ES2962285T3

ES2962285T3 - Composición para su uso en el tratamiento de enfermedades neuroinflamatorias que contiene células progenitoras neurales o secretoma de las mismas como principios activos

Info

Publication number: ES2962285T3
Application number: ES18176352T
Authority: ES
Inventors: Dong Wook Kim; Han Soo Kim
Original assignee: S Biomedics Co Ltd
Current assignee: S Biomedics Co Ltd
Priority date: 2014-06-27
Filing date: 2015-06-26
Publication date: 2024-03-18
Anticipated expiration: 2035-06-26
Also published as: EP3403658B1; US20230158079A1; EP3162372A1; EP3162372B1; EP3403658A1; ES2865373T3; JP6400744B2; KR20160001908A; KR101675123B1; JP2017520578A; CN106714814A; EP3162372A4; US20170136068A1; WO2015199499A1; EP3403658C0

Abstract

La presente invención proporciona una composición para tratar enfermedades isquémicas o enfermedades neuroinflamatorias. Las células progenitoras neurales positivas para PSA-NCAM utilizadas en la presente invención promueven la angiogénesis en el tejido inyectado e inhiben una respuesta inflamatoria. Las células progenitoras neurales PSA-NCAM positivas pueden aislarse simplemente usando un anticuerpo anti-PSA-NCAM y exhiben excelentes actividades angiogénicas y antiinflamatorias en comparación con las células madre mesenquimales y, por lo tanto, pueden ser útiles como composición para tratar eficazmente enfermedades isquémicas causadas por una lesión vascular y enfermedades por daño nervioso causadas por inflamación. Además, un secretoma de las células progenitoras neurales de la presente invención reduce el sitio de lesión isquémica y permite que se recupere una función neurológica, y por lo tanto puede usarse como agente para tratar enfermedades isquémicas y trastornos degenerativos del sistema nervioso tales como enfermedades de daño nervioso causadas. por inflamación. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Composición para su uso en el tratamiento de enfermedades neuroinflamatorias que contiene células progenitoras neurales o secretoma de las mismas como principios activos

Campo técnico

La presente invención se refiere a una composición para su uso en un método de tratamiento de enfermedades neuroinflamatorias que contiene células precursoras neurales positivas para moléculas de adhesión de células neurales polisialiladas (PSA-NCAM, por sus siglas en inglés) como principio activo.

Antecedentes de la técnica

Las células madre se consideran un material candidato terapéutico prometedor para diversas enfermedades debido a su multipotencia. Por ejemplo, las células madre mesenquimáticas (<m>S<c>, por sus siglas en inglés) liberan muchos factores nutricionales que pueden obtenerse y aislarse fácilmente y lograr la promoción de la angiogénesis y la inhibición de la inflamación (Caplan, A. I., y Dennis, J. E. (2006).Journal of Cellular Biochemistry,98, 1076-1084). Estas características de las MSC se han tenido en cuenta en estudios para la aplicación en el tratamiento de varias enfermedades humanas. Estudios recientes han descubierto que las MSC contribuyen a la reparación de tejidos en un gran número de modelos animales y tratamientos clínicos humanos (Chen, J., Li, Y., Katakowski, M.,et al.(2003).Journal of Neuroscience Research,73, 778-786; Kopen, G. C., Prockop, D. J., y Phinney, D. G. (1999).Proceedings of the National Academy of Sciences,96, 10711-10716). Varias publicaciones indicaron que la capacidad de diferenciaciónin vitrode MSC en el linaje neural (Bae, K. S., Park, J. B., Kim, H. S., Kim, D. S., Park, D. J., y Kang, S. J. (2011).Yonsei Medical Journal,52, 401 412) y astrocitos (Kopen, G. C., Prockop, D. J., y Phinney, D. G. (1999).Proceedings of the National Academy of Sciences,96, 10711-10716), pero no hay evidencia definitiva sobre qué funciones realizan las células diferenciadasin vivo.Parece que el efecto favorable de las MSC es inducido por mecanismos paracrinos más que por el reemplazo celular y, por lo tanto, el trasplante de las MSC tendría efectos temporales y limitados, pero no el alivio mantenido durante un período de tiempo largo (Cho, S. R., Kim, Y. R., Kang, H. S.,et al.(2009).Cell Transplantation,18, 1359-1368).

Por el contrario, las células madre embrionarias (ESC, por sus siglas en inglés) pueden diferenciarse en todos los tipos celulares particulares derivados de tres capas germinales embrionarias y tienen una gran capacidad de autorrenovación. Evidentemente, las células precursoras neurales (NPC, por sus siglas en inglés) derivadas de ESC, en primer lugar, se diferencian en un tipo celular particular de células de linaje neural incluyendo las células neurales, astrocitos y oligodendrocitos y, por lo tanto, se consideran una fuente de células para la reparación de los tejidos cerebrales. Estas células secretan algunos factores para promover la supervivencia y la proliferación de células precursoras neurales endógenas (Capone, C., Frigerio, S., Fumagalli, S.,et al.(2007).PLoSOne,7, e373). Sin embargo, aún no se sabe cómo las NPC diferenciadas de las ESC o el líquido de cultivo de las NPC contribuyen a la mejora de las funciones después del trasplante en modelos de enfermedades.

KIM, DAE-SUNGET AL., "Highly Pure and Expandable PSA-NCAM-Positive Neurat', PLOS ONE,vol. 7, n.° 7, julio de 2012, desvela células precursoras neurales positivas para PSA-NCAM y sus efectos beneficiosos en la terapia celular para trastornos neurodegenerativos.

DIBAJNIAET AL., "Role of neural precursor cells in promoting repair following stroke", ACTA PHARMACOLOGICA SINICA,vol. 34, n.° 1,2013, páginas 78-90, desvela el papel de las células precursoras neurales en la promoción de la reparación después de un ictus, por ejemplo, ictus isquémico.

MACAS JADRANKAET AL., "Increased generation of neuronal progenitors after ischemic injury in the aged adult human forebrain", JOURNAL OF NEUROSCIENCE,SOCIETY FOR NEUROSCIENCE, EE.UU., vol. 26, n.° 50, 30 de noviembre de 2006, páginas 13114-13119, desvela, por ejemplo, una mayor generación de células precursoras neurales positivas para PSA-NCAM después de una lesión isquémica en el prosencéfalo humano adulto de edad avanzada.

FOX GERARD BET AL., "The modulations of NCAM polysialylation state that follow transient global ischemia are brief on neurons but enduring on glia", JOURNAL OF NEUROPATHOLOGY AND EXPERIMENTAL NEUROLOGY,LIPPINCOT WILLIAMS AND WILKINS, NUEVA YORK, vol. 60, n.° 2, 31 de enero de 2001, páginas 132-140, desvela un proceso adaptativo después de un evento isquémico que consiste en la expresión de NCAM polisialilada en el hipocampo del jerbo isquémico como modelo para la reparación/remodelación dependiente de neurotróficos que es resultado de la siguiente interrupción transitoria del flujo sanguíneo.

IWAI MASANORIET AL., "Three steps of neural stem cells development in gerbil dentate gyrus after transient ischemia", JOURNAL OF CEREBRAL BLOOD FLOW & METABOLISM,NATURE PUBLISHING GROUP, EE.UU., vol. 22, n.° 4, 31 de marzo 2002, páginas 411-419, desvela, por ejemplo, tres etapas del desarrollo de células madre neurales en el giro dentado del jerbo después de una isquemia transitoria, publicando el aumento del desarrollo y la migración de células positivas para PSA-NCAM en la zona subgranular después de la isquemia como signo de neurogénesis persistente después de una isquemia global transitoria.

BASE DE DATOS WPI, Semana 201410, Thomson científico, Londres, Reino Unido; documento AN 2012-R77360 y documento KR 2012 0136638, 20 de diciembre de 2012, desvela, por ejemplo, un método para separar células precursoras neurales de células madre pluripotentes mediante la obtención de población celular, la puesta en contacto la de población celular con anticuerpo contra la molécula de adhesión de células neurales polisialada (PSA-NCAM), la separación de la célula unida con el anticuerpo y la diferenciación de las células separadas en roseta neural.

El documento WO 2008/070513 A1 desvela, por ejemplo, la modulación de PSA-NCAM como regulador en el tratamiento de una enfermedad ocular.

Descripción detallada de la invención

Problema técnico

Los presentes inventores se esforzaron en desarrollar un método fundamental para tratar la enfermedad neuroinflamatoria. Como resultado, los presentes inventores descubrieron, cuando se inyectan en el sitio de la lesión células progenitoras neurales que expresan PSA-NCAM, que es una molécula adhesiva nerviosa en la superficie celular, se potencia la neurorregeneración, se promueve la vascularización y se suprime la reacción inflamatoria, de manera que el daño del tejido nervioso provocado por la inflamación se trate de manera eficiente, completando de este modo la presente invención. Además, como un enfoque diferente del trasplante de células madre, es posible reducir el área de lesión isquémica y restablecer la función nerviosa mediante la adición al sitio de la lesión de las proteínas secretoras de células neuroepiteliales (secretoma), recuperando de este modo la función perdida en enfermedades neuroinflamatorias, confirmando de este modo que la enfermedad puede tratarse eficazmente, completando de este modo la presente invención.

En consecuencia, un aspecto de la presente invención es proporcionar una composición para su uso en un método de tratamiento de una enfermedad neuroinflamatoria, comprendiendo la composición células precursoras neurales positivas para moléculas de adhesión de células neurales polisialiladas (PSA-NCAM) como principio activo,

en donde la enfermedad neuroinflamatoria es una lesión de la médula espinal,

en donde las células precursoras neurales positivas para PSA-NCAM se separan de rosetas neurales diferenciadas de células madre pluripotentes,

en donde las células madre pluripotentes son células madre embrionarias o células madre pluripotentes inducidas (iPSC, por sus siglas en inglés).

Otros propósitos y ventajas de la presente invención serán más obvios con la siguiente descripción detallada de la invención, las reivindicaciones y los dibujos.

Solución técnica

De acuerdo con un aspecto de la presente invención, se proporciona una composición para su uso en el tratamiento de una enfermedad neuroinflamatoria, conteniendo la composición células precursoras neurales positivas para moléculas de adhesión de células neurales polisialiladas (PSA-NCAM) como principio activo.

