CN109966317A - 神经保护组合物、其制备方法及其医学用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种源自间充质干细胞的神经保护组合物，特别是一种源自牙髓间充质干细胞原代培养物的神经保护组合物。本发明还涉及一种制备所述神经保护组合物的方法，以及所述神经保护组合物在治疗与神经元损伤相关的神经系统疾病中的医学用途，所述疾病包括蛛网膜下腔出血和帕金森氏病。

Description

神经保护组合物、其制备方法及其医学用途
技术领域
本发明涉及一种源自间充质干细胞的神经保护组合物，特别是一种源自牙髓间充质干细胞原代培养物的神经保护组合物，其制备方法，及其在治疗与神经元损伤相关的神经系统疾病中的医学用途，所述疾病包括蛛网膜下腔出血和帕金森氏病。
背景技术
蛛网膜下腔出血(SAH)是指血液外渗至蛛网膜与脑周围的软脑脊膜之间的蛛网膜下腔中。它出现在多种临床环境中，最常见的是头部创伤；非创伤性(或自发性)蛛网膜下腔出血通常出现在破裂的脑动脉瘤或动静脉畸形的情况中。自发性病例的危险因素包括高血压、吸烟、家族史、酗酒和可卡因使用。
动脉瘤型SAH带来显著的患病率和死亡率。患有动脉瘤型SAH的人有近半数在30天内死亡，三分之一的存活者遭受长期的身体、神经认知、精神和/或心理上的症状，例如偏瘫、情绪障碍、经常性头痛、认知和记忆缺陷。SAH患者还可能在年老时罹患阿尔茨海默病或失智症的可能性增加。除了原始的出血之外，多种因素，例如缺氧、低血压、脑水肿、再出血、迟发性缺血性神经功能缺损(DIND)和/或由夹闭或卷绕期间的脑动脉操作引起的缺血，都会导致继发性脑损伤。如果没有及时给予正确的医学治疗，第一次出血后存活的患者可能在3周内再次出血，其死亡率高达80％。
一旦红细胞进入蛛网膜下区域并发生红细胞裂解，就会诱发化学性脑膜炎，其进而会引起一系列复杂的病理生理过程，包括颅内压升高、脑血流量和脑灌注压降低、血脑屏障(BBB)损伤、脑水肿、急性脑血管痉挛、微血管功能障碍和神经元凋亡机制。上述过程可能继发性地引起钙超载、自由基累积、线粒体功能障碍和免疫炎症反应。虽然脑血管痉挛被认为是在SAH存活者中最常见的失能和死亡原因，但其他影响(例如皮层传播抑制引起的早期脑损伤、血脑屏障破坏、微循环功能受损、神经炎症和凋亡性神经元细胞死亡)也可能促成SAH诱导的病变。本领域已知，SAH的发病与其他神经障碍和神经损伤有一些共同的病理学特征。
尽管SAH及其相关并发症具有高严重性，但目前治疗SAH的措施相对而言是低效的。因此，需要一种为神经组织提供保护的治疗性组合物。
发明内容
干细胞对神经障碍的旁分泌效应已被注意了几十年(参见例如Torrente D.等，Hum Exp Toxicol.2014,33(7):673-84；以及下述综述性文献：Martínez-Garza D.M.等，Medicina Universitaria 2016,18(72):169-180；Im W.S.and Kim M.H.,J.Mov.Disord.2014,7(1):1-6；Turgeman G.,Neural.Regen.Res.2015May,10(5):698–699；Hasan A.et al.,Front.Neurol.8:28,2017,DOI:10.3389/fneur.2017.00028)。已经有人提出假说：干细胞可以分泌多种生长因子、细胞因子和趋化因子，这些因子可以增强细胞存活、增加神经生成、减少炎症和线粒体功能，并且所有这些效应都导致神经保护和修复。因此，将干细胞分泌蛋白组(secretome)而非整个干细胞引入受损组织被认为是克服基于细胞移植局限性的有前景的安全治疗措施。虽然已鉴定出由干细胞释放的一些旁分泌分子，包括Scurfin、脑源性神经营养因子(BDNF)和CC趋化因子配体2(CCL2)，但所鉴定的全部蛋白的分子量均都大于10kDa。令人惊讶和出乎意料的是，本发明人发现源自于间充质干细胞(MSC)的原代培养物的条件培养基(例如源自牙髓间充质干细胞(DPMSC)的原代培养物的条件培养基)的≤5kDa级分表现出优异的神经保护活性。该培养基级分显然可用于治疗神经障碍，例如SAH和帕金森氏病。
因此，在第一方面，本文提供了一种神经保护组合物，其能够通过包括以下步骤的方法获得：
(i)在无血清基础培养基中培养间充质干细胞至少3小时以获得细胞培养物；和
(ii)处理步骤(i)中获得的细胞培养物以得到分子量不超过约5kDa的水性级分作为所述神经保护组合物。
在第二方面，本文提供了一种神经保护组合物的制备方法，其包括以下步骤：
(i)在无血清基础培养基中培养间充质干细胞至少3小时以获得细胞培养物；和
(ii)处理步骤(i)中获得的细胞培养物以得到分子量不超过约5kDa的水性级分作为所述神经保护组合物。
在第三方面，本文提供了一种神经保护组合物在制造一供用于治疗个体体内与神经元损伤相关的神经障碍的医药品上的用途，其中，所述神经保护组合物能够通过上述方法获得。
在第四方面，本文提供了一种治疗个体的与神经元损伤相关的神经障碍的方法，所述方法包括向所述个体施用有效量的神经保护组合物以抑制神经元损伤；其中，所述神经保护组合物能够通过上述方法获得。
