KR101889228B1 - Psa-ncam-양성 신경전구세포를 유효성분으로 포함하는 척수손상 치료용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 척수손상 치료용 조성물에 관한 것이다. 본 발명에서 이용되는 PSA-NCAM-양성 신경전구세포는 주입된 조직에서의 혈관신생을 촉진하고 염증반응을 억제한다. 본 발명의 PSA-NCAM-양성 신경전구세포는 항-PSA-NCAM-항체를 이용하여 간단히 분리할 수 있으며, 중간엽 줄기세포(MSC)에 비하여도 우수한 혈관신생 및 염증억제 활성을 보여, 척수손상에 대한 효율적인 치료 조성물로서 유용하게 이용될 수 있다.

Description

PSA-NCAM-양성 신경전구세포를 유효성분으로 포함하는 척수손상 치료용 조성물{A Composition for Treating Spinal Cord Injury Comprising PSA-NCAM-positive Neural Precursor Cells as Active Ingredient}

본 발명은 PSA-NCAM-양성 신경전구세포를 유효성분으로 포함하는 척수손상 치료용 조성물에 관한 것이다.

줄기세포는 그 다분화능으로 인하여, 다양한 질환의 유망한 치료 후보물질로 여겨진다. 예를 들어, 중간엽 줄기세포(mesenchymal stem cells, MSCs)는 쉽게 수득 및 분리가 가능하며 혈관신생을 촉진하고 염증을 억제하는 많은 영양인자를 분비한다[1]. MSC의 이러한 특성은 인간 질병의 치료에 적용하기 위한 연구에서 고려되어 왔다. 최근의 연구에 의하면 MSC는 많은 동물모델[2, 3] 및 인간 임상치료[2, 3]에서 조직 회복에 기여하는 것으로 밝혀졌다. 몇몇 보고들이 인 비트로에서 MSC가 뉴런[6] 및 성상세포(astrocyte)[3]를 포함하는 신경계열로의 분화능력을 언급하고 있으나, 이들 분화된 세포들이 인 비보에서 어떠한 기능을 하는지에 대한 명확한 증거는 없다. MSC의 유익한 효과는 세포 대체 보다는 측분비(paracrine) 기작에 의해 유도되는 것으로 보이며, 이에 MSC의 이식(transplantation)은 장기간 지속되는 개선이 아닌, 일시적이고 한정된 효과를 가질 것으로 보인다[7].

이에 반하여, 배아줄기세포(embryonic stem cells, ESCs)는 3개의 배아 생식엽(embryonic germ layer)에서 유래하는 모든 특정 세포 형태로 분화할 수 있고 강력한 자가재생 능력을 가지는 것으로 알려졌다. 주목할 만한 것은, ESC에서 유래한 신경전구세포(neural precursor cells, NPCs)는 우선적으로 뉴런, 성상세포 및 희소돌기아교세포(oligodendrocyte)를 포함하는 신경계열의 특정 형태의 세포로 분화하기 때문에 뇌조직 회복을 위한 세포원(cell source)으로 여겨진다는 것이다.

이들 세포는 또한 내생 신경전구세포의 생존 및 증식을 촉진하는 몇몇 인자를 분비한다[8]. 그러나, ESC에서 분화된 NPC들이 어떻게 질환모델에서 이식 후 기능의 개선에 기여하는지는 여전히 알려져 있지 않다. 본 발명자들은 PSA-NCAM(polysialic acid-neural cell adhesion molecule)-양성 NPC(NPC^PSA-NCAM+)들이 인간 배아줄기세포 또는 유도만능줄기세포(iPSCs)의 신경 로제트로부터 분리된 원시 신경전구세포임을 밝힌 바 있다[9]. 이들 세포들은 비-신경 세포 파퓰레이션의 신호가 전혀 없이 신경 마커를 강하게 발현하였으며(전체 세포의 80-90%), 그 원시세포로서의 특성이 유지되는 동안 배양 환경 내에서 여러 계대를 증식하였다. 이에, 본 발명에서는 랫트 뇌졸중 모델을 이용하여 인간 ESC에서 유래된 NPC^PSA-NCAM+ 세포의 치료적 잠재성을 조사하고자 하였다. 한편, MSC는 이식 실험에서 측분비 효과를 비교하기 위한 양성 대조군으로 사용되었다. MSC는 뇌졸중 동물모델의 허혈성 뇌조직에서 항-염증 작용, 혈관신생 촉진 작용 및 내생적 신경조직 생성 작용을 통해 신경보호 작용을 가지는 것으로 보고되었다[10].

본 발명자들은 인간 ESC-유래 NPC^PSA-NCAM+ 세포가 허혈성 뇌졸중에서 항-아교세포 활성화 및 혈관신생 촉진활성을 가지는 유망한 치료자원으로서 다양한 허혈성 질환 및 신경염증 질환의 치료에 사용될 수 있음을 밝혔다.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

본 발명자들은 척수손상에 있어, 혈관 복원 및 염증인자 억제를 통해 병인을 제거하는 근본적인 치료방법을 개발하기 위하여 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 표면에서 신경접착 분자인 PSA-NCAM를 발현하는 신경전구세포를 병변부위에 주입할 경우, 혈관의 신생이 촉진되고 염증반응이 억제됨으로써 척수손상을 효율적으로 치료할 수 있음을 발견함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서 본 발명의 목적은 척수손상 치료용 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 전분화능 만능줄기세포(pluripotent stem cell)로부터 분화된 신경 로제트로부터 분리된, PSA-NCAM(poly-sialylated neural cell adhesion molecule)-양성 신경전구세포(neural precursor cell)를 유효성분으로 포함하는 척수손상 치료용 조성물을 제공한다.

본 발명자들은 척수손상에 있어, 혈관 복원 및 염증인자 억제를 통해 병인을 제거하는 근본적인 치료방법을 개발하기 위하여 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 표면에서 신경접착 분자인 PSA-NCAM를 발현하는 신경전구세포를 병변부위에 주입할 경우, 혈관의 신생이 촉진되고 염증반응이 억제됨으로써 척수손상을 효율적으로 치료할 수 있음을 발견하였다.

본 명세서에서 용어“치료”는 (a)질환, 질병 또는 증상의 발전의 억제; (b)질환, 질병 또는 증상의 경감; 또는 (c)질환, 질병 또는 증상을 제거하는 것을 의미한다. 본 발명의 조성물은 허혈성 질환 또는 신경염증 질환에 걸린 개체에서 허혈성 조직의 혈관을 복원하거나 염증반응을 억제함으로써 이의 증상의 발전을 억제하거나, 이를 제거하거나 또는 경감시키는 역할을 한다. 따라서, 본 발명의 조성물은 그 자체로 허혈성 질환 또는 신경염증 질환의 치료 조성물이 될 수도 있고, 혹은 다른 항-허혈/항-염증 조성물과 함께 투여되어 이들 질환에 대한 치료 보조제로 적용될 수도 있다. 이에, 본 명세서에서 용어“치료”또는“치료제”는“치료 보조”또는“치료 보조제”의 의미를 포함한다.

