JP2023510512A - 神経変性障害を治療するための間葉系幹細胞を含む組成物 - Google Patents
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Abstract
本発明は、神経変性疾患を治療するための方法又は組成物に関し、特に、本発明は、小脳の神経変性疾患を有する患者に有効成分として幹細胞を含む組成物を投与するステップを含む、小脳の神経変性疾患を治療するための方法、又は有効成分として間葉系幹細胞を含む、小脳の神経変性疾患を治療するための組成物に関する。本発明に従う間葉系幹細胞を用いる治療方法又は治療組成物は、神経炎症の低減、Ｍ１ミクログリアの阻害、Ｍ２ミクログリアの活性化、プルキンエ細胞のアポトーシスの阻害、ニューロン死滅の阻害、運動能力の改善等での卓越した効果を有し、したがって、小脳性運動失調及び多系統萎縮症をはじめとする神経変性疾患の軽減及び治療で効果的に用いることができる。
【選択図】 図５Ａ
【選択図】 図５Ａ
Description
本出願は、２０２０年１月８日出願の韓国特許出願第１０－２０２０－０００２７５８号に対する優先権を主張し、該出願はその全体が参照により本明細書中に組み入れられる。
本発明は、神経変性疾患を治療するための方法又は組成物に関し、特に、本発明は、小脳の神経変性疾患を有する患者に有効成分として間葉系幹細胞を含む組成物を投与するステップを含む、小脳の神経変性疾患を治療するための方法、又は有効成分として間葉系幹細胞を含む、小脳の神経変性疾患を治療するための組成物に関する。
小脳性運動失調（ＣＡ）及び多系統萎縮症（ＭＳＡ）等の疾患は、小脳又は関連する経路を侵す病理過程により引き起こされる運動神経変性疾患である。小脳性運動失調及び多系統萎縮症は、歩行困難等の、動作の異常な協調及び平衡障害により特徴付けられる。
小脳性運動失調及び多系統萎縮症は、遺伝的欠陥、散発性の神経変性障害、後天性疾患（例えば、感染、毒性反応、アルコール、及びビタミン欠乏）、及び他の未知の原因により引き起こされる場合がある。いくつもの近年の臨床的及び前臨床的研究が、小脳炎症が、小脳性運動失調及び多系統萎縮症の進行において重要な役割を果たし得ることを実証している。例えば、ミクログリア及び星状膠細胞の活性化による炎症性分子の産生を含む神経毒性炎症性応答が、遺伝性小脳性運動失調、特に脊髄小脳性運動失調の患者及び動物モデルで観察されてきた。神経膠細胞の活性化は、炎症性分子の産生をもたらし、且つ小脳性運動失調及び多系統萎縮症の多数の動物モデルで観察されており、並びに、神経膠細胞の活性化は小脳性運動失調及び多系統萎縮症を有する患者の小脳で見出された。小脳炎症は、小脳機能不全を生じるプルキンエ細胞の喪失を誘導することが知られている。加えて、小脳は、毒物及び中毒に対して特に致死性であり、且つ後天性の小脳性運動失調及び多系統萎縮症は、ウイルス感染及び毒物曝露（アルコール、薬物、及び環境毒性）により引き起こされる炎症性応答に起因して起こり得る。しかしながら、疾患の一部の動物モデルが、これらの遺伝的原因、小脳神経毒性、及び物理的損傷に関連する小脳性運動失調及び多系統萎縮症の病因に対する研究の結果から開発されているが、ｉｎ ｖｉｖｏで小脳性運動失調及び多系統萎縮症を研究するための好適な動物モデルがない。
小脳性運動失調及び多系統萎縮症をはじめとする神経変性疾患の基本的メカニズムは、神経細胞に対する機能的及び定量的損傷の段階的な出現である。現在、小脳性運動失調及び多系統萎縮症等の神経変性疾患は、予防又は治療することができず、極めて例外的な症例でのみ、治療及び症状軽減が可能である。
近年、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）が、その抗炎症機能、再生能、及び低い免疫反応性を理由に、神経変性疾患に対する治療候補として注目されている。ヒト間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ）は、自己再生及び数種類の特殊化された細胞へと分化する能力を有する多能性細胞である。損傷した脳では、ｈＭＳＣは選択的に損傷部位を標的とし、抗アポトーシス、血管新生、抗炎症、免疫修飾、及び化学誘引等の広範囲の活性を有することが公知の様々な成長因子、サイトカイン、及びケモカインを分泌する。ｈＭＳＣは、アルツハイマー病、パーキンソン病、及び脳卒中等の神経学的疾患に対する治療効果を有することが知られているが、小脳の神経変性疾患の患者及び動物モデルでの間葉系幹細胞の治療効果に対しては、ほとんど情報がない。
したがって、小脳性運動失調及び多系統萎縮症をはじめとする小脳の神経変性疾患でのｈＭＳＣの作用を確認するために、本発明者らは、小脳にリポ多糖（ＬＰＳ）を直接注入することにより、又は腹腔へとＡｒａ－Ｃ（シタラビン）を注入することにより、動物モデルを確立した。加えて、本発明者らは、遺伝子改変を通じた遺伝学的動物モデルであるＳＣＡ２疾患動物モデルを含む３種類の動物モデルでの、ヒト間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ）の治療効果を確認しようと試みた。
本発明の目的は、小脳の神経変性疾患を有する患者に有効成分として幹細胞を含む組成物を投与するステップを含む、小脳の神経変性疾患を治療するための方法を提供することである。