在第五方面，本文提供了一种神经保护组合物在制造一供用于保护患有或有风险患有神经功能丧失的个体免受神经元损伤的医药品上的用途，其中，所述神经保护组合物能够通过上述方法获得。
在第六方面，本文提供了一种抵御神经元损伤的保护方法，所述方法包括向患有或有风险患有神经功能丧失的个体施用有效量的神经保护组合物，从而保护所述个体免受神经元损伤；其中，所述神经保护组合物能够通过上述方法获得。
在第七方面，本文提供了一种神经保护组合物在制造一供用于抑制有需要的个体的脑神经炎症的医药品上的用途，其中所述神经保护组合物能够通过上述方法获得。
在第八方面，本文提供了一种抑制有需要的个体的脑神经炎症的方法，所述方法包括施用有效量的神经保护组合物，从而抑制所述个体的脑神经炎症；其中，所述神经保护组合物能够通过上述方法获得。
在优选的实施方案中，处理步骤(ii)包括通过分子量截留值为5kDa的膜来超滤步骤(i)中获得的细胞培养物，从而收集通过该膜的滤液作为所述神经保护组合物。
在优选的实施方案中，间充质干细胞是牙髓间充质干细胞。
在优选的实施方案中，与神经元损伤相关的神经障碍选自于由肌萎缩侧索硬化症、阿尔茨海默病、帕金森氏病、亨廷顿病、肌营养不良症、多发性硬化、缺血性中风、出血性中风、短暂性脑缺血发作(TIA)和创伤性脑损伤(TBI)组成的群组。在更优选的实施方案中，与神经元损伤相关的神经障碍选自于由阿尔茨海默病、帕金森氏病、亨廷顿病、缺血性中风、原发性SAH、继发性SAH、创伤性SAH和脑内出血(ICH)、短暂性脑缺血发作(TIA)和创伤性脑损伤(TBI)组成的群组。在甚至更优选的实施方案中，与神经元损伤相关的神经障碍选自于由帕金森氏病、原发性SAH和继发性SAH组成的群组。
附图说明
参考下面对优选实施方案的描述并结合附图，本发明的上述和其他目的、特征和效果将变得显而易见，在附图中：
图1A-1C是显示对照组(图1A)、SAH组(图1B)和治疗组(图1C)中大鼠脑表面上的微循环脉管系统的图像，其中大鼠脑中的小动脉和小静脉分别用字母A和V标记；
图2A和2B是显示出SAH大鼠模型中脑表面处的局部血流和脑组织氧压的直方图；
图2C是显示出SAH大鼠模型的脑组织中的Iba1阳性小神经胶质细胞的组织学图像；
图3是显示出本发明的神经保护组合物对神经元细胞活力的增强作用的直方图；
图4A和4B是显示出D-gal诱导的大鼠肝性脑病模型中脑表面处的局部血流和脑组织氧压的直方图；
图4C是显示出D-gal诱导的大鼠肝性脑病模型的脑组织中TUNEL阳性神经胶质细胞的组织学图像；
图5A和5B是用本发明的神经保护组合物处理的斑马鱼的荧光显微图像；和
图6是显示出本文公开的培养基级分对鱼藤酮损伤大鼠模型中的旋转棒活动量的影响的直方图，其中在用鱼藤酮处理之前(预测试)、用鱼藤酮处理之后(损伤)、和施用培养基级分之后对各组中的大鼠进行旋转棒试验。
具体实施方式
除非另有说明，本说明书和所附权利要求中使用的以下术语具有以下定义。应注意的是，在本说明书和权利要求中使用的不定冠词“一个”或“一种”旨在表示一个或多于一个，例如“至少一个”、“至少两个”或“至少三个”，且并不仅仅指单一的一个。另外，权利要求中使用的术语“包括”、“包含”和“具有”是开放式用语，并且不排除未提及的要素。除非另有说明，术语“或”通常涵盖“和/或”。在整个说明书和所附权利要求中使用的术语“约”用于描述和表示不会实质上影响本发明实质的微小变化。
本发明基于以下发现：源自间充质干细胞(MSC)的条件培养基的≤5kDa水性级分，特别是源自牙髓间充质干细胞(DPMSC)的≤5kDa水性级分，具有神经保护活性，其增强神经元存活率、改善脑微循环、减少神经炎症并减轻血管收缩，表明该培养基级分在治疗与神经元损伤相关的神经障碍中具有治疗效果。
术语“间充质干细胞”或缩写“MSC”在本文中用于指源自成体基质组织的多能干细胞，具有广泛的自我更新性质和分化为间充质谱系细胞的能力；所述成体基质组织包括但不限于骨髓、脂肪组织、肌肉组织、牙髓、脐带血、羊水、骨骼肌、滑膜和华通氏胶。在优选实施方案中，本文使用的MSC源自牙髓组织。本发明中使用的MSC可以从人类、大鼠、小鼠、绵羊、牛、猪、狗、猫、马和非人类灵长类动物(例如猴、大猩猩和黑猩猩)中收集。MSC的优势在于来源丰富、易于分离、无痛采集和法律和伦理接受度高。这些特征使得MSC受到巨大的治疗方面的关注，因为它们是具有治疗多种急性和退化性疾病的潜力的细胞群。
在本发明的上下文中，MSC可以通过本领域已知的方法从各种来源收集。例如，在收集骨髓来源的MSC的情况下，可以在适当的麻醉下用针从人类或非人类动物个体的髂嵴获得骨髓，然后进行密度梯度离心并选择贴壁细胞。或者，当需要从牙髓中收集MSC时，可以使用活检装置从人类或非人类动物个体的牙龈中拣取组织样本，然后进行胶原酶消化。在优选实施方案中，MSC的收集还可以包括利用表面抗原标志物的差异从细胞培养物中分离出MSC。分离方法的非限制性实例包括磁性细胞分选(MACS)、荧光激活细胞分选(FACS)和流式细胞术分选(FCS)。
