CN106714814A - 包含神经前体细胞或其分泌蛋白质组作为有效成分的治疗缺血性疾病或神经炎症性疾病的组合物 - Google Patents
包含神经前体细胞或其分泌蛋白质组作为有效成分的治疗缺血性疾病或神经炎症性疾病的组合物 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供治疗缺血性疾病或神经炎症性疾病的组合物。在本发明所利用的多聚唾液酸神经细胞粘附分子‑阳性神经前体细胞用于促进被注射的组织中的血管生成以及抑制炎症反应。可利用抗多聚唾液酸神经细胞粘附分子‑抗体简单地分离上述多聚唾液酸神经细胞粘附分子‑阳性神经前体细胞，并且相对于间充质干细胞，呈现更优秀的血管生成及验证抑制活性，从而可有用地用作针对因血管损伤而引起的缺血性疾病及因炎症而引起的神经损伤疾病的有效的治疗组合物。并且，本发明的神经前体细胞的分泌蛋白质组不仅减少缺血性损伤部位，还恢复神经功能，因而还可用作针对因缺血性疾病和炎症而引起的神经损伤疾病等的退行性神经系统疾病的治疗剂。
Description
技术领域
本发明涉及神经前体细胞或包含其分泌蛋白质组(Secretome)作为有效成分的治疗缺血性疾病或神经炎症性疾病的组合物。
背景技术
干细胞因其多分化能而被视为多种疾病的有希望的治疗候选物质。例如，间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)具有可容易地获得及分离、促进血管生成、抑制炎症的许多营养因子等特性(Caplan，A.I.，&Dennis，J.E.(2006).Journal of CellularBiochemistry，98，1076-1084)。间充质干细胞的这些特性被适用于治疗人类疾病的研究中。根据最近的研究，间充质干细胞在许多动物模型及人体临床治疗(Chen，J.，Li，Y.，Katakowski，M.，et al.(2003).Journal of Neuroscience Research，73，778-786；Kopen，G.C.，Prockop，D.J.，&Phinney，D.G.(1999).Proceedings of the National Academy ofSciences，96，10711-10716)中起到组织恢复的作用。在一些报道中提及了间充质干细胞在体外分化为包括神经细胞(Bae，K.S.，Park，J.B.，Kim，H.S.，Kim，D.S.，Park，D.J.，&Kang，S.J.(2011).Yonsei Medical Journal，52，401-412)及星形胶质细胞(astrocyte)(Kopen，G.C.，Prockop，D.J.，&Phinney，D.G.(1999).Proceedings of the National Academy ofSciences，96，10711-10716)的神经系列的分化能力，但未提及这些被分化的细胞在体内起到哪些功能的明确证据。间充质干细胞的有益的效果为上述间充质干细胞被旁分泌(paracrine)机制诱导，而不是细胞替代，由此，间充质干细胞的移植(transplantation)可具有临时且有限的效果，而不是长时间持续的改善(Cho，S.R.，Kim，Y.R.，Kang，H.S.，etal.(2009).Cell Transplantion，18，1359-1368)。
相反地，胚胎干细胞(embryonic stem cells，ESCs)可分化为来源于3个胚芽层(embryonic germ layer)的所有特定细胞形态，并且具有强大的自我再生能力。值得注意的是，来源于胚胎干细胞的神经前体细胞(neural precursor cells，NPCs)优选分化为包括神经细胞、星形胶质细胞及少突胶质细胞(oligodendrocyte)的神经系列的特定形态的细胞，因此可视为用于脑组织恢复的细胞源(cells ource)。这些细胞还分泌促进内源性神经前体细胞的生存及增殖的一些因子(Capone，C.，Frigerio，S.，Fumagalli，S.，et al.(2007).PLoSOne，7，e373)。但是，仍然未提及分化于胚胎干细胞的神经前体细胞或者神经前体细胞的培养液在完成疾病模型移植后如何起到改善功能的作用的内容。
在本说明书全文中，参照了多篇论文及专利文献，并表示了其引用。所引用的论文及专利文献的公开内容全部引入本说明书作为参照，从而更加明确说明本发明所属技术领域的水平及本发明的内容。
发明内容
技术问题
本发明者为了开发缺血性疾病或神经炎症性疾病的根本的治疗方法而进行了深入研究。其结果，当向病变部位注射在表面表达作为神经粘附分子的多聚唾液酸神经细胞粘附分子(PSA-NCAM，poly-sialylated neural cell adhesion molecule)的神经前体细胞时，促进血管的新生以及抑制炎症反应，从而可有效地治疗因血管损伤而产生的缺血性疾病及因炎症而产生的神经组织的损伤，由此完成了本发明。因此，作为不同于干细胞移植的实施方式，通过给药至神经前体细胞分泌蛋白质组的病变部位来减少缺血性损伤部位并恢复神经功能，从而可有效地治疗缺血性疾病和因炎症而产生的神经损伤疾病等的退行性神经系统疾病，由此完成了本发明。
并且，本发明的目的在于，提供治疗缺血性疾病或神经炎症性疾病的组合物。
本发明的再一目的在于，提供缺血性疾病或神经炎症性疾病的治疗方法。
根据如下的发明的详细说明、权利要求及附图可进一步明确本发明的还有一目的及优点。
解决问题的方案
根据本发明的一实施方式，本发明提供包含多聚唾液酸神经细胞粘附分子-阳性神经前体细胞作为有效成分的治疗缺血性疾病或神经炎症性疾病的组合物。
根据本发明的再一实施方式，本发明提供包括向所需的个体给药包含多聚唾液酸神经细胞粘附分子-阳性神经前体细胞作为有效成分的组合物的步骤的缺血性疾病或神经炎症性疾病的治疗方法。
根据本发明，本发明的组合物在患有缺血性疾病或神经炎症性疾病的个体恢复缺血性组织的血管或者抑制炎症反应，从而起到抑制上述症状的发展或者去除或减轻上述症状的作用。并且，本发明的组合物因其本身的特性还可作为缺血性疾病或神经炎症性疾病的治疗组合物，并且还可以与其它抗缺血/抗炎症组合物同时给药而作为针对这些疾病的治疗辅助剂。在此，在本说明书使用的术语“治疗”或“治疗剂”包括“治疗辅助”或“治疗辅助剂”的意识。
根据本发明，本发明的组合物显著增加作为血管生成诱发因子的促血管生成素-1(angiopoietin-1)的表达，并且大大提高给药(或移植)部位的血管数量及微血管浓度。并且，本发明的组合物因血管组织的消失、血管生成的缺乏或不正常血管的形成等而产生的血流量减少的个体中恢复血管组织或者增加血管的数量，从而可用作恢复血流量的有效的缺血性疾病治疗组合物。
根据本发明，本发明的组合物抑制所给药(或移植)的神经组织中的反应性小胶质细胞及星形胶质细胞地活性化。小胶质细胞(microglia)作为在中枢神经系统执行第一性免疫功能的细胞，与正常状态的小胶质细胞不同地，被活性化的小胶质细胞积极地进行吞噬作用，并且实现细胞增殖，而且通过表达TNF-α、IL-1β及IL-6等的细胞因子、趋化因子、诱生型一氧化氮合酶(iNOS，inducible nitric oxide synthase)、环氧合酶-2(COX-2，cyclooxygenase-2)等的遗传基因来生成炎症介质物质。被活性化的星形胶质细胞也分泌作为炎症性细胞因子的IL-6、TGF-β、LIF及IL-1，所分泌的这些细胞因子重新使小胶质细胞及星形胶质细胞活性化，从而恶化组织内环境。并且，用于抑制小胶质细胞及星形胶质细胞的活性化的本发明的组合物可有效地防止因炎症反应而引起的神经组织的损伤。
根据本发明的一实例，本发明的治疗缺血性疾病或神经炎症性疾病的组合物用于增加促血管生成素-1的表达。
在本说明书所使用的术语“表达的增加”是指不同于正常状态以能够检测出的程度显著增加遗传基因或蛋白质的表达，更具体地，不同于对照组，表达量称为130％以上。
根据本发明发热一实例，本发明的治疗缺血性疾病或神经炎症性疾病的组合物用于抑制胶质细胞(glial cell)或星形胶质细胞的活性化。
在本说明书所使用的术语“活性化的抑制”是指抑制引起胶质细胞或星形胶质细胞的数量、功能及活性化降低的体内变形，例如是指抑制显著降低这些细胞的特异性标记(例如，CD68或GFAP)的表达或者无法检测或者以无意识的水准存在的现象。
根据本发明的一实例，在本发明所使用的多聚唾液酸神经细胞粘附分子-阳性神经前体细胞从神经丛分离，上述神经丛从全能干细胞分化。
根据本发明，在本发明所使用的多聚唾液酸神经细胞粘附分子-阳性神经前体细胞可利用抗多聚唾液酸神经细胞粘附分子-抗体从神经丛分离，上述神经丛通过神经分化刺激从全能干细胞分化。
根据本发明的还有一实施方式，本发明提供包含神经前体细胞的分泌蛋白质组作为有效成分的治疗缺血性疾病或神经炎症性疾病的组合物。
本发明的另一实施方式，本发明提供包括向所需的个体给药包含神经前体细胞的分泌蛋白质组作为有效成分的组合物的步骤的缺血性疾病或神经炎症性疾病的治疗方法。
在本说明书所使用的术语“神经前体细胞的分泌蛋白质组”(Secretome)是指在培养神经前体细胞的过程中从神经前体细胞分泌至外部(培养基)的蛋白质的集合体。
根据本发明的一实例，适用于本发明的分泌蛋白质组的制备的神经前体细胞分化至全能干细胞。
根据本发明的一实例，上述神经前体细胞为通过使全能干细胞(例如，胚胎干细胞或诱导全能干细胞)分化为神经系列细胞而形成的神经丛(neural rosette)步骤中的神经前体细胞。