本発明の別の目的は、有効成分として幹細胞を含む、小脳の神経変性疾患の症状を軽減又は治療するための組成物を提供することである。
しかしながら、本発明により達成されるべき技術的課題は、上記の課題に限定されず、言及されていない他の課題が、以下の説明から当業者により明確に理解されるであろう。
上記の課題を解決するために、本発明は、小脳の神経変性疾患を有する患者に有効成分として幹細胞を含む組成物を投与するステップを含む、小脳の神経変性疾患を治療するための方法、又は有効成分として幹細胞を含む、小脳の神経変性疾患の症状を軽減若しくは治療するための組成物を提供する。
本発明は、小脳での炎症を誘導するために動物モデルにＬＰＳを投与することにより、又は小脳の発達を阻害するためにＡｒａ－Ｃを投与することにより、神経変性疾患の動物モデルを確立し、且つ第５世代を通じて遺伝的に安定化されているＳＣＡ２遺伝子改変疾患を有する動物モデルを構築した。次に、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）の治療効果を、これらの様々な病理メカニズムを有する神経変性疾患の３種類の動物モデルで実験した。
本明細書中で用いる場合、用語「小脳の神経変性疾患」とは、小脳の異常な機能に起因して、動作がぎこちなく、且つ動作間の協調がない神経学的疾患を指し、様々な医学的及び神経学的疾患又は遺伝的素因により誘導される全ての神経変性疾患を含む。本発明では、小脳の神経変性疾患としては、炎症により誘導される神経変性疾患、毒物により誘導される神経変性疾患、又は遺伝子改変により引き起こされる神経変性疾患が挙げられる。
本発明では、小脳の神経変性疾患は、小脳性運動失調又は多系統萎縮症を含む。
本明細書中で用いる場合、用語「幹細胞」とは、様々な身体組織へと分化する能力を有する未分化細胞を指し、より詳細には、いずれかの特異的細胞又は複数の機能的細胞へと分化する能力及び同じ細胞自体を繰り返し生成できる自己複製能を有する未分化細胞を含むことができる。幹細胞は胎児の発達の途中で全ての組織中で生成され、且つ成体でさえも、骨髄及び上皮組織等の、細胞が活発に置き換えられる一部の組織中に見出すことができる。
本発明の幹細胞は、成体幹細胞でもよく、成体幹細胞は、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）、間葉系間質細胞、及び多能性幹細胞からなる群より選択される少なくとも１種でもよいが、これらに限定されない。
本発明の幹細胞は、ヒト間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ）でもよいが、これに限定されない。
加えて、本明細書中で用いる場合、用語「間葉系幹細胞（ＭＳＣ）」とは、骨、軟骨、脂肪、神経組織、線維芽細胞、及び筋細胞等の特異的器官の細胞へと分化する前の、多能性を有する幹細胞（多能性幹細胞）を指す。間葉系幹細胞は、好ましくは、臍帯、臍帯血、骨髄、脂肪、筋肉、神経、皮膚、羊膜、絨毛膜、脱落膜、及び胎盤からなる群より選択される１つから誘導できるが、これらに限定されない。
本発明の一実施形態では、幹細胞として、同種骨髄由来間葉系幹細胞を用いた。
本発明の幹細胞を取得するために、骨髄を採取及び単離する方法により正常且つ健康なドナーから寄付される骨髄を、ＣＳＢＭ－Ａ０６培地を用いて１：２に希釈し、続いて、予め調製された骨髄の同量のフィコール層上に滴下注入する。これを４００×ｇで３０分間遠心分離し、得られる単球細胞層を単離し、ＣＳＢＭ－Ａ０６培地を用いて２回洗浄し、続いて３７℃及び５％ＣＯ２が維持される培養条件下で培養することができる。４８時間の培養後、フラスコの底部に接着していない細胞を、新規培地を交換することにより除去し、底部に接着した細胞を、３～４日間毎に１回培地を交換することにより培養する。培養された細胞が約８０％まで増殖したとき、新たなフラスコへと継代培養し、培養された細胞のうちの一部を継続的に継代培養し、一部をＤＭＳＯを含有する凍結保存溶液中に懸濁し、凍結保存した。
本発明では、幹細胞の単離及び培養のために使用可能な培養培地として、１０％ＦＢＳを含有する細胞培養培地を用いることができる。細胞培養培地として、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、最小必須培地（ＭＥＭ）、アルファ最小必須培地（α－ＭＥＭ）、マッコイ５Ａ培地、イーグル基礎培地、ＣＭＲＬ（Ｃｏｎｎａｕｇｈｔ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）培地、グラスゴー最少必須培地、ハムＦ－１２培地、ＩＭＤＭ（イスコフ改変ダルベッコ培地）、リーボビッツＬ－１５培地、及びＲＰＭＩ（ロズウェルパーク記念研究所）１６４０培地等の、当技術分野で通常用いられるいずれかの細胞培養培地を用いることができる。
本発明に従う幹細胞のうちの８０％以上、好ましくは９０％以上が、ＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０又はＣＤ１０５をはじめとする間葉系幹細胞陽性表面マーカーを発現し、且つ本発明に従う幹細胞のうちの５％以下、好ましくは３％以下が、ＣＤ３４又はＣＤ４５をはじめとする陰性表面マーカーを発現する。