用于培养MSC的细胞培养基可以是为细胞提供充分的营养的任何标准细胞培养基。合适的培养基包括但不限于：Dulbecco氏改良的Eagle氏培养基(DMEM)，α最低限度必需培养基(α-MEM)，Iscove氏改良的Dulbecco氏培养基(IMDM)，营养混合物F-12(Ham's F12)，RPMI 1640，McCoy氏5A培养基，MesenPRO RSTM培养基及其组合，以及对本领域技术人员而言显而易见的其他培养基制剂。这些培养基可以容易地制备或从商业来源获得。细胞培养基及方法的详细内容可参见Methods For Preparation of Media,Supplements andSubstrate For Serum-Free Animal Cell Culture Alan R.Liss,纽约(1984)和Cell&Tissue Culture:Laboratory Procedures,John Wiley&Sons Ltd.,Chichester,英国英格兰1996。细胞培养基中可以补充组分，例如维生素、蛋白质和糖、生长因子(例如FGF和EGF)、抗生素(例如青霉素、链霉素和四环素)、杀真菌剂、激素、抗氧化剂等。如果需要，可以加入血液组分，例如胎牛血清、人血浆和富含血小板的血浆(PRP)，以支持所培养的细胞的生长。
通常，MSC在培养几代后会表现出细胞生长逐渐减少并最终衰老，从而导致分泌蛋白组内容物的潜在下降。因此，为了获得最大的旁分泌效应，原代培养的MSC用于产生在第1代和第10代之间、优选在第2代和第6代之间的条件培养基。根据本发明，通过标准方法使用无菌处理和操作来培养MSC，并且在无血清基础培养基中条件化MSC。本文所用的术语“基础培养基”可以指含有支持无特定营养需求的哺乳动物细胞的生长通常所需的无机盐、氨基酸和维生素的任何液体培养基。在一些优选实施方案中，无血清基础培养基不含生长因子。基础培养基的实例包括但不限于基础培养基Eagles(BME)、最低限度必需培养基(MEM)、Dulbecco氏改良的Eagle氏培养基(DMEM)、营养混合物F-10(HAM's F10)和营养混合物F-12(HAM's F12)。无血清基础培养基可以补充有血清替代培养基，例如可从Invitrogen-Gibco(Grand Island,NY,美国)商购获得的血清替代培养基。
在一个实施方案中，在培养物中达到10％-90％汇合度、优选在培养物中为30％-80％汇合度、例如在培养物中为50％-80％汇合度的MSC可通过在无血清基础培养基中培养细胞来条件化。当无血清基础培养基中的分泌蛋白组(例如细胞外蛋白)已达到所需水平时，收获细胞培养物。在优选实施方案中，在培育了3小时至120小时之间的任何时间或甚至更久时，优选在无血清基础培养基中开始培养后的第3、6、12、18、24、30、36、42、48、60、72、84、96、108、120小时，例如在开始培养后的第72小时和第96小时以及其间的所有时刻，收获细胞培养物。在另一个优选实施方案中，一旦细胞超过50％汇合度、优选70％-100％汇合度、例如80％-90％汇合度，即可以收获MSC培养物。
根据本发明，进一步处理收获的细胞培养物以得到分子量不超过约5kDa的水性级分。这种处理可以通过能够基于分子量来分离分子的任何常规方法来进行，其实例可以包括凝胶过滤、密度梯度纯化、膜过滤、超滤、离心、超速离心和本领域已知的其他类似方法。在一个实施方案中，可以首先对细胞培养物进行膜过滤、离心或其组合，以除去大部分细胞碎片和其他不溶性物质，从而以获得条件培养基，然后通过分子量截留值为5kDa的滤膜对该条件培养基进行超滤。在另一个实施方案中，通过分子量截留值为5kDa的膜直接对细胞培养物进行超滤，其实例包括但不限于分子量截留值为5kDa的切向流过滤(TFF)。如此获得的≤5kDa级分表现出下文所述的所需的神经保护活性，可以对其进行额外的纯化工序以除去不需要的物质，例如蛋白酶和有毒化学物质。纯化方法包括凝胶色谱、离子交换色谱、亲和色谱、HPLC纯化等。
已显示MSC在许多涉及神经元死亡的病症(例如创伤性脑损伤(TBI)、SAH、阿尔茨海默病和亨廷顿病)中具有强效治疗作用(Im W.S.and Kim M.H.同上；Ghonim H.T.等，J.V.I.N.,2016January,8(5):30–37；Martínez-Garza D.M.等，同上；Turgeman G.,同上；Hasan A.等，同上)。如本文所公开的，本发明从MSC培养物获得的≤5kDa培养基级分具有神经保护作用并且在体外增强神经元的存活(如下文实施例5所示)。从实施例4所示的SAH大鼠模型和实施例6所示的D-gal诱导的大鼠肝性脑病模型的结果测量可以看到，鞘内递送所述≤5kDa培养基级分改善了脑组织氧合作用、使脑血管痉挛和血管收缩降低、以及减少体内神经炎症，所有这些都是导致或促成脑神经元损伤的关键因素，并且发现得到了改善。在本文中，在实施例7-9中进一步证明，≤5kDa培养基级分在斑马鱼和大鼠模型中增强了运动性并且还增加了神经元活性。总之，本文展示的结果证明≤5kDa培养基级分能够充当神经保护组合物。
