重视。在我国，包括脑梗死在内的脑卒中发病率、致残率和病死率居高不下。

目前对脑缺血的治疗主要包括恢复脑血流、保护神经元、促进脑功能恢复等。抗血栓、脑保护是脑缺血治疗药物研发的两个主要方向，前者包括溶栓、抗凝、抗血小板以及降纤药；后者则包括抗氧化、钙拮抗以及兴奋性氨基酸拮抗药等。然而，尽管20世纪50年代后开展了数百项以各种损伤机制为靶点的新药临床研究，取得积极结果者甚少。除了护理和保守治疗所用药物外，目前国内外，特别是欧美发达国家，批准用于脑缺血疾病治疗的药物很少，仅有如FDA批准的rtPA（溶栓）、日本批准的依达拉奉（保护神经）和阿加曲班（抗凝）几种。经循证医学证明有益于脑缺血治疗的药物更为罕见，如阿司匹林。单一抗血栓和脑保护机制研发的脑卒中治疗药物大多未能通过临床试验验证，由此医学界认识到，介于脑缺血－再灌注损伤机制的复杂性，单一机制的脑卒中治疗药物的价值相对有限，研发应当更多地寻求“多靶点”作用机制的药物。在我国，中药制剂在脑血管疾病的治疗中占有一定的地位。治疗脑缺血的中药制剂包括活血化瘀和舒经通络药物，这些中药品种的临床应用效果一方面在一定程度上得到临床认可，另一方面却缺少符合国际规范的临床试验资料的支持，因此与结合循证医学结合的新产品开发将成为今后的趋势，开发生产心脑血管系统疾病用药并实现产业化具有极其重要的社会意义和经济意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种药物组合物，其治疗脑血管疾病具有药效确切，安全性高的优点。

本发明提供的治疗心脑血管疾病的药物组合物，包含曲札茋苷、虎杖苷与曲札茋苷衍生物。作为优选，所述组合物由曲札茋苷、虎杖苷以及曲札茋苷衍生物组成。更优选地，本发明所述药物组合物中曲札茋苷含量为90%～99%，虎杖苷含量为0.5%～5%，曲札茋苷衍生物含量为0.5%～5%。

曲札茋苷为化合物（E）-1-（3,5-二羟苯基）-2-（3-羟基-4-O-β-D-吡喃葡萄糖苯基）乙烯，或称为3,5,3’,4’-四羟基茋-3’-O-β-葡萄糖苷（又有称3,5,4'-三羟基-茋-3'-O-葡萄糖苷），分子式C₂₀H₂₂O₉，分子量406.13，结构式如式1所示。

虎杖苷又名白藜芦醇苷，分子式为C₂₀H₂₂O₈，分子量390.40，结构式如式2所示：

曲札茋苷衍生物结构如式3所示：

更优选地，所述药物组合物中曲札茋苷含量为90%～98%，虎杖苷含量为0.5%～5%，曲札茋苷衍生物含量为1.5%～4.5%。

本发明还提供以所述药物组合物为活性成分的药物制剂，包含曲札茋苷、虎杖苷与曲札茋苷衍生物以及药学上可接受的辅料。

本发明还提供所述药物组合物在制备治疗脑血管疾病的药物中的用途。

作为优选，所述脑血管疾病为缺血性脑血管疾病。

作为优选，所述药物为口服制剂或注射制剂。

在本发明的具体实施方式所述药物组合物对大鼠脑缺血再灌注损伤的影响研究显示，各组受试样品对大鼠行为学评分及脑坏死百分率均有降低作用；其中本发明所述药物组合物及阳性对照依达拉奉对大鼠行为学评分和脑坏死百分率均有显著或非常显著性差异（P<0.05或p<0.01）。本发明所述药物组合物可以显著升高血清中SOD及GSH含量（p<0.05，与模型组比较）；还可显著降低血清中MDA含量（p<0.05，与模型组比较）。

以上结果显示，本发明所述曲札茋苷、虎杖苷和曲札茋苷衍生物的组合物对脑缺血再灌注损伤具有治疗作用。

细胞试验显示，给予0.5mM的双氧水可引起神经元一定程度的损伤，这种作用可为50μM,100μM与200μM的本发明所述药物组合物以及阳性药尼莫地平所翻转，提示曲札茋苷组合物对脑缺血再灌注的治疗作用是通过抗氧化途径实现神经保护作用。小鼠最大耐受量研究结果显示，本发明所述药物组合物是安全可靠的，表明本发明所述药物组合物具有良好的临床应用前景。