본 명세서에서 용어“허혈성 질환”은 혈관 손상에 따른 혈액 누수(blood leakage), 색전(embolism) 또는 경색(infarction) 등에 의해 혈류량이 감소하여 혈액공급이 차단된 조직이 괴사에 이르는 질환을 말한다. 본 발명에 따르면, 본 발명의 조성물은 혈관신생 유발인자인 안지오포이에틴-1(angiopoietin-1)의 발현을 유의하게 증가시키며, 투여(또는 이식) 부위의 혈관 수 및 미세혈관 농도를 크게 증가시킨다. 따라서, 본 발명의 조성물은 혈관조직의 소실, 혈관생성의 결핍 또는 비정상적 혈관의 형성 등에 의해 혈류량이 감소된 개체에서 혈관 조직을 회복하거나 혈관의 수를 증가시킴으로써 혈류량을 회복시키는 효율적인 허혈성 질환 치료 조성물로 이용될 수 있다.

본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 본 발명의 조성물로 치료되는 허혈성 질환은 허혈성 심장질환, 심근경색, 협심증, 하지동맥 허혈성 질환, 사지말단부 허혈성 질환 및 허혈성 뇌혈관 질환으로 구성된 군으로부터 선택된다.

본 명세서에서 용어“허혈성 심장질환”은 심장에 혈액을 공급하는 관상동맥이 손상되거나, 협소 또는 폐색되어 심장근육으로의 혈류가 감소하여 초래되는 질환을 의미한다. 보다 구체적으로는, 본 발명의 조성물로 치료되는 허혈성 심장질환은 협심증, 심근경색증 및 심부전증으로 구성된 군으로부터 선택된다.

본 명세서에서 용어“허혈성 뇌혈관 질환”은 뇌혈관이 손상되거나, 협소 또는 폐색되어 이로 인해 혈류를 공급받지 못한 뇌조직이 손상되는 질환을 의미한다. 보다 구체적으로는, 상기 허혈성 뇌혈관 질환은 허혈성 뇌졸중이다.

본 명세서에서 용어“신경염증 질환”은 염증 반응에 의한 신경 조직의 손상으로 초래되는 질환을 의미한다.

본 발명에 따르면, 본 발명의 조성물은 투여(또는 이식)된 신경조직에서의 반응성 미세아교세포 및 성상세포의 활성화를 억제한다. 미세아교세포(microglia)는 중추신경계에서 일차적인 면역 기능을 수행하는 세포로서, 활성화된 미세아교세포는 정상 상태의 미세아교세포와는 달리 포식작용을 활발히 하고, 세포증식을 하며, TNF-α, IL-1β 및 IL-6 등과 같은 사이토카인, 케모카인, iNOS(inducible nitric oxide synthase), COX-2(cyclooxygenase-2) 등의 유전자를 발현시켜 염증매개 물질들을 생성한다. 활성화된 성상세포(astrocyte) 역시 염증성 사이토카인인 IL-6, TGF-β, LIF 및 IL-1를 분비하며, 분비된 이들 사이토카인들은 다시 미세아교세포 및 성상세포를 활성화시킴으로써 조직 내 환경을 악화시킨다. 따라서, 미세아교세포 및 성상세포의 활성화를 억제하는 본 발명의 조성물은 염증 반응으로 인한 신경조직의 손상을 효과적으로 차단할 수 있다.

본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 본 발명의 조성물로 치료되는 신경염증 질환은 알츠하이머병, 파킨슨병, 헌팅턴병, 루게릭병, 크로이츠펠트야콥병, 다발성 경화증, 근위축성 측삭 경화증, 미만성 루이소체병, 백색질뇌염, 측두엽간질 및 척수손상으로 구성된 군으로부터 선택된다. 상기 척수손상은 예컨대, 염증성 척수손상일 수 있다.

본 명세서에서 용어“투여”또는“투여하다”는 본 발명의 조성물의 치료적 유효량을 대상체에 직접적으로 투여함으로써 대상체의 체내에서 동일한 양이 형성되도록 하는 것을 말한다. 따라서, 용어“투여하다”는 본 발명의 유효성분인 PSA-NCAM-양성 신경전구세포를 병변부위에 주입 또는 이식(transplantation)하는 것을 포함하므로, 용어“투여하다”는“주입하다”또는“이식하다”와 같은 의미로 사용된다.

조성물의“치료적 유효량”은 조성물을 투여하고자 하는 대상체에게 치료적 또는 예방적 효과를 제공하기에 충분한 추출물의 함량을 의미하며, 이에 “예방적 유효량”을 포함하는 의미이다. 본 명세서에서 용어“대상체”는 제한없이 인간, 마우스, 래트, 기니아 피그, 개, 고양이, 말, 소, 돼지, 원숭이, 침팬지, 비비 또는 붉은털 원숭이를 포함한다. 구체적으로는, 본 발명의 대상체는 인간이다.

본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 본 발명의 조성물은 안지오포이에틴-1의 발현을 증가시킨다.

본 명세서에서 용어“발현의 증가”란 정상인에 비하여 유전자 또는 단백질의 발현이 측정 가능할 정도로 유의하게 증가하는 것을 말하며, 보다 구체적으로는 대조군에 비하여 발현량이 130% 이상이 되는 것을 말한다.

본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 본 발명의 조성물은 아교세포(glial cell) 또는 성상세포(astrocyte)의 활성화를 억제한다.

본 명세서에서 용어“활성화의 억제”는 아교세포 또는 성상세포의 수, 기능 및 활성화의 저하를 야기하는 생체 내 변형을 의미하며, 예를 들어 이들 세포들의 특이적인 마커(예를 들어 CD68 또는 GFAP)의 발현이 유의하게 감소하거나, 탐지 불가능해지거나, 또는 무의미한 수준으로 존재하게 되는 것을 의미한다.

본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 본 발명에서 이용되는 PSA-NCAM-양성 신경전구세포는 전분화능 만능줄기세포로부터 분화된 신경 로제트로부터 분리된다.