神経変性疾患を有する動物モデルの大槽へと直接移植される場合に、本発明に従う幹細胞は、小脳の抗炎症活性を誘導し、且つ炎症性サイトカイン（ＩＬ－１β又はＴＮＦα）又は炎症性ケモカイン（ＭＩＰ－１α又はＭＣＰ－１）の発現を減少させることができる。加えて、本発明に従う幹細胞は、炎症性神経膠細胞であるＭ１型ミクログリアの活性化を阻害し、且つ抗炎症性神経膠細胞であるＭ２型ミクログリアを活性化し、それにより、小脳の抗炎症活性を誘導することができる。加えて、本発明に従う幹細胞は、プルキンエ細胞の損傷を阻害し、したがって異常な行動的運動障害症状を軽減又は治療するために有用に用いることができる。本発明の組成物は、幹細胞と一緒に、多系統萎縮症等の神経変性疾患の治療効果を有する１つ又は複数の公知の有効成分をさらに含有することができる。
本発明の組成物は、治療的組成物の調製で通常用いられる適切な懸濁化剤を含むことができる。例えば、注射剤は、保存料、鎮痛剤、可溶化剤又は安定化剤等をさらに含むことができ、局所投与用製剤は、基剤、賦形剤、滑沢剤、又は保存料等をさらに含むことができる。
本明細書中で用いる場合、用語「投与」とは、いずれかの適切な方法により被験体に本発明の所与の組成物を提供することを意味する。望ましい作用のために、幹細胞の投与量は、２．０×１０４～１．０×１０６細胞／動物であり、一度に投与するか、又は単回投与若しくは反復投与のために数回に分けることができる。しかしながら、有効成分の実際の投与量は、治療される疾患、疾患の重症度、投与経路、被験体の体重、年齢、及び性別等等のいくつかの関連する因子を考慮して決定されるべきであることが理解されるべきである。したがって、投与量は、いかなる態様においても、本発明の範囲を限定することを意図されない。
本発明の組成物は、注射剤の形態でもよい。
本発明の組成物は、様々な経路により被験体に投与することができる。投与は、髄腔内、静脈内、筋内、動脈内、髄内、硬膜内、神経内、脳室内（脳室下帯）、脳血管内投与等でもよく、好ましくは、治療を必要とする被験体の硬膜へと直接移植することができるが、これに限定されない。
本明細書中で用いる場合、用語「治療」とは、小脳の神経変性疾患に関連する疾患の症状を改善することを包括的に指す。この用語は、そのような疾患を治癒すること（状態を正常被験体のものと実質的に同一にすること）、若しくは実質的に予防すること（疾患の発症を阻害するか又は遅延させること）、又はそのような疾患の状態を軽減すること（状態を改善するか又は有益に変化させること）を含むことができ、且つ小脳性運動失調及び多系統萎縮症に関連する疾患から生じる１つの症状又は症状のうちの大部分を、軽減、治癒又は予防することを含むことができるが、それらに限定されない。
加えて、本発明は、ヒト以外の動物の小脳へと炎症誘導性物質を注入するステップを含む、小脳の神経変性疾患の動物モデルを作製するための方法、及び該方法を用いて作製される疾患の動物モデルを提供する。
本発明の一実施形態では、炎症誘導性物質は、ＬＰＳ（リポ多糖）でもよい。
本発明の一実施形態では、動物モデルは、シリンジを用いてマウスの小脳へとＬＰＳを直接注入することにより作製された。好ましくは、本発明の一実施形態では、動物モデルは、マウスの小脳へと５μｇ／５μＬの濃度でＬＰＳを直接注入することにより調製されたが、各物質の濃度及び注入量並びに世代は、当業者の技術的知識の範囲内で、作製される動物モデルの生物種、年齢、及び体重等に応じて調節することができる。
本発明の一実施形態では、炎症誘導性物質により誘導される神経変性疾患の動物モデルは、小脳に限定される炎症性応答が、小脳にＬＰＳを直接投与することにより活性化され、且つ炎症性環境中での小脳性運動失調の患者及び動物モデルで観察されるプルキンエ細胞の機能不全及び損傷に起因する運動失調症状が示されるものである。
本発明の一実施形態では、Ｍ１型ミクログリアの活性化がＬＰＳ注入後に誘導され、且つ小脳の神経炎症性応答が、ＩＬ－１β及びＴＮＦα等の炎症促進性サイトカイン又はＭＩＰ－１及びＭＣＰ－１等の炎症促進性ケモカインの発現を増加させることにより誘導された。加えて、プルキンエ細胞の損傷又はアポトーシスが、ＬＰＳ注入後に誘導された。
加えて、本発明は、ヒト以外の動物の小脳へと細胞分裂抑制剤（ａｎｔｉ－ｍｉｏｔｉｃ ａｇｅｎｔ）を直接注入するステップを含む、小脳の神経変性疾患の動物モデルを作製するための方法、及び該方法を用いて作製される疾患の動物モデルを提供する。
本発明の一実施形態では、細胞分裂抑制剤は、Ａｒａ－Ｃ（シタラビン）でもよい。
本発明の一実施形態では、動物モデルは、シリンジを用いてマウスの腹腔へとＡｒａ－Ｃを直接注入することにより作製された。好ましくは、本発明の一実施形態では、動物モデルは、１～３日齢の動物の腹腔へと４０μｇ／ｋｇのＡｒａ－Ｃを注入することにより作製されるが、各物質の濃度及び注入量並びに世代は、当業者の技術的知識の範囲内で、作製される動物モデルの生物種、年齢、及び体重等に応じて調節することができる。
本発明の一実施形態では、細胞分裂抑制剤により誘導される神経変性疾患の動物モデルは、小脳の発達が阻害され、且つ人工的運動失調が、小脳発達が進行する前に、出生後１日目～３日目の間に連続的に（１日１回、合計３回）動物の腹腔へとＡｒａ－Ｃを直接投与することにより起こるものである。マウスでは、小脳発達は、１４日齢後に起こる。プルキンエ細胞は胎生１３日目に観察され、小脳の外顆粒層、プルキンエ細胞層、及び内顆粒層は出生後に形成される。小脳の場合、出生後に発達する唯一の器官であり、この時点で細胞分裂抑制剤を直接投与することにより、小脳成熟障害を誘導し、神経変性疾患を誘導し得る。