根据本发明的一实例，上述神经前体细胞为多聚唾液酸神经细胞粘附分子-阳性神经前体细胞。
根据本发明的另一实例，上述神经前体细胞为多聚唾液酸神经细胞粘附分子-阴性神经前体细胞。
上述多聚唾液酸神经细胞粘附分子-阳性或阴性神经前体细胞可利用抗多聚唾液酸神经细胞粘附分子-抗体从神经丛分离，上述神经丛通过神经分化刺激从全能干细胞分化。
根据本发明的一实例，在动物细胞培养基中培养神经前体细胞来获得的细胞培养液中含有上述分泌蛋白质组。即，在本发明的组合物可包含含有神经前体细胞的分泌蛋白质组的神经前体细胞的培养液。
根据本发明的一实例，在包含ITS(胰岛素/转铁蛋白/硒)及碱性成纤维细胞生长因子(bFGF，basic fibroblast growth factor)的无血清动物细胞培养基中培养神经前体细胞后，可通过去除细胞来获得上述神经前体细胞的细胞培养液。在上述培养的过程中可利用传代培养的神经前体细胞，例如，通过在添加有N2、B-27和/或Gem21的含碱性成纤维细胞生长因子的动物细胞培养基进行传代培养(例如，4传代以上)而获得的神经前体细胞。
上述培养基中的细胞的去除可使用离心分离、过滤等的普通的细胞分离方法实施。
只要是在培养神经前体细胞的过程中使用的普通培养基，则不对上述动物细胞培养基进行限制，例如可使用DMEM/F12。
根据本发明的一实例，上述神经前体细胞从人类诱导全能干细胞分化，上述神经前体细胞的分泌蛋白质组包括如下的蛋白质：聚集蛋白(Agrin)、膜联蛋白A5(AnnexinA5)、基础免疫球蛋白(BSG，Basigin)、二聚糖(Biglycan)、钙调蛋白-3(Calponin-3)、类共激活蛋白(Coactosin-like protein)、丝切蛋白-1(Cofilin-1)、胶原蛋白α-2、滞蛋白-3(Cullin-3)、消去蛋白(Destrin)、营养不良蛋白聚糖(Dystroglycan)、肝配蛋白-B2(Ephrin-B2)、输出蛋白-2(Exportin-2)、埃兹蛋白(Ezrin)、纤维连接蛋白、纤蛋白-1(Fibulin-1)、卷曲相关(Frizzled-related)蛋白质、半乳糖凝集素-3结合蛋白(Galectin-3 binding protein)、颗粒体蛋白(Granulins)、生长/分化因子11(Growh/differentiationfactor11)、触珠蛋白(Haptoglobin)、血液结合素(Hemopexin)、高速泳动族蛋白(High mobility group protein)B2、角蛋白(Hornerin)、输入蛋白-9(Importin-9)、胰岛素样生长因子结合蛋白2(Insulin-like grwoth factor-binding protein2)、狼疮La蛋白(Lupus La protein)、巨噬细胞移动抑制因子(Macrophage migrationinhibitory factor)、中期因子(Midkine)、膜突蛋白(Moesin)、神经毡蛋白2(Neuropilin2)、多效蛋白(Pleiotrophin)、抑制蛋白-1(Profilin-1)、DJ-1蛋白(ProteinDJ-1)、根蛋白(Radixin)、分泌型卷曲相关蛋白-2(Secreted frizzled-related protein-2)、胞裂蛋白-11(Septin-11)、踝蛋白-1(Talin-1)、睾丸蛋白聚糖(Testican)、促胸腺生成素(Thymopoietin)、转胶蛋白-3(Transgelin-3)及波形蛋白(Vimentin)。
根据本发明的一实例，上述神经前体细胞从人类胚胎干细胞分化，上述神经前体细胞的分泌蛋白质组包括如下的蛋白质：聚集蛋白(Agrin)、膜联蛋白A2(Annexin A2)、吸引素(Attractin)、二聚糖(Biglycan)、血浆铜蓝蛋白(Ceruloplasmin)、丝切蛋白-1(Cofilin-1)、胶原蛋白α-1、冠蛋白-1X(Coronin-1X)、皮西丁蛋白(Dermicidin)、DERP12、肝配蛋白-B3、外生骨疣样蛋白-2(Exostosin-2)、埃兹蛋白(Ezrin)、明胶-3结合蛋白、颗粒体蛋白(Granulins)、生长分化因子11(Growh/differentiation factor 11)、触珠蛋白(Haptoglobin)、血液结合素(Hemopexin)、高速泳动族蛋白B2、角蛋白(Hornerin)、胰岛素样生长因子结合蛋白2(Insulin-like grwoth factor-binding protein 2)、狼疮La蛋白、中期因子(Midkine)、膜突蛋白(Moesin)、多表皮生长因子样结构域蛋白8(Multipleepidermal growth factor-like domains protein 8)、巢蛋白-1(Nidogen-1)、胸腺旁腺素(Parathymosin)、抑制蛋白-2(Profilin-2)、DJ-1蛋白(ProteinDJ-1)、分泌型卷曲相关蛋白-2、分泌粒蛋白(Secretogranin)、踝蛋白-1(Talin-1)、胸腺素β-4(Thymosin beta-4)、转化生长因子Β诱导蛋白IG-H3(TGFBI，Transforming grwowth factor-beta-inducedprotein ig-h3)、转胶蛋白(Transgelin)及波形蛋白(Vimentin)。
以下，对共同适用于如上所述的本发明的组合物及治疗方法的内容进行说明。
在本说明书所使用的术语“干细胞”是在分化(differentiation)为形成组织的各细胞之前的步骤的未分化细胞的总称，具有根据特定分化刺激(环境)而能够分化为特定细胞的能力。不同于停止细胞分裂的已完成分化的细胞，干细胞的特征在于，可通过细胞分裂而生成(self-renewal)与自身相同的细胞，并具有如下的分化可塑性(plasticity)，即，若施加分化刺激，则分化为特定细胞，并且这种分化还可根据其它环境或其它分化刺激而分化为多种细胞。
在本发明所使用的干细胞为如下的全能干细胞(pluripotent stem cell)，即，可在体外无限增殖，并且可分化为来源于3种种类的所有胚层(外胚层、中胚层和内胚层)的多种细胞。更具体地，上述全能干细胞为胚胎干细胞(embryonic stem cells)、诱导多能干细胞(iPSCs，induced pluripotent stem cells)、胚胎生殖细胞(embryonic germ cells)或胚胎癌细胞(embryonic carcinoma cells)。
胚胎干细胞来源于胚盘胞的内细胞团(ICM)，胚胎生殖细胞来源于5～10周龄的生殖嵴(gonadal ridge)的原始生殖细胞。
诱导全能干细胞为通过插入从非全分化能细胞(例如，体细胞)赋予全能性的特定遗传基因来人工制备的全分化能干细胞中的一种。诱导全能干细胞在干细胞遗传基因及蛋白质表达、染色体甲基化、倍增时间(doubling time)、胚体形成、畸胎瘤形成、生存性嵌合体形成、杂交性及分化性等方面与全分化能干细胞(例如，胚胎干细胞)相同。
上述术语“神经丛(neural rosette)”是指人类胚胎干细胞的神经分化过程的初始步骤的神经干细胞，神经丛具有圆柱形的放射形态。上述神经丛由表达Pax6及Sox1等的初始神经外胚层(neuroectodermal)标记的细胞形成，并且可分化为神经细胞及神经胶质细胞。上述神经分化刺激可通过本技术领域的常规实施方法实现分化，例如，可通过无血清培养基(Tropepe V et al.，Neuron.30:6578(2001))，成纤维细胞生长因子(FGFs，fibroblast growth factors)、细胞外因子(Wnt)及视黄酸(RA，retinoic acid)等的成形素(morphogens)的处理(Ying QL et al.Nat Biotechnol.21:183186(2003))实现分化，但并不限定于此。
上述抗体可使用多克隆抗体或单克隆抗体。针对多聚唾液酸神经细胞粘附分子的抗体可通过本技术领域的常规实施方式制备，例如，可通过融合方法(Kohler andMilstein，European Journal of Immunology，6:511-519(1976))、重组DNA方法(美国专利第4，816，56号)或噬菌体抗体库方法(Clackson et al，Nature，352:624-628(1991)及Marks et al，J.Mol.Biol.，222:58，1-597(1991))制备。针对抗体制备的普通过程已详细记载于Harlow，E.and Lane，D.，Using Antibodies:A Laboratory Manual，Cold SpringHarbor Press，New York，1999；Zola，H.，Monoclonal Antibodies:A Manual ofTechniques，CRC Press，Inc.，Boca Raton，Florida，1984；及Coligan，CURRENT PROTOCOLSIN IMMUNOLOGY，Wiley/Greene，NY，1991，上述文献作为参考引用在本说明书。例如，用于生成单克隆抗体的杂交瘤细胞的制备可通过融合非凋亡化细胞株和抗体生成淋巴细胞来实现，在此过程中所需要的技术已被本发明所述技术领域的普通技术人员所公知，并且可容易实现。多克隆抗体可通过如下的方法实现，即，向适合的动物注射多聚唾液酸神经细胞粘附分子抗原，并从上述动物收集抗血清后，利用公知的亲和性(affinity)技术从抗血清分离抗体而获得。