본 명세서에서, 용어 “줄기세포”는 조직을 구성하는 각 세포로 분화(differentiation)되기 전 단계의 미분화 세포들을 총칭하며, 특정 분화 자극(환경)에 의해 특정 세포로 분화할 수 있는 능력을 가지고 있다. 줄기세포는 세포분열이 정지된 분화된 세포와는 달리 세포분열에 의해 자신과 동일한 세포를 생산(self-renewal)할 수 있고, 분화 자극이 가해지면 특정 세포로 분화되고 이러한 분화는 다른 환경 또는 다른 분화 자극에 의해 다양한 세포로도 분화될 수 있는, 분화의 유연성(plasticity)을 가지고 있는 것이 특징이다.

본 발명에서 이용되는 줄기세포는 인 비트로에서 무한정 증식되며, 3종류의 모든 배아층(외배엽, 중배엽과 내배엽)으로부터 유래되는 다양한 세포로 분화될 수 있는 전분화능 만능줄기세포(pluripotent stem cell)이다.

보다 구체적으로, 상기 전분화능 만능줄기세포는 배아줄기세포(embryonic stem cells), 배아생식세포(embryonic germ cells), 배아종양세포(embryonic carcinoma cells) 또는 iPSCs(induced pluripotent stem cells)이며, 가장 구체적으로, 상기 전분화능 만능줄기세포는 배아줄기세포(embryonic stem cells)이다.

배아줄기세포는 배반포의 내부세포괴(ICM)로부터 유래되고, 배아생식세포는 5-10 주령의 생식융기(gonadal ridge)의 원시생식세포로부터 유래된다. 유도만능줄기세포(iPSCs)는 비-전분화능 세포(예를 들면, 체세포)로부터 전능성을 부여하는 특정 유전자를 삽입하여 인공적으로 유래된 전분화능 줄기세포의 하나이다. 유도만능중기세포는 줄기세포 유전자 및 단백질 발현, 염색체 메틸화, 배가시간(doubling time), 배아체 형성, 테라토마 형성, 생존성 키메라 형성, 교잡성 및 분화성을 가지는 면에서 전분화능 줄기세포(예를 들면, 배아줄기세포)와 동일하다고 여겨진다.

본 발명에 따르면, 본 발명에서 이용되는 PSA-NCAM-양성 신경전구세포는 전분화능 만능줄기세포로부터 신경분화 자극을 통해 분화된 신경 로제트에서 항-PSA-NCAM-항체를 이용하여 분리될 수 있다.

본 명세서의 용어“신경 로제트(neural rosette)”는 인간 배아줄기세포의 신경분화 과정의 초기단계의 신경줄기세포를 말하며, 신경 로제트는 원주형의 방사상 형태를 갖는다. 상기 신경 로제트는 Pax6 및 Sox1 같은 초기 신경외배엽(neuroectodermal)마커를 발현하는 세포로 구성되며, 다양한 뉴우론 세포 및 신경교세포로 분화할 수 있다.

상기‘신경 분화 자극’은 당업계에서 통상적으로 실시되는 방법들, 예를 들어, 무혈청 배지(Tropepe V et al., Direct neural fate specification from embryonic stem cells: A primitive mammalian neural stem cell stage acquired through a default mechanism. Neuron. 30:6578(2001)), FGFs(fibroblast growth factors), Wnt 및 RA(retinoic acid)와 같은 모르포겐(morphogens)의 처리(Ying QL et al. Conversion of embryonic stem cells into neuroectodermal precursors in adherent monoculture. Nat Biotechnol. 21:183186(2003))에 의해 분화 할 수 있으나, 이에 한정하지 않는다.

본 발명에서 이용되는 항체는 폴리클로날 또는 모노클로날 항체이며, 바람직하게는 모노클로날 항체이다.

PSA-NCAM에 대한 항체는 당업계에서 통상적으로 실시되는 방법들, 예를 들어, 융합 방법(Kohler and Milstein, European Journal of Immunology, 6:511-519(1976)), 재조합 DNA 방법(미국 특허 제4,816,56호) 또는 파아지 항체 라이브러리 방법(Clackson et al, Nature, 352:624-628(1991) 및 Marks et al, J. Mol. Biol., 222:58, 1-597(1991))에 의해 제조될 수 있다. 항체 제조에 대한 일반적인 과정은 Harlow, E. and Lane, D., Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, New York, 1999; Zola, H., Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, CRC Press, Inc., Boca Raton, Florida, 1984; 및 Coligan , CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY, Wiley/Greene, NY, 1991에 상세하게 기재되어 있으며, 상기 문헌들은 본 명세서에 참조로서 삽입된다. 예를 들어, 단일클론 항체를 생산하는 하이브리도마 세포의 제조는 불사멸화 세포주를 항체-생산 림프구와 융합시켜 이루어지며, 이 과정에 필요한 기술은 당업자에게 잘 알려져 있으며 용이하게 실시할 수 있다. 폴리클로날 항체는 PSA-NCAM 항원을 적합한 동물에게 주사하고, 이 동물로부터 항혈청을 수집한 다음, 공지의 친화성(affinity) 기술을 이용하여 항혈청으로부터 항체를 분리하여 얻을 수 있다.

본 명세서에서, PSA-NCAM을 언급하면서 사용되는 용어 “항체”는 PSA-NCAM에 대한 특이 항체로서, PSA-NCAM 단백질에 대해 특이적으로 결합하며, 완전한 항체 형태뿐만 아니라 항체 분자의 항원 결합 단편을 포함한다.

완전한 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 구조이며 각각의 경쇄는 중쇄와 다이설파이드 결합으로 연결되어 있으며, 항체 분자의 항원 결합 단편이란 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편으로서 Fab, F(ab'), F(ab')2 및 Fv을 포함한다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 항체를 이용한 PSA-NCAM-양성 신경전구세포 분리를 위해 형광-활성세포분류기(fluorescence-activating cell sorters: FACS), 자성활성세포분류기(magnetic activated cell sorter: MACS) 및 보체 매개성 용해(complement-mediated lysis) 방법을 이용하며, 보다 구체적으로는 MACS를 이용하여 실시한다.

본 발명의 조성물이 약제학적 조성물로 제조되는 경우, 본 발명의 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 본 발명의 약제학적 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제 시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘, 미네랄 오일, 식염수, PBS(phosphate buffered saline) 또는 배지 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 경구 또는 비경구 투여할 수 있으며, 구체적으로는 비경구 투여, 보다 구체적으로는 근육 내(intramuscular) 투여, 뇌실 (intracerebroventricular) 투여, 척수강(Intrathecal) 투여 또는 혈관 내(intravascular) 투여이다.

본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물의 일반적인 투여량은 성인 기준으로 1일 당 10²-10¹⁰ 세포이다.

본 발명의 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액, 시럽제 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 산제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:

(a) 본 발명은 척수손상 치료용 조성물을 제공한다.