本発明の一実施形態では、小脳の発達がＡｒａ－Ｃ注入後に阻害されていることが解剖学的に確認され、且つ小脳の発達が阻害されていることが、小脳の染色を介して見出された。
加えて、本発明は、ヒト以外の動物で遺伝子を過剰発現又は阻害するステップを含む、遺伝学的神経変性疾患の動物モデルを作製するための方法、及び該方法を用いて作製される疾患の動物モデルを提供する。
本発明の一実施形態では、過剰発現される遺伝子はＳＣＡ２でもよい。
本発明の一実施形態では、遺伝学的動物モデルは、第５世代までＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスを繰り返し戻し交配することを介して遺伝的に安定化された疾患を有する動物モデルを利用するが、各物質の濃度及び注入量並びに世代は、当業者の技術的知識の範囲内で、作製される動物モデルの生物種、年齢、及び体重等に応じて調節することができる。
本発明の一実施形態では、遺伝子改変により引き起こされる神経変性疾患の動物モデルは、ヒトＳＣＡ２遺伝子がＰｃｐ２プロモーターへと挿入及び過剰発現されているＢ６Ｄ２－Ｔｇ（Ｐｃｐ２－ＳＣＡ２）１１Ｐｌｔ／Ｊマウスであり、運動失調及びふらつき等の異常な神経学的症状が８週目から現れ、且つ２４週目～２７週目でプルキンエ細胞のうちの約５０％が失われる動物モデルを用いることができる。
本発明に従う間葉系幹細胞を用いる治療方法又は治療組成物は、神経炎症の低減、Ｍ１ミクログリアの阻害、Ｍ２ミクログリアの活性化、プルキンエ細胞のアポトーシスの阻害、ニューロン死滅の阻害、運動能力の改善等での卓越した効果を有し、したがって、小脳性運動失調及び多系統萎縮症をはじめとする神経変性疾患の軽減及び治療で効果的に用いることができる。
＜実験材料及び方法＞
動物
雄性Ｃ５７ＢＬ／６マウス（Ｄａｅｈａｎ Ｂｉｏｌｉｎｋ、Ｒｅｐｕｂｌｉｃ ｏｆ Ｋｏｒｅａ）及びＢ６Ｄ２－Ｔｇ（Ｐｃｐ２－ＳＣＡ２）１１Ｐｌｔ／Ｊマウスを、１２時間光周期を伴う制御環境で飼育し、食餌は不断給餌として与えた。全ての動物実験手順は、慶北大学校（Ｋｙｕｎｇｐｏｏｋ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）の動物実験倫理委員会の規則に従って行った（第ＫＮＵ２０１６－４２号）。
動物
雄性Ｃ５７ＢＬ／６マウス（Ｄａｅｈａｎ Ｂｉｏｌｉｎｋ、Ｒｅｐｕｂｌｉｃ ｏｆ Ｋｏｒｅａ）及びＢ６Ｄ２－Ｔｇ（Ｐｃｐ２－ＳＣＡ２）１１Ｐｌｔ／Ｊマウスを、１２時間光周期を伴う制御環境で飼育し、食餌は不断給餌として与えた。全ての動物実験手順は、慶北大学校（Ｋｙｕｎｇｐｏｏｋ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）の動物実験倫理委員会の規則に従って行った（第ＫＮＵ２０１６－４２号）。
ＬＰＳ注入により誘導される炎症性変性疾患の動物モデル及びヒト間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ）の移植
炎症関連小脳性運動失調を、マウスの小脳へとリポ多糖（ＬＰＳ、５μｇ／５μＬ）を直接注入することにより誘導した。具体的には、１０週齢のマウスを、１１５ｍｇ／ｋｇのケタミン（Ｙｕｈａｎ、Ｒｅｐｕｂｌｉｃ ｏｆ Ｋｏｒｅａ）及び２３ｍｇ／ｋｇのロムパン（Ｒｏｍｐｕｎ）（Ｂａｙｅｒ Ｋｏｒｅａ、Ｒｅｐｕｂｌｉｃ ｏｆ Ｋｏｒｅａ）を１０週齢のマウスの腹腔へと注入することにより麻酔し、続いて、定位固定装置（Ｄａｖｉｄ Ｋｏｐｆ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｔｕｊｕｎｇａ、ＣＡ、ＵＳＡ）に固定した。小脳への注入のために、頭蓋骨を中央部の矢状切開を介して露出させ、続いて穿頭を行った。合計５μＬのＬＰＳ（１ｍｇ／ｍＬ）又はリン酸緩衝生理食塩液（ＰＢＳ）を、ハミルトンシリンジ（１０μＬ、３０Ｇ）に接続した注入ポンプ（ＫＤ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｎｅｗ Ｈｏｐｅ、ＰＡ、ＵＳＡ）を介して小脳へと注入した（ラムダに対して、ＡＰ：－０．２５ｃｍ；ＤＶ：－０．２５ｃｍ）。注入チューブに沿った逆流を制御するために、針を５分間留置した。
炎症関連小脳性運動失調を、マウスの小脳へとリポ多糖（ＬＰＳ、５μｇ／５μＬ）を直接注入することにより誘導した。具体的には、１０週齢のマウスを、１１５ｍｇ／ｋｇのケタミン（Ｙｕｈａｎ、Ｒｅｐｕｂｌｉｃ ｏｆ Ｋｏｒｅａ）及び２３ｍｇ／ｋｇのロムパン（Ｒｏｍｐｕｎ）（Ｂａｙｅｒ Ｋｏｒｅａ、Ｒｅｐｕｂｌｉｃ ｏｆ Ｋｏｒｅａ）を１０週齢のマウスの腹腔へと注入することにより麻酔し、続いて、定位固定装置（Ｄａｖｉｄ Ｋｏｐｆ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｔｕｊｕｎｇａ、ＣＡ、ＵＳＡ）に固定した。小脳への注入のために、頭蓋骨を中央部の矢状切開を介して露出させ、続いて穿頭を行った。合計５μＬのＬＰＳ（１ｍｇ／ｍＬ）又はリン酸緩衝生理食塩液（ＰＢＳ）を、ハミルトンシリンジ（１０μＬ、３０Ｇ）に接続した注入ポンプ（ＫＤ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｎｅｗ Ｈｏｐｅ、ＰＡ、ＵＳＡ）を介して小脳へと注入した（ラムダに対して、ＡＰ：－０．２５ｃｍ；ＤＶ：－０．２５ｃｍ）。注入チューブに沿った逆流を制御するために、針を５分間留置した。