在本说明书中，提及多聚唾液酸神经细胞粘附分子时所使用的术语“抗体”为针对多聚唾液酸神经细胞粘附分子的特异抗体，并与多聚唾液酸神经细胞粘附分子蛋白质特异性结合，不仅包括完整的抗体形态，还包括抗体分子的抗原结合片段。完成的抗体为具有2个整体长度的轻链及2个整体长度的重链的结构，各个轻链以二硫键的方式与重链相连接，抗体分子的抗原结合片段作为具有抗原结合功能的片段，包括Fab、F(ab')、F(ab')2及Fv。
为了分离利用抗体的多聚唾液酸神经细胞粘附分子-阳性神经前体细胞，可利用荧光激活细胞分选机(fluorescence-activating cell sorters，FACS)、磁性激活细胞分选机(magnetic activated cell sorter，MACS)及补体介导溶解(complement-mediatedlysis)方法。
在本说明书所使用的术语“治疗”是指：(a)抑制疾病、病症或症状的发展；(b)减轻疾病、病症或症状；或者(c)去除疾病、病症或症状。本发明的组合物起到抑制、去除或减轻缺血性疾病或神经炎症性疾病的症状的发展的作用。并且，本发明的组合物因其本身的特性还可作为缺血性疾病或神经炎症性疾病的治疗用组合物，并且还可以与其它抗缺血/抗炎症组合物同时给药而作为针对这些疾病的治疗辅助剂。在此，在本说明书使用的术语“治疗”或“治疗剂”包括“治疗辅助”或“治疗辅助剂”的意识。
在本说明书所使用的术语“缺血性疾病”是指如下的疾病，即，因伴随血管损伤的血液渗漏(blood leakage)、栓塞(embolism)或梗塞(infarction)等而减少血流量，因而使血液供给被切断的组织坏死。
根据本发明的一实例，可通过本发明的组合物治疗的缺血性疾病选自由缺血性心脏疾病、心肌梗死、心绞痛、下肢动脉缺血性疾病、四肢远端缺血性疾病及缺血性脑血管疾病组成的组中。
在本说明书所使用的术语“缺血性心脏疾病”是指因向心脏供给血液的冠状动脉损伤、冠状动脉狭窄或被阻塞而减少流向心脏肌肉的血流并由此产生的疾病。更具体地，可通过本发明的组合物治疗的缺血性心脏疾病选自由心绞痛、心肌梗死症及心脏衰竭组成的组中。
在本说明书所使用的术语“缺血性脑血管疾病”是指因脑血管损伤、脑血管狭窄或被阻塞而使无法接受血流的脑组织损伤的疾病。更具体地，上述缺血性脑血管疾病为缺血性脑卒中。
在本说明书所使用的术语“神经炎症性疾病”是指因炎症反应而产生的神经组织的损伤所导致的疾病。
根据本发明的一实例，可通过本发明的组合物治疗的神经炎症性疾病选自由阿耳茨海默氏病、帕金森病、亨丁顿舞蹈症、肌肉萎缩症、克雅氏病、多发性硬化症、肌萎缩侧索硬化症、弥漫性路易体病、白质脑炎、颞叶癫痫及炎症性脊髓损伤组成的组中。
在本说明书所使用的术语“给药”或“进行给药”是指，通过向对象体直接给药本发明的组合物的治疗有效量而在对象体的体内形成相同的量。并且，术语“进行给药”包括向病变部位注射本发明的有效成分(多聚唾液酸神经细胞粘附分子-阳性神经前体细胞或神经前体细胞的分泌蛋白质组)，因此术语“进行给药”和“进行注射”为相同的意识。
组合物的“治疗有效量”是指为了向待给药组合物的个体提供治疗效果或预防效果而所需的充分的提取物的含量，并且上述“治疗有效量”包括“预防有效量”。在本说明书所使用的术语“个体”无限制地包括人类、小鼠、大鼠、豚鼠、狗、猫、马、牛、猪、猴、黑猩猩、狒狒或猕猴。具体地，本发明的个体为人类。
本发明的组合物被制备为药物组合物的情况下，本发明的药物组合物包括药学上可接受的载体。包含在本发明的药物组合物的药学上可接受的载体作为制剂时通常利用的，包括乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露醇、淀粉、阿拉伯胶、磷酸钙、藻酸盐、半乳糖凝集素、硅酸钙、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、水、糖浆、甲基纤维素、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石、硬脂酸镁、矿物油、食盐水、磷酸盐缓冲盐水(PBS，phosphatebuffered saline)或培养基等，但并不限定于此。
除了上述成分以外，本发明的药物组合物还可包括润滑剂、润湿剂、甜味剂、调味剂、乳化剂、悬浮剂、保鲜剂。适合的药学上可接受的载体及制剂详细地记载于Remington'sPharmaceutical Sciences(19th ed.，1995)。
本发明的药物组合物可实施口服或非口服给药，具体地，可以是非口服给药，更具体地，可以是肌肉内(intramuscular)给药、脑室内(intracerebroventricular)给药、脊髓腔(Intrathecal)给药或血管内(intravascular)给药。
本发明的药物组合物的适合的给药量可根据制剂化方法、给药方式、患者的年龄、体重、性别、病态、饮食、给药时间、给药途径、排泄速度及反应灵敏性等的因素开多种处方。以成人为基准，本发明的药物组合物的普通给药量为每天102-1010细胞。
本发明的药物组合物根据本发明所属技术领域的普通技术人员可容易实施的方法并利用药学上可接受的载体和/或赋形剂来进行制剂化，从而可制备成单位容量形态或者以填充于大型容器内的方式制备。此时，剂型可以为油介质或水介质中的溶液、悬浮液、糖浆剂或乳液形态，并且还可以为浸膏剂、粉剂、粉末剂、颗粒剂、片剂或胶囊剂形态，而且还包括分散剂或稳定剂。
发明的效果
如下的概括说明本发明的特征及优点。
(a)本发明提供治疗缺血性疾病或神经炎症性疾病的组合物。
(b)在本发明所使用的多聚唾液酸神经细胞粘附分子-阳性神经前体细胞用于促进被注射的组织中的血管生成以及抑制炎症反应。上述多聚唾液酸神经细胞粘附分子-阳性神经前体细胞可利用抗多聚唾液酸神经细胞粘附分子-抗体简单地分离，相对于间充质干细胞，呈现优秀的血管生成及验证抑制活性，从而可有用地用作针对因血管损伤而引起的缺血性疾病及因炎症而引起的神经损伤疾病的有效的治疗组合物。
(c)本发明的神经前体细胞的分泌蛋白质组不仅减少缺血性损伤部位，还恢复神经功能，因而还可用作针对因缺血性疾病和炎症而引起的神经损伤疾病等的退行性神经系统疾病的治疗剂。
附图说明
图1为示出移植NPCPSA-NCAM+及间充质干细胞的大鼠脑缺血中的梗塞部位缩小的图。图1a为示出实验计划图的示意图。在大脑中动脉闭塞(pMCAo)1日后，对实验动物随机给药NPCPSA-NCAM+、间充质干细胞或磷酸盐缓冲盐水(分别n＝10)。在移植26日后牺牲实验动物，并对脑组织进行免疫组织化学分析。图1b为示出大鼠大脑中动脉闭塞模型中的间充质干细胞移植及NPCPSA-NCAM+移植在移植26日后对梗塞大小产生的效果的图。与磷酸盐缓冲盐水组相比，分别为*P<0.05及**P<0.01。图1c为示出给药磷酸盐缓冲盐水、NPCPSA-NCAM+或间充质干细胞的大鼠中的移植26日后的代表图像的图。
图2为示出在移植NPCPSA-NCAM+的大鼠脑卒中模型中提高行动能力的图。分别示出体重变化(图2a)、前肢踩空试验(图2b)、非对称试验(图2c)、平衡木试验(图2d)、抓握牵引试验(图2e)及改良神经功能评分(图2f)的结果。检测值用±标准误差表示。与磷酸盐缓冲盐水组相比，分别为*P<0.05、**P<0.01及***P<0.001。
图3为示出生存的NPCPSA-NCAM+的编入大鼠脑组织以及分化为大鼠脑组织的图。图3a示出梗塞部位。在移植26日后对NPCPSA-NCAM+的生存及增殖进行实验。在大鼠脑缺血中检测出Ki67(绿色)或DCX(红色)阳性细胞。比例尺：500μm。图3b为图3a的高倍率体。比例尺：200μm。图3为示出同时表达hNu(绿色)及DCX(红色)的NPCPSA-NCAM+细胞的一列的图，许多被移植的NPCPSA-NCAM+细胞呈现hNu阳性，由此可知，NPCPSA-NCAM+细胞具有优秀的生存率和在被损伤的脑组织中的存活率。比例尺：20μm。图3d为示出在大部分的间充质干细胞移植组的针道(needle tract)周围检测出一些增殖的Ki67+hNu-细胞的图。比例尺：200μm。
在图3b从左侧开始是有关DCX/DAPI、Ki67/DAPI、DCX/Ki67/DAPI、Tuj1/DAPI、Nestin/Ki67/DAPI的图。在图3c从左侧开始向顺时针方向是有关DAPI、hNu、hNU/DCX、DCX的图。在图3d从左侧开始是有关hNU/DAPI、Ki37/DAPI、hNU/Ki67的图。
图4为示出在大鼠脑组织NPCPSA-NCAM+对神经组织的贡献以及对胶质细胞活性化的减少效果的图。图4a为示出在移植NPCPSA-NCAM+的大鼠脑检测出hMito+(红色)及MAP2+(绿色)细胞的图。比例尺：20μm。图4b为被移植的细胞的移植26日后的共聚焦图像。供体来源细胞(绿色，hNu+)与MAP2+(红色)共同位于NPCPSA-NCAM+移植部位。DAPI为蓝色。图4c示出在对侧纹状体的宿主神经细胞没有与MAP2同时存在的hMi的图。可知，在纹状体明显地存在MAP2+细胞。比例尺：20μm。图4d为示出在移植NPCPSA-NCAM+的大鼠脑未检测出hMito+GFAP+细胞的图。比例尺：20μm。图4e为示出在NPCPSA-NCAM+移植组同侧纹状体的ED-1阳性被显著减少以及在间充质干细胞移植组减少程度小于上述NPCPSA-NCAM+移植组的图。NPCPSA-NCAM+移植组及间充质干细胞移植组均与磷酸盐缓冲盐水组呈现显著的差异。相对于间充质干细胞组或磷酸盐缓冲盐水组，在NPCPSA-NCAM+移植组GFAP的表达被显著减少。比例尺：200μm。在至少5个单独的显微镜区域对ED1或GFAP阳性细胞的数量进行检测。检测值用±标准误差表示。进行各组之间的多重比较的结果，分别为*P<0.05及***P<0.001。