(b) 본 발명에서 이용되는 PSA-NCAM-양성 신경전구세포는 주입된 조직에서의 혈관신생을 촉진하고 염증반응을 억제한다.

(c) 본 발명에서 이용되는 PSA-NCAM-양성 신경전구세포는 항-PSA-NCAM-항체를 이용하여 간단히 분리할 수 있으며, 중간엽 줄기세포(MSC)에 비하여도 우수한 혈관신생 및 염증억제 활성을 보여, 척수손상 및 염증으로 인한 신경손상 질환에 대한 효율적인 치료 조성물로서 유용하게 이용될 수 있다.

도 1은 NPC^PSA-NCAM+ 및 MSC를 이식한 랫트 허혈 뇌에서의 경색부위 축소를 보여주는 그림이다. 도 1a는 실험 계획도를 보여주는 모식도이다. pMCAo 이후 1일째에, 실험동물에 무작위로 NPC^PSA-NCAM+, MSC 또는 PBS를 저리하였다(각각 n=10). 이식 후 26일 째에 실험동물을 희생시키고 뇌 조직에 대한 면역조직화학 분석을 진행하였다. 도 1b는 랫트 pMCAo 모델에서 MSCs 및 NPC^PSA-NCAM+ 이식이 이식 26일 째에 경색 크기에 미치는 효과를 보여주는 그림이다. PBS 군과 비교시 각각 *P<0.05 및 **P<0.01이다. 도 1c는 PBS, NPC^PSA-NCAM+ 또는 MSC를 처리한 랫트에서 이식 26일째의 대표적 이미지를 보여주는 그림이다.
도 2는 NPC^PSA-NCAM+를 이식한 랫트 뇌졸중 모델에서 행동능력의 향상을 보여주는 그림이다. 각각 체중변화(도 2a), 풋 폴트 검사(도 2b), 비대칭 검사(도 2c), 빔 균형 검사(도 2d), 포착가능 견인 검사(도 2e) 및 mNSS(도 2f) 결과를 나타낸다. 측정값은 ±표준오차로 표시하였다. PBS 군과 비교하여 각각 *P<0.05, **P<0.01 및 ***P<0.001이다.
도 3은 생존한 NPC^PSA-NCAM+의 랫트 뇌조직으로의 편입 및 분화를 보여준다. 도 3a는 경색 부위를나타낸다. 이식된 NPC^PSA-NCAM+의 생존 및 증식을26일째에 시험하였다. Ki67(녹색) 또는 DCX(붉은색) 양성세포가 랫트 허혈 뇌에서 관찰되었다. 스케일바: 500 μm. 도 3b는 도 3a의 고배율 사진이다. 스케일 바:200μm. 도 3은 hNu(녹색) 및 DCX(붉은색)을 함께 발현하는 NPC^PSA-NCAM+ 세포의 일례를 보여주는 그림으로, 많은 이식된 NPC^PSA-NCAM+ 세포들이 hNu 양성을 보여 우수한 생존률과 손상된 뇌조직으로의 생착률을 보임을 알 수 있다. 스케일 바:20μm. 도 3d는 MSC-이식군의 대부분에서 바늘관(needle tract) 주위에 몇몇 증식한 Ki67⁺hNu^- 세포가 관찰됨을 보여주는 그림이다. 스케일 바:200μm.
도 4는 랫트 뇌 조직에서 NPC^PSA-NCAM+의 신경조직에의 기여 및 아교세포 활성화의 감소효과를 보여주는 그림이다. 도 4a는 NPC^PSA-NCAM+-이식된 랫트 뇌에서 hMito⁺(붉은색) 및 MAP2⁺(녹색) 세포가 관찰됨을 보여주는 그림이다. 스케일 바:20μm. 도 4b는 이식된 세포의 이식 26일째의 공초첨 이미지이다. 공여자-유래 세포(녹색, hNu+)는 NPC^PSA-NCAM+ 이식부위에서 MAP2(붉은색)와 함께 위치하였다. DAPI, 파란색. 도 4c는 반대측 선조체의 숙주 뉴런에 MAP2와 함께 위치하는 hMi가 없음을 보여주는 그림이다. 선조체에 MAP2⁺ 세포가 두드러지게 존재하는 것을 알 수 있다. 스케일 바:20μm. 도 4d는 NPC^PSA-NCAM+-이식된 랫트뇌에 hMito⁺GFAP⁺ 세포가 검출되지 않음을 보여주는 그림이다. 스케일 바:20μm. 도 4e는 NPC^PSA-NCAM+-이식 그룹에서 동측 선조체의 ED-1 양성이 유의하게 감소하고, MSC-이식 그룹에서는 그 정도가 덜함을 보여주는 그림이다. NPC^PSA-NCAM+-및 MSC-이식 그룹 모두 PBS 그룹과는 유의한 차이를 보였다. GFAP의 발현은 MSC-또는 PBS 군에 비해 NPC^PSA-NCAM+-이식 군에서 눈에 띄게 감소하였다. 스케일 바:200μm. ED1 또는 GFAP 양성 세포의 수를 최소 5개의 별개의 현미경 영역에서 측정하였다. 측정값은 ±표준오차로 표시하였다. 각 그룹 간의 다중 비교시 *P<0.05 및 ***P<0.001이다.
도 5는 NPC^PSA-NCAM+가 이식된 랫트 허혈 뇌에서 혈관신생이 촉진됨을 보여주는 그림이다. 도 5a는 PBS 군, NPC^PSA-NCAM+- 또는 MSC-이식 군의 허혈성 뇌의 면역염색 결과를 각각 나타낸 그림이다. 스케일 바:200μm. 도 5b는 NPC^PSA-NCAM+-이식 부위의 숙주 기원 α-SMA-양성 혈관상피세포(붉은색)의 대표적인 이미지를 보여주는 그림이다. 스케일 바:20μm. 도 5c는 NPC^PSA-NCAM+-또는 MSC-이식된 랫트에서 α-SMA-양성 미세혈관의 정량분석 결과를 보여주는 그림이다. 측정값은 ±표준오차로 표시하였다. *NPC^PSA-NCAM+ 군을 MSC 또는 PBS 군과 비교시 각각 P<0.05 및 *P<0.01. 도 5d는 허혈성 뇌에서의 랫트-안지오포이에틴-1 발현량을 RT-PCR로 NPC^PSA-NCAM+(NPC) 또는 MSC 이식 7일 및 26일 후에 측정한 결과를 나타내는 그림이다. 안지오포이에틴-1의 RT-PCR 증폭(위) 및 샴 대조군(기저값)에 대해 GAPDH-표준화한 mRNA 수준(아래)의 정량화 결과를 보여준다. 측정값은 ±표준오차로 표시하였다. * PBS 군과 비교시 P<0.05.
도 6은 NPC^PSA-NCAM+, MSC 또는 PBS를 이식한 허혈 뇌에서의 랫트 및 인간 신경영양 인자 발현수준을 RT-PCR을 이용하여 조사한 결과를 나타낸 그림이다. 신경영양 인자의 RT-PCR 증폭 및 샴 대조군(기저값)(그룹 당 n=3)에 대해 GAPDH-표준화한 mRNA 수준의 정량화 결과를 보여준다. 측정값은 ±표준오차로 표시하였다. *PBS 군과 비교시 P<0.05.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예