次に、ＬＰＳを注入されたマウスの頭部を、定位固定装置中で身体に向かって約９０°回転させた。下層の硬膜を露出させ、続いて、ｈＭＳＣ（１×１０５細胞／２０μＬ又は１×１０６細胞／２０μＬ）を、注入ポンプに接続したハミルトンシリンジ（２５μＬ、３０Ｇ）を用いて大槽に移植した。１０分間後に針を取り出し、切開部位を、シルク縫合糸を用いて縫合した。
Ａｒａ－Ｃ注入により誘導される小脳性運動失調の動物モデル及びヒト間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ）の移植
細胞分裂抑制剤であるＡｒａ－Ｃを、マウスでの炎症とは無関係な小脳性運動失調を誘導するために用いた。具体的には、神経毒性誘導小脳性運動失調の動物モデルを、出生後１日目から３日目までのマウスに１日１回、４０ｍｇ／ｋｇの濃度でＡｒａ－Ｃを腹腔内投与することにより構築した。
細胞分裂抑制剤であるＡｒａ－Ｃを、マウスでの炎症とは無関係な小脳性運動失調を誘導するために用いた。具体的には、神経毒性誘導小脳性運動失調の動物モデルを、出生後１日目から３日目までのマウスに１日１回、４０ｍｇ／ｋｇの濃度でＡｒａ－Ｃを腹腔内投与することにより構築した。
次に、上記と同様にして、ｈＭＳＣ（１×１０５細胞／２０μＬ又は１×１０６細胞／２０μＬ）を、Ａｒａ－Ｃを注入されたマウスの大槽に移植した。
ｈＭＳＣの単離及び幹細胞の特性の分析
ヒト骨髄サンプルを、慶北大学校Ｃｈｉｌｇｏｋ Ｈｏｓｐｉｔａｌの臨床研究審査委員会（ＩＲＢ：２０１７－１１－０１５－００７）により承認された手順に従って、８名の健康ドナーから確保した。
ヒト骨髄サンプルを、慶北大学校Ｃｈｉｌｇｏｋ Ｈｏｓｐｉｔａｌの臨床研究審査委員会（ＩＲＢ：２０１７－１１－０１５－００７）により承認された手順に従って、８名の健康ドナーから確保した。
単核細胞を、フィコール（Ｆｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅ Ｐｒｅｍｉｕｍ；ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏ－Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ＡＢ）を用いる密度勾配遠心により骨髄から単離し、約１×１０５細胞／ｃｍ２の密度でＣＳＢＭ－Ａ０６培地（Ｃｏｒｅｓｔｅｍ、Ｒｅｐｕｂｌｉｃ ｏｆ Ｋｏｒｅａ）中に播種し、続いて、１０％ＦＢＳ（胎児ウシ血清；Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ、ＵＳＡ）、２．５ｍＭ Ｌ－アラニル－Ｌ－グルタミン（Ｂｉｏｃｈｒｏｍ ＡＧ、Ｂｅｒｌｉｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）、及び１％ペニシリン－ストレプトマイシン（Ｂｉｏｃｈｒｏｍ ＡＧ）を用いて培養した。接着していない細胞を、新鮮培地を用いて除去し、続いて、３～４日間毎に１回、培地を交換した。７０～８０％コンフルエントまで増殖した細胞を第０継代と定めた（第ゼロ継代、Ｐ０）。引き続く実験の前に、第１０継代（Ｐ１０）まで細胞を継代培養した。
集団倍加時間（ＰＤＴ）：ＰＤＴは、連続的な継代培養で測定し、以下の方程式を用いて算出した：
（式中、Ｔ０は細胞移植時間であり、Ｔは細胞回収時間であり、Ｎ０は当初の細胞数であり、且つＮは回収された細胞数である）。
多系統分化アッセイ：細胞分化は、先行技術に従って誘導した。具体的には、ｈＭＳＣを２４ウェルプレート中で培養し、且つｈＭＳＣ機能特定キット（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ、ＵＳＡ）を用いて、脂肪形成系統、骨形成系統、及び軟骨形成系統に従って分化させるために刺激した。分化後、脂肪細胞の脂肪滴をオイルレッドＯ染色試薬（Ｓｉｇｍａ、Ｓａｉｎｔ Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵＳＡ）を用いて可視化した。骨形成分化は、アリザリンレッド（Ｓｉｇｍａ、Ｓａｉｎｔ Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵＳＡ）を用いてカルシウム蓄積を染色することにより確認し、軟骨形成分化は、アルシアンブルー染色（Ｓｉｇｍａ、Ｓａｉｎｔ Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵＳＡ）により確認した。