图5为示出在移植NPCPSA-NCAM+的大鼠脑缺血促进血管生成的图。图5a为分别示出磷酸盐缓冲盐水组、NPCPSA-NCAM+或间充质干细胞移植组的缺血性脑的免疫染色结果的图。比例尺：200μm。图5b为示出NPCPSA-NCAM+移植部位的宿主起源α-SMA-阳性血管上皮细胞(红色)的代表图像的图。比例尺：20μm。图5c为示出移植NPCPSA-NCAM+或间充质干细胞的大鼠中的α-SMA-阳性微血管地定量分析结果的图。检测值用±标准误差表示。对*NPCPSA-NCAM+组和间充质干细胞或*NPCPSA-NCAM+组和磷酸盐缓冲盐水组进行比较的结果，分别为P<0.05及P<0.01。图5d为示出通过逆转录-聚合酶链反应在抑制NPCPSA-NCAM+(NPC)或间充质干细胞后的7日及26日对缺血性脑中的大鼠-促血管生成素-1表达量进行检测的结果的图。并且，示出对促血管生成素-1的逆转录-聚合酶链反应扩增(上部分)及空白对照组(基准值)进行磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)标准化的信使核糖核酸(mRNA)水准(下部分)的定量化结果。检测值用±标准误差表示。与*磷酸盐缓冲盐水组相比，P<0.05。
图6为示出利用逆转录-聚合酶链反应对移植NPCPSA-NCAM+、间充质干细胞或磷酸盐缓冲盐水的脑缺血中的大鼠及人类神经营养因子表达水准进行检测的结果的图。并且，示出对神经营养因子的逆转录-聚合酶链反应扩增及空白对照组(基准值)(每组n＝3)进行磷酸甘油醛脱氢酶标准化的信使核糖核酸水准的定量化结果。检测值用±标准误差表示。与*磷酸盐缓冲盐水组相比，P<0.05。
图7为示出磷酸盐缓冲盐水对照组、培养基对照组及分泌蛋白质组处理组的缺血性病变部位的大小的图。
图8为示出磷酸盐缓冲盐水对照组、培养基对照组及分泌蛋白质组处理组的体重变化的图。
图9为示出磷酸盐缓冲盐水对照组、培养基对照组及分泌蛋白质组处理组的行为分析结果的图。图9a示出平衡木试验结果，图9b示出抓握牵引试验结果，图9c示出前肢踩空试验结果，图9d示出各单位时间的行为活跃度的线截面(line cross)结果。
图10为示出磷酸盐缓冲盐水对照组、培养基对照组及分泌蛋白质组处理组的综合行动神经改善效果(改良神经功能评分)分析结果的图。
在图7至图10中，*P值(value)<0.05，**P值<0.01。
具体实施方式
以下，通过实施例对本发明进行更详细的说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员而言，这些实施例仅用于更具体地说明本发明，并且根据本发明的主旨，本发明的保护范围并不限定于这些实施例。
实施例
实施例1.多聚唾液酸神经细胞粘附分子-阳性神经前体细胞对缺血性疾病和神经炎症性疾病的治疗效果
实验方法
来源于人类间充质干细胞及人类胚胎干细胞的NPCPSA-NCAM+细胞的培养及分化
人类细胞的使用已结构医学研究伦理审查委员会(Institutional ReviewBoard，IRB No.4-2008-0643)的批准。人类骨髓从提出知情同意书的健康的成人志愿者的后部髂嵴获取。如下的简要说明获取方法，即，利用密度梯度离心分离(GE Healthcare，Uppsala，Sweden)分离骨髓单核细胞，在投入10％的空腹血糖(FBS)(Gibco，GrandIsland，NY)的DMEM放置上述骨髓单核细胞后，在37℃的温度下，在包含5％的CO2的加湿空气中进行培养。在24小时后，清洗并去除非吸附细胞。每3日更换培养液，在细胞汇合度达到90％的情况下，利用0.05％的胰蛋白酶/乙二胺四乙酸(Invitrogen，Carlsbad，CA)对细胞进行传代培养。
在本实验使用完成3～5传代的吸附间充质干细胞。为了诱导神经，在无碱性成纤维细胞生长因子的人类胚胎干细胞培养基(Invitrogen)上，在包含5μM的游离碱(DM，dorsomorphin)(Sigma，St。Louis，MO)及5～10μM的SB431542(Calbiochem，San Diego，CA)的悬浮液培养4日来源于人类胚胎干细胞的类胚体(embryoid bodies，EBs)，然后在投入20ng/ml的碱性成纤维细胞生长因子的1XN2(Invitrogen)培养基中5日左右吸附于包被基质胶的培养皿(BD Biosciences，Bedford，MA)((Kim，D.S.，Lee，D.R.，Kim，H.S.，et al.(2012).PLoSOne，7，e39715)。利用pulled玻璃吸管从周边的扁平细胞小心地分离出现在所吸附的EB菌落的中心的神经丛。在涂敷有基质胶的培养皿使小丛块进行煮沸，并在投入1XN2、1XB27(Invitrogen)的DMEM/F12进行培养(Kim，D.S.，Lee，J.S.，Leem，J.W.，et al.(2010).Stem Cell Reviews and Reports，6，270-281)。
借助磁性激活细胞分选机的多聚唾液酸神经细胞粘附分子-阳性神经前体细胞的分离
在10μM的Y27632(Sigma)暴露1小时左右完成80～90％合流的被扩增的神经丛，以防止在进行磁性激活细胞分选机步骤之前发生细胞凋亡的现象。在利用Accutase(Invitrogen)完成分离后，在包含1％的牛血清白蛋白(BSA)的磷酸盐缓冲盐水使细胞(～1×108cells)成块，并与结合有微珠(Miltenyi Biotec)的抗多聚唾液酸神经细胞粘附分子抗体共同在4℃的温度下培养15分钟。在彻底清洗完毕后，将细胞悬浮液放入磁性细胞分选机(MASC，magnetic activated cell sorting)，并用管洗脱残留在色谱柱的标记阳性的细胞。将所分离的NPCPSA-NCAM+以4～5×105cells/cm2的浓度重新放置于添加有N2B27培养基或20ng/ml的碱性成纤维细胞生长因子的NBG培养基(投入1XN2、0.5XB27及0.5×G21)(GeminiBio-Products，WestSacramento，CA)。培养培养基每天进行更换，细胞按2～3日进行传代培养。
脑卒中模型的确立及NPCPSA-NCAM+的定位注射(stereotaxic injection)
在N2O与O2之比为70％～30％的条件下，使用3％的异氟烷(HanaPharm，Seoul，Korea)对2周龄的雄性斯普拉-道来(Sprague-Dawley)大鼠(体重为约250～300g)进行麻醉。分离左侧颈总动脉及外颈动脉，并用4-0手术用缝合线连接。向左侧内颈动脉插入尼龙线，并移动至韦利斯氏环(永久性大脑中动脉阻塞：permanent middle cerebral arteryocclusion，大脑中动脉闭塞)，遗留线，直到牺牲大鼠。
在大脑中动脉闭塞2日后，进行NPCPSA-NCAM+、间充质干细胞或磷酸盐缓冲盐水的定位注射。使用舒泰(VirbacS。A。，France，25mg/kg)麻醉大鼠，并放置于正位外科手术工具(David Kopf Instruments，Tujunga，CA)。向左侧纹状体(striatum)(从前囟的坐标：前后侧(anteroposterior)+0.7mm，内外侧(mediolateral)-2mm及背腹侧(dorsoventral)-5.5mm，从脑膜(meninges)-2.5mm)插入A26号针头(Hamilton syringe，Hamilton，Reno，NV)；向5.5mm及-2.5mm部位注射5μl的NPCPSA-NCAM+、间充质干细胞(分别1×105cells/μl)或磷酸盐缓冲盐水。通过持续的搅拌来防止细胞凝集，并向左侧纹状体以1μl/min的速度注射所有细胞。9只实验动物在大脑中动脉闭塞手术及细胞移植过程中死亡。
在12小时明/暗循环的条件下，在实验室动物护理评估和鉴定协会(AAALAC，Association for Assessment and Accreditation of Laboratry Animal Care)批准的设施中饲养所有动物。动物实验接受了医学研究伦理审查委员会(Institutional ReviewBoard，IRBNo。4-2011-0087)的批准。
行为试验
前肢踩空试验(Foot fault test)：前肢踩空试验用于检测在2分钟的试验过程中准确地将前爪放置于等距离栅板(equi-distant grid，60×60cm，6cm长度)的程度。上述试验基于现有的研究并根据变更的步骤执行[12，13]。
不对称行为试验(Asymmetric behavior test)：利用已报告的变更的抬高身体摇摆试验(EBST，elevated body swing test)。将大鼠的尾巴抬高至实验区域表面的10cm后检测侧面运动。检测1分钟向右侧或左侧的摇摆(swing)频度。如下的计算了不对称分数值：0分-扭转躯干，向左侧或右侧摇摆，1分-<30°的不对称扭转，2分->30°的不对称扭转。根据扭转躯干的方向，分数按同侧扭转(同侧twist，与梗塞部位相同的方向)或相反侧扭转(contralateral twist，与梗塞部位相反的方向)计算。