실험방법

인간 MSC 및 인간 ESC-유래 NPC ^PSA-NCAM+ 세포의 배양 및 분화

인간 세포의 사용은 의학연구윤리심의위원회(Institutional Review Board, IRB No. 4-2008-0643)의 승인을 받았다. 인간 골수는 사전 동의서를 제출한 건강한 성인 지원자의 후부장골능선에서 수득하였다. 요약하면, 골수 단핵세포를 밀도구배 원심분리(GE Healthcare, Uppsala, Sweden)를 이용하여 분리하고 10% FBS(Gibco, GrandIsland, NY)가 보충된 DMEM에 플레이팅한 뒤 37^oC에서 5% CO₂를 포함하는 가습 대기 하에서 배양하였다. 24시간 뒤에, 비-흡착 세포를 세척하고 제거하였다. 배양액을 매 3일마다 교체하고 90% 컨플루언시에 도달하였을 때 세포를 0.05% 트립신/EDTA (Invitrogen, Carlsbad, CA)를 이용하여 계대배양하였다. 3-5계대의 흡착 MSC를 본 실험에서 사용하였다. 신경 유도를 위하여, bFGF가 없는 hESC 배지(Invitrogen) 상에서 hESC에서 유래된 배아체(embryoid bodies, EBs)를 5 μM DM(dorsomorphin)(Sigma, St. Louis, MO) 및 5-10 μM SB431542 (Calbiochem, San Diego, CA)를 포함하는 현탄액에서 4일간 배양하고 이후 20 ng/ml bFGF가 보충된 1× N2(Invitrogen)배지에서 마트리젤-코팅된 디쉬(BD Biosciences, Bedford, MA)에 5일간 흡착시켰다[9].

흡착된 EB 콜로니의 중심에 나타난 신경 로제트를 pulled 글래스 파이펫을 이용하여 주변의 평평한 세포로부터 조심스럽게 분리하였다. 작은 로제트 덩어리를 마트리젤 코팅된 디쉬에 씨딩하고 1×N2, 1×B27 (Invitrogen)가 보충된 DMEM/F12에서 배양하였다[11].

MACS에 의한 PSA-NCAM-양성 NPC의 분리

80-90% 컨플루언시의 확장된 신경 로제트를 10 μM Y27632(Sigma)에 1시간 동안 노출시켜 MACS 단계에 들어가긴 전 세포사가 일어나는 것을 방지하였다. Accutase(Invitrogen)를 이용하여 분리한 뒤에, 세포들(~1×10⁸ cells)을 1% BSA가 포함된 PBS에서 블로킹하고, 마이크로비드(Miltenyi Biotec)가 접합된 항-PSA-NCAM 항체와 함께 4℃에서 15분간 배양하였다. 집중적으로 세척한 뒤, 세포 현탄액을 MASC(magnetic activated cell sorting)에 넣고 컬럼에 남아있는 양성-표지된 세포를 튜브로 용리시켰다. 분리된 NPC^PSA-NCAM+를 N2B27 배지 또는 20ng/ml bFGF가 추가된 NBG 배지(1×N2, 0.5×B27 및 0.5×G21 보충)(GeminiBio-Products, WestSacramento, CA)에 4-5×10⁵cells/cm² 농도로 다시 플레이팅하였다. 배양 배지는 매일 교체하였으며, 세포는 2-3일마다 계대배양하였다.

뇌졸중 모델의 확립 및 NPC ^PSA-NCAM+ 의 정위주입(stereotaxic injection)

2주령의 수컷 Sprague-Dawley 랫트(체중 약 250-300 g)를 N₂O 대 O₂.의 비율 70%-30% 하에서 3% 이소플로란(Hana Pharm, Seoul, Korea)으로 마취하였다. 좌측 총경동맥 및 외경동맥을 분리하고 4-0 수술용 봉합사로 연결하였다. 나일론 실을 좌측 내경동맥에 삽입하여 윌리스 고리까지 이동시켰으며(영구적 중대뇌동맥 폐색: permanent middle cerebral artery occlusion, pMCAo), 랫트를 희생시킬 때 까지 실을 남겨두었다.

pMCAo 이후 2일 뒤에 NPC^PSA-NCAM+, MSCs 또는 PBS의 정위주입을 수행하였다. 랫트를 졸레틸(VirbacS. A., France, 25mg/kg)로 마취하고 정위 외과수술도구(David Kopf Instruments, Tujunga, CA)에 위치시켰다. A26-게이지 바늘(Hamilton syringe, Hamilton, Reno, NV)을 좌측 선조체(striatum)(브레그마로부터의 좌표: 전후측(anteroposterior) +0.7mm, 내외측(mediolateral)-2mm 및 등배측(dorsoventral)-5.5mm, 수막(meninges)으로부터 -2.5mm)에 삽입하였다; 5μl의 NPC^PSA-NCAM+, MSCs(각각 1×10⁵cells/μl) 또는 PBS를 5.5mm 및 -2.5mm 부위에 주입하였다. 모든 세포를 지속적인 교반을 통해 세포 응집을 막으면서 좌측 선조체에 1μl/min의 속도로 주입하였다. 9마리의 실험동물이 pMCAo 수술 및 세포 이식 도중 사망하였다.

모든 동물을 AAALAC(Association for Assessment and Accreditation of Laboratry Animal Care)가 승인한 시설에서 12 시간 명/암 사이클 하에서 길렀다. 동물 실험은 의학연구윤리심의위원회(Institutional Review Board, IRB No. 4-2011-0087)의 승인을 받았다.

행동 검사

풋 폴트 검사(Foot fault test): 풋 폴트 검사는 2분 간의 시험 동안 등거리 격자판(equi-distant grid, 60×60 cm, 6cm 거리) 상에서 앞발을 정확하게 위치시키는 정도를 측정한다. 상기 시험은 종래의 연구에 기초하여 변형된 절차에 따라 수행하였다[12, 13].