免疫表現型決定：ｈＭＳＣの特性を確認するために、５回継代以内の細胞を、細胞表面マーカーＣＤ２９、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、ＣＤ３４、ＣＤ４５（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）、及びＣＤ４４（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）について染色した。細胞表面マーカーの発現を、フローサイトメーター（ＢＤ ＦＡＣＳ Ｃａｎｔｏ◎ＩＩ）を用いて測定し、ｈＭＳＣをＣＤ２９／ＣＤ４４／ＣＤ７３／ＣＤ１０５陽性且つＣＤ３４／ＣＤ４５陰性細胞として特定した。
行動試験
動物モデル行動試験のために、ロータロッド試験を、ｈＭＳＣ移植の１日前及びｈＭＳＣ移植後の４週間にわたって週１回行い、簡略化複合表現型スコアリングシステムを、ｈＭＳＣ移植後の４週間毎に１回行った。
動物モデル行動試験のために、ロータロッド試験を、ｈＭＳＣ移植の１日前及びｈＭＳＣ移植後の４週間にわたって週１回行い、簡略化複合表現型スコアリングシステムを、ｈＭＳＣ移植後の４週間毎に１回行った。
ロータロッド試験：先行文献に開示される方法に従って、運動協調及び平衡を評価するために、ロータロッド試験を用いた（Ｚｈａｎｇ ＭＪ、Ｓｕｎ ＪＪ、Ｑｉａｎ Ｌ、Ｌｉｕ Ｚ、Ｚｈａｎｇ Ｚ、Ｃａｏ Ｗ、Ｌｉ Ｗ、Ｘｕ Ｙ：Ｈｕｍａｎ ｕｍｂｉｌｉｃａｌ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｅｎｈａｎｃｅ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ ｆａｃｔｏｒｓ ａｎｄ ｐｒｏｔｅｃｔ ａｔａｘｉｃ ｍｉｃｅ．Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ ２０１１、１４０２：１２２～１３１）。実験マウスを、４週間にわたって週１回、回転ロッド上に注意深く置いた。回転速度を、５分間で４ｒｐｍから４０ｒｐｍまで直線的に増加させ、同じ速度（４０ｒｐｍ）を５分間維持した。マウスが平衡を失ってロッドから落下するまでにかかる時間（潜時）、すなわち、マウスが回転ロッド上に残ることができた合計時間を記録した。筋肉疲労を防ぐために、各マウスを各実験の間に１０分間休ませた。
簡略化複合表現型スコアリングシステム：ＬＰＳ誘導小脳性運動失調マウスモデルでの疾患の重症度を定量的に分析するために、慣用的に公知のスコアリングシステムを、レッジ試験（ｌｅｄｇｅ ｔｅｓｔ）及び後肢抱込み試験と組み合わせて用いた（Ｇｕｙｅｎｅｔ ＳＪ、Ｆｕｒｒｅｒ ＳＡ、Ｄａｍｉａｎ ＶＭ、Ｂａｕｇｈａｎ ＴＤ、Ｌａ Ｓｐａｄａ ＡＲ、Ｇａｒｄｅｎ ＧＡ：Ａ ｓｉｍｐｌｅ ｃｏｍｐｏｓｉｔｅ ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ ｓｃｏｒｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ｅｖａｌｕａｔｉｎｇ ｍｏｕｓｅ ｍｏｄｅｌｓ ｏｆ ｃｅｒｅｂｅｌｌａｒ ａｔａｘｉａ．Ｊ Ｖｉｓ Ｅｘｐ ２０１０）。スコアリングシステムを、１４週齢のマウスで実行し、全ての試験を０～３点のスケールでランク付けし、０～６の複合表現型スコアを付加した：０のスコアは関連する表現型がないことを意味し、３のスコアは最も重度の症状を意味する。各試験を３回行った。
レッジ試験：運動平衡障害及び運動失調を、レッジ試験を通して評価した。マウスが全体的な平衡を失わずにレッジに沿って歩行した場合に０のスコアが適用され、マウスがレッジに沿って不平衡な位置で歩行した場合に１のスコアが適用され、レッジに沿って歩行している途中にマウスがよろめいた場合に２のスコアが適用され、マウスが後肢を効果的に用いることができなかった場合に３のスコアが適用された。
後肢抱込み試験：この試験は、小脳性運動失調のマウスモデルでの疾患進行のマーカーとして用いた（Ｃｈｏｕ ＡＨ、Ｙｅｈ ＴＨ、Ｏｕｙａｎｇ Ｐ、Ｃｈｅｎ ＹＬ、Ｃｈｅｎ ＳＹ、Ｗａｎｇ ＨＬ：Ｐｏｌｙｇｌｕｔａｍｉｎｅ－ｅｘｐａｎｄｅｄ ａｔａｘｉｎ－３ ｃａｕｓｅｓ ｃｅｒｅｂｅｌｌａｒ ｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎ ｏｆ ＳＣＡ３ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｍｉｃｅ ｂｙ ｉｎｄｕｃｉｎｇ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ｄｙｓｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ Ｄｉｓ ２００８、３１：８９～１０１）。マウスの後肢の全部が一貫して腹部から広がっていた場合に０のスコアが適用され、一方の後肢が測定時間のうちの５０％超にわたって腹部に向かって縮められていた場合に１のスコアが適用され、両方の後肢が測定時間のうちの５０％超にわたって腹部に向かって部分的に縮められていた場合に２のスコアが適用され、両方の後肢が測定時間のうちの５０％超にわたって腹部に向かって完全に縮められていたか又は腹部に接触していた場合に３のスコアが適用された。
全身運動性試験（オープンフィールド試験）：マウスを白色アクリル箱（４０×４０×４０ｃｍ）の中央に置いた後、５分間自由に移動させ、マウスの動作をＳｍａｒｔ映像トラッキングソフトウェア（Ｐａｎｌａｂ Ｈａｒｖａｒｄ Ａｐｐａｒａｔｕｓ）を用いて測定した。
ウエスタンブロット分析