本文所用的术语“神经保护”是指药物组合物能够维持神经元细胞的存活和活性或者维持或甚至恢复其神经元功能、或者缓解或减轻可能导致神经元损伤的一种或多种因素(例如神经炎症、血管痉挛、血管收缩、微血管功能障碍和氧化应激)，甚至在病理或有害条件下也是如此。术语“神经保护”可以涵盖预防个体的神经元细胞受损和/或在个体中出现神经元损伤后治疗神经元损伤。在这方面，术语“预防”包括降低神经元损伤的严重性/强度或减少神经元损伤的引发。术语“治疗”包括在神经元损伤出现后减轻神经元损伤、改善由神经元损伤引起或导致神经元损伤的一种或多种症状、或减缓神经元损伤的进程。在一些实施方案中，术语“治疗”可以指：与具有相同病症但未接受治疗或接受不同的治疗的对照个体中的神经元死亡率相比，使患有与神经元死亡相关的神经障碍的个体中的神经元死亡减少。然而，术语“神经保护”不应被理解为针对神经元损伤始终有100％的保护。本文所用的术语“神经元损伤”可以指由于疾病或受伤而对任何细胞类型(例如神经元、星形胶质细胞、神经胶质细胞)产生的损伤，其进而可以导致细胞死亡或细胞功能丧失。神经元损伤的程度可以用本领域已知的任何神经元功能可视化方法来确定，例如脑电描记术、磁共振成像、计算机断层扫描、对比血管造影术和多普勒超声检查。
在一方面，本发明涵盖了本文公开的神经保护组合物用于治疗个体的与神经元损伤相关的神经障碍的医学用途，以及治疗个体的与神经元损伤相关的神经障碍的治疗方法，该方法包括向个体施用有效量的所述神经保护组合物。本文所用的术语“与神经元损伤相关的神经障碍”可以指神经系统疾病，其特征在于神经元损伤或具有涉及神经元损伤的病因。通常，如果个体患有本领域已知的与神经元损伤相关的病症，则本文公开的医学用途和治疗方法不要求在治疗前在个体中检测到细胞损伤。与神经元损伤相关的神经障碍的非限制性实例包括：肌萎缩侧索硬化症，阿尔茨海默病，帕金森氏病，亨廷顿病，肌营养不良症，多发性硬化，缺血性中风，出血性中风(例如原发性蛛网膜下腔出血(原发性SAH)、继发性SAH、创伤性SAH和脑出血(ICH))，短暂性脑缺血发作(TIA)，和创伤性脑损伤(TBI)。与神经元损伤相关的神经障碍可由医生、兽医或其他临床医师诊断。
下文实施例中所示的数据表明，本文公开的神经保护组合物在脑组织中特别有效地维持脑神经细胞的存活和活性。在一个优选实施方案中，神经障碍与神经炎症引起的神经元损伤有关。已知脑出血(例如SAH)会导致神经炎症反应级联，其中，晚期糖基化终产物受体(RAGE)相关的细胞内信号传导在丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)和核因子κB(NF-κB)的激活中起重要作用。已报道，外源施用重组sRAGE作为诱骗剂以与膜结合的RAGE竞争与配体的结合，改善了小鼠I/R损伤的结果并进一步保护了神经元免于神经元死亡(Wang KC等，J.Cereb.Blood Flow Metab.2017Feb 20；37(2):435-443)，表明神经炎症的减弱或缓解可能是治疗脑出血的有效措施。此外，许多神经系统退行性病症已被证实与神经炎症相关或由其引起，例如阿尔茨海默病、帕金森氏病和亨廷顿病(McManus R.M.and Heneka M.T.,Alzheimer's Research&Therapy 2017,9:14,DOI 10.1186/s13195-017-0241-2；GagneJ.J.and Power M.C.,Neurology 2010Mar 23,74(12):995-1002；Im W.S.and Kim M.H.，同上)。在优选实施方案中，与神经元损伤相关的神经障碍选自于由阿尔茨海默病、帕金森氏病、亨廷顿病、缺血性中风、原发性SAH、继发性SAH、创伤性SAH和脑内出血(ICH)、短暂性脑缺血发作(TIA)和创伤性脑损伤(TBI)组成的群组。在更优选的实施方案中，与神经元损伤相关的神经障碍选自于由帕金森氏病、原发性SAH和继发性SAH组成的群组。
本文所用的术语“个体”意在涵盖人类或非人类脊椎动物，例如非人类哺乳动物。非人类哺乳动物包括家畜、伴侣动物、实验动物和非人类灵长类动物。非人类个体还包括但不限于马、牛、猪、山羊、狗、猫、小鼠、大鼠、豚鼠、沙鼠、仓鼠、水貂、兔和鱼。应理解的是，优选的个体是人，尤其是患有或有风险患有与神经元损伤相关的神经障碍(例如帕金森氏病、原发性SAH和继发性SAH)的人类患者。
为了研究的目的，术语“个体”可以指本文定义的生物学样品，其包括但不限于细胞、组织或器官。因此，本发明意在应用于活体内和活体外。
根据本发明，术语“施用”包括通过任何合适的途径将处在合适的药物制剂中的所述神经保护组合物分配、递送或施加给个体，以将所述神经保护组合物或其代谢物组(metabolome)递送至个体中的所需位置，从而使所述神经保护组合物或其代谢物组与靶细胞或组织接触。在一个实施方案中，神经保护组合物在损伤事件或神经障碍发作之前、期间和/或之后施用给个体。在一个实施方案中，可以将一种或多种治疗剂与神经保护组合物一起施用给个体。神经保护组合物可以在施用所述一种或多种治疗剂之前(例如0.5小时、1小时、2小时、4小时、6小时、12小时、18小时、24小时、36小时、2天、3天、4天、5天、6天、7天或更长时间)、同时或之后(例如0.5小时、1小时、2小时、4小时、6小时、12小时、18小时、24小时、36小时、2天、3天、4天、5天、6天、7天或更长时间)施用。神经保护组合物和所述治疗剂可以通过不同的方案(例如不同的计划)、不同的施用途径或不同的剂量来施用。