비대칭 행동검사(Asymmetric behavior test): 종래에 보고된 변형된 EBST(elevated body swing test)를 이용하였다. 랫트의 꼬리를 실험 구역 표면의 10cm까지 들어올린 후 측면 운동을 검사하였다. 우측 또는 좌측으로의 스윙(swing) 빈도를 1분간 측정하였다. 비대칭 점수값은 다음과 같이 계산하였다; 0점-몸통을 비틈, 좌측 또는 우측으로 스윙, 1점-<30^o로 비대칭적 비틈, 2점->30^o로 비대칭적 비틈. 몸통을 비트는 방향에 따라, 점수는 동측 비틈(동측 twist, 경색 부위와 같은 쪽) 또는 반대측 비틈(contralateral twist, 경색 부위와 반대 쪽)으로 계산하였다.

Beam balance test(빔 균형 검사): 빔 보행기구는 빔(100×5×2 cm)으로 구성된다. 운동능력은 종래 연구에서 사용된 6점 단위로 평가하였다; 1점-빔 위에서 안정적인 자세 및 발로 균형을 이룸, 2점-비의 측면을 움켜쥐고 흔들리는 동작을 함, 3점-하나 이상의 발이 미끄러짐, 4점-균형을 잡으려는 시도를 하나 떨어짐, 5점-빔에 걸쳐있으나 떨어짐, 점 6-균형을 잡으려는 시도 없이 떨어짐.

포착가능 견인 검사(Prehensile traction test): 검사 중 포착가능 여부는 랫트가 앞발로 수평방향의 로프에 매달릴 수 있는 능력을 통해 측정한다. 포착가능 견인 검사는 랫트의 근육 강도를 평가하기 위하여 행해졌다. 이 검사는 종래에 보고된 방법으로 실시하였다. 철막대(직경 2cm, 길이 100cm)를 수평으로 스펀지 고무패드(두께 7.5 cm)의 70cm 위에 위치시켰다. 랫트의 앞발을 철막대에 위치시킨 뒤 풀어주었다. 랫트를 5초간 철막대에 매달리도록 하였다. 떨어지는데 걸리는 시간과 뒷다리를 철막대 위에 올려놓는지 여부를 통해 다음과 같이 점수를 계산하였다; 0점 -랫트가 5초 동안 매달리고 뒷다리를 올려놓음, 1점 - 랫트가 5초 동안 매달리고 뒷다리를 올려놓지 못함; 2점 - 랫트가 3-4초 간 매달림, 3점 - 랫트가 0-2초 동안 매달림.

mNSS(Modified neurological severity score): 신경장애 점수는 운동, 감각 및 반사신경 검사를 복합하여 도출되며, 종래에 보고된 방법으로 실시하였다. 객관적인 정량화는 비대칭 행동 검사, 빔 균형 검사, 포착가능 견인 검사 오픈 필드 검사(회전빈도) 및 풋 폴트 검사에 기초하여 이루어지며 다음과 같이 점수를 계산하였다; 0점 - 결함이 없음, 2점- 반대쪽 앞다리를 완전히 뻗는 데에 어려움이 있음(3≤front foot fault<10), 4점-반대쪽 앞다리를 뻗지 못함(front foot fault≥10), 6점-반대측으로 다소 선회함(1≤회전 또는 비대칭 비틀림<5), 8점-심하게 선회함(회전 또는 비대칭 비틀림≥5), 10점-반대측으로 떨어짐(포착가능 견인≤2).

면역조직화학적 분석 및 정량화

뇌 조직을 24시간 동안 4% 포름알데히드로 고정하고 PBS로 세척하였다. 파라핀 단면 제작을 위해, 누진 에탄올에서 조직을 탈수시키고 파라핀에 포매시켰다. 파라핀-포매된 뇌를 마이크로톰 상에서 5 mm 두께 층으로 절단하고, 자일렌에서 10분 간 탈파라핀화한 뒤 누진 알콜에서 재수화하였다. 단면에 10 mM 시트르산을 1시간 동안 처리한 뒤 PBS 및 0.5% 트리톤 X-100을 함유하는 5% BSA 용액을 첨가하였다. 이후, 뇌 절편을 DCX (Abcam), Tuj1(Covance), hNu(Millipore, clone 235-1), GFAP(Millipore), Ki67(Leica Microsystems), hMito(Millipore), MAP2(Millipore), 인간 Nestin(Millipore, clone 10C2) 또는 ED-1(Abcam)(1:100)에 대한 1차 항체와 함께 10-12시간 동안 4℃에서 배양하였다. 1차 항체와 함께 밤새 배양한 뒤에, 절편들을 PBS로 세척하고 절편들을 형광 표지된 2차 항체인항-래빗 IgG와 1시간 동안 배양하였다. 절편들을 다시 한번 PBS로 세척하고 DAPI(4’,6’-diamidino-2-phenylindole)를 이용하여 마운팅하였다. 형광 현미경(Olympus IX71)를 이용하여 절편의 형광 이미지를 얻었다. 뇌조직 내에서 특정 항체와 반응하는 신경 세포의 수를 정확히 측정하기 위하여 블라인드 테스트를 이용하였다. 실험에 대해 미리 알지 못하는 세명의 실험자에게 슬라이드 내 5개의 50 mm² 사각형 내에서의 ED-1⁺ 세포 및 α-SMA⁺ 혈관(직경 50mm 이하)의 수를 세도록 하였다. 이후 조사자는 세명의 실험자의 결과를 종합하여 검출된 뉴런의 수를 정확하게 결정하였다.

이식 후 26일 째에, 랫트(그룹당 10 마리)를 졸레틸(Virbac S.A., France, 25 mg/kg)로 마취하고 PBS 및 PBS에 함유된 4% 파라포름알데히드(pH 7.5)로 관류하였다.

*

*경색 부위 측정을 위하며, 뇌 절편을 헤마톡실린으로 염색하고 현미경(Zeiss, Oberkochen, Germany)으로 촬영하였다. 반대측 반구의 경색 면적에서 동측 반구의 경색 면적을 뺀 간접적인 손상 부위를 계산하였다. 상대적인 경색 면적을 NIH Image J 프로그램(1.47 버전)으로 분석하였다. 반대측 반구와 비교한 간접적 손상의 평균 백분율을 표시하였다［14］.

역전사 중합효소 연쇄반응(RT-PCR)

Trizol 시약(Invitrogen)을 이용하여 총 RNA를 분리하였다. 표준 역전사(RT)를 Transcriptase Ⅱ(Invitrogen)를 이용하여 우선 수행한 뒤 다음과 같은 프라이머 세트로 RT-PCR을 수행하였다: 안지오포이에틴 1 정방향 프라이머: TGTGTCCATCAGCTCCAGTTGC, 역방향 프라이머: CGGCTACCATGCTCGAGATAGG (Bioneer, Daejeon, Korea). PCR 산물을 1.2% 아가로스 젤에 돌린 후 브롬화 에티듐으로 염색하여 UV광 하에서 밴드(약 400 bp)를 검출하였다. 마지막으로, 검출된 밴드를 NIH Image J 프로그램 (버전 1.47)으로 정량화하였다.