De acuerdo con la presente invención, la composición para su uso de acuerdo con la presente invención inhibe las respuestas inflamatorias en un sujeto con una enfermedad neuroinflamatoria y, por lo tanto, suprime el desarrollo de síntomas de las enfermedades, o elimina o alivia las enfermedades. Por lo tanto, la composición de la presente invención puede ser en sí misma una composición para su uso en el tratamiento de una enfermedad neuroinflamatoria. Como se usa en el presente documento, el término "tratamiento" o la expresión "agente de tratamiento" incluye un significado de "auxiliar de tratamiento" o "adyuvante de tratamiento".

De acuerdo con la presente invención, la composición para su uso de acuerdo con la presente invención inhibe la activación de células microgliales reactivas y astrocitos en tejidos neurales administrados (o trasplantados). Las células microgliales realizan una función inmunitaria primaria en el sistema nervioso central, y las células microgliales activadas, a diferencia de las células microgliales en un estado normal, realizan la fagocitosis activa y la proliferación celular, y generan materiales mediados por inflamación a través de la expresión de genes, tales como citocinas (por ejemplo, TNF-a, IL-1p e IL-6), quimiocinas, óxido nítrico sintasa inducible (iNOS) y ciclooxigenasa-2 (COX-2). Los astrocitos activados también secretan citocinas inflamatorias, tales como IL-6, TGF-p, LIF o IL-1, y las citocinas secretadas activan nuevamente las células microgliales y los astrocitos, agravando de este modo los entornos en los tejidos. Por lo tanto, la composición para su uso de acuerdo con la presente invención, que inhibe la activación de células microgliales y astrocitos, puede bloquear eficazmente el daño de los tejidos neurales debido a respuestas inflamatorias.

Como se desvela en el presente documento, la composición para su uso de acuerdo con la presente invención aumenta la expresión de angiopoyetina-1.

Como se usa en el presente documento, la expresión "aumento de la expresión" se refiere a aumentar significativamente la expresión de un gen o una proteína de manera que sea medible, en comparación con personas normales y, más específicamente, el término se refiere a un nivel de expresión del 130 % o más en comparación con los controles.

Como se desvela en el presente documento, la composición para su uso de acuerdo con la presente invención inhibe la activación de células gliales o astrocitos.

Como se usa en el presente documento, la expresión "inhibición de la activación" se refiere a una transformaciónin vivoque provoca deterioros en el número, las funciones y la activación de células gliales o astrocitos, y por ejemplo, se refiere a disminuir significativamente la expresión de un marcador específico (por ejemplo, CD68 o GFAP) de esas células, siendo imposible detectar la expresión, o haciendo que la expresión sea de un nivel insignificante.

De acuerdo con una realización de la presente invención, las células precursoras neurales positivas para PSA-NCAM se separan de rosetas neurales diferenciadas de células madre pluripotentes.

De acuerdo con la presente invención, las células precursoras neurales positivas para PSA-NCAM pueden separarse de rosetas neurales, que se diferencian de células madre pluripotentes a través de la estimulación de la diferenciación neural, usando un anticuerpo anti-PSA-NCAM.

Como se desvela en el presente documento, se proporciona una composición para tratar una enfermedad isquémica o una enfermedad neuroinflamatoria, conteniendo la composición, como principio activo, un secretoma de células precursoras neurales.

Como se usa en el presente documento, la expresión "secretoma de células precursoras neurales" se refiere a un agregado de proteínas secretadas de células precursoras neurales al exterior (medio de cultivo) cuando se cultivan las células precursoras neurales.

Como se desvela en el presente documento, las células precursoras neurales utilizadas en la preparación del secretoma de la presente divulgación se diferencian de células madre pluripotentes.

Como se desvela en el presente documento, las células precursoras neurales son células precursoras neurales en la etapa de rosetas neurales formadas por la diferenciación de células madre pluripotentes (por ejemplo, células madre embrionarias o células madre pluripotentes inducidas) en células de linaje neural.

De acuerdo con una realización de la presente invención, las células precursoras neurales son células precursoras neurales positivas para PSA-NCAM.

Como se desvela en el presente documento, las células precursoras neurales son células precursoras neurales negativas para PSA-NCAM.

Las células precursoras neurales positivas o negativas para PSA-NCAM pueden separarse de rosetas neurales, que se diferencian de células madre pluripotentes mediante la estimulación de la diferenciación neural, usando un anticuerpo anti-PSA-NCAM.

Como se desvela en el presente documento, el secretoma está contenido en un líquido de cultivo celular obtenido cultivando células precursoras neurales en un medio de cultivo de células animales.

Como se desvela en el presente documento, el líquido de cultivo celular de las células precursoras neurales puede obtenerse cultivando las células precursoras neurales en un medio de cultivo de células animales sin suero que contiene insulina/transferrina/selenio (ITS, por sus siglas en inglés) y factor de crecimiento de fibroblastos básico (bFGT, por sus siglas en inglés) y después retirando las células. Para el cultivo, células precursoras neurales que se obtienen subcultivando (por ejemplo, al menos cuatro pases) las células precursoras neurales en un medio de cultivo de células animales que contiene bFGF suplementado con, por ejemplo, N2, B-27 y/o Gem21.

La retirada de las células del medio de cultivo puede realizarse usando un método de separación celular ordinario, tal como centrifugación o filtración.

Para el medio de cultivo de células animales, puede usarse, sin limitación, un medio habitual que se usa para cultivar células precursoras neurales. Por ejemplo, puede usarse DMEM/F12, DMEM o RPMI-1640.

Como se desvela en el presente documento, las células precursoras neurales que se diferencian de células madre pluripotentes inducidas en seres humanos y el secretoma de células precursoras neurales incluyen las siguientes proteínas:

Agrina, anexina A5, BSG (Basigina), biglicano, calponina-3, proteína similar a coactosina, cofilina-1, colágeno alfa-2, culina-3, destrina, distroglicano, efrina-B2, exportina-2, ezrina, fibronectina, fibulina-1, proteína relacionada con frizzled, proteína de unión a gelatina-3, granulinas, factor 11 de crecimiento/diferenciación, haptoglobina, hemopexina, proteína de grupo de alta movilidad B2, hornerina, importina-9, proteína 2 de unión a factor de crecimiento insulínico, proteína La de Lupus, factor inhibidor de migración de macrófagos, midquina, moesina, neuropilina 2, pleiotrofina, profilina-1, proteína DJ-1, radixina, proteína 2 relacionada con el frizzled secretada, septina-11, talina-1, testicano, timopoyetina, transgelina-3 y vimentina.

Como se desvela en el presente documento, las células precursoras neurales que se diferencian de células madre embrionarias en seres humanos y el secretoma de células precursoras neurales incluyen las siguientes proteínas:

Agrina, anexina A2, atractina, biglicano, ceruloplasmina, cofilina-1, colágeno alfa-1, coronina-1X, dermicidina, DERP12, eprina-B3, exoestosina-2, ezrina, proteína de unión a gelatina-3, granulinas, factor 11 de crecimiento/diferenciación, haptoglobina, hemopexina, proteína de grupo de alta movilidad B2, hornerina, proteína 2 de unión a factor de crecimiento insulínico, proteína La de Lupus, midquina, moesina, proteína 8 de múltiples dominios similares al factor de crecimiento epidérmico, nidógeno-1, paratimosina, profilina-2, proteína DJ-1, proteína 2 relacionada con el frizzled secretada, secretogranina, talina-1, timosina beta-4, TGFBI (proteína ig-h3 inducida por el factor de crecimiento transformante beta), transgelina y vimentina.

En lo sucesivo en el presente documento, se describen los contenidos comunes de la composición para su uso en un método de la presente invención.

Como se usa en el presente documento, la expresión "células madre" es una expresión genérica para células indiferenciadas antes de la diferenciación en células respectivas que constituyen tejidos, y las células madre tienen la capacidad de diferenciarse en células particulares mediante estimulaciones de diferenciación particulares (entorno). A diferencia de las células indiferenciadas en las que la división celular ha cesado, las células madre son capaces de producir las mismas células que las propias a través de división celular (autorrenovación) y tienen plasticidad en la diferenciación, en la que las células madre se diferencian en células particulares mediante la aplicación de la estimulación de diferenciación y pueden diferenciarse en diversas células mediante diferentes entornos o mediante diferente diferenciación.

Las células madre utilizadas en la presente invención son células madre pluripotentes que proliferan indefinidamentein vitroy pueden diferenciarse en diversas células derivadas de todas las capas embrionarias (ectodermo, mesodermo y endodermo). Más específicamente, las células madre pluripotentes son células madre embrionarias, células madre pluripotentes inducidas (iPSC), células germinales embrionarias o células de carcinoma embrionario. En la medida en que no implique la destrucción de un embrión humano, las células madre embrionarias derivan de la masa celular interna (ICM, por sus siglas en inglés) del blastocisto, y las células germinales embrionarias derivan de células germinales primordiales presentes en las crestas gonadales de 5-10 semanas de edad.

Las células madre pluripotentes inducidas (iPSC) son un tipo de células madre pluripotentes derivadas artificialmente de células no pluripotentes (por ejemplo, células somáticas) insertando un gen particular que transmite pluripotencia a los mismos. Se considera que las células madre pluripotentes inducidas son las mismas que las células madre pluripotentes (por ejemplo, células madre embrionarias), puesto que las células madre pluripotentes inducidas tienen genes de células madre y expresión de proteínas, patrón de metilación cromosómica, tiempo de duplicación, capacidad de formación de cuerpos embrioides, capacidad de formación de teratoma, capacidad viable de formación de quimeras, hibridabilidad y capacidad de diferenciación muy similares a los de las células madre embrionarias.

La expresión "rosetas neurales" se refiere a células madre neurales en la fase inicial del procedimiento de diferenciación neural de células madre embrionarias humanas, y la roseta neural tiene una forma radial cilíndrica. Las rosetas neurales se componen de células que expresan marcadores neuroectodérmicos iniciales, tales como Pax6 y Sox1, y pueden diferenciarse en diversas células neurales y células neurogliales. La estimulación de la diferenciación neural puede diferenciarse mediante un método que se realiza habitualmente en la técnica, por ejemplo, medios sin suero (Tropepe Vet al., Neuron.30:6578(2001)), factores de crecimiento de fibroblastos (FGF, por sus siglas en inglés) y tratamiento con morfógenos, tales como Wnt y ácido retinoico (RA, por sus siglas en inglés) (Ying QLet al. Nat Biotechnol.