本文公开的神经保护组合物可以通过任何合适的途径施用给个体，例如局部、肠内或胃肠外途径，例如口服、静脉内、动脉内、皮下、肌肉内、腹膜内、透皮、经粘膜(例如鼻、舌下、阴道、颊、直肠)、鞘内、颅内或脑内途径。施用可以像注射那样快速进行，也可以像缓慢输注或缓释制剂施用那样持续一段时间进行。
在一个优选实施方案中，神经保护组合物为鼻内施用，并以鼻内施用制剂的形式制备。用于鼻内施用的制剂是本领域已知的，并且可以是鼻滴剂、鼻喷雾剂或气溶胶制剂的形式。气溶胶制剂可以采用冻干粉末、悬浮液或溶液的形式。在另一个优选实施方案中，神经保护组合物通过口腔和咽喉粘膜施用，并以经粘膜施用制剂的形式制备。
在另一个优选实施方案中，本文公开的神经保护组合物被制备成注射剂，其为液体溶液或悬浮液，其优选在带有药学上可接受的载剂时与受体的血液等渗。作为替代，可以制备适于在注射前溶解或悬浮在液体中的固体形式。可注射制剂还可以包含一种或多种药学上可接受的载剂。合适的赋形剂可包括例如水、生理食盐水、右旋糖、甘油、乙醇、润湿剂、乳化剂和pH缓冲剂。在一些实施方案中，组合物是冻干形式，在这种情况下它可以包含稳定剂，例如BSA。在一些实施方案中，可能需要用防腐剂(例如硫柳汞或叠氮化钠)配制组合物，以利于长期储存。载剂还可以含有其它药学上可接受的赋形剂，用于改变或维持制剂的pH值、渗量、粘度、透明度、颜色、无菌性、稳定性、溶解速率或气味。类似地，载剂可以含有其他药学上可接受的赋形剂，用于改变或维持穿过血脑屏障的释放、吸收或渗透。
神经保护组合物以治疗有效量施用给个体，以引发研究人员、兽医、医生或其他临床医师所寻求的在细胞、组织、系统、动物或人类中的生物学或药物响应，并优选地稳定、改善或缓解个体中疾病状况的一种或多种症状，例如稳定、改善或缓解神经炎症、血管痉挛、血管收缩、偏瘫、反射亢进、肌肉虚弱、颤搐、言语问题、呼吸问题、吞咽困难、记忆丧失、意识错乱、定向障碍、书写困难、抑郁、焦虑、回避社交、情绪波动、攻击性、睡眠习惯改变、震颤、运动迟缓、肌肉僵硬、平衡受损、面部不自主运动、四肢麻木或虚弱、部分或完全丧失视力、疲劳、眩晕、身体或面部一侧瘫痪、以及头痛。因此，术语“有效量”是指当向个体施用有效量的组合物时产生观察到的上述任何一个症状减轻的药效的神经保护组合物的量。尽管有效量通常通过将它们与不存在本文公开的神经保护组合物时观察到的效果(即，对照)相比较的效果来确定，但实际剂量根据所选择的特定施用途径来计算。可以根据所选择的特定施用途径来计算实际剂量。本领域普通技术人员会常规地进一步细化确定适当的施用剂量所需的计算。因此，当施用给人类个体时，优选每天、每周或一周两次以0.01mg/kg体重/天至100mg/kg体重/天、更优选以0.1mg/kg/天至10mg/kg/天的量施用所述神经保护组合物。可以根据所用的剂量制剂和施用途径的药代动力学参数来重复进行剂量施用。
如本文所公开的，本发明还涵盖了所述神经保护组合物在抑制有需要的个体的脑神经炎症中的医学用途，以及抑制有需要的个体的脑神经炎症的治疗方法。本文使用的术语“神经炎症”可以指出现在神经组织中的炎症反应，其可以涉及小胶质细胞激活、星形胶质细胞增生和许多炎症介质的释放。在本发明的上下文中使用的术语“抑制”是指降低特定活性的量、质或效果，并且是指例如降低出现在脑组织中的炎症反应的严重性，作为向个体施用有效量的神经保护组合物的结果，例如实施例4和6中展示的结果。
给出以下实施例仅出于说明目的，并不意图限制本发明的范围。应当注意的是，在下述实施例中，通过分级来呈现动物模型的数据。通过Logistic回归将临床结果与分级关联起来。细胞培养的数据将以平均值±SE给出。获得了针对不同浓度CSF的累积浓度-响应曲线。通过双因素ANOVA进行统计学分析。统计学显著性定义为p<0.05。
实施例1：分离和培养牙髓干细胞(DPSC)
从3周龄雄性Wistar大鼠完整地采集上牙，而后使用注射器针头提取组织，并转移到25cm2烧瓶(Corning,Inc.,美国纽约州)中。将牙髓用磷酸盐缓冲盐水洗涤两次，并用II型胶原酶(50-100U/ml)处理1小时。随后将组织以200rpm离心4分钟以获得细胞团块，随后用磷酸盐缓冲盐水洗涤细胞团块两次。在补充有10％FBS(Grand Island,美国纽约州)的Dulbecco氏改良的Eagle培养基(DMEM)营养混合物F12(DMEM/F12；LifeTechnologies,Karlsruhe,德国)中培养细胞数天，直至细胞数达到超过1×106个。用胰蛋白酶处理细胞以使其脱落，并用磷酸盐缓冲盐水洗涤两次，然后重悬于0.5ml磷酸盐缓冲盐水中。通过在磁活化细胞分离器中与抗成纤维细胞抗体偶联的磁珠一起在4℃下培育15分钟，耗尽细胞悬浮液的成纤维细胞。将来自细胞分离器的洗脱物以200rpm离心4分钟，以获得间充质干细胞(MSC)。当MSC达到汇合时，用胰蛋白酶(Sigma Chemical Co.,St.Louis,MO,美国)使MSC脱离，并在75cm2烧瓶(Corning,Inc.美国纽约州)中以2×103个细胞/cm2的密度进行传代培养，然后在在150cm2烧瓶(Corning,Inc.美国纽约州)中以5×104DPSC的密度进行第3代传代培养。