통계적 분석

데이터는 평균 ± 표준오차로 나타내었다. 행동검사 및 경색 면적의 데이터는 SPSS(Statistical Package for Social Sciences, 버전 20.0)을 이용하여 ANOVA 및 독립 t-검정으로 분석하였다. P-values<0.05인 경우 통계적 유의성이 있는 것으로 간주하였다.

실험결과

NPC ^PSA-NCAM+ 의 이식은 숙주 뇌의 경색 부위를 감소시킨다

본 발명의 전체적인 실험설계는 도 1a에 나타내었다. 신경조직의 손상 정도는 이식 26일 후 헤마톡실린을 통해 정상적으로 염색되지 않은 뇌 부위(area)를 통해 평가하였다. 경색 부위는 대뇌 피질 및 선조체에서 주로 나타났다. 경색 부위는 MSCs 또는 NPC^PSA-NCAM+를 이식한 경우보다 PBS를 처리한 허혈성 뇌에서 명확하게 더 넓었다(도 1b). 반대측에 대한 경색 면적의 백분율은 NPC^PSA-NCAM+(7.1±2.5%) 또는 MSC(14.9±1.9%)가 이식된 군에서 PBS 군(25.1±2.4 %)에 비해 유의하게 감소하였다(F=13.64, P<0.01). NPC^PSA-NCAM+-및 MSC-이식 군 간의 경색이 통계적으로 다르지는 않았으나, NPC^PSA-NCAM+-이식군의 경색 면적은 MSC-이식군에 비하여 명백하게 더 좁았다(도 1c).

NPC ^PSA-NCAM+ 의 이식은 랫트 뇌졸중 모델에서 행동능력을 향상시킨다.

랫트의 체중은 pMCAo 후 첫째날 측정한 기저값에 비해 40 g이 감소하였다. 체중 감소는 PBS-처리 랫트에서 7일 후 정점에 다다랐다. MSC-이식 군에서, 체중은 이식 17일 후 기저 단계까지 회복되었다. 그러나, NPC^PSA-NCAM+-이식 군에서는 PBS 군과 비교하여 이식 3일 뒤부터 유의한 체중 회복이 관찰되었다(P<0.05)(도 2a). pMCAo 이후, 3일(P<0.05)에서 13일 (P<0.01)사이까지 풋 폴트/라인 크로스 빈도는 PBS 군에 비해 NPC^PSA-NCAM+ 및 MSC 이식 군에서 유의하게 감소하였다(도 2b). 뿐만 아니라, NPC^PSA-NCAM+이식군은 13일 째에 풋 폴트/라인 크로스가 MSC 이식 군과 비교하여도 유의하게 감소하였다. 그러나, 이러한 차이는 이후(이식 후 17 및 24일) 체중 증가에 따른 활동성 감소로 인해 덜 두드러지게 되었다.

모든 랫트가 pMCAo 전에는 EBTS에서 상대적으로 낮은 비대칭성을 보인 반면, pMCAo 후에는 모든 실험동물의 비대칭성이 명확히 관찰되었다. 이식 3일 후, NPC^PSA-NCAM+- 및 MSC-이식 군에서 동측 비틀기 행동을 보이기 시작했다. MSC-이식군이 이식 13일 후까지 완만한 향상을 보인 반면(P<0.05), NPC^PSA-NCAM+-이식군의 비대칭 행동점수는 이식 후 7일째에 유의하게 감소하기 시작하여 24일째까지 지속되었다(P<0.01)(도 2c).

NPC^PSA-NCAM+ 이식은 MSC-이식군 및 PBS군에 비해 3일에서 24일 사이의 빔 균형 검사에서의 기능회복도 개선시켰다(P<0.01)(도 2d). NPC^PSA-NCAM+ 이식은 운동조정 능력을 반영하는 빔 위에서 유지하는 시간을 유의하게 증가시켰으나, MSC- 및 PBS-처리 군에서는 통계적인 차이점을 보이지 않았다.

앞발의 근육강도와 음의 상관관계를 가지는 포착가능 견인 점수는 NPC^PSA-NCAM+ 이식군에서 3-24일 사이에 점차 감소하였다(P<0.01)(도 2e). MSC-이식군도 이식 7-24일 후에 유사한 개선 패턴을 보였다.

*신경 회복효과의 정량화를 표준화하기 위하여, 본 발명자들은 마지막으로 비대칭 행동점수, 빔 균형시험, 포착가능 견인 검사, 오픈 필드검사(회전 빈도, 데이터 미공개) 및 풋폴트 검사에 기반하여 mNSS 기준을 평가하였다. mNSS는 점진적인 신경기능 회복이 PBS-처리군에 비하여 NPC^PSA-NCAM+- 및 MSC-이식군에서 3일 후부터 두드러지기 시작함을 보여준다(P<0.05)(도 2f). 뿐만 아니라, NPC^PSA-NCAM+-이식군은 7일 이후부터 24일까지 MSC-이식군에 비하여도 실질적인 개선을 보였다(P<0.01). NPC^PSA-NCAM+-이식군의 효과는 특히 3일에서 7일 사이에 명확해졌는데, 이를 통해 이식 초기 강력한 곁분비(paracrine) 효과가 있음을 알 수 있다.

이식된 NPC ^PSA-NCAM+ 는 숙주 뇌에서 생존하여 신경계로 분화한다.

이식된 세포의 밀도를 추적하기 위하여, 본 발명자들은 26일 째에 hNu(인간-특이적 핵), Ki67(증식세포 마커), DCX(신경모세포 마커), 네스틴(신경줄기세포 마커) 및 Tuj1(신경마커)에 대한 항체를 이용하여 조직학적 분석을 수행하였다. NPC^PSA-NCAM+의 이식 뒤에, 대부분의 세포는 최초 이식 부위(예를 들어 선조체)에서 별견되었다. 이식된 NPC^PSA-NCAM+의 생존, 증식 및 분화는 손상된 뇌에서의 Ki67⁺, DCX⁺, Tuj1⁺ 및 네스틴⁺의 존재를 통해 확인하였다(도 3a 및 3b). 이식된 NPC^PSA-NCAM+ 세포의 다수는 DCX 또는 Tuj1를 발현한 반면, 일부는 네스틴에 대해 양성이었다. 이식된 세포들의 유사분열 단계는 Ki67-면역반응성을 통해 조사하였다. hNu⁺ 세포(9184개)의 일부는 이식 26일째에 Ki67에 대해서도 양성이었다(432개, 4.7%). NPC^PSA-NCAM+ 세포에서의 Tuj-1 면역반응성은 DCX 면역반응성과 광범위하게 중첩되었다(도 3b). 이들 DCX 면역반응성 세포들은 랫트 유래가 아닌 인간 유래의 세포들이며(도 3c), 이를 통해 뇌 경색부위의 감소는 이식된 세포의 융합에 부분적으로 기인함을 알 수 있다.