附图说明

图1显示小鼠对本发明所述组合物最大耐受量实验的生长曲线。

具体实施方式

本发明公开了一种治疗脑血管疾病的药物组合物，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的产品及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本发明治疗心脑血管疾病的曲札茋苷单体、虎杖苷单体与曲札茋苷衍生物单体组合物具有疗效可靠，安全性高的优点，通过下列药效学实验证明。

本发明的更详细情况可在实施例中找到，而不是将保护范围限制到该实施例。下面结合实施例，进一步阐述本发明：

试验样品：

曲札茋苷，昆明制药集团股份有限公司提供，纯度99.3%，批号20120401；虎杖苷，昆明制药集团股份有限公司提供，纯度99.6%，批号20111109；曲札茋苷衍生物，昆明制药集团股份有限公司提供，含量99.4%，批号20130115。其结构式如下：

曲札茋苷组合物制备，

1号组合物：分别称取曲札茋苷、虎杖苷和曲札茋苷衍生物，按重量比例混合成含曲札茋苷90.5%，含虎杖苷5.5%，含曲札茋苷衍生物4.5%的组合物。

2号组合物：分别称取曲札茋苷、虎杖苷和曲札茋苷衍生物，按重量比例混合成含曲札茋苷98.5%，含虎杖苷0.5%，含曲札茋苷衍生物1.5%的组合物。

实施例1、曲札茋苷组合为对大鼠脑缺血再灌注损伤的影响

1药品

1.1受试药物配制

分别取注射用水6ml，加温至80℃，加入2g羟丙基-β-环糊精，搅拌使溶解，分别加入150mg曲札茋苷、虎杖苷、曲札茋苷衍生物和曲札茋苷组合物搅拌使溶解，加入氯化钠90mg搅拌溶解，最后补加注射用水至10ml，测半成品pH值（5.0-6.0），得15mg/ml溶液，并依次稀释得3.75mg/ml溶液，备用。

阳性对照药：依达拉奉注射液，来源：南京先声东元制药有限公司，批号：80-101207

规格：5ml：10mg，性状：无色或几乎无色的澄明液体，备用。

1.2试剂

红四氮唑（TTC），中国医药集团上海化学试剂公司，批号：20120315。称取1.20g红四氮唑、0.286g Na₂HPO₄·12H₂O和0.027gK₂HPO₄加入双蒸水定溶至100ml避光保存。

0.9%氯化钠注射液，批号10010792，山东长富洁晶药业有限公司，规格500ml/瓶。

水合氯醛，批号20081027，国药集团化学试剂有限公司，使用时用生理盐水配制成12%浓度。

直径0.265mm尼龙线，日本生产。

丙二醛(MDA)测试盒，超氧化物歧化酶(SOD)测试盒，乳酸脱氢酶(LDH)测试盒，谷草转氨酶(AST)测试盒，谷胱甘肽(GSH)测试盒，以上试剂盒均购自南京建成科技有限公司。

2动物

品系：SD大鼠

来源：上海斯莱克实验动物有限责任公司

性别：雄性

体重：220-250克

动物合格证号：SCXK（沪）2008-0016

饲养：SPF屏障系统饲养，室温23±2℃，湿度40-70％，人工照明模拟昼夜变化，自由进食与饮水。

3试验分组

雄性SD大鼠，分为8组，分别为假手术组、模型组、KPC-XM18低(0.938mg/kg)、中(1.875mg/kg)、高(3.75mg/kg)剂量组、KPC-XM18苷元(2.25mg/kg)、虎杖苷组(15mg/kg)和依达拉奉注射液组(5mg/kg)，给药体积为1ml/kg。