21:183186(2003)), pero no se limita a ello.

Como anticuerpo pueden usarse anticuerpos policlonales o anticuerpos monoclonales. Los anticuerpos contra PSA-NCAM pueden producirse mediante los métodos que se realizan convencionalmente en la técnica, por ejemplo, un método de fusión (Kohler y Milstein,European Journal of Immunology,6:511-519 (1976)), un método de ADN recombinante (documento USP 4.816.56) o un método de biblioteca de anticuerpos en fagos (Clacksonet al., Nature,352:624-628 (1991) yMarkset al., J. Mol. Biol.,222:58, 1-597 (1991)). Un procedimiento general para la producción de anticuerpos se describe en detalle en Harlow, E. y Lane, D.,Using Antibodies: A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Press, Nueva York, 1999; Zola, H.,Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques,CRC Press, Inc., Boca Ratón, Florida, 1984; y Coligan,CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY,Wiley/Greene, NY, 1991. Por ejemplo, las células de hibridoma que producen anticuerpos monoclonales pueden obtenerse fusionando estirpes celulares inmortales con linfocitos productores de anticuerpos, para lo cual la tecnología ha sido bien conocida por los expertos en la materia y puede realizarse fácilmente. Los anticuerpos policlonales pueden obtenerse inyectando antígenos de PSA-NCAM en un animal adecuado, recogiendo antisueros del animal y después aislando anticuerpos de los antisueros usando la técnica de afinidad conocida.

Como se usa en el presente documento para recitar la PSA-NCAM, el término "anticuerpo" se refiere a un anticuerpo específico de PSA-NCAM, y el anticuerpo se une específicamente a la proteína PSA-NCAM, e incluye una forma completa de un anticuerpo y un fragmento de unión a antígeno de la molécula de anticuerpo. El anticuerpo completo tiene una estructura que tiene dos cadenas ligeras de longitud completa y dos cadenas pesadas de longitud completa, y las cadenas ligeras están unidas a las cadenas pesadas a través de un enlace disulfuro, respectivamente. El fragmento de unión a antígeno de la molécula de anticuerpo es un fragmento que tiene una función de unión a antígeno e incluye Fab, F(ab'), F(ab')2 y Fv.

Para la separación de células precursoras neurales positivas para PSA-NCAM usando un anticuerpo, puede usarse clasificación celular activada por fluorescencia (FACS, por sus siglas en inglés), clasificación celular activada magnética (MACS, por sus siglas en inglés), adherencia de plástico recubierto de anticuerpos y lisis mediada por complemento.

Como se usa en el presente documento, el término "tratamiento" se refiere a: (a) suprimir el desarrollo de la enfermedad, trastorno o síntoma; (b) reducir la enfermedad, trastorno o síntoma; o (c) eliminar los síntomas de la enfermedad, trastorno o síntoma. La composición para su uso de acuerdo con la presente invención suprime el desarrollo de síntomas de una enfermedad neuroinflamatoria, o elimina o reduce los síntomas de una enfermedad neuroinflamatoria. Por lo tanto, la composición de la presente invención puede ser en sí misma una composición para su uso en el tratamiento de una enfermedad neuroinflamatoria. Como se usa en el presente documento, el término "tratamiento" o "agente de tratamiento" incluye un significado de "auxiliar de tratamiento" o "adyuvante terapéutico".

Como se usa en el presente documento, la expresión "enfermedad neuroinflamatoria" se refiere a una enfermedad provocada por el daño de los tejidos neurales debido a respuestas inflamatorias.

De acuerdo con una realización de la presente invención, la enfermedad neuroinflamatoria que puede tratarse mediante la composición de la presente invención es una lesión inflamatoria de la médula espinal.

Como se usa en el presente documento, el término "administración" o "administrar" se refiere a un método en donde una cantidad terapéuticamente eficaz de la composición de la presente invención se administra directamente a un sujeto para formar la misma cantidad de la misma en el cuerpo del sujeto. Por lo tanto, el término "administrar" incluye la inyección de un principio activo (un secretoma de células precursoras neurales positivas para PSA-NCAM o células precursoras neurales) alrededor de un sitio de lesión y, por lo tanto, el término "administrar" se usa con el mismo significado que el término "inyectar".

La expresión "cantidad terapéuticamente eficaz" de la composición se refiere al contenido de un extracto, que es suficiente para proporcionar un efecto terapéutico o profiláctico a un sujeto que se ha de tratar y, por lo tanto, la expresión tiene un significado que incluye "cantidad profilácticamente eficaz". Como se usa en el presente documento, el término "sujeto" incluye, pero sin limitación, ser humano, ratón, rata, cobaya, perro, gato, caballo, vaca, cerdo, mono, chimpancé, babuino o mono Rhesus. Específicamente, el sujeto de la presente invención es un ser humano.

En los casos en los que la composición para su uso de acuerdo con la presente invención se prepara como una composición farmacéutica, la composición farmacéutica de la presente divulgación contiene un vehículo farmacéuticamente aceptable. El vehículo farmacéuticamente aceptable contenido en la composición farmacéutica de la presente divulgación es uno que se usa convencionalmente en la formulación, y los ejemplos del mismo pueden incluir, pero sin limitación, lactosa, dextrosa, sacarosa, sorbitol, manitol, almidón, goma arábiga, fosfato de calcio, alginato, gelatina, silicato de calcio, celulosa microcristalina, polivinilpirrolidona, celulosa, agua, jarabe, metilcelulosa, hidroxibenzoato de metilo, hidroxibenzoato de propilo, talco, estearato de magnesio, aceite mineral, solución salina, solución salina tamponada con fosfato (PBS) y medios.

La composición farmacéutica de la presente divulgación puede contener adicionalmente, además de los ingredientes anteriores, un lubricante, un agente humectante, un agente edulcorante, un agente saborizante, un emulsionante, un agente de suspensión, un conservante y similares. Los vehículos y preparaciones farmacéuticamente aceptables adecuados se describen en detalle enRemington's Pharmaceutical Sciences(19a ed., 1995).

La composición farmacéutica de la presente divulgación puede administrarse por vía oral o por vía parenteral, y los ejemplos de administración parenteral pueden incluir la administración intravenosa, la administración intracerebroventricular, la administración intratecal o la administración intravascular.

Una dosis adecuada de la composición farmacéutica de la presente divulgación puede variar dependiendo de diversos factores, tales como el método de formulación, la forma de administración, la edad, el peso corporal, el género, la morbilidad y la dieta del paciente, el tiempo de administración, la vía de administración, la tasa de excreción y la sensibilidad de respuesta. La dosis general de la composición farmacéutica de la presente divulgación es de 102-1010 células por día basándose en un adulto.

La composición farmacéutica de la presente divulgación puede formularse en una forma farmacéutica unitaria o puede prepararse en un recipiente multidosis usando un vehículo y/o excipiente farmacéuticamente aceptable de acuerdo con el método fácilmente realizado por un experto habitual en la materia a la que pertenece la presente invención. En este caso, la forma farmacéutica puede ser una solución en un medio oleoso o acuoso, una suspensión, un jarabe o una emulsión, un extracto, una pulverización, un polvo, un gránulo, un comprimido o una cápsula y puede incluir adicionalmente un dispersante o un estabilizante.

Efectos ventajosos

Las características y ventajas de la presente invención se resumen a continuación:

(a) La presente invención proporciona una composición para su uso en el tratamiento de enfermedades neuroinflamatorias.

(b) Las células progenitoras neurales positivas para PSA-NCAM utilizadas en la presente invención promueven la angiogénesis en el tejido inyectado e inhiben una respuesta inflamatoria. Las células progenitoras neurales positivas para PSA-NCAM pueden aislarse simplemente usando un anticuerpo anti-PSA-NCAM y presentan excelentes actividades angiogénicas y antiinflamatorias en comparación con las células madre mesenquimáticas y, por lo tanto, pueden ser útiles como composición para tratar eficazmente enfermedades de daño nervioso provocados por la inflamación.

(c) Aunque no forma parte de la presente invención, un secretoma de las células progenitoras neurales de la presente divulgación reduce el sitio de la lesión isquémica y permite que se recupere una función neurológica y, por lo tanto, puede usarse como agente para tratar enfermedades isquémicas y trastornos degenerativos del sistema nervioso tales como enfermedades de daño nervioso provocadas por la inflamación.

Breve descripción de los dibujos

La FIG. 1 ilustra la reducción del área de infracción en cerebro isquémico de rata trasplantado con NPCpsa-ncam+ y MSC. La FIG. 1a es una vista esquemática que muestra el diseño experimental. Un día después de pMCAo, los animales se asignaron aleatoriamente para recibir NPCpsa-ncam+, MSC o PBS (n = 10 cada uno). El día 26 después del trasplante, los animales se sacrificaron y los cerebros se procesaron para la inmunohistoquímica. La FIG. 1b muestra el efecto del trasplante de MSC y NPCPSA'NCAM+ sobre el tamaño del infarto en un modelo de rata con pMCAo el día 26 después del trasplante. * P < 0,05 y *** P < 0,01 en comparación con el grupo de PBS. La FIG. 1c muestra imágenes representativas obtenidas el día 26 después del trasplante de células en ratas tratadas con PBS, NPCPSA-NCAM+ o MSC.

La FIG. 2 ilustra la potenciación del rendimiento conductual en un modelo de ictus en rata trasplantado con n p Cpsa-ncam+. Las imágenes respectivas muestran los resultados del cambio de peso corporal (FIG. 2a), el ensayo de fallo de la pata (FIG. 2b), el ensayo asimétrico (FIG. 2c), el ensayo de equilibrio en barra (FIG. 2d), el ensayo de tracción prensil (FIG. 2e) y mNSS (FIG. 2f). Los valores de medición son media ± E.T.M. * P < 0,05, ** P < 0,01 y *** P < 0,001 en comparación con el grupo de PBS.