平衡木试验(Beam balance test)：横梁步行机构由横梁(100×5×2cm)形成。运动能力按现有研究中使用的6分单位进行评价：1分-在横梁上实现稳定的姿势以及用爪子实现平衡，2分-抓住横梁的侧面并进行摇摆动作，3分-一只以上的爪子掉落，4分-试图保持平衡而掉落，5分-搭载横梁而掉落，6分-没有试图保持平衡而掉落。
抓握牵引试验(Prehensile traction test)：试验中的能否抓握是通过大鼠用前爪吊在水平方向的绳索的能力进行检测。抓握牵引试验是为了评价大鼠的肌肉强度而进行。该试验是通过现有的方法进行。将铁棒(直径2cm，长度100cm)水平放置于海绵橡胶垫(厚度7.5cm)的70cm的上方。使大鼠的前爪位于铁棒后放开大鼠。使大鼠挂在铁棒5秒钟。通过计算掉下来所花费的时间和是否将后爪放在铁棒来如下的计算分数：0分-大鼠悬挂5秒钟且后爪没有掉下来，1分–大鼠悬挂5秒钟且后爪掉下来；2分-大鼠悬挂3～4秒钟，3分-大鼠悬挂0～2秒钟。
改良神经功能评分(mNSS，Modified neurological severity score)：神经障碍分数通过结合运动、知觉及反射神经检查来导出，并使用现有的方法进行。客观定量化基于不对称行为试验、平衡木试验、抓握牵引试验、旷场试验(旋转频度)及前肢踩空试验实现，并如下地计算分数：0分-无缺陷，2分-很难完全伸展相反侧前腿(3≤front foot fault<10)，4分-无法伸展相反侧前腿(front foot fault≥10)，6分-向相反侧些许旋转(1≤旋转或不对称扭转<5)，8分-旋转得厉害(旋转或不对称扭转≥5)，10分-向相反侧掉落(抓握牵引≤2)。
免疫组织化学分析及定量化
用4％的甲醛固定脑组织24小时左右，并用磷酸盐缓冲盐水清洗。为了制备石蜡截面，在递增乙醇对组织进行脱水，并包埋在石蜡。在显微镜用薄片切片机上以5mm厚度层切割包埋在石蜡的脑，在二甲苯进行10分钟脫石蜡化后，在递增酒精进行再水化。向截面处理1小时左右的10mM的柠檬酸后，添加含有磷酸盐缓冲盐水及0.5％的氚核X-100的5％的牛血清白蛋白溶液。然后，在4℃的温度下与针对DCX(Abcam)、Tuj1(Covance)、hNu(Millipore，clone235-1)、GFAP(Millipore)、Ki67(Leica Microsystems)、hMito(Millipore)、MAP2(Millipore)、人类Nestin(Millipore，clone10C2)或ED-1(Abcam)(1：100)的第一抗体共同培养脑切片10～12小时。与第一抗体共同培养过夜后，用磷酸盐缓冲盐水清洗切片，将切片与被荧光标记的作为第二抗体的抗兔IgG培养31小时左右。重新用磷酸盐缓冲盐水清洗一次切片，并利用4′，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI，4’，6’-diamidino-2-phenylindole)进行装片。利用荧光显微镜(OlympusIX71)来获取切片的荧光图像。为了准确地检测在脑组织内与特定抗体反应的神经细胞的数量，而利用盲试。使预先不知道实验的三名实验者检查幻灯片内的5个50mm2四角形内的ED-1+细胞及α-SMA+血管(直径为50mm以下)的数量。然后，调查者通过综合三名实验者的结果来准确地决定所检测的神经细胞的数量。
在移植26日后，利用舒泰(VirbacS。A。，France，25mg/kg)对大鼠(每组10只)进行麻醉，并利用包含在磷酸盐缓冲盐水及磷酸盐缓冲盐水的4％的多聚甲醛(pH7.5)进行灌注。
为了检测梗塞部位，以苏木精对脑切片进行染色，并利用显微镜(Zeiss，Oberkochen，Germany)进行拍摄。计算从相反侧半球的梗塞面积减去同侧半球的梗塞面积的间接损伤部位。通过NIHImageJ程序(1.47版本)对相对梗塞面积进行分析。显示与相反侧半球进行比较的间接损伤的平均百分比。
逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)
利用Trizol试剂(Invitrogen)来分离总核糖核酸(RNA)。首选，利用转录酶(Transcriptase)Ⅱ(Invitrogen)来进行标准逆转录(RT)后，利用如下的引物集进行逆转录-聚合酶链反应：促血管生成素1正向引物：TGTGTCCATCAGCTCCAGTTGC(序列列表第一序列)，反向引物：CGGCTACCATGCTCGAGATAGG(序列列表第二序列)(Bioneer，Daejeon，Korea)。将聚合酶链反应产物转接在1.2％的琼脂糖凝胶旋后，利用溴化乙锭进行染色，并从紫外光检测出条带(约400bp)。最后，利用NIHImageJ程序(版本1.47)对所检测出的条带进行定量化。
统计分析
数据以平均±标准误差显示。利用社会科学统计软件(SPSS，StatisticalPackage for Social Sciences，版本20.0)并使用方差分析法(ANOVA)及独立样本t检验对行为试验及梗塞面积的数据进行分析。当P-values<0.05时，视为具有统计显著性。
实验结果
NPCPSA-NCAM+的移植减少宿主脑的梗塞部位。
图1a示出本发明的整体实验设计。神经组织的损伤程度通过在移植26日后利用苏木精无法正常染色的脑部位(area)进行评价。梗塞部位主要显示在大脑皮质及纹状体。相对于移植间充质干细胞或NPCPSA-NCAM+的情况，梗塞部位在处理磷酸盐缓冲盐水的缺血性脑中明确地更宽(图1b)。相对于磷酸盐缓冲盐水组(25.1±2.4％)，针对相反侧的梗塞面积的百分比在移植NPCPSA-NCAM+(7.1±2.5％)或间充质干细胞(14.9±1.9％)的组中被显著地减少(F＝13.64，P<0.01)。虽然NPCPSA-NCAM+移植组及间充质干细胞移植组之间的梗塞没有明显地差异，但NPCPSA-NCAM+移植组的梗塞面积明显地更窄于间充质干细胞移植组(图1c)。
NPCPSA-NCAM+的移植在大鼠脑卒中模型中提升行动能力。
相对于在大脑中动脉闭塞1日后检测的基准值，大鼠的体重被减少40g。体重减少在磷酸盐缓冲盐水处理大鼠的7日后达到顶点。在间充质干细胞移植组中，体重在移植17日后恢复到基础阶段。但是，与磷酸盐缓冲盐水组相比，在NPCPSA-NCAM+移植组中，从移植3日后开始检测出显著的体重恢复(P<0.05)(图2a)。从大脑中动脉闭塞后的3日(P<0.05)至13日(P<0.01)，与磷酸盐缓冲盐水组相比，踩空/线截面频度在NPCPSA-NCAM+移植组及间充质干细胞移植组被显著地减少(图2b)。而且，与间充质干细胞移植组相比，NPCPSA-NCAM+移植组在13日也显著减少踩空/线截面。但是，这种差异随着此后的(移植后的17日及24日)体重增加而引起的活动性减少变得不明显。
在大脑中动脉闭塞之前，所有大鼠在电子血液跟踪系统(EBTS)呈现相对低的不对称性，相反地，在大脑中动脉闭塞后，明确观察到所有实验动物的不对称性。在移植3日后，在NPCPSA-NCAM+移植组及间充质干细胞移植组开始出现同侧扭转行为。间充质干细胞移植组直到移植13日呈现缓慢的上升趋势(P<0.05)，相反地，NPCPSA-NCAM+移植组的不对称行为分数从移植7日后开始显著地减少，并持续到24日(P<0.01)(图2c)。
与间充质干细胞移植组及磷酸盐缓冲盐水组相比，NPCPSA-NCAM+移植还改善了从3日到24日之间的平衡木试验中的功能恢复(P<0.01)(图2d)。NPCPSA-NCAM+移植显著地增加了用于反应运动调节能力的在横梁上维持的小时，但在间充质干细胞处理组及磷酸盐缓冲盐水处理组未呈现统计上的差异。
与前爪的肌肉强度具有阴性相互关系的抓握牵引分数在NPCPSA-NCAM+移植组中的3～24日之间逐渐减少(P<0.01)(图2e)。间充质干细胞移植组也在移植7～24日后呈现了类似的改善模式。
为了使神经恢复效果的定量化标准化，本发明者最后基于不对称行为分数、平衡木试验、抓握牵引试验、旷场试验(旋转频度，未公开数据)及前肢踩空试验对改良神经功能评分基准进行了评价。改良神经功能评分示出了如下的内容，即，与磷酸盐缓冲盐水处理组相比，在NPCPSA-NCAM+移植组及间充质干细胞移植组中，逐渐的神经功能恢复从3日逐渐开始呈现(P<0.05)(图2f)。不仅如此，与间充质干细胞移植组相比，NPCPSA-NCAM+移植组从7日至24日还呈现出实质性的改善(P<0.01)。NPCPSA-NCAM+移植组的效果尤其在3日至7之间明确地呈现，由此可知，在移植初始具有强有力的旁分泌(paracrine)。
被移植的NPCPSA-NCAM+在宿主脑中生存，并分化为神经系统。
为了追踪被移植的细胞的密度，本发明者在26日利用针对hNu(人类-特异性核)、Ki67(增殖细胞标记)、DCX(神经母细胞标记)、巢蛋白(神经干细胞标记)及Tuj1(神经标记)的抗体进行组织化学分析。在移植NPCPSA-NCAM+后，大部分的细胞在初始移植部位(例如，纹状体)被发现。被移植的NPCPSA-NCAM+的生存、增殖及分化通过已损伤的脑中的Ki67+、DCX+、Tuj1+及巢蛋白+的存在来确认(图3a及图3b)。被移植的大部分NPCPSA-NCAM+细胞表达DCX或Tuj1，而一部分针对巢蛋白具有阳性。被移植的细胞的有丝分裂步骤通过Ki67-免疫反应性进行调差。hNu+细胞(9184个)的一部分在移植后的26日也对Ki67具有阳性(432个，4.7％)。NPCPSA -NCAM+细胞中的Tuj-1免疫反应性与DCX免疫反应性广泛地重叠(图3b)。这些DCX免疫反应性细胞并不是来源于大鼠的细胞，而是来源于人类的细胞(图3c)，由此可知，脑梗塞部位的减少部分起源于被移植的细胞的融合。