4试验方法

4.1试验造模

将健康SD大鼠，按照1.3项所述分成8组，以12%的水合氯醛腹腔麻醉（360mg/kg）后，仰卧固定于手术台上。室温维持在25℃左右。切开右侧颈部皮肤，分离、结扎右侧颈总动脉、颈外动脉及其分支动脉。分离右侧颈内动脉（ICA），在ICA近端备线、远端放置动脉夹，颈总动脉分叉处切口，插入直径为0.265mm的尼龙线17～20mm，栓线进入ICA、穿过大脑中动脉（MCA）起始端至大脑前动脉近端，阻断MCA的所有血流来源。扎紧备线，2小时后，舌下静脉给予各组药物后拔出尼龙线，使其血流再通，结扎备线并缝合皮肤，将手术大鼠分笼放回笼内饲养。

4.2试验指标检测

4.2.1行为学评分

术后24h，用单盲法进行行为学评分，评分方法为：（1）提鼠尾离开地面约1尺，观察前肢情况。正常大鼠两前肢对称地伸向地面。如手术的对侧前肢出现腕屈、肘屈曲、肩内旋或既有肘屈曲又有肩内旋者，分别记为1、2、3、4分。（2）将动物置平滑地板上分别推左（或右）肩向对侧移动，检查抵抗推动的阻力。正常大鼠双侧阻力明显，且呈对称性。如果推右肩向左侧移动时，发现阻力下降者，根据下降程度的不同，评分为1-3分。（3）将动物两前肢置一金属网上，观察两前肢的肌张力。正常大鼠两前肢张力明显且对称。而发生左前肢张力下降者，根据下降程度的轻重评为1-3分。（4）动物有不停向一侧转圈者，计1分。根据以上标准打分，满分11分。

4.2.2生化指标

腹主动脉采血，3000rpm离心15分钟，取血清-20℃冷冻保存。按照试剂盒说明书操作，测定MDA、SOD、LDH、AST和GSH。

4.2.3梗死百分率

取脑后将大脑平均冠状分为5片，放于1.2%TTC溶液中，37℃温育10～15min染色。梗死区不着色，正常脑组织染成红色。拍照后分别称量全脑重量和坏死部分重量，计算坏死区重量占全脑重量的百分率。所有的数据的统计学分析用t检验。

5试验结果见表1和表2

表1曲札茋苷组合物对线栓法致大鼠局部脑缺血-再灌注损伤的治疗作用

与模型组相比较：*P<0.05，**P<0.01；与假手术组相比较：^#P<0.05，^##P<0.01

表1显示：大鼠在手术后都有比较明显的行为学缺陷和大脑组织缺血坏死，说明造模成功。各受试样品对大鼠行为学评分及脑坏死百分率均有降低作用；其中曲札茋苷组合物及阳性对照依达拉奉对大鼠行为学评分和脑坏死百分率均有显著或非常显著性差异（P<0.05或p<0.01，与模型组比较）。

表2KPC-XM18对线栓法致大鼠脑缺血-再灌注血清生化指标的影响

与模型组相比较：*P<0.05，**P<0.01

与假手术组相比较：^#P<0.05，^##P<0.01

表2显示：与假手术组比较，模型组血清中MDA含量明显升高，而SOD及GSH含量则明显降低（p<0.05），AST及LDH虽有一定的升高，但与假手术组比较没有显著差异（p>0.05）。各受试药物组均可以显著升高血清中SOD及GSH含量（p<0.05，与模型组比较）；其中，除虎杖苷组外，其余各组均可以显著降低血清中MDA含量（p<0.05，与模型组比较）。

从试验的情况看，通过曲札茋苷、虎杖苷和曲札茋苷衍生物的组合得到的本发明所述药物组合物能够明显提高对大鼠脑缺血再灌注损伤的治疗作用。

实施例2：曲札茋苷组合物对缺氧缺糖引起的神经细胞损伤的保护作用

1实验材料

1.1受试样品

配制：称取适量曲札茋苷组合物后，加入0.01M PBS至所需体积，得高剂量受试品(1mg/ml)；后经0.2μm滤器过滤除菌，按一定比例以PBS进行相应稀释，分别得各剂量受试品。