La FIG. 3 ilustra la integración y diferenciación de NPCPSA-NCAM+ viables en tejido cerebral de rata. La FIG. 3a muestra un sitio de infracción. Se sometieron la supervivencia y la proliferación de NPCPSA-NCAM+ trasplantadas el día 26. Se observaron células positivas para Ki67 (verde) o DCX (rojo) en cerebro isquémico de rata. Barra de escala: 500 um. La FIG. 3b muestra grandes aumentos del recuadro en la FIG. 3a. Barras de escala: 200 um. La FIG. 3c muestra ejemplos de células NPCpsa-ncam+ que coexpresan hNu (verde) y DCX (rojo). Muchas células NPCpsa-ncam+ injertadas demostraron positividad para hNu, indicando buena supervivencia e integración en el cerebro dañado. Barras de escala: 20 um. La FIG.

3d muestra que se observaron pocas células K167+ hNu- en proliferación dentro y alrededor del tracto de la aguja en la mayoría de los casos de grupos injertados con MSC. Barras de escala: 200 um. La FIG. 3b proporciona imágenes con respecto a DCX/DAPI, Ki67/DAPI, DCX/Ki67/DAPI, Tuj1/DAPI y Nestina/Ki67/DAPI, desde el lado izquierdo. La FIG. 3c proporciona imágenes con respecto a DAPI, hNu, hNU/DCX y DCX en el sentido de las agujas del reloj desde la izquierda. La FIG. 3d proporciona imágenes con respecto a hNU/DAPI, Ki37/DAPI y hNU/Ki67 desde el lado izquierdo.

La FIG. 4 ilustra el compromiso neuronal de NPCpsa-ncam+ y reducción de la activación glial en tejido cerebral de rata. La FIG. 4a muestra que se observaron células con hMito+ (rojo) y MAP2+ (verde) en cerebro de rata trasplantado con NPCPSA-ncam+. Barra de escala: 20 um. La FIG. 4b muestra imágenes confocales de células injertadas el día 26 después del trasplante. Las células derivadas del donante (verde, hNu+) colocalizadas con MAP2 (rojo) dentro de los injertos generados por trasplante de NPCPSA-NCAM+. DAPI, azul. La FIG. 4c muestra que las neuronas del hospedador en el cuerpo estriado contralateral estaban desprovistas de hMito colocalizado con MAP2. Obsérvense las células MAP2+ prominentes en el cuerpo estriado. Barra de escala: 20 um. La FIG. 4d muestra que las células hMito+GFAP+ no fueron detectables en el cerebro de rata trasplantado con<n p>Cpsa-ncam+. Barra de escala: 20 um. La FIG. 4e muestra que la positividad de ED-1 en el cuerpo estriado ipsilateral se redujo significativamente en el grupo trasplantado con NPCpsa-ncam+ y, en menor medida, en el grupo trasplantado con MSC. Ambos grupos trasplantados con NPCpsa-ncam+ y MSC fueron significativamente diferentes del grupo de PBS. La expresión de GFAP fue notablemente inferior en el grupo trasplantado con NPCPSA-NCAM+ que en los grupos de MSC o PBS. Barra de escala: 200 um. La FIG. 4f muestra el número de células positivas para ED1 o GFAP contadas en al menos cinco campos microscópicos separados. Los valores de medición son media ± E.T.M. * P < 0,05 y *** P < 0,001 cuando las comparaciones múltiples se realizaron entre los grupos.

La FIG. 5 ilustra la estimulación de la angiogénesis en cerebro isquémico de rata trasplantada con<n p>Cpsa-ncam+. La FIG.

5a muestra resultados de inmunotinción de cerebro isquémico del grupo de PBS, el grupo trasplantado con NPCpsa-ncam+ o MSC, respectivamente. Barra de escala: 200 um. La FIG. 5b muestra imágenes representativas de células endoteliales vasculares positivas para a-SMA de origen del hospedador (rojo) en la región injertada con NPCpsa-ncm+. Barra de escala: 20 um. La FIG. 5c muestra los resultados del análisis cuantitativo de microvasos positivos para a-SMA en ratas trasplantadas con NPCPSA-NCM+ o MSC. Los valores de medición son media ± E.T.M.*P< 0,05 y P < 0,01 en el grupo de NPCpsa-ncam+ en comparación con el grupo de MSC o PBS, respectivamente. La FIG. 5d muestra los resultados de los niveles de expresión de angiopoyetina-1 de rata en cerebro isquémico evaluados usando RT-PCR los días 7 y 26 después del trasplante con NPCPSA-NCAM+ (NPC) o MSC. Se muestran la amplificación por RT-PCR de angiopoyetina-1 (arriba) y la cuantificación de los niveles de ARNm normalizados por GAPDH con respecto al control simulado (valor basal) (abajo) (n = 3 por grupo). Los valores de medición son media ± E.T.M.P< 0,05 en comparación con el grupo de PBS.

La FIG. 6 ilustra los niveles de expresión de factores neurotróficos de rata y humanos en cerebro isquémico, evaluados usando RT-PCR el día 26 después del trasplante con NPCPSA-NCAM+, MSC o PBS. Se muestran la amplificación por RT-PCR de factores neurotróficos y la cuantificación de los niveles de ARNm normalizados por GAPDH con respecto a los controles simulados (valor basal) (n = 3 por grupo). Los valores de medición son media ± E.T.M. *P< 0,05 en comparación con el grupo de PBS.

La FIG. 7 muestra los tamaños del sitio de lesión isquémica en el grupo de control de PBS, el grupo de control de medio y el grupo tratado con secretoma.

La FIG. 8 ilustra el cambio en el peso corporal en el grupo de control de PBS, el grupo de control de medio y el grupo tratado con secretoma.

La FIG. 9 ilustra los resultados del análisis conductual en el grupo de control de PBS, el grupo de control de medio y el grupo tratado con secretoma. La FIG. 9a muestra el resultado del ensayo de equilibrio en barra; la FIG. 9b muestra los resultados del ensayo de tracción prensil; la FIG. 9c muestra los resultados del ensayo de fallo de la pata; la FIG. 9d muestra resultados de cruce de líneas que indican la actividad del comportamiento por unidad de tiempo.

La FIG. 10 muestra los resultados del análisis integral del efecto de mejora de las neuronas conductuales (mNSS) en el grupo de control de PBS, el grupo de control de medio y el grupo tratado con secretoma.

* Valor de P < 0,05, ** Valor de P < 0,01 en las FIG. 7 a 10.

Modo para realizar la invención

EJEMPLOS

Ejemplo 1: Efecto del tratamiento de células precursoras neurales positivas para PSA-NCAM sobre enfermedades isquémicas y una enfermedad neuroinflamatoria

Métodos

Cultivo y diferenciación de MSC humanas y n PCfsa-ncam+ derivadas de ESC humanas

El uso de células humanas fue aprobado por la Junta de revisión institucional (N.° de IRB 4-2008-0643). Se obtuvo médula ósea humana mediante aspiración de la cresta ilíaca posterior de voluntarios adultos sanos que dieron su consentimiento informado. Brevemente, se aislaron células mononucleares de médula ósea usando centrifugación en gradiente de densidad (GE Healthcare, Uppsala, Suecia) y se sembraron en placa a una densidad de 1*106 células/cm2 en DMEM suplementado con FBS al 10 % (Gibco, Grand Island, NY), y se cultivaron a 37 a en una atmósfera humidificada que contenía CO2 al 5 %. Después de 24 h, las células no adherentes se lavaron y se retiraron. El medio se cambió cada 3 días y las células se subcultivaron usando tripsina al 0,05 %/EDTA (Invitrogen, Carlsbad, CA) cuando alcanzaron una confluencia del 90 %.

Para este estudio se usaron MSC adherentes en los pases 3-5. Para la inducción neural, se cultivaron cuerpos embrioides (EB, por sus siglas en inglés) derivados de hESC durante 4 días en suspensión con dorsomorfina (DM, por sus siglas en inglés) 5 |jM (Sigma, San Luis, MO) y SB431542 (SB) 5-10 |jM (Calbiochem, San Diego, CA) en medio de hESC privado de bFGF (Invitrogen) y después unido a placas recubiertas con Matrigel (BD Biosciences, Bedford, MA) en medio 1*N2 (Invitrogen) suplementado con bFGF 20 ng/ml durante los 5 días adicionales (Kim, D. S., Lee, D. R., Kim, H. S.,et al.(2012).PLoSOne,7, e39715). Las rosetas neurales que aparecían en el centro de las colonias de EB adheridas se aislaron cuidadosamente usando pipetas de vidrio estirado de las células planas circundantes. Después se sembraron pequeños grupos de rosetas en placas recubiertas con Matrigel después de una trituración suave y se cultivaron en DMEM/F12 suplementado con 1 * N2, 1 * B27 (todos de Invitrogen) (denominado medio N2B27) más bFGF 20 ng/ml (Kim, D. S., Lee, J. S., Leem, J. W.,et al.(2010).Stem Cell Reviews and Reports,6, 270-281).

Aislamiento de NPC positivas para PSA-NCAM mediante MACS

Se expusieron células de roseta neural expandidas con una confluencia del 80-90 % a Y27632 10 jM (Sigma) durante 1 h para evitar la muerte celular antes de someterlas al procedimiento de MACS. Después de la disociación usando Accutase (Invitrogen), las células (~1*108 células) se bloquearon brevemente en PBS con BSA al 2 % y después se incubaron con anticuerpo anti-PSANCAM conjugado con microperlas (Miltenyi Biotec) durante 15 minutos a 4a Después de lavados exhaustivos, la suspensión celular se sometió al procedimiento de MACS y las células marcadas positivamente que permanecieron en la columna se eluyeron a un tubo con medio de cultivo. Se volvieron a cultivar NPCPSA-NCAM+ aisladas en la placa de cultivo a una densidad de 4-5*105 células/cm2 en medio N2B27 o medio NBG más 20 ng/ml de bFGF (suplemento 1* N2, 0,5* B27 y 0,5* G21 (Gemini BioProducts, Sacramento Oeste, CA)). El medio de cultivo se cambió todos los días y se hicieron pases de las células cada 2-3 días.

Establecimiento de un modelo de ictus e inyección estereotáxica de NPCPSA-NCAM+

Se anestesiaron ratas Sprague-Dawley macho de 2 meses de edad (aproximadamente 250-300 g de peso corporal) con isoflurano al 3 % (Hana Pharm, Seúl, Corea) en una mezcla del 70-30 % de N2O a O2. Se aislaron la arteria carótida común izquierda y la arteria carótida externa y se ligaron con una sutura quirúrgica 4-0. Se insertó un hilo de nailon en la arteria carótida interna izquierda y se avanzó hasta el círculo de Willis (oclusión permanente de la arteria cerebral media: pMCAO, por sus siglas en inglés). El hilo se dejó en su lugar hasta el sacrificio de las ratas.