ウエスタンブロットのために、総細胞溶解物を、ＬＰＳを注入されたマウスに関して小脳虫部から、Ａｒａ－Ｃを注入されたマウスに関して小脳全体から調製した。小脳虫部を単離し、各組織を、溶解バッファー（５８ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ６．８；１０％グリセロール；及び２％ＳＤＳ）中のプロテアーゼ阻害剤カクテル（１：１００、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ、ＭＡ、ＵＳＡ）及びホスファターゼ阻害剤カクテル（１：１００、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を用いてホモジナイズした。溶解物を遠心分離し、続いて、ＢＣＡキット（Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ、ＵＳＡ）を用いてタンパク質濃度を定量化した。ゲル電気泳動を用いてタンパク質を分離し、続いて、電気泳動転写システム（Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用いてメンブレン上に転写した。メンブレンを、以下の一次抗体と共に４℃で一晩インキュベートした：抗Ｉｂａ１（抗イオン化カルシウム結合性アダプター分子１、１：１５００、Ｗａｋｏ、Ｏｓａｋａ、Ｊａｐａｎ）、抗ＧＦＡＰ（抗グリア線維性酸性タンパク質、１：２０００、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ、ＵＳＡ）、抗ＴＮＦα（抗腫瘍壊死因子α、１：１０００、Ａｂｃａｍ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＵＫ）、抗ＩＬ－１β（１β、１：１０００、Ａｂｃａｍ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ、ＵＳＡ）、抗ＭＣＰ－１（抗単球化学誘引物質タンパク質１、１：５００、Ａｂｃａｍ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＵＫ）、抗ＭＩＰ－１α（抗マクロファージ炎症性タンパク質１α、１：１０００、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ、ＵＳＡ）、抗Ｃａｌ－Ｄ２８Ｋ（抗カルビンジン－Ｄ－２８Ｋ、１：２０００、Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵＳＡ）、抗切断型カスパーゼ－３（１：１０００、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ、ＵＳＡ）、抗カスパーゼ－３（１：１０００、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ、ＵＳＡ）、抗ＣＤ８６（抗分化クラスター８６、１：１０００、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、ＵＳＡ）、抗ＣＤ２０６（抗分化クラスター２０６、１：１０００、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ、ＵＳＡ）、抗ｉＮＯＳ（抗誘導性酸化窒素シンターゼ、１：１０００、Ａｂｃａｍ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＵＫ）、抗ＩＬ－１０（抗インターロイキン１０、１：１０００、Ａｂｃａｍ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ、ＵＳＡ）、抗ＴＳＧ－６（抗ＴＮＦα刺激遺伝子－６、１：１０００、ＧｅｎｅＴｅｘ、Ｉｒｖｉｎｅ、ＣＡ、ＵＳＡ）、抗βアクチン（抗β、１：２０００、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ、ＣＡ、ＵＳＡ）。
ウエスタンブロットのために、総細胞溶解物を、ＬＰＳを注入されたマウスに関して小脳虫部から、Ａｒａ－Ｃを注入されたマウスに関して小脳全体から調製した。小脳虫部を単離し、各組織を、溶解バッファー（５８ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ６．８；１０％グリセロール；及び２％ＳＤＳ）中のプロテアーゼ阻害剤カクテル（１：１００、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ、ＭＡ、ＵＳＡ）及びホスファターゼ阻害剤カクテル（１：１００、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を用いてホモジナイズした。溶解物を遠心分離し、続いて、ＢＣＡキット（Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ、ＵＳＡ）を用いてタンパク質濃度を定量化した。ゲル電気泳動を用いてタンパク質を分離し、続いて、電気泳動転写システム（Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用いてメンブレン上に転写した。