1.2阳性对照品1

名称：尼莫地平

来源：Sigma

批号：SLBB1165V

性状：黄色粉末

配制：称取适量样品后加入DMSO至所需体积(3mg/ml)；后经0.2μm滤器过滤除菌，按一定比例以PBS进行相应稀释，得所需剂量受试品。

1.3阴性对照品

名称：无菌PBS

来源：武汉Boster生物技术有限公司

批号：S17B21

规格：500ml/瓶

性状：无色液体

1.4实验动物

品系：SD大鼠

来源：上海西普尔-必凯实验动物有限公司

性别：雌雄不限

年龄：出生后1天

动物合格证号：SCXK（沪）2008-0016

1.5实验仪器

全自动酶标仪，Labsystem Dragon公司生产；CO₂培养箱，德国Heaeus公司生产；真空泵(GL-802型)，海门市其林贝尔仪器制造有限公司生产；倒置相差显微镜，Metrio公司生产。

1.6其它试剂

双氧水：Sigma公司生产，批号：131K2176

DMEM培养液：Corning Cellgro生产，批号：R10013577

D-Hanks缓冲液：武汉Boster生物技术有限公司生产，批号：08H16B75

L-多聚赖氨酸：Sigma公司生产，批号：931R366V

L-Glutamax：Gibco公司生产，批号：1184649

Neurobasal培养液：Gibco公司生产，批号：1158267

B27添加剂：Gibco公司生产，批号：1153933

胎牛血清：上海普飞生物技术有限公司，批号：11A2375

青-链霉素：武汉Boster生物技术有限公司生产，批号：05E10A16

四氮唑蓝(MTT)：Sigma公司生产，批号：67R338V

2实验方法

皮层神经元培养

在超净台中，无菌条件下将出生后1天的SD乳鼠断头取脑，用弯镊将双侧皮层收集于冰冷Hanks液中。仔细去除脑膜、血管等组织，并用虹膜剪剪碎组织至1mm³大小，加入适量胰酶(0.125%)，37℃消化20min，弃胰酶，并加全培液(含10%血清的DMEM液)作用5min，以终止胰酶的作用。800rpm离心5min后弃上清并加入1ml种植培养液，经75μm滤膜过滤后，计数重悬，制成密度均一的单细胞悬液(1-2x10⁵个/ml)，接种于预先用多聚赖氨酸包被的96孔板中，每孔200μl，置于37℃，5%CO₂的恒温培养箱内培养，24h后换以维持培养液(96%Neurobasal+2%B27+1%GlutaMAX+1%青-链霉素)继续培养，后每隔3天换液一次。

双氧水处理

培养至第10天的神经元，分为正常对照组，模型组(双氧水处理)，给药组以及阳性对照组。神经元预先给药孵育1h，后加双氧水处理(终浓度0.5mM)，24h后做MTT分析。

所有数据用均值±标准差表示，统计学分析用方差分析进行，组间多重比较用student’s Newman-Keuls检验进行分析。

3实验结果

1号组合物和2号组合物对双氧水引起的神经元损伤模型的影响结果见表3。

表3.曲札茋苷组合物对双氧水引起的神经元损伤模型的影响

与正常组比较：^*P<0.05

与模型组比较：^##P<0.01

以上结果显示，给予0.5mM的双氧水可引起神经元一定程度的损伤，这种作用可为曲札茋苷组合物(50,100与200μM)以及阳性药尼莫地平所翻转，提示曲札茋苷组合物对脑缺血再灌注的治疗作用是通过抗氧化的途径实现的神经保护作用。

实施例3：曲札茋苷组合物的小鼠最大耐受量研究

1实验材料

1.1受试样品

配制：取注射用水约30ml，加温至80℃，加入10g羟丙基-β-环糊精，搅拌使溶解，再加入3g曲札茋苷1号组合物，搅拌使溶解，再加入0.45g氯化钠搅拌溶解，最后补加注射用水至制成量50ml，测半成品pH值（5.0-6.0）和含量合格后，精滤至澄明，待用。

1.2阴性对照

名称：羟丙基-β-环糊精

来源：昆明制药集团股份有限公司

配制：取注射用水约30ml，加温至80℃，加入10g羟丙基-β-环糊精，搅拌使溶解，再加入0.45g氯化钠搅拌溶解，最后补加注射用水至制成量50ml，测半成品pH值（5.0-6.0）和含量合格后，精滤至澄明，待用。