La inyección estereotáxica de n PCpsa-ncam+, MSC o PBS se realizó 2 días después de la pMCAo. Las ratas se anestesiaron con zoletil (Virbac S.A., Francia, 25 mg/kg) y después se colocaron en un aparato quirúrgico estereotáxico (David Kopf Instruments, Tujunga, California). Se insertó una aguja de calibre 26 (jeringuilla Hamilton, Hamilton, Reno, NV) en el cuerpo estriado izquierdo (coordenadas del bregma: anteroposterior+0,7 mm, mediolateral -2 mm y dorsoventral -5,5 mm, - 2,5 mm desde las meninges); se inyectaron 5 |jl de NPCPSA'NCAM+ o MSC (1*105 células/pl cada una) o PBS en los sitios de 5,5 mm y -2,5 mm. Todas las células se infundieron constantemente en el cuerpo estriado izquierdo a una tasa de 1 jl/m in con agitación continua para evitar la agregación celular. Nueve animales murieron mientras se realizaba la cirugía de pMCAo y el trasplante de células.

Todos los animales se alojaron en instalaciones aprobadas por la Asociación para la evaluación y acreditación del cuidado de animales de laboratorio (AAALAC, por sus siglas en inglés), usando un ciclo de luz/oscuridad de 12 h. El experimento fue aprobado por la Junta de revisión institucional (N.° de IRB 4-2011-0087).

Ensayos conductuales

Ensayo de fallo de la pata: El ensayo de fallo de la pata mide la precisión de la colocación de la pata delantera en una cuadrícula equidistante (60*60 cm, 6 cm de distancia) durante un período de ensayo de 2 minutos. Este ensayo fue un procedimiento modificado que se basa en el estudio anterior [12, 13].

Ensayo conductual asimétrico: El ensayo modificado de balanceo del cuerpo elevado se adaptó del informe anterior. Se examinaron los movimientos laterales de las ratas después de elevarlas por la cola hasta 10 cm por encima de la superficie del área de ensayo. La frecuencia del balanceo hacia la izquierda o hacia la derecha se puntuó durante 1 min. El valor de la puntuación asimétrica se calculó mediante las siguientes puntuaciones; puntuación 0 - giro del torso, balanceo a la izquierda y la derecha, puntuación 1 - giro asimétrico < 30°, puntuación 2 - giro asimétrico > 30°. De acuerdo con la dirección de torsión del torso, la puntuación se contó como giro ipsilateral (igual que el sitio del infarto) o giro contralateral (opuesto al sitio del infarto).

Ensayo de equilibrio en barra: El aparato de marcha en barra se compone de una barra (100*5*2 cm). El desempeño motor se calificó en una escala de 6 puntos adaptada de una descripción anterior; puntuación 1 - equilibrio con postura estable y patas en la parte superior de la barra, puntuación 2 - agarra el lado de la barra y tiene movimientos temblorosos, puntuación 3 - una o más patas se salen de la barra, puntuación 4 - intenta mantener el equilibrio sobre la barra pero se cae, puntuación 5 - se extiende sobre la barra pero se cae, puntuación 6 - se cae de la barra sin intentar mantener el equilibrio.

Ensayo de tracción prensil: La porción prensil del ensayo implica la capacidad de la rata para aferrarse a la cuerda horizontal con sus patas delanteras. Se usó el ensayo de tracción prensil para medir la fuerza muscular de la rata. Este ensayo se adaptó de ensayos similares descritos anteriormente. La barra de acero (2 cm de diámetro, 100 cm de longitud) se colocó horizontalmente a 70 cm por encima de la almohadilla de goma esponjosa (7,5 cm de espesor). Se colocaron las patas delanteras de la rata sobre la barra de acero y se liberó al animal. Se permitió que la rata se aferrara a la barra de acero durante hasta 5 s. Se apuntó el tiempo de caída y si la rata llevó o no la extremidad posterior a la barra con las siguientes puntuaciones; puntuación 0 - la rata se aferra durante 5 s y levanta la extremidad posterior, puntuación 1 - la rata se aferra durante 5 s y no levanta ninguna extremidad posterior, puntuación 2 - la rata se aferra durante 3-4 s, puntuación 3 - la rata se aferra durante 0-2 s.

Puntuación de gravedad neurológica modificada (mNSS, por sus siglas en inglés): La puntuación de gravedad neurológica es una combinación de ensayos motores, sensoriales y reflejos como se describieron anteriormente. Las cuantificaciones objetivas se basaron en el ensayo conductual asimétrico, el ensayo de equilibrio en barra, el ensayo de tracción prensil, el ensayo de campo abierto (frecuencia de rotación) y el ensayo de fallo de la pata con las siguientes puntuaciones; puntuación 0 - sin déficits, puntuación 2 - dificultad para extender totalmente la extremidad anterior contralateral (3 < fallo de la pata delantera < 10), puntuación 4 - incapacidad de extender la extremidad anterior contralateral (fallo de la pata delantera > 10), puntuación 6 - giros leves hacia el lado contralateral (1 < rotación o torsión asimétrica < 5), puntuación 8 - giros severos (rotación o torsión asimétrica > 5), puntuación 10 - caída hacia el lado contralateral (tracción prensil < 2).

Análisis y cuantificación inmunohistoquímicos

El cerebro se fijó durante 24 h en paraformaldehído al 4%y se lavó con PBS. Para las secciones de parafina, los tejidos se deshidrataron en una serie graduada de etanol y después se incluyeron en parafina. El cerebro incluido en parafina se seccionó en capas de 5 um de espesor en un micrótomo, se desparafinizó en xileno durante 10 min y se rehidrató en una serie graduada de alcohol. Las secciones se trataron con ácido cítrico 10 mM durante 1 h seguido de la adición de una solución de BSA al 5 % que contenía PBS y T riton X-100 al 0,5 %. Después de eso, las secciones de cerebro se incubaron con anticuerpos primarios contra DCX (Abeam), Tuj1 (Covance), hNu (Millipore, clon 235-1), GFAP (Millipore), Ki67 (Leica Microsystems), hMito (Millipore), MAP2 (Millipore), Nestina humana (Millipore, clon 10C2) o ED-1 (Abcam) (1:100) durante 10-12 h a 4 a Después de la incubación durante la noche con los anticuerpos primarios, las secciones se lavaron con PBS antes de incubarlas con un anticuerpo secundario marcado con fluorescencia, anti-IgG de conejo, durante 31 h. Después, las secciones se lavaron una vez más con PBS antes de montarlas con 4',6'-diamidino-2-fenilindol (DAPI) 1 ug/ml. Se usó un microscopio fluorescente (Olympus IX71) para producir imágenes fluorescentes de las secciones. Con el fin de determinar con precisión la cantidad de células neuronales en el cerebro que reaccionaron con anticuerpos específicos, se utilizó un ensayo con ocultación. A tres individuos, todos los cuales no tenían conocimiento previo del experimento, se les pidió que contaran el número de células ED-1 y vasos a-SMA+ (con un diámetro de 50 um o menos) en cinco de los cuadrados con 50 mm2 en un portaobjetos. Después, un investigador tomó los resultados de los tres individuos para determinar con precisión el número de neuronas detectadas.

Veintiséis días después del trasplante, las ratas (n = 10 por grupo) se anestesiaron con zoletil (Virbac S.A., Francia, 25 mg/kg) y se perfundieron con PBS y paraformaldehído al 4 % en PBS (pH 7,5).

Para medir el área del infarto, las secciones del cerebro se tiñeron con hematoxilina y se fotografiaron con un microscopio (Zeiss, Oberkochen, Alemania). Se calculó el área de lesión indirecta, en la que el área intacta del hemisferio ipsilateral se restó del área del hemisferio contralateral. El área relativa del infarto se analizó con el programa NIH Image J (versión 1.47). Se presentó como un porcentaje promedio de la lesión indirecta en comparación con el hemisferio contralateral.

Reacción en cadena de la polimerasa - Transcripción inversa (RT-PCR, por sus siglas en inglés)

El ARN total se aisló usando reactivo Trizol (Invitrogen). La transcripción inversa (RT, por sus siglas en inglés) convencional se realizó en primer lugar usando Transcriptasa II (Invitrogen) y después, la RT-PCR se realizó con un conjunto de cebadores de PCR específicos: Cebador directo: TGTGTCCATCAGCTCCAGTTGC, Cebador inverso: CGGCTACCATGCTCGAGATAGG) para angiopoyetina 1 (Bioneer, Daejeon, Corea). Los productos de la PCR se procesaron en gel de agarosa al 1,2 % y después se tiñeron con bromuro de etidio para detectar bandas (tamaño aproximado: 400 pares de bases) con luz ultravioleta. Finalmente, las bandas detectadas se cuantificaron mediante el uso del programa NIH Image J (versión 1.47).

Análisis estadístico

Los datos se expresaron como media ± E.T.M. Los datos del ensayo conductual y el área del infarto se analizaron mediante ANOVA y un ensayo t independiente usando el Paquete estadístico para ciencias sociales (SPSS) versión 20.0. Las diferencias con valores de P < 0,05 se consideraron estadísticamente significativas.

Resultados

Trasplante de área de infarto reducida NPCPSA-NCAM+ en el cerebro hospedador

El diseño global de este experimento se muestra en la FIG. 1a. La gravedad del daño del tejido neural se determinó como el área del cerebro que normalmente no se tiñe con hematoxilina el día 26 después del trasplante. Las lesiones de infarto aparecieron principalmente en la corteza y el cuerpo estriado. El área del infarto fue obviamente mayor en los cerebros isquémicos tratados con PBS que en los trasplantados con MSC o n p Cpsa-ncam+ (FIG. 1 b). El porcentaje de área de infarto con respecto al lado contralateral se redujo significativamente en ratas trasplantadas con NPCPSA-NCAM+ (7,1 ± 2,5 %) o MSC (14,9 ± 1,9 %) en comparación con el del grupo de PBS (25,1 ± 2,4 %) (F = 13,64, P < 0,01). Aunque las áreas de infarto de los grupos trasplantados con n p Cpsa-ncam+ y MSC no fueron estadísticamente diferentes, las ratas trasplantadas con NPCPSA-NCAM+ obviamente mostraron un área de infarto más pequeña que la de las ratas trasplantadas con MSC (FIG.