许多被移植的NPCPSA-NCAM+细胞呈现优秀的生存率，并且被编入至已损伤的组织，但是用于表达hNu的间充质干细胞在移植26日后仅检测出少许细胞(图3d)。大部分的被移植的NPCPSA-NCAM+细胞为未成熟神经细胞(例如，DCX阳性，部分为Ki67阳性细胞)(图3b)。相反地，被移植的间充质干细胞(hNu+细胞)在损伤部位并未呈现DCX阳性，在大部分的间充质干细胞移植组中，少数的增殖中的hNu-Ki67+细胞存在于针道内部及周围(图3d)。
在移植NPCPSA-NCAM+的大鼠检测出hMito+MAP2+及hNu+MAP2+双重标记细胞(图4a及4b)，但几乎未检测出hMito+GFAP+(图4d)或hMito+GalC+(未公开数据)共-染色细胞，由此可知，NPCPSA-NCAM+细胞为主要参与神经系统的前体细胞。在对侧纹状体中几乎未检测到hMito+细胞(图4c)。
NPCPSA-NCAM+的移植在宿主脑中抑制反应性胶质细胞的活性。
少许GFAP(星形胶质细胞标记)-阳性细胞出现在针道内部及周围，但GFAP的表达在NPCPSA-NCAM+移植组中明显地较少(图4e)。事实上，GFAP-阳性细胞的数量在NPCPSA-NCAM+移植组被大大地减少(P<0.001)，在间充质干细胞移植组其减少程度较低(图4e及图4f)。由此可知，NPCPSA-NCAM+移植强有力地抑制反应性星形胶质细胞的活性化，并由此形成对组织重生有利的环境(Gonzalez，F.F.，McQuillen，P.，Mu，D.，et al.(2007).DevelopmentalNeuroscience，29，321-330)。
缺血性脑卒中诱导因组织损伤而产生的小胶质细胞的相反的反应。对此，本发明者在移植后的26日利用用于识别CD68(活性小胶质细胞标记)的ED1抗体来对缺血脑组织中的小胶质细胞地活性化进行了调查(图4e)。值得注意的是，ED1-阳性细胞在NPCPSA-NCAM+组被显著地减少(P<0.001)，而间充质干细胞移植组的减少程度小于上述NPCPSA-NCAM+组(P<0.05)(图4f)。虽然，纹状体内的Nu+细胞在6月后被检测出，但在移植NPCPSA-NCAM+的脑的移植部位或其它部位完全没有畸胎瘤的痕迹。
NPCPSA-NCAM+移植促进宿主脑中的血管生成。
利用作为平滑肌肌动蛋白标记的α-SMA的抗体对缺血性脑中的内源性血管生成进行调查。其结果可知，与间充质干细胞处理组及磷酸盐缓冲盐水处理组相比，NPCPSA-NCAM+移植大鼠中α-SMA反应性血管的数量在移植部位周围增加(图5a，图5b)。通过微血管的定量分析，明确确认到与间充质干细胞处理组及磷酸盐缓冲盐水处理组相比，NPCPSA-NCAM+移植大鼠的α-SMA+血管在梗塞部位增加(图5c)。
在移植7日及26日后，利用逆转录-聚合酶链反应对脑组织中的作为血管生成诱发因子的促血管生成素-1的表达水准进行调查的结果，在第26日，NPCPSA-NCAM+移植大鼠中的表达水准显著地高于其它组(P<0.05)(图5d)，由此可知，由长时间生存的NPCPSA-NCAM+诱导血管新生。在移植后的26日与移植后的7日的相比，NPCPSA-NCAM+移植的大鼠呈现出促血管生成素-1增加的模式，相反地，间充质干细胞处理大鼠的促血管生成素-1与其7日的相比，没发生变化或者略有减少。但是，与磷酸盐缓冲盐水处理组相比，间充质干细胞处理大鼠在7日呈现增加的模式(P<0.05)。
实施例2.针对神经前体细胞分泌蛋白质组的缺血性疾病和神经炎症性疾病的治疗效果
实验材料及实验方法
来源于人类胚胎干细胞的NPCPSA-NCAM+细胞的获得
人类细胞的使用受到医学研究伦理审查委员会(Institutional Review Board，IRBNo.4-2008-0643)的批准。为了神经诱导，在没有碱性成纤维细胞生长因子的人类胚胎干细胞培养基(Invitrogen)上，在包含5μM的游离碱(Sigma，St。Louis，MO)及5～10μM的SB431542(Calbiochem，SanDiego，CA)的悬浮液培养来源于人类胚胎干细胞和iPSC的各类胚体(embryoid bodies，EBs)4日后，在投入的碱性成纤维细胞生长因子的1XN2(Invitrogen)培养基中5日左右吸附于包被基质胶的培养皿(BD Biosciences，Bedford，MA)(Kim，D.S.，Lee，D.R.，Kim，H.S.，et al.(2012).Highly pure and expandable PSA-NCAM-positive neural precursors from human ESC and iPSC-derived neuralrosettes.PLoSOne，7，e39715)。利用玻璃吸管从周边的扁平细胞小心地分离出现在所吸附的EB菌落的中心的神经丛。在涂敷有基质胶的培养皿使小丛块进行煮沸，并在投入1XN2、1XB27(Invitrogen)的DMEM/F12进行培养(Kim，D.S.，Lee，J.S.，Leem，J.W.，et al.(2010).Robust enhancement of neural differentiation from human ES and iPS cellsregardless of their innate difference in differentiation propensity.Stem CellReviews and Reports，6，270-281)。
在10μM的Y27632(Sigma)暴露1小时左右完成80～90％合流的被扩增的神经丛，以防止在进行磁性激活细胞分选机步骤之前发生细胞凋亡的现象。在利用Accutase(Invitrogen)完成分离后，在包含1％的牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲盐水使细胞(～1×108cells)成块，并与结合有微珠(MiltenyiBiotec)的抗多聚唾液酸神经细胞粘附分子抗体共同在4℃的温度下培养15分钟。在彻底清洗完毕后，将细胞悬浮液放入磁性细胞分选机，并用管洗脱残留在色谱柱的标记阳性的细胞。将所分离的NPCPSA-NCAM+以4～5×105cells/cm2的浓度重新放置于添加有N2B27培养基或的碱性成纤维细胞生长因子的NBG培养基(投入1XN2、0.5XB27及0.5×G21)(GeminiBio-Products，WestSacramento，CA)。培养培养基每天进行更换，细胞按2～3日进行传代培养。
在来源于人类全分化能干细胞的神经前体细胞(神经前体细胞)中分泌蛋白质组的分离
将从上述过程中获得的来源于人类全程干细胞的神经前体细胞(多聚唾液酸神经细胞粘附分子-阳性神经前体细胞)放入基本培养液(DMEM/F-12)，并投入N2(100×-最终浓度1X)、B-27(50×-最终浓度0.5X)及Gem21(50×-最终浓度0.5X)的血清清除补充剂，添加碱性成纤维细胞生长因子并在涂敷有基质胶(Matrigel)的60mm培养皿反复培养4传代以上，在完成扩增后，在8～10个培养皿培养至填满约90％的细胞。在去除培养液后，以磷酸缓冲溶液清洗3次，向无血清基础培养液(DMEM/F12)仅添加ITS(100×-最终浓度1X)和碱性成纤维细胞生长因子并培养24小时。在对照组中，在无细胞的培养皿投入相同量的相同构成的培养液(向基础培养液添加相同量的ITS和碱性成纤维细胞生长因子)，在培养基培养24小时左右后，将回收的作为对照组使用。收集所有培养液进行离心分离(在800g进行30分)，在去除细胞的碎渣等后，立即冷冻于-70℃的冷冻箱，需要时通过解冻来使用。
脑卒中模型的制备
为了检测对因局部脑缺血而产生的神经细胞损伤的神经细胞保护效果，而使用所应用的血管内缝合法(intraluminal suture method)。作为ZiaLonga(ZeaLonga，etal，Stroke。，1989，20，84-91)开发的方法的局部脑缺血模型与其他模型不同地具有临床上类似的优点。由于这些理由成为适合于针对缺血-再灌注(ischemia-reperfusion)的机理研究或者筛选多种药物的效果的模型。
在循环一周后，使用呼吸麻醉机来对实验动物(雄性斯普拉-道来rat，体重250～300g)进行麻醉，作为麻醉剂使用异氟醚(isoflurane)。首先，在混合80％的N2O和20％的O2混合气中以5％的异氟醚对大白鼠诱导全身麻醉后，并以2～2.5％维持麻醉。为了制备脑卒中模型，在切开大白鼠的左侧颈部皮肤后，向内侧剥离颈及导出总动脉(common carotidartery)、外颈动脉(external carotid artery)及内颈动脉(internal carotid artery)后，利用黑丝轻轻地扎住各个血管，并切断血流。切割一半程度的颈总动脉，通过切面对尼龙缝合线的末端进行烧烙，从而插入通过圆角处理来制备成0.40mm的25mm的4-0尼龙探针(probe)。将通过外颈动脉插入的尼龙探针经过内颈动脉插入并固定于大脑中动脉部位，在颈总动脉分枝插入约18～20mm程度后，堵住大脑中动脉的起始部，并用线固定，从而在永久关闭大脑中动脉后，重新缝合皮肤切开部位，并从麻醉中自然恢复。
在脑卒中模型通过脑动脉的分泌蛋白质组注射及行为实验
在诱发脑卒中1日后，对行为实验确立基线(baseline)，然后以与制备脑卒中模型相同的方式通过右侧外颈动脉向内颈动脉部位插入胰岛素针头，然后通过上述针头对分泌蛋白质组动脉注射0.2mg/kg(体积)左右，对对照组给药相同体积的培养液或磷酸缓冲溶液(磷酸盐缓冲盐水)。在注射分泌蛋白质组液体后，观察动物的状态14日左右，在注射前检测1次体重，在注射后检测4次体重，并进行行为分析。