实施例2：制备具有生物活性的培养基级分
条件培养基如下产生：向150cm2细胞培养瓶(Corning,Inc.美国纽约州)中的80％汇合度的传代2-5代的MSC按20mL/瓶添加无血清DMEM/F12(Life Technologies,Karlsruhe,德国)，然后培育72小时，所述DMEM/F12中补充有10ml Hank平衡盐溶液(HBSS；Life Technologies,Carlsbad,美国加利福尼亚州)和300μl青霉素-链霉素(1％)。为进行下文所述的体外和体内实验，使用配备有5kDa截留膜(Millipore Co.,Billerica,美国马萨诸塞州)的切向流过滤(TFF)系统(Millipore Co.,St.Charles,美国密苏里州)按照制造商的说明书进一步浓缩条件培养基，由此得到标称分子量等于和小于5kDa的培养基级分。
实施例3：大鼠SAH模型
在本实施例中使用了雄性Wistar大鼠(250至300g)。所有外科手术程序均按照美国国立卫生研究所实验动物护理和使用指南进行，并且动物实验获得了当地动物护理和使用委员会的批准。麻醉剂为2.5％异氟烷以及70％一氧化二氮和27.5％氧气。通过气管造口管给药以确保深度镇静，这通过后肢和前肢疼痛反射的缺失以及角膜反射的缺失来确认。在整个手术过程中保持正常的、不费力的呼吸。将动物置于热毯上，用直肠探针监测温度，并将体温保持在37℃。监测血压并使其维持在100-120mmHg。
将动物随机分成三组，即：SAH组，其中，在将动物保持在头部向下20度的位置的同时，历时5分钟将0.3ml新鲜自体血液注射至小脑池中，从而在大鼠中诱导SAH；对照组，对照组接受了给予生理盐水而不是自体血液的假手术；和治疗组，其中在SAH诱导前1小时，将实施例2中制备的培养基级分鞘内施用给大鼠。
实施例4：SAH后大鼠大脑膜的微脉管系统
在SAH诱导后24小时，检查大鼠模型的脑表面上的微循环脉管系统。在大鼠额缝后进行5×5mm的开颅术。用微型剪刀打开硬脑膜。使用具有高分辨率(752×582像素)单色电荷耦合器件(CCD)摄像机的CAM1激光多普勒毛细管风速计(KK Technology,英国)来使微循环脉管系统可视化，并测量皮质血管中的血流速度。将解剖显微镜附接到重支持物上以允许三维适应而不接触脑表面。视野为684×437μm，放大图像以提供约0.91μm/像素的整体放大率。结果示于图1A-1C中。如图1A和1B所示，其中大鼠脑中的小动脉和小静脉分别用字母A和V标记，在SAH组中观察到次级小动脉(由箭头指示)和末端小动脉(由三角头指示)的弥漫性血管收缩，这与对照组相反。然而，在治疗组中血管收缩减轻，如图1C所示。
还测量了微循环参数，包括血流量和氧分压。使用激光检测器(OxyLite 2000E和OxyFlow 2000E系统,Oxford Optronic Ltd.,英国英格兰)来确定大鼠脑中的血流量和氧分压。如图2A和图2B所示，在距离脑表面<4mm的深度处，与对照组相比，SAH组中的脑表面处的局部血流和脑组织氧压显著更低，而在治疗组中，观察到了局部血流和脑组织氧压的剂量依赖性增加。
在SAH诱导后第24小时，还通过小脑延髓池从SAH组收集了脑脊髓液(CSF)。
在SAH诱导后第24小时牺牲动物，并将它们的脑在含4％甲醛的PBS(由多聚甲醛粉末新鲜制备)中于4℃固定过夜，然后转移至4℃的连续的20％蔗糖溶液和30％蔗糖溶液(w/v)中，直至脑沉到溶液底部。在Tissue-包埋中心(Sakura,Torrance,美国加利福尼亚州)中将脑包埋，而后在冠状解剖平面中进行切片(使用低温恒温器制作10μm的切片)。先将切片暴露于含有0.1％Triton X-100(Amresco,Santa Cruz,美国加利福尼亚州)和10％正常山羊血清(Sigma Chemical Co.,St.Louis,美国密苏里州)的PBS至少30分钟，以阻断非特异性抗体结合，然后与抗Iba1抗体培育。离子化钙结合接头分子1(Iba1)是在小神经胶质细胞中特异性表达的钙结合蛋白，在神经炎症、神经损伤和中枢神经系统缺血后，其在小神经胶质细胞中的表达上调。图2C显示，与SAH组相比，治疗组中Iba1阳性小神经胶质细胞的数量显著下降，表明治疗组中的炎症较少。
本实施例中公开的所有数据都表明，鞘内注射实施例2中制备的培养基级分改善了脑组织氧合作用并减少了脑血管痉挛和炎症，因此在动物模型中提供了神经元保护。
实施例5：神经元细胞活力测定