1c).

Trasplante de rendimientos conductuales mejorados por NPCPSA-NCAM+ de un modelo de ictus de rata

Las ratas perdieron 40 g de su peso corporal en comparación con el valor basal medido el primer día después de pMCAo. La pérdida de peso alcanzó el máximo el día 7 después del tratamiento en ratas tratadas con PBS. En el grupo trasplantado con MSC, el peso corporal se recuperó al valor basal el día 17 después del trasplante. Sin embargo, la recuperación significativa del peso corporal comenzó a aparecer a partir del día 3 después del trasplante en el grupo trasplantado con n p Cpsa-ncam+ en comparación con controles de PBS (P < 0,05) (FIG. 2a). Después de pMCAO, los fallos de las patas disminuyeron significativamente en ratas trasplantadas con NPCPSA-NCAM+ y MSC en comparación con los controles de PBS, desde el día 3 (P < 0,05) hasta el día 13 (P < 0,01) (FIG. 2b). Adicionalmente, el grupo trasplantado con NPCPSA-NCAM+ mostró una reducción significativa en los fallos de las patas/cruce de líneas en comparación con el grupo trasplantado con MSC el día 13. No obstante, esto fue menos evidente en los días posteriores (días 17 y 24 después del trasplante) cuando la actividad de los animales disminuyó debido al aumento de peso.

Aunque todas las ratas mostraron relativamente poca asimetría en EBTS antes de pMCAo, la asimetría fue evidente en todos los animales después de pMCAo. El día 3 después del trasplante, los grupos trasplantados con NPCPSA-NCAM+- y MSC comenzaron a mostrar un comportamiento de torsión ipsilateral. Mientras que el grupo trasplantado con MSC mostró una mejora modesta hasta el día 13 después del trasplante (P < 0,05), la puntuación de comportamiento asimétrico disminuyó significativamente en el grupo trasplantado con NPCPSA-NCAM+ el día 7 y duró hasta el día 24 después del trasplante (P < 0,01) (FIG. 2c).

El trasplante con NPCPSA-NCAM+ también mejoró la recuperación funcional en el ensayo de equilibrio en barra desde el día 3 al 24, en comparación con el grupo trasplantado con MSC y los controles de PBS (P < 0,01) (FIG. 2d). El trasplante con NPCpsa-ncam+ aumentó significativamente el tiempo de retención en la barra, que está bien correlacionado con la coordinación motora, mientras que no se mostró ninguna diferencia estadística entre los grupos tratados con MSC y PBS.

La puntuación de tracción prensil, relacionada negativamente con la fuerza muscular de la pata delantera, disminuyó gradualmente en el grupo trasplantado con NPCPSA-NCAM+ desde el día 3 al 24 (P < 0,01) (FIG. 2e). El grupo trasplantado con MSC también mostró un patrón similar de mejora desde el día 7 al 24 después del trasplante.

Para normalizar las cuantificaciones del resultado neurológico, los presentes inventores finalmente evaluaron los criterios de mNSS basándose en una puntuación de comportamiento asimétrico, ensayo de equilibrio en barra, ensayo de tracción prensil, ensayo de campo abierto (frecuencia de rotación, datos no mostrados) y ensayo de fallo de la pata. La mNSS mostró que la recuperación progresiva de la función neurológica se vuelve significativa después del día 3 en ambos grupos trasplantados con NPCPSA-NCAM+ y MSC en comparación con los grupos tratados con PBS (P < 0,05) (FIG. 2f). Por otro lado, el grupo trasplantado con n Pc psa-ncam+ mostró una mejora sustancial en comparación con el grupo trasplantado con MSC desde el día 7 al 24 (P < 0,01). El efecto del grupo trasplantado con NPCPSA-NCAM+ fue especialmente evidente desde el día 3 al 7, lo que sugiere un fuerte efecto paracrino en el punto temporal temprano después del trasplante.

Las NPCPSA-NCAM+ trasplantadas sobrevivieron y se diferenciaron con compromiso neuronal en el cerebro hospedador

Para rastrear el destino de las células trasplantadas, los presentes inventores realizaron un análisis histológico con anticuerpos contra hNu (núcleos específicos de seres humanos), Ki67 (marcador de células en proliferación), DCX (marcador de neuroblastos), nestina (marcador de células madre neurales) y Tuj1 (marcador neuronal) el día 26. Después del trasplante de NPCPSA-NCAM+, la mayoría de las células se encontraron en el sitio de trasplante original (es decir, el cuerpo estriado). La supervivencia, la proliferación y la diferenciación de NPCPSA-NCAM+ trasplantadas se confirmaron por células Ki67+, DCX+, Tuj1+ y nestina+ en el cerebro dañado (FIG. 3a y 3b). La mayoría de NPCPSA-NCAM+ trasplantadas expresaron DCX o Tuj1, mientras que una porción de ellas fue positiva para nestina. El estado mitótico de las células trasplantadas se reveló por la inmunorreactividad a Ki67. Un subconjunto de células hNu+ (9184 recuentos) fue positivo para Ki67 (432 células) el día 26 después del trasplante (4,7 %). La inmunorreactividad a Tuj-1 se superpuso en gran medida con la de DCX en NPCPSA-NCAM+ (FIG. 3b). Estas células inmunorreactivas a DCX no eran de origen de rata sino de origen humano (FIG. 3c), lo que implica que el área de infarto cerebral reducida observada con NPCPSA-NCAM+ se debió en parte a la integración de células trasplantadas.

Mientras que muchas NPCPSA-NCAM+ trasplantadas demostraron una buena supervivencia e integración en el tejido dañado, solamente se detectaron unas pocas MSC con expresión de hNu el día 26 después del trasplante (FIG. 3d). La mayoría de las NPCPSA-NCAM+ injertadas eran células neuronales inmaduras (es decir, células positivas para DCX con una fracción de células positivas para Ki67) (FIG. 3b). Por el contrario, las MSC trasplantadas (células hNu+) no presentaron positividad para DCX en las lesiones, y una pequeña cantidad de células hNu-Ki67+ en proliferación estaban dentro y alrededor del tracto de la aguja en la mayoría de los casos de grupos injertados con MSC (FIG. 3d).

Mientras que las células doblemente marcadas hMito+MAP2+ y hNu+MAP2+ se detectaron en ratas trasplantadas con NPGpsa-ncam+ (FIG. 4a y 4b), las células coteñidas hMito+GFAP+ (FIG. 4d) o hMito+GalC+ (datos no mostrados) apenas fueron detectables, lo que indica que NPCPSA-NCAM+ son células progenitoras con compromiso principalmente neuronal. No se observaron células hMito+ en el cuerpo estriado contralateral (FIG. 4c).

El trasplante de NPCPSA-NCAM+ suprimió la activación glial reactiva en el cerebro hospedador

La expresión de GFAP (marcador de astrocitos), fue notablemente baja en el grupo trasplantado con NPCPSA-NCAM+, aunque se encontraron algunas células positivas para GFAP a lo largo de los recorridos de las agujas (FIG. 4e). De hecho, el número de células positivas para GFAP se redujo considerablemente en el grupo NPCPSA-NCAM+ (P < 0,001) y en menor medida en el grupo trasplantado con MSC (P < 0,05) en comparación con el grupo de PBS (FIG. 4e, f). Estos hallazgos sugieren que el trasplante de NPCPSA-NCAM+ suprime intensamente la activación de los astrocitos reactivos, promoviendo de este modo un entorno favorable para la reparación tisular (González, F. F., McQuillen, P., Mu, D.,et al.(2007).Developmental Neuroscience,29, 321-330).

El ictus isquémico induce una respuesta microglial adversa acompañada de daño tisular. Por lo tanto, los presentes inventores examinaron la activación microglial en tejidos cerebrales isquémicos el día 26 después del trasplante usando un anticuerpo contra ED1 que reconoce CD68 (marcador microglial activo) (FIG. 4e). Cabe destacar que, el número de células positivas para ED1 disminuyó significativamente en el grupo de NPCPSA-NCAM+ (P < 0,001) y, en menor medida, en el grupo trasplantado con MSC (P < 0,05) (FIG. 4f). Aunque se detectaron células hNu+ en el cuerpo estriado después de 6 meses, no hubo signos de teratoma en ninguno de los injertos u otras regiones de los cerebros trasplantados con NPCPSA-NCAM+

Trasplante de NPCPSA-NCAM+ potenció la angiogénesis en el cerebro hospedador

Se examinó la angiogénesis endógena en tejidos cerebrales isquémicos usando un anticuerpo contra a-SMA, un marcador de actina del músculo liso. Como resultado, se observó que el número de vasos reactivos a a-SMA en las ratas trasplantadas con NPCPSA-NCAM+ aumentó alrededor del sitio del injerto, en comparación con los de los grupos tratados con MSC y PBS (FIG. 5a, b). El análisis cuantitativo de los microvasos demostró claramente que los vasos a-SMA+ en ratas trasplantadas con NPCPSA-NCAM+ aumentaron en el área del infarto, en comparación con los de los grupos tratados con MSC y PBS (FIG. 5c).

Cuando los niveles de expresión del marcador proangiogénico, angiopoyetina-1, en los tejidos cerebrales se investigaron usando RT-PCR los días 7 y 26 después del trasplante, los niveles eran sustancialmente más altos en ratas trasplantadas con NPCPSA-NCAM+ el día 26 que en otros grupos (P < 0,05) (FIG. 5d), lo que sugiere la inducción de angiogénesis por NPCpsa-ncam+ que sobrevivieron a largo plazo. Las ratas trasplantadas con NPCpsa'ncam+ el día 26 también demostraron un patrón creciente de angiopoyetina-1 en comparación con su nivel el día 7, mientras que la angiopoyetina-1 en ratas tratadas con MSC el día 26 no cambió o disminuyó ligeramente en comparación con el nivel del día 7. Sin embargo, las ratas tratadas con MSC mostraron un patrón creciente el día 7 en comparación con el del grupo tratado con PBS (P < 0,05).