①上体姿态(torso twisting)检测：为了试验被视为实验动物的大脑皮质和纹状体知觉的上体姿态，而检测不对称运动行为。
②平衡木(beam balance)试验：通过使实验动物在窄横梁上保持稳定的平衡姿态来评价总前庭运动功能(gross vestibulomotor function)。
③前肢踩空试验(foot-fault test)：作为在运动过程中检测运动行为(motormovement)的调节(协同)和组合(综合)时使用的实验方法，踩空(Foot-fault)是指动物的前爪或后爪未放错位置(misplace)或者爪子从栅板(grid bar)之间掉落的情况，踩空在撑场动物中不同寻常的对称。
④抓握牵引试验(Prehensile Traction test)：检测中的抓握牵引与否是通过实验动物可利用前爪挂在水平方向的绳索的能力来检测。抓握牵引试验是为了评价实验动物的肌肉强度而进行的。通过现有的方法进行上述试验。将铁棒(直径2cm，长度100cm)水平放置于海绵橡胶垫(厚度7.5cm)上方的70cm处。将实验动物的前爪放置于铁棒后，松开实验动物。使实验动物挂在铁棒5秒钟。通过计算掉下来所花费的时间和是否将后爪放在铁棒来如下的计算分数：0分-大鼠悬挂5秒钟且后爪没有掉下来，1分–大鼠悬挂5秒钟且后爪掉下来；2分-大鼠悬挂3～4秒钟，3分-大鼠悬挂0～2秒钟。
⑤旷场试验(open-field test)：作为确认不同步行或多水准的试验，通过直接观察动物的行为模式和特性，来检测动物的活动性、情绪性及行为模式等。
⑥改良神经功能评分(modified Neural Sibiarity Score)：作为通过上述的多种试验获得的运动、知觉、平衡、反应及情绪实验值的中和成绩，根据如下的基准计算分数(按每个个体合算分数来检测改良神经功能评分)。
-旷场试验(检测动物的情绪性、活动性、行为模式等)
无动作：3
1～20次：2
21～30次：1
30次以上：0
-抓握牵引试验(体力检测)
0～5秒：3
6～10秒：2
11～20秒：1
21秒以上：0
-平衡木试验(平衡知觉检测)
0分：1＝稳定的姿势
2＝抓住横梁的侧面略有晃动的程度
1分：3＝1只以上的爪子从横梁掉落的情况
4＝试图保持平衡而掉落的情况
2分：5＝未保持平衡，倒挂在横梁而掉落的情况
6＝在横梁上完全无法保持平衡而掉落的情况
-前肢踩空试验(运动协调能力)
0～5次：0
6～10次：1
11～20次：2
21次以上：3
-上体姿态试验(不对称运动行为)
0次：2
1～4次：1
5次以上：0
在诱发脑缺血14日后，以舒泰对大白鼠进行麻醉，并进行剖胸，然后，切开右心耳，并向左心室注入针头后，以利用泵向心脏灌注磷酸缓冲溶液的方式去除血液，并取出脑组织。以前囟(bregma)为基准将用于制备样品的组织切片包埋于石蜡，为了确认损伤的脑组织，而将脑组织切片染色于苏木精，在完成脱水后进行固定，利用数码相机拍摄幻灯片后，存储在电脑。使用图像分析程序(image J)以如下的数学式1计算脑梗塞比率(％)。
数学式1
脑梗塞比率(％)＝(正常左半球的面积-脑梗塞部位的正常组织的面积)/正常左半球的面积×100
分泌蛋白质组分析(Secretomics)
在来源于人类胚胎干细胞的神经前体细胞的分泌蛋白质组和来源于人类iPSC的神经前体细胞的分泌蛋白质组中，分别以4～12％的梯度Novex Bis-Tris凝胶(Invitrogen)进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)而完成分离后，以Gel Cord Blue染色试剂(Pierce)以无法看到蛋白质条带的方式对凝胶进行染色。按相同大小的10条带切割完成染色的凝胶，并以现有的方法胶内胰蛋白酶降解。
使用与纳米超高效(Nano Ultra Performance)液相色谱法(EksigentTechnologies)结合的LinearTrap Quadrupole(LTQ)质谱仪(Thermo Finnigan)对通过胶内降解而制备的肽进行分析。具体地，将胰蛋白酶处理的肽适用于填有C18普通5微米大小的树脂的分析色谱柱(75微米×11cm)。在97％的溶液A(在蒸馏水添加0.1％的甲酸)使用60％的溶液B(向乙腈添加0.1％的甲酸)以流速为0.3微升/小时的条件进行分线性45分梯度。对所降解的肽离子以纳米电喷射离子(Electrospray Ionization，ESI)源进行电动喷雾。在MS/MS谱中，按片段选择整个MS扫描，并以结果-依存扫描获得最多的5种谱。将针对动态排除的重复计数设定为1，将重复期间设定为30秒，将动态排除期间设定为180秒，将排除质量宽度设定为1.5Da，将动作排除列表设定为50。
在ipi.HUMANv3.76数据库(89378项目)使用Thermo-SEQUEST算法(ThermoFinnigan)来检索肽及蛋白质的确认。在检索数据库后，利用scarffold2(ProteomeSoftware)确认完成确认的肽及蛋白质。在借助SEQUEST检索出的肽中，选择具有0.95以上的肽预测(Peptide Prophet)的一组肽。并且，获得具有0.99以上的蛋白质预测(ProteinProphet)盖然性及2个以上的固有肽的蛋白质列表。
统计分析
组之间的统计学显著水平利用适用Tukey'scorrection的单向方差分析法(one-watanalysis of variance，ANOVA)来获得，将p值<0.05判定为统计学显著。
实验结果
为了在脑卒中模型检测根据神经前体细胞的分泌蛋白质组的疾病改善，而按如下的3个组进行了2周的实验。在诱发脑卒中24小时后，通过行为实验将确认完成疾病诱导的大白鼠随机分配成3个组后，向右侧外颈动脉注射相同量的分泌蛋白质组(0.2mg/kg，体积)、培养基或磷酸盐缓冲盐水。在注射各物质后，在3日、7日、10日及14日确认动物的状态和体重，并进行行为分析。
表1
缺血病变部位分析结果
在大白鼠中通过永久MCAO的脑卒中的诱导引发了广泛的脑病变的损伤。在进过脑卒中诱导14日后，取出脑，并通过氯化三苯基四氮唑(TTC(2，3，5-triphenyltetrazoliumchloride))染色确认脑的损伤与否和损伤部位。TTC染色以与细胞内的正常线粒体氧化酶系统(mitochondrial oxidative enzyme system)发生反应的方式进行染色，若发生脑缺血损伤而损伤线粒体，则干扰氧化系统，从而未完成染色而显示白色，因此可区分脑的损伤部位。
如图7所示，因大脑中动脉闭塞而引发的损伤主要发生在右侧脑的皮质部位和纹状体部位(图7)。并且，神经前体细胞的分泌蛋白质组注射减少缺血性病变部位(infarctsize)。在磷酸盐缓冲盐水对照组损伤了将近又脑的60％，在培养基对照组损伤了46％左右，但分泌蛋白质组处理组的损伤部位为29％程度，与对照组相比，损伤部位明显减少了。
体重分析结果
由于脑卒中的诱发减少大白鼠的运动能力，而立即减少体重并持续到第7日，多种治疗剂通过运动能力的恢复诱导体重的增加。分泌蛋白质组的注射也与细胞移植相同地诱导体重增加(图8)。在神经损伤的恢复过程中最显著的现象为体重的恢复。与磷酸盐缓冲盐水对照组相比，分泌蛋白质组处理组出现明显的改善。
行为分析结果
与两个对照组相比，分泌蛋白质组处理组在平衡木试验中呈现统计学显著的行为改善效果，这种效果呈现从治疗3日开始发生改善等的即时性效果(图9a)。
并且，与两个对照组相比，在抓握牵引试验(prehensile traction)中也从治疗(注射)7日开始呈现统计学显著的效果(图9b)。
而且，分泌蛋白质组注射呈现减少网兜中的失足(foot fault)频度的效果(图9c)。在检测每单位时间的行为的活跃度的线截面(line cross)也呈现出改善趋势(图9d)。
综合行动神经改善效果(改良神经功能评分)分析结果
改良神经功能评分(Modified Neurological Severity Score test)为用于检测神经学功能的结构表。按运动(肌肉状态)和知觉(mensory)(视觉、嗅觉及本体感觉(proprioceptive))项目进行评价。正常为0分，分数越高被判断为功能异常程度越严重。如图10所示，在改良神经功能评分的分析中，分泌蛋白质组处理组从治疗开始阶段呈现出明显高于磷酸盐缓冲盐水对照组和培养基对照组的治疗效果(行为改善)(图10)。
在改良神经功能评分试验中，在诱发脑缺血1日后，磷酸盐缓冲盐水对照组从平均5.4分变为14后的平均5.5分，由此可知，维持因脑卒中而产生的神经行为学障碍。在培养基对照组的情况下，临时性行为改善效果呈现在治疗后的第3日，但未发挥额外的改善效果。相反地，在分泌蛋白质组处理组的情况下，从治疗3日(改良神经功能评分4.5分)至10日(改良神经功能评分3分)呈现了持续的行为改善效果。
分泌蛋白质组分析结果