已显示，来自患者和大鼠的SAH后脑脊髓液诱导神经元细胞死亡(Wang K.C.等，同上)。进行本实施例是为了确定在实施例4的治疗组中观察到的组织损伤减少是否归因于实施例2中制备的培养基级分对皮质神经元的直接有益效应。
从胎龄15天(E15)的大鼠胚胎建立了大脑皮质的解离细胞富神经元培养物。将细胞铺板在聚乙烯亚胺基底上的60mm直径塑料皿或35mm玻璃底皿中，并置于0.8ml含有Earle盐且补充有10％热灭活FBS(Grand Island,美国纽约州)、1mM L-谷氨酰胺、1mM丙酮酸盐、20mM KCl、26mM碳酸氢钠的最小限度必需培养基(pH 7.2)中。在细胞贴壁后，将培养基更换为含有B27补充物(Grand Island,美国纽约州)的Neurobasal培养基。在7至9日龄的培养物中进行实验。培养物中约95％的细胞是神经元，其余细胞是星形胶质细胞。将培养的神经元与在实施例4中从SAH大鼠收集的0.25ml脑脊髓液(CSF)和5ml Locke缓冲液一起培育。将对照培养物在含有10mM葡萄糖的Locke缓冲液中培育。
用Alamar蓝染料评价细胞活力。对解离的细胞进行计数，并将其铺板于24孔板中并暴露于预定时间的处理。除去培养基并更换为每孔300μl的稀释在Locke溶液中的0.5％Alamar蓝，并在37℃、5％CO2培养箱中培育1-2小时。使用HTS 7000Plus Bio Assay Reader(540nm的激发波长和590nm的发射波长；购自Perkin-Elmer Inc.,Wellesley,美国马萨诸塞州)测量Alamar蓝反应产物的水平。将暴露于实验处理的培养物的值表示为未经处理的对照培养物的平均值的百分比。
如图3所示，从SAH组大鼠采集的脑脊髓液诱导了神经元死亡，而将实施例2中制备的培养基级分(2μg/ml和10μg/ml)外源施用给暴露于CSF的培养的神经元时，显示出显著下降的死亡趋势。该结果表明，实施例2中制备的培养基级分针对从SAH患者中回收的CSF内的某些细胞毒性分子显示出了保护作用。
实施例6：D-gal诱导的肝性脑病
将雄性Wistar大鼠(250至300g)随机分为3组，即：对照组，其中对大鼠腹腔内注射D-半乳糖胺(D-gal)(1000mg/kg)一次，以诱导急性肝衰竭；治疗组，其中在D-gal注射后3小时对大鼠鞘内注射实施例2中制备的培养基级分；和假试(Sham)组，其中大鼠既未用D-gal处理也未用实施例2中制备的培养基级分处理。
按照实施例4中所述的程序，在D-gal注射后第24小时，观察并测量大鼠大脑膜的微循环脉管系统。如图4A和4B所示，与假试组相比，对照组中脑表面处的局部血流和脑组织氧压显著降低，而在治疗组中则观察到局部血流和脑组织氧压的恢复。该结果表明，鞘内注射实施例2中制备的培养基级分逆转了由D-gal诱导的肝性脑病引起的大脑微循环病损。
在D-gal注射后第48小时牺牲动物，并将它们的脑在含4％甲醛的PBS(由多聚甲醛粉末新鲜制备)中于4℃固定过夜，然后转移至4℃的连续的20％蔗糖溶液和30％蔗糖溶液(w/v)中，直至脑沉到溶液底部。在Tissue-包埋中心(Sakura,Torrance,美国加利福尼亚州)中将脑包埋，而后在冠状解剖平面中进行切片(使用低温恒温器制作10μm的切片)。先将切片暴露于含有0.1％Triton X-100(Amresco,Santa Cruz,美国加利福尼亚州)和10％正常山羊血清(Sigma Chemical Co.,St.Louis,美国密苏里州)的PBS至少30分钟，以阻断非特异性抗体结合。根据制造商的说明书，使用TUNEL Assay(Calbiochem/EMD Chemicals,Gibbstown,美国新泽西州)评估神经胶质细胞的凋亡。图4C显示，与对照组相比，治疗组中的TUNEL阳性神经胶质细胞的数量显著下降，表明所注射的培养基级分在该动物模型中提供了神经元保护。
实施例7：神经元活性的增强
将30只野生型AB斑马鱼(鮐(Danio rerio))转移到6孔微孔板中。通过肌肉注射，用实施例2中制备的培养基级分处理斑马鱼(22、67和200ng/鱼)，注射体积为20nL/鱼。将培养基级分梯度稀释在充当载剂对照的生理盐水中。处理后，用自动视频跟踪系统监测来自每组的10只斑马鱼，以测量斑马鱼移动的总距离(S)。使用以下等式计算运动性降低：
运动性降低(％)＝(1-(S(样品)/S(载剂))×100％。
结果总结在下表1中。
表1.斑马鱼(n＝10)中的运动性降低
上表1中所示的数据表明，实施例2中制备的培养基级分的处理以剂量依赖性方式增强了斑马鱼的运动性并因此增强了斑马鱼的神经元活性。
在一个单独的实验中，将30只野生型AB斑马鱼幼体转移到6孔微孔板中。通过卵黄囊注射，用实施例2中制备的培养基级分处理斑马鱼幼体(44、133和400ng/鱼)，注射体积为40nL/鱼。将培养基级分稀释在充当载剂对照的生理盐水中。处理后，用吖啶橙对斑马鱼染色，在荧光显微镜下对来自每组的10只斑马鱼拍照，以量化斑马鱼皮肤荧光强度(S)。使用以下等式计算样品诱导的皮肤毒性：
皮肤毒性＝[S(样品)/S(载剂)–1]×100％。
结果示于图5A和5B中，并进一步列于下表2中。