1.3实验动物

品系：ICR小鼠

体重：17-20g

性别：雌雄各半

来源：上海西普尔-必凯实验动物有限责任公司

许可证号：SCXK（沪）2008-0016

等级：清洁级

饲养：动物饲养于正压净化通风动物房内，室温24±1℃，湿度40～70％，人工照明模拟昼夜变化，自由进食与饮水。

2实验方法

健康ICR小鼠，适应性饲养3天后，按体重随机分为阴性对照组、KPC-XM18，每组20只，雌雄各半。实验当天，称重，动物静脉给予受试样品，给药体积为0.5ml/20g，给药后3h内连续观察，观察动物外观、行为、活动等，以后每天观察，直至14天。如有动物出现死亡，应记录死亡动物的标识，并及时解剖。实验过程中，第1、2、3、5、7、9、11、14天称重。

3实验结果

实验结果见图1及表4、5和6。

小鼠静脉给予受试样品1100mg/kg后，动物出现濒死症状，呼吸急促，活动减少，1h后小鼠呼吸及活动恢复正常。14天内动物活动及食欲均无明显变化，且无动物发生死亡，给药组动物体重增长与溶剂组相当。给药后第14天，动物颈椎脱臼死亡后，解剖未发现主要脏器异常。

从试验结果上看，本组合物是安全可靠的。

表4.单次静脉给予受试样品对雄性ICR小鼠体重的影响

^*p<0.05，^**p<0.01，与溶剂对照组比较

表5单次静脉给予受试样品对雌性ICR小鼠体重的影响

^*p<0.05，^**p<0.01，与溶剂对照组比较

表6受试样品静脉注射给药小鼠死亡分布

实施例4：本发明药物组合物注射液的制备

取曲札茋苷、虎杖苷和曲札茋苷衍生物按重量比为曲札茋苷90%～99%，虎杖苷0.5%～5%，曲札茋苷衍生物0.5%～5%进行配比，加适量注射用水溶解，超滤，灌装，灭菌，制成注射用注射剂。

实施例5：本发明药物组合物冻干粉针的制备

取曲札茋苷、虎杖苷和曲札茋苷衍生物按重量比为曲札茋苷90%～99%，虎杖苷0.5%～5%，曲札茋苷衍生物0.5%～5%进行配比，加适量注射用水溶解，过滤，灌装，冷冻干燥，制成注射用冻干粉针剂。

实施例6：本发明药物组合物片剂的制备

取曲札茋苷、虎杖苷和曲札茋苷衍生物按重量比为曲札茋苷90%～99%，虎杖苷0.5%～5%，曲札茋苷衍生物0.5%～5%进行配比，根据常规制剂方法制备成片剂。

实施例7：本发明药物组合物胶囊剂的制备

取曲札茋苷、虎杖苷和曲札茋苷衍生物按重量比为曲札茋苷90%～99%，虎杖苷0.5%～5%，曲札茋苷衍生物0.5%～5%进行配比，根据常规制剂方法制备成片胶囊剂。

实施例8：本发明药物组合物颗粒剂的制备

取曲札茋苷、虎杖苷和曲札茋苷衍生物按重量比为曲札茋苷90%～99%，虎杖苷0.5%～5%，曲札茋苷衍生物0.5%～5%进行配比，根据常规制剂方法制备成片颗粒剂。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种治疗脑血管疾病的药物组合物，其特征在于，包含结构为结构为式1所示的曲札茋苷、式2所示虎杖苷和结构为式3所示曲札茋苷衍生物，

2.根据权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，该组合物由曲札茋苷、虎杖苷以及曲札茋苷衍生物组成。

3.根据权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，该组合物中曲札茋苷含量为90%～99%，虎杖苷含量为0.5%～5.5%，曲札茋苷衍生物含量为0.5%～5%。

4.根据权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，该组合物中曲札茋苷含量为90%～98%，虎杖苷含量为0.5%～5%，曲札茋苷衍生物含量为1.5%～4.5%。

5.包含权利要求1-4任一项所述药物组合物的药物制剂。

6.根据权利要求5所述的药物制剂，其特征在于，其为口服制剂或注射制剂。

7.权利要求1-4任一项所述药物组合物在制备治疗脑血管疾病的药物中的用途。

8.根据权利要求7所述的用途，其特征在于，所述脑血管疾病为缺血性脑血管疾病。

9.根据权利要求7所述的用途，其特征在于，所述药物为口服制剂。

10.根据权利要求7所述的用途，其特征在于，所述药物为注射制剂。