从来源于诱导多能干细胞的神经前体细胞获得的分泌蛋白质组包括聚集蛋白(Agrin)、膜联蛋白A5(AnnexinA5)、基础免疫球蛋白(BSG，Basigin)、二聚糖(Biglycan)、钙调蛋白-3(Calponin-3)、类共激活蛋白(Coactosin-like protein)、丝切蛋白-1(Cofilin-1)、胶原蛋白α-2、滞蛋白-3(Cullin-3)、消去蛋白(Destrin)、营养不良蛋白聚糖(Dystroglycan)、肝配蛋白-B2(Ephrin-B2)、输出蛋白-2(Exportin-2)、埃兹蛋白(Ezrin)、纤维连接蛋白、纤蛋白-1(Fibulin-1)、卷曲相关(Frizzled-related)蛋白质、半乳糖凝集素-3结合蛋白(Galectin-3binding protein)、颗粒体蛋白(Granulins)、生长分化因子11(Growh/differentiationfactor11)、触珠蛋白(Haptoglobin)、血液结合素(Hemopexin)、高速泳动族蛋白(High mobility group protein)B2、角蛋白(Hornerin)、输入蛋白-9(Importin-9)、胰岛素样生长因子结合蛋白2(Insulin-like grwoth factor-bindingprotein2)、狼疮La蛋白(Lupus La protein)、巨噬细胞移动抑制因子(Macrophagemigration inhibitory factor)、中期因子(Midkine)、膜突蛋白(Moesin)、神经毡蛋白2(Neuropilin2)、多效蛋白(Pleiotrophin)、抑制蛋白-1(Profilin-1)、DJ-1蛋白(ProteinDJ-1)、根蛋白(Radixin)、分泌型卷曲相关蛋白-2(Secreted frizzled-related protein-2)、胞裂蛋白-11(Septin-11)、踝蛋白-1(Talin-1)、睾丸蛋白聚糖(Testican)、促胸腺生成素(Thymopoietin)、转胶蛋白-3(Transgelin-3)及波形蛋白(Vimentin)等的蛋白质。
从人类胚胎干细胞的神经前体细胞获得的分泌蛋白质组包括聚集蛋白(Agrin)、膜联蛋白A2(Annexin A2)、吸引素(Attractin)、二聚糖(Biglycan)、血浆铜蓝蛋白(Ceruloplasmin)、丝切蛋白-1(Cofilin-1)、胶原蛋白α-1、冠蛋白-1X(Coronin-1X)、皮西丁蛋白(Dermicidin)、DERP12、肝配蛋白-B3、外生骨疣样蛋白-2(Exostosin-2)、埃兹蛋白(Ezrin)、明胶-3结合蛋白、颗粒体蛋白(Granulins)、生长分化因子11(Growh/differentiation factor 11)、触珠蛋白(Haptoglobin)、血液结合素(Hemopexin)、高速泳动族蛋白B2、角蛋白(Hornerin)、胰岛素样生长因子结合蛋白2(Insulin-like grwothfactor-binding protein 2)、狼疮La蛋白、中期因子(Midkine)、膜突蛋白(Moesin)、多表皮生长因子样结构域蛋白8(Multiple epidermal growth factor-like domains protein8)、巢蛋白-1(Nidogen-1)、胸腺旁腺素(Parathymosin)、抑制蛋白-2(Profilin-2)、DJ-1蛋白(ProteinDJ-1)、分泌型卷曲相关蛋白-2、分泌粒蛋白(Secretogranin)、踝蛋白-1(Talin-1)、胸腺素β-4(Thymosin beta-4)、转化生长因子Β诱导蛋白IG-H3(TGFBI，Transforming grwowth factor-beta-induced protein ig-h3)、转胶蛋白(Transgelin)及波形蛋白(Vimentin)等的蛋白质。
如上所述地详细说明了本发明的特定部分，对于本发明所属领域的普通技术人员而言，这些具体技术仅是优选实例，本发明的范围并不限定于上述实例。因此，由所附的权利要求书和其等同替代物定义本发明的实际范围。
序列表
<110> INDUSTRY-ACADEMIC COOPERATION FOUNDATION, Yonsei University
<120> 包含神经前体细胞或其分泌蛋白质组作为有效成分的治疗缺血性疾病或神经炎症性疾病的组合物
<130> PP150076
<150> KR 10-2014-0080009
<151> 2014-06-27
<160> 2
<170> KopatentIn 2.0
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 促血管生成素-1的正向引物
<400> 1
tgtgtccatc agctccagtt gc 22
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 促血管生成素-1的反向引物
<400> 2
cggctaccat gctcgagata gg 22
Claims (20)
1.一种治疗缺血性疾病或神经炎症性疾病的组合物，其特征在于，包含多聚唾液酸神经细胞粘附分子-阳性神经前体细胞作为有效成分。
2.根据权利要求1所述的治疗缺血性疾病或神经炎症性疾病的组合物，其特征在于，上述治疗缺血性疾病或神经炎症性疾病的组合物用于增加促血管生成素-1的表达。
3.根据权利要求1所述的治疗缺血性疾病或神经炎症性疾病的组合物，其特征在于，上述治疗缺血性疾病或神经炎症性疾病的组合物用于抑制胶质细胞或星形胶质细胞的活性化。
4.根据权利要求3所述的治疗缺血性疾病或神经炎症性疾病的组合物，其特征在于，上述治疗缺血性疾病或神经炎症性疾病的组合物用于减少CD68或胶质纤维酸性蛋白的表达。
5.根据权利要求1所述的治疗缺血性疾病或神经炎症性疾病的组合物，其特征在于，上述多聚唾液酸神经细胞粘附分子-阳性神经前体细胞从神经丛分离，上述神经丛从全能干细胞分化。
6.一种治疗缺血性疾病或神经炎症性疾病的组合物，其特征在于，包含神经前体细胞的分泌蛋白质组作为有效成分。
7.根据权利要求6所述的治疗缺血性疾病或神经炎症性疾病的组合物，其特征在于，上述神经前体细胞从全能干细胞分化。
8.根据权利要求6所述的治疗缺血性疾病或神经炎症性疾病的组合物，其特征在于，上述神经前体细胞为从全能干细胞分化的神经丛步骤中的神经前体细胞。
9.根据权利要求6所述的治疗缺血性疾病或神经炎症性疾病的组合物，其特征在于，上述神经前体细胞为多聚唾液酸神经细胞粘附分子-阳性神经前体细胞。
10.根据权利要求6所述的治疗缺血性疾病或神经炎症性疾病的组合物，其特征在于，上述神经前体细胞为多聚唾液酸神经细胞粘附分子-阴性神经前体细胞。
11.根据权利要求6所述的治疗缺血性疾病或神经炎症性疾病的组合物，其特征在于，在动物细胞培养基中培养神经前体细胞来获得的细胞培养液中含有上述分泌蛋白质组。
12.根据权利要求11所述的治疗缺血性疾病或神经炎症性疾病的组合物，其特征在于，在包含胰岛素/转铁蛋白/硒和碱性成纤维细胞生长因子的无血清动物细胞培养基中培养神经前体细胞后，去除细胞来获得上述细胞培养液。
13.根据权利要求6所述的治疗缺血性疾病或神经炎症性疾病的组合物，其特征在于，上述分泌蛋白质组包括如下的蛋白质：聚集蛋白、膜联蛋白A5、基础免疫球蛋白、二聚糖、钙调蛋白-3、类共激活蛋白、丝切蛋白-1、胶原蛋白α-2、滞蛋白-3、消去蛋白、营养不良蛋白聚糖、肝配蛋白-B2、输出蛋白-2、埃兹蛋白、纤维连接蛋白、纤蛋白-1、卷曲相关蛋白、半乳糖凝集素-3结合蛋白、颗粒体蛋白、生长分化因子11、触珠蛋白、血液结合素、高速泳动族蛋白B2、角蛋白、输入蛋白-9、胰岛素样生长因子结合蛋白2、狼疮La蛋白、巨噬细胞移动抑制因子、中期因子、膜突蛋白、神经毡蛋白2、多效蛋白、抑制蛋白-1、DJ-1蛋白、根蛋白、分泌型卷曲相关蛋白-2、胞裂蛋白-11、踝蛋白-1、睾丸蛋白聚糖、促胸腺生成素、转胶蛋白-3以及波形蛋白。
14.根据权利要求6所述的治疗缺血性疾病或神经炎症性疾病的组合物，其特征在于，上述分泌蛋白质组包括如下的蛋白质：聚集蛋白、膜联蛋白A2、吸引素、二聚糖、血浆铜蓝蛋白、丝切蛋白-1、胶原蛋白α-1、冠蛋白-1X、皮西丁蛋白、DERP12、肝配蛋白-B3、外生骨疣样蛋白-2、埃兹蛋白、半乳糖凝集素-3结合蛋白、颗粒体蛋白、生长分化因子11、触珠蛋白、血液结合素、高速泳动族蛋白B2、角蛋白、胰岛素样生长因子结合蛋白2、狼疮La蛋白、中期因子、膜突蛋白、多表皮生长因子样结构域蛋白8、巢蛋白-1、胸腺旁腺素、抑制蛋白-2、DJ-1蛋白、分泌型卷曲相关蛋白-2、分泌粒蛋白、踝蛋白-1、胸腺素β-4、转化生长因子Β诱导蛋白IG-H3、转胶蛋白以及波形蛋白。
15.根据权利要求1或6所述的治疗缺血性疾病或神经炎症性疾病的组合物，其特征在于，上述缺血性疾病选自由缺血性脑血管疾病、缺血性心脏疾病、心肌梗死、心绞痛、下肢动脉缺血性疾病以及四肢远端缺血性疾病组成的组中。
16.根据权利要求15所述的治疗缺血性疾病或神经炎症性疾病的组合物，其特征在于，上述缺血性脑血管疾病为缺血性脑卒中。
17.根据权利要求1或6所述的治疗缺血性疾病或神经炎症性疾病的组合物，其特征在于，上述神经炎症性疾病选自由阿耳茨海默氏病、帕金森病、亨丁顿舞蹈症、肌肉萎缩症、克雅氏病、多发性硬化症、肌萎缩侧索硬化症、弥漫性路易体病、白质脑炎、颞叶癫痫及炎症性脊髓损伤组成的组中。
18.根据权利要求5、7、8中任一项所述的治疗缺血性疾病或神经炎症性疾病的组合物，其特征在于，上述全能干细胞为胚胎干细胞、诱导多能干细胞、胚胎生殖细胞或胚胎癌细胞。
19.一种缺血性疾病或神经炎症性疾病的治疗方法，其特征在于，包括向所需的个体给药包含多聚唾液酸神经细胞粘附分子-阳性神经前体细胞作为有效成分的组合物的步骤。
20.一种缺血性疾病或神经炎症性疾病的治疗方法，其特征在于，包括向所需的个体给药包含神经前体细胞的分泌蛋白质组作为有效成分的组合物的步骤。
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