表2.斑马鱼(n＝10)中的皮肤毒性
表2表明，实施例2中制备的培养基级分对斑马鱼皮肤无毒。图5A和5B显示，在用实施例2中制备的培养基级分处理的斑马鱼中，既未观察到异常的皮肤和肌肉泛型交替，也没有观察到异常的色素沉着。
实施例8：抗帕金森氏病功效测试
将30只野生型AB斑马鱼幼体转移到6孔微孔板中。用神经毒素6-羟基多巴胺(6-OHDA)处理斑马鱼以诱导帕金森氏病模型。将诺米芬辛(一种市售的去甲肾上腺素-多巴胺重摄取抑制剂)用作阳性对照药物，并通过以1.5μg/mL的终浓度进行浸泡来递送。以44、133和400ng/鱼测试实施例2中制备的培养基级分，其通过卵黄囊注射递送。诺米芬辛和培养基级分均与6-OHDA共处理。处理后，将鱼幼体从6孔板转移到96孔板中，每孔中一条鱼和200μL溶液，然后将板加载到斑马鱼特异性行为分析系统(Viewpoint,法国)中，并记录每只幼体的运动性30分钟，每组记录10只幼体。测量幼体的总游泳距离(D，单位mm)作为评估帕金森氏病治疗功效的终点。使用以下等式计算抗帕金森氏病功效：
功效＝{[D(样品)–D(模型)]/D(对照)–D(模型)]}×100％。
结果示于图5A和5B中，并进一步列于下表3中。
表3.斑马鱼模型(n＝10)中的抗帕金森氏病功效
与模型相比，*p<0.05,***p<0.001。
在6-OHDA诱导的帕金森氏病样斑马鱼幼体模型测定中，实施例2中制备的培养基级分在三个测试浓度下都显著挽救了帕金森氏病样运动障碍，表明该培养基级分表现出了对暴露于6-OHDA的斑马鱼胚胎的神经保护效应。
实施例9：帕金森氏病大鼠模型
将雄性Lewis大鼠(8周龄)随机分为4组。对照组的大鼠每天腹腔内注射二甲亚砜，而三个治疗组中的大鼠持续两周腹腔内注射溶于二甲亚砜中的鱼藤酮(2mg/kg/天)。使用配备有直径3.1cm的旋转棒的旋转棒装置(Ugo Basile model 7700,Veresi,意大利)，在鱼藤酮处理之前和之后评估各组中动物的运动协调性。在旋转棒测试中，首先使动物暴露于3天的预训练制程，以在第4天的实际评估前使它们在旋转棒上适应。图6中所示的动物从旋转棒上跌落的平均潜伏期表明，受鱼藤酮损伤的大鼠显示出了典型的帕金森氏病症状，因此与对照相比具有显著更低的表现。在鱼藤酮处理后，治疗组中的大鼠持续两周每天颅内注射0.6mg实施例2中制备的培养基级分，或持续两周每天静脉内注射30mg实施例2中制备的培养基级分，或持续两周每天静脉内注射100mg实施例2中制备的培养基级分。在各组中再次进行旋转棒测试，并记录动物从旋转棒上跌落的平均潜伏期。如图6所示，施用本文公开的培养基级分改善了大鼠模型中的鱼藤酮诱导的运动协调性病损。
尽管已经参考上述优选实施方案描述了本发明，但应该认识到，这些优选实施方案仅出于说明目的而给出，并不意图限制本发明的范围，并且在不脱离本发明的主旨和范围的情况下，可以进行对相关领域的技术人员而言显而易见的各种修改和改变。
本文提及的所有论文、出版物、文献、专利、专利申请、网页和其他印刷或电子文件，包括但不限于下面列出的参考文献，都通过援引将其整体并入。在出现冲突时，以包括定义在内的本说明书为准。

Claims (10)

1.一种制备神经保护组合物的方法，其特征在于所述方法包括以下步骤：
(i)在无血清基础培养基中培养间充质干细胞至少3小时以获得细胞培养物；和
(ii)处理步骤(i)中获得的细胞培养物以得到分子量不超过约5kDa的水性级分作为所述神经保护组合物。
2.如权利要求1所述的方法，其中，所述处理步骤(ii)包括通过分子量截留值为5kDa的膜来超滤步骤(i)中获得的细胞培养物，从而收集通过该膜的滤液。
3.如权利要求1所述的方法，其中，所述间充质干细胞是牙髓间充质干细胞。
4.一种能够用权利要求1至3中任一项所述的方法获得的神经保护组合物。
5.一种神经保护组合物在制造一供用于治疗个体体内与神经元损伤相关的神经障碍的医药品上的用途，其中，所述神经保护组合物能够用权利要求1至3中任一项所述的方法获得。
6.如权利要求5所述的用途，其中，所述与神经元损伤相关的神经障碍选自于由肌萎缩侧索硬化症、阿尔茨海默病、帕金森氏病、亨廷顿病、肌营养不良症、多发性硬化、缺血性中风、出血性中风、短暂性脑缺血发作(TIA)和创伤性脑损伤(TBI)组成的群组。
7.如权利要求6所述的用途，其中，所述与神经元损伤相关的神经障碍选自于由阿尔茨海默病、帕金森氏病、亨廷顿病、缺血性中风、原发性SAH、继发性SAH、创伤性SAH和脑内出血(ICH)、短暂性脑缺血发作(TIA)和创伤性脑损伤(TBI)组成的群组。
8.如权利要求7所述的用途，其中，所述与神经元损伤相关的神经障碍选自于由帕金森氏病、原发性SAH和继发性SAH组成的群组。
9.一种神经保护组合物在制造一供用于抑制有需要的个体的脑神经炎症的医药品上的用途，其中所述神经保护组合物能够用权利要求1至3中任一项所述的方法获得。
10.如权利要求5所述的用途，其中，所述个体选自于由人类和非人类脊椎动物组成的群组。
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