Ejemplo 2: Efecto del tratamiento del secretoma de las células precursoras neurales sobre una enfermedad isquémica y una enfermedad neuroinflamatoria

Materiales y métodos

Células NPCPSA-NCAM+ derivadas de ESC humanas

El uso de células humanas fue aprobado por la Junta de revisión institucional (N.° de IRB 4-2008-0643). Para la inducción neural, se cultivaron cuerpos embrioides (EB) derivados de hESC e iPSC durante 4 días en suspensión con dorsomorfina (DM, por sus siglas en inglés) 5 |<j>M (Sigma, San Luis, MO) y SB431542 (SB) 5-10 |<j>M (Calbiochem, San Diego, CA) en medio de hESC privado de bFGF (Invitrogen) y después unido a placas recubiertas con Matrigel (BD Biosciences, Bedford, MA) en medio 1*N2 (Invitrogen) suplementado con bFGF 20 ng/ml durante los 5 días adicionales (Kim, D. S., Lee, D. R., Kim, H. S.,et al.(2012). Precursores neurales positivos para PSA-NCAM altamente puros y expandibles de rosetas neurales derivadas de ESC y iPSC humanas.PLoSOne,7, e39715). Las rosetas neurales que aparecían en el centro de las colonias de EB adheridas se aislaron cuidadosamente usando pipetas de vidrio estirado de las células planas circundantes. Después se sembraron pequeños grupos de rosetas en placas recubiertas con Matrigel y se cultivaron en DMEM/F12 suplementado con 1 * N2, 1 * B27 (Invitrogen) (Kim, D. S., Lee, J. S., Leem, J. W.,et al.(2010). Potenciación robusta de la diferenciación neural de las células ES e iPS humanas, independientemente de su diferencia innata en la propensión a la diferenciación.Stem Cell Reviews and Reports,6, 270-281).

Se expusieron células de roseta neural expandidas con una confluencia del 80-90 % a Y27632 10 j M (Sigma) durante 1 h para evitar la muerte celular antes de someterlas al procedimiento de MACS. Después de la disociación usando Accutase (Invitrogen), las células (1*108 células o menos) se bloquearon brevemente en PBS con BSA al 1 % y después se incubaron con anticuerpo anti -PSA-NCAM conjugado con microperlas (Miltenyi Biotec) durante 15 minutos a 4a Después de lavados exhaustivos, la suspensión celular se sometió al procedimiento de MACS, y las células marcadas positivamente que permanecieron en la columna se eluyeron a un tubo con medio de cultivo. Se volvieron a cultivar NPCpsa_ncam+ aisladas en la placa de cultivo a una densidad de 4 a 5*105 células/cm2 en medio N2B27 o medio NBG más 20 ng/ml de bFGF (suplemento 1* N2, 0,5* B27 y 0,5* G21 (Gemini BioProducts, Sacramento Oeste, CA)). El medio de cultivo se cambió todos los días y se hicieron pases de las células cada 2-3 días.

Aislamiento de secretoma en células precursoras neurales (NPS) derivadas de células madre pluripotentes humanas

Las células precursoras neurales de células madre pluripotentes humanas obtenidas (células precursoras neurales positivas para PSA-NCAM) se cultivaron y se amplificaron repetidamente durante 4 pases o más en una placa de 60 mm recubierta con Matrigel con suplementos de retirada de suero de N2 (100X - concentración final 1X), B-27 (50X -concentración final 0,5X) y Gem21 (50X - concentración final 0,5X) y bFGF (20 ng/ml) en un cultivo base (DMEM/F-12), y después se cultivaron en 8-10 placas hasta las células alcanzaron una confluencia del 90 %. Después de retirar el líquido de cultivo, las células se lavaron tres veces con solución salina tamponada con fosfato y se cultivaron durante 24 h en un líquido de cultivo base sin suero (DMEM/F12) suplementado solamente con ITS (100X - concentración final 1X) y bFGF (20 ng/ml). Para un control, se puso la misma cantidad de líquido de cultivo base con la misma composición (líquido de cultivo base suplementado con la misma cantidad de ITS y bFGF) en una placa sin células, se cultivó en una incubadora durante 24 h y después se recogió. Todo el líquido de cultivo se recogió y se centrifugó (800 g a 30 min) para retirar los residuos celulares y después se congeló directamente en un congelador a -70^, y, cuando fue necesario, se descongeló antes de su uso.

Establecimiento del modelo de ictus

Con el fin de medir los efectos protectores neurales contra el daño neural debido al ictus isquémico local, se usó un método de sutura intraluminal aplicada. Este método es un modelo de ictus isquémico local desarrollado por Zia Longa (Zea Longa,et al., Stroke.,1989, 20, 84-91), y una ventaja de similitud clínica, a diferencia de otros modelos. Por este motivo, este modelo es adecuado para buscar el mecanismo de isquemia-reperfusión o el cribado de los efectos de varios fármacos.

Después de una semana de aclimatación, los animales (rata Sprague-Dawley macho, peso corporal de 250-300 g) se anestesiaron usando una máquina de anestesia respiratoria y se usó isoflurano como fármaco anestésico. Se sometió por primera vez a ratas blancas a anestesia general usando una mezcla de gases de N2O al 80 % y O2 al 20 %, e isoflurano al 5 %, que después se mantuvo al 2-2,5 % para la anestesia. Para el establecimiento del modelo de ictus, se hizo una incisión en la piel del cuello izquierdo de las ratas blancas y después en la arteria carótida común, se aislaron la arteria carótida externa y la arteria carótida interna, y las arterias respectivas se ataron ligeramente con un hilo de seda negro para bloquear el flujo sanguíneo. La arteria carótida común se cortó por la mitad y la sonda de nailon 4-0 de 25 mm con un extremo de 0,40 mm, obtenida redondeando el extremo de la sutura de nailon usando cauterización, se insertó a través de la sección cortada. La sonda de nailon insertada en la arteria carótida externa se insertó y se fijó en la arteria cerebral media a través de la arteria carótida interna. Después de insertar la sonda a aproximadamente 18-20 mm del sitio de la rama de la arteria carótida común, se bloqueó el origen de la arteria cerebral media y después se fijó con un hilo para ocluir permanentemente la arteria cerebral media. Después de eso, el sitio de la incisión en la piel se suturó de nuevo y después las ratas se recuperaron naturalmente de la anestesia.

Inyección de secretoma en un modelo de ictus a través de la arteria cerebral y ensayo conductual

Después de que se estableciese el valor basal para el ensayo conductual un día después de la inducción del ictus, se inserta una aguja de jeringa de insulina en la arteria carótida interna a través de la arteria carótida externa derecha de la misma manera que se establece el modelo de ictus, y a través de la aguja, se inyectaron por vía intraarterial 0,2 mg/kg (volumen 50 pl) del secretoma y se administró como control el mismo volumen del líquido de cultivo o solución salina tamponada con fosfato (PBS). Después de la inyección del líquido de secretoma, el estado de los animales se observó durante 14 días. La medición del peso se realizó una vez antes de la inyección y cuatro veces después de la inyección, y se realizó el análisis conductual.

1) Ensayo de torsión del torso: Con el fin de someter a ensayo la postura de la parte superior del cuerpo considerada como el sentido de la corteza cerebral y el cuerpo estriado de los animales, se midió el comportamiento asimétrico.

2) Ensayo de equilibrio en barra: La función vestibulomotora macroscópica se evaluó a través de la postura estable de los animales sobre la barra estrecha.

3) Ensayo de fallo de la pata: Este ensayo se usa cuando se someten a ensayo el ajuste (cooperación) y la unificación (integración) del movimiento del motor. El fallo de la pata se define como cuando la pata cae entre las barras de la rejilla o la rata coloca erróneamente una extremidad anterior o posterior. El fallo de la pata es simétrico en animales normales.

4) Ensayo de tracción prensil: La porción prensil del ensayo implica la capacidad de la rata para aferrarse a la cuerda horizontal con sus patas delanteras. Se usó el ensayo de tracción prensil para medir la fuerza muscular de la rata. Este ensayo se adaptó de ensayos similares descritos anteriormente. La barra de acero (2 cm de diámetro, 100 cm de longitud) se colocó horizontalmente a 70 cm por encima de la almohadilla de goma esponjosa (7,5 cm de espesor). Se colocaron las patas delanteras de la rata sobre la barra de acero y se liberó al animal. Se permitió que los animales se aferraran a la barra de acero durante hasta 5 s. Se apuntó el tiempo de caída y si los animales llevaron o no la extremidad posterior a la barra con las siguientes puntuaciones; puntuación 0 - la rata se aferra durante 5 s y levanta la extremidad posterior, puntuación 1 - la rata se aferra durante 5 s y no levanta ninguna extremidad posterior, puntuación 2 - la rata se aferra durante 3-4 s, puntuación 3 - la rata se aferra durante 0-2 s.

5) Ensayo de campo abierto: Este ensayo se usa para conocer los niveles generales de actividad al caminar. La actividad, las emociones y los patrones conductuales de los animales se midieron midiendo directamente los aspectos y características conductuales.

6) Puntuación de gravedad neural modificada (mNSS): La puntuación es una puntuación total de valores de ensayos motores, sensoriales, de equilibrio, de reacción y de emoción obtenidos a través de los diversos ensayos anteriores, y la puntuación se calcula según los siguientes criterios (mNSS se mide sumando las puntuaciones para cada sujeto).

- Ensayo de campo abierto (que mide patrones de emoción, de actividad y conductuales de los animales).

Sin movimiento: 3

1-20: 2

21-30: 1

30 o más: 0

- Ensayo de tracción prensil (medición muscular)

0-5 s: 3

6-10 s: 2

11-20 s: 1

21 s o más: 0

- Ensayo de equilibrio en barra (medición del sentido del equilibrio)

Puntuación 0:

1 = Postura estable

2 = agarra el lado de la barra y tiene movimientos temblorosos

Puntuación 1:

3 = una o más patas se salen de la barra.

4 = intenta mantener el equilibrio en la barra pero se cae

Puntuación 2:

5 = se extiende sobre la barra pero se cae.