많은 이식된 NPC^PSA-NCAM+ 세포들이 우수한 생존률을 보이면서 손상된 조직으로 편입되었으나, hNu를 발현하는 MSC는 이식 26일 후에 몇몇 세포만이 검출되었다(도 3d). 대부분의 이식된 NPC^PSA-NCAM+ 세포는 미성숙 신경세포(예를 들어 DCX 양성이고 일부 Ki67 양성 세포)이다(도 3b). 반면, 이식된 MSCs(hNu⁺ 세포)는 손상 부위에서 DCX 양성을 보이지 않았으며, 대부분의 MSC 이식군에서 소수의 증식중인 hNu ^-Ki67⁺ 세포가 바늘관 내 및 주위에 존재하였다(도 3d).

NPC^PSA-NCAM+가 이식된 랫트에서 hMito⁺MAP2⁺ 및 hNu⁺MAP2⁺ 이중표지 세포가 검출되었으나(도 4a 및 4b), hMito⁺GFAP⁺(도 4d) 또는 hMito⁺GalC⁺(데이터 미공개) 공-염색 세포는 거의 검출되지 않음으로서, NPC^PSA-NCAM+ 세포는 신경계에 주로 기여하는 전구세포임을 알 수 있었다. 반대측 선조체에서 hMito⁺ 세포는 거의 관찰되지 않았다(도 4c).

NPC ^PSA-NCAM+ 의 이식은 숙주 뇌에서 반응성 아교세포의 활성을 억제한다.

몇몇 GFAP(성상세포 마커)-양성 세포들이 바늘과 주변에서 발견되기는 했으나, GFAP의 발현은 NPC^PSA-NCAM+ 이식군에서 눈에 띄게 낮았다(도 4e). 사실, GFAP-양성세포의 수는 NPC^PSA-NCAM+ 이식군에서 크게 감소하였고(P<0.001), MSC-이식군에서는 그 감소 정도가 보다 낮았다(더 4e 및 4f). 이는 NPC^PSA-NCAM+ 이식이 반응성 성상세포의 활성화를 강하게 억제하고, 이로써 조직 재생에 유리한 환경을 조성함을 보여주는 것이다[15].

허혈성 뇌졸중은 조직 손상에 의한 미세아교세포의 반대 반응을 유도한다. 이에, 본 발명자들은 이식 26일 째에 CD68(활성 미세아교세포 마커)를 인식하는 ED1 항체를 이용하여 허혈 뇌조직에서의 미세아교세포 활성화를 조사하였다(도 4e). 주목할 만한 것은 ED1-양성 세포가 NPC^PSA-NCAM+ 군에서 유의하게 감소하였고(P<0.001), MSC-이식군은 보다 덜 감소하였다는 것이다(P<0.05)(도 4f). 비록 선조체 내의 Nu⁺세포가 6개월 뒤에 검출되기는 했지만, NPC^PSA-NCAM+가 이식된 뇌의 이식부위 또는 다른 부위에서 테라토마의 흔적은 전혀 없었다.

NPC ^PSA-NCAM+ 이식은 숙주 뇌에서의 혈관신생을 촉진한다.

평활근 액틴 마커인 α-SMA의 항체를 이용하여 허혈성 뇌에서의 내생적 혈관신생을 조사하였다. 그 결과, NPC^PSA-NCAM+-이식 랫트에서 MSC- 및 PBS-처리군에 비해 α-SMA 반응성 혈관의 수가 이식부위 주변에서 증가하였음을 관찰하였다(도 5a, 5b). 미세혈관의 정량적 분석을 통해 NPC^PSA-NCAM+-이식 랫트의 α-SMA⁺ 혈관이 MSC- 및 PBS-처리군의 그것에 비해 경색부위에서 증가하였음을 명확히 확인하였다(도 5c).

이식 후 7일 및 26일에 RT-PCR을 이용하여 뇌 조직에서의 혈관신생 유발인자인 안지오포이에틴-1의 발현수준을 조사한 결과, 26일째 NPC^PSA-NCAM+ 이식 랫트에서의 발현수준은 다른 군에 비하여 유의하게 높았으며(P<0.05)(도 5d), 이를 통해 장기간 생존한 NPC^PSA-NCAM+에 의해 혈관 신생이 유도되었음을 알 수 있었다. NPC^PSA-NCAM+-이식된 랫트는 26일 째에 7일째보다 증가된 안지오포이에틴-1 패턴을 보인 반면, MSCs-처리 랫트의 안지오포이에틴-1은 7일째의 그것과 비교하여 변화가 없거나 조금 감소하였다. 그러나 MSCs-처리 랫트는 7일째 PBS-처리군에 비하여 증가된 패턴을 보였다(P<0.05).

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

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Claims (7)

1. 전분화능 만능줄기세포(pluripotent stem cell)로부터 분화된 신경 로제트로부터 분리된, PSA-NCAM(poly-sialylated neural cell adhesion molecule)-양성 신경전구세포(neural precursor cell)를 유효성분으로 포함하는 척수손상 치료용 조성물로서,
   상기 PSA-NCAM-양성 신경전구세포는 상기 분화된 신경 로제트에 PSA-NCAM(poly-sialated neural cell adhesion molecule) 항체를 접촉시켜 PSA-NCAM-양성 신경전구세포만을 분리하여 수득하며,
   상기 전분화능 만능줄기세포는 배아줄기세포(embryonic stem cells) 또는 iPSCs(induced pluripotent stem cells)인 척수손상 치료용 조성물.
   
2. 제 1 항에 있어서, 상기 조성물은 안지오포이에틴-1의 발현을 증가시키는 것을 특징으로 하는 조성물.
   
3. 제 1 항에 있어서, 상기 조성물은 아교세포(glial cell) 또는 성상세포(astrocyte)의 활성화를 억제하는 것을 특징으로 하는 조성물.
   
4. 제 3 항에 있어서, 상기 조성물은 CD68 (ED1) 또는 GFAP (glial fibrillary acidic protein)의 발현을 감소시키는 것을 특징으로 하는 조성물.
   
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