6 = se cae de la barra sin intentar mantener el equilibrio

- Ensayo de fallo de la pata (Capacidad de cooperación motora)

0-5 s: 0

6-10 s: 1

11-20 s: 2

21 s o superior: 3

- Ensayo de postura de la parte superior del cuerpo (Ensayo de comportamiento asimétrico)

0: 2

1-4: 1

5 o más: 0

Las ratas blancas se anestesiaron con zoletilo 14 días después de la inducción isquémica y se sometieron a una incisión abierta en el pulmón y en la aurícula derecha. Se inyectó una aguja en el ventrículo izquierdo y, después, el corazón se perfundió con PBS usando una bomba para retirar el flujo sanguíneo y después se extrajo el tejido cerebral. Las secciones de tejido para la construcción de la muestra se incluyeron en parafina en la base del bregma. Para la verificación del tejido cerebral dañado, las secciones de tejido cerebral se tiñeron con hematoxilina y se deshidrataron, y el portaobjetos se fotografió usando una cámara digital y después se transfirió a un ordenador. El porcentaje de área de infarto se calculó mediante la ecuación 1 usando un programa de análisis de imágenes (image J).

Ecuación 1

Porcentaje de infarto (%) = (el área del hemisferio contralateral - el área intacta del hemisferio ipsilateral)/ el área del hemisferio contralateral X 100

Secretómica

El secretoma de células precursoras neurales derivadas de hESC y el secretoma de células precursoras neurales derivadas de iPSC humanas se separaron en SDS-PAGE usando gel Novex Bis-Tris con un gradiente del 4-12 % (Invitrogen) y después los geles se tiñeron con reactivo de tinción Gel Code Blue (Piece) para mostrar bandas de proteínas. Los geles teñidos se cortaron en 10 bandas del mismo tamaño, que después se sometieron a digestión tríptica en gel mediante un método conocido.

Los péptidos preparados mediante digestión tríptica en gel se analizaron mediante el espectrómetro de masas LinearTrap Quadrupole (LTQ) (Thermo Finnigan) acoplado con cromatografía líquida Nano Ultra Performance (Eksigent Technologies). Específicamente, se aplicaron péptidos tripsinizados a una columna analítica (75 |jm * 11 cm) llena de resina C18 de tamaño Spm normal. Se logró un gradiente lineal de 45 minutos desde el 97 % de disolvente A (ácido fórmico al 0,1 % en agua destilada) hasta el 60 % de disolvente B (ácido fórmico al 0,1 % en acetonitrilo) a un caudal de 0,3 jl/min. Los iones peptídicos separados se electropulverizaron en la fuente de ionización por nanoelectronebulización (IEN). Todos los espectros de EM/EM se obtuvieron mediante barridos dependientes de datos en los que se seleccionaron para la fragmentación los cinco espectros más abundantes del barrido de EM completo. El recuento de repeticiones para la exclusión dinámica se estableció en 1, la duración de la repetición fue de 30 s, la duración de la exclusión dinámica se estableció en 180 s, el ancho de la masa de exclusión fue de 1,5 Da y la lista de exclusión dinámica fue de 50.

La identificación de péptidos y proteínas se investigó a partir de la base de datos ipi.HUMAN v3.76 (89 378 entradas) usando el algoritmo Turbo-SEQUEST (Thermo Finnigan). Después de la investigación de bases de datos, los péptidos y proteínas identificados se confirmaron usando el armazón 2 (Proteome Software). Entre los péptidos obtenidos de la búsqueda por SEQUEST, se seleccionó un conjunto de péptidos con una probabilidad de PeptideProphet superior a 0,95. Además, se obtuvo una lista de proteínas que tenían una probabilidad de ProteinProphet superior a 0,99 y también tenían más de dos péptidos únicos.

Análisis estadístico

La significación estadística entre los grupos se obtuvo usando análisis de varianza unidireccional (ANOVA) con la corrección de Tukey, y se determinó que un valor de p < 0,05 era estadísticamente significativo.

Resultados

Para investigar el alivio de la enfermedad mediante el secretoma de células precursoras neurales en un modelo de ictus, se sometieron a ensayo los siguientes tres grupos durante 2 semanas. A las 24 h de la inducción del ictus, se distribuyeron arbitrariamente ratas blancas, con la enfermedad inducida confirmada mediante un ensayo conductual, en tres grupos, y se inyectó un volumen igual (50 pl) del secretoma (0,2 mg/kg, volumen 50 pl), medio o PBS en la arteria carótida externa derecha. Se controló el estado y el peso de los animales 3, 7, 10 y 14 después de la inyección de cada material y se realizó un análisis conductual.

T l 11

Resultados del análisis de lesión isquémica

La inducción de ictus a través de MCAO permanente en ratas blancas indujo una lesión cerebral extensa. El cerebro se extrajo 14 días después de la inducción del ictus, y después el daño y los sitios dañados del cerebro se confirmaron mediante tinción con TTC (cloruro de 2,3,5-trifeniltetrazolio). La tinción con TTC se produce por una reacción con el sistema enzimático oxidativo mitocondrial normal en las células y las mitocondrias dañadas por daño isquémico no se tiñen debido a la alteración del sistema oxidativo, mostrándose en blanco, lo que puede diferenciar los sitios dañados del cerebro.

Como se muestra en la FIG. 7, el daño inducido por la oclusión de la arteria cerebral media apareció principalmente en la corteza y el cuerpo estriado (FIG. 7). La inyección del secretoma de células precursoras neurales redujo el área de la lesión isquémica (tamaño del infarto). El control de PBS mostró aproximadamente el daño del 60 % del cerebro derecho y el control medio mostró aproximadamente el 46 %, pero el grupo tratado con secretoma mostró un sitio dañado de aproximadamente el 29 %, que se redujo significativamente en comparación con los controles.

Resultados del análisis de peso corporal

La inducción de ictus reduce el rendimiento motor de ratas blancas, la pérdida de peso inmediata se adelantó 7 días y diversos agentes de tratamiento indujeron el aumento de peso corporal a través de la recuperación del rendimiento motor. La inyección del secretoma también indujo un aumento de peso corporal similar al trasplante de células (FIG. 8). La recuperación del peso corporal fue notable en la recuperación del daño neural. El grupo tratado con secretoma mostró una mejora significativa en comparación con el control de PBS.

Resultados del análisis conductual

El grupo tratado con secretoma mostró un efecto de mejora conductual estadísticamente significativo en comparación con los dos controles en el ensayo de equilibrio en barra, y hubo un efecto inmediato, por ejemplo, el efecto se presentó desde el día 3 después del tratamiento (FIG. 9).

Además, el grupo tratado con secretoma mostró un efecto estadísticamente significativo en comparación con los dos controles el día 7 después del tratamiento (inyección) en el ensayo de tracción prensil.

Además, la inyección del secretoma mostró el efecto de reducción en la frecuencia de fallos de la pata en una red (FIG.

9c). La inyección del secretoma también mostró una mejora en el cruce de líneas para medir la actividad del comportamiento por unidad de tiempo

Resultados del análisis de la puntuación de gravedad neurológica modificada (mNSS)

El ensayo de puntuación de gravedad neurológica modificada (mNSS) es una tabla compuesta para medir funciones neurológicas. Se evaluaron puntos motores (estado muscular) y sensoriales (visión, tacto y propiocepción. La puntuación normal es 0 y cuanto más alta es la puntuación, más graves son las disfunciones. Como se muestra en la FIG. 10, el grupo tratado con secretoma mostró un efecto del tratamiento significativamente mayor (mejora conductual) con respecto al tratamiento inicial en el análisis de mNSS, en comparación con el control de PBS y el control de medio (FIG. 10).

En el ensayo de mNSS, el control de PBS mostró que la puntuación promedio fue de 5,4 el día 1 y de 5,5 el día 14 después de la inducción isquémica, lo que indica que los trastornos neuroconductuales provocados por el ictus se mantuvieron. El control medio mostró un efecto temporal de mejora conductual el día 3 de tratamiento, pero no ejerció un efecto de mejora adicional. Por otro lado, el grupo tratado con secretoma mostró un efecto de mejora conductual continua desde el día 3 de tratamiento (puntuación de mNSS: 4,5) hasta el día 10 de tratamiento (puntuación de mNSS: 3).

Resultados del análisis del secretoma

El secretoma obtenido de células precursoras neurales derivadas de iPSC incluye las siguientes proteínas: Agrina, anexina A5, BSG (Basigina), biglicano, calponina-3, proteína similar a coactosina, cofilina-1, colágeno alfa-2, culina-3, destrina, distroglicano, efrina-B2, exportina-2, ezrina, fibronectina, fibulina-1, proteína relacionada con frizzled, proteína de unión a gelatina-3, granulinas, factor 11 de crecimiento/diferenciación, haptoglobina, hemopexina, proteína de grupo de alta movilidad B2, hornerina, importina-9, proteína 2 de unión a factor de crecimiento insulínico, proteína La de Lupus, factor inhibidor de migración de macrófagos, midquina, moesina, neuropilina 2, pleiotrofina, profilina-1, proteína DJ-1, radixina, proteína 2 relacionada con el frizzled secretada, septina-11, talina-1, testicano, timopoyetina, transgelina-3 y vimentina.

El secretoma obtenido de células precursoras neurales derivadas de células madre embrionarias humanas incluye las siguientes proteínas: Agrina, anexina A2, atractina, biglicano, ceruloplasmina, cofilina-1, colágeno alfa-1, coronina-1X, dermicidina, DERP12, eprina-B3, exoestosina-2, ezrina, proteína de unión a gelatina-3, granulinas, factor 11 de crecimiento/diferenciación, haptoglobina, hemopexina, proteína de grupo de alta movilidad B2, hornerina, proteína 2 de unión a factor de crecimiento insulínico, proteína La de Lupus, midquina, moesina, proteína 8 de múltiples dominios similares al factor de crecimiento epidérmico, nidógeno-1, paratimosina, profilina-2, proteína DJ-1, proteína 2 relacionada con el frizzled secretada, secretogranina, talina-1, timosina beta-4, TGFBI (proteína ig-h3 inducida por el factor de crecimiento transformante beta), transgelina y vimentina.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Una composición para su uso en un método de tratamiento de una enfermedad neuroinflamatoria, comprendiendo la composición células precursoras neurales positivas para moléculas de adhesión de células neurales polisialiladas (PSA-NCAM) como principio activo,

en donde la enfermedad neuroinflamatoria es una lesión de la médula espinal,

2. La composición para su uso de acuerdo con la reivindicación 1, las células precursoras neurales positivas para PSA-NCAM se separan de las rosetas neurales, que se diferencian de células madre pluripotentes, usando un anticuerpo anti-PSA-NCAM.