メンブレンを、以下の一次抗体と共に４℃で一晩インキュベートした：抗Ｉｂａ１（抗イオン化カルシウム結合性アダプター分子１、１：１５００、Ｗａｋｏ、Ｏｓａｋａ、Ｊａｐａｎ）、抗ＧＦＡＰ（抗グリア線維性酸性タンパク質、１：２０００、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ、ＵＳＡ）、抗ＴＮＦα（抗腫瘍壊死因子α、１：１０００、Ａｂｃａｍ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＵＫ）、抗ＩＬ－１β（１β、１：１０００、Ａｂｃａｍ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ、ＵＳＡ）、抗ＭＣＰ－１（抗単球化学誘引物質タンパク質１、１：５００、Ａｂｃａｍ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＵＫ）、抗ＭＩＰ－１α（抗マクロファージ炎症性タンパク質１α、１：１０００、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ、ＵＳＡ）、抗Ｃａｌ－Ｄ２８Ｋ（抗カルビンジン－Ｄ－２８Ｋ、１：２０００、Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵＳＡ）、抗切断型カスパーゼ－３（１：１０００、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ、ＵＳＡ）、抗カスパーゼ－３（１：１０００、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ、ＵＳＡ）、抗ＣＤ８６（抗分化クラスター８６、１：１０００、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、ＵＳＡ）、抗ＣＤ２０６（抗分化クラスター２０６、１：１０００、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ、ＵＳＡ）、抗ｉＮＯＳ（抗誘導性酸化窒素シンターゼ、１：１０００、Ａｂｃａｍ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＵＫ）、抗ＩＬ－１０（抗インターロイキン１０、１：１０００、Ａｂｃａｍ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ、ＵＳＡ）、抗ＴＳＧ－６（抗ＴＮＦα刺激遺伝子－６、１：１０００、ＧｅｎｅＴｅｘ、Ｉｒｖｉｎｅ、ＣＡ、ＵＳＡ）、抗βアクチン（抗β、１：２０００、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ、ＣＡ、ＵＳＡ）。
次に、メンブレンをＨＲＰコンジュゲート化二次抗体（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ、ＵＳＡ）と共にインキュベートし、続いて化学発光ウエスタンブロット検出試薬（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いてウエスタンブロットを行った。半定量分析のために、バンド密度を、ＩｍａｇｅＱｕａｎｔ ＬＡＳ ５００イメージャー（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ）を用いて測定した。各タンパク質バンドの強度を、Ｍｕｌｔｉ Ｇａｕｇｅ Ｖ３．０ソフトウェア（Ｆｕｊｉ Ｆｉｌｍ、Ｔｏｋｙｏ、Ｊａｐａｎ）を用いて算出し、且つ対応するβアクチン（βバンド）の強度に対して標準化した。
統計解析
全ての統計解析は、ＳｉｇｍａＰｌｏｔソフトウェア１２．０（Ｓｙｓｔａｔ Ｓｏｆｔｗａｒｅ、Ｓａｎ Ｌｅａｎｄｒｏ、ＣＡ）を用いて行った。データは、平均±標準誤差（平均の標準誤差、ＳＥＭ）として表される。統計学的有意性は、ＡＮＯＶＡ（一元配置分散分析）及びそれに続く、群間の多重比較のためのテューキーの事後検定又は２群間の比較のためのスチューデントｔ検定を用いて決定した。
全ての統計解析は、ＳｉｇｍａＰｌｏｔソフトウェア１２．０（Ｓｙｓｔａｔ Ｓｏｆｔｗａｒｅ、Ｓａｎ Ｌｅａｎｄｒｏ、ＣＡ）を用いて行った。データは、平均±標準誤差（平均の標準誤差、ＳＥＭ）として表される。統計学的有意性は、ＡＮＯＶＡ（一元配置分散分析）及びそれに続く、群間の多重比較のためのテューキーの事後検定又は２群間の比較のためのスチューデントｔ検定を用いて決定した。
＜実験結果＞
１．炎症誘導性物質（ＬＰＳ）により誘導される神経変性疾患の動物モデル
炎症により誘導される神経変性疾患の動物モデルを確立するために、炎症性神経変性のための有効物質として、ＬＰＳを小脳へと直接注入した。
１．炎症誘導性物質（ＬＰＳ）により誘導される神経変性疾患の動物モデル
炎症により誘導される神経変性疾患の動物モデルを確立するために、炎症性神経変性のための有効物質として、ＬＰＳを小脳へと直接注入した。
図１Ａのウエスタンブロット結果に示される通り、Ｉｂａ１（ミクログリア）の発現は、ＬＰＳ注入により経時的に有意に増加した（ＬＰＳ注入後１日目：＊＊ｐ＜０．０１及び＊＊＊ｐ＜０．００１、ＬＰＳ注入後７日目：＊＊＊ｐ＜０．００１対対照群、ＣＯＮ）。Ｉｂａ１発現結果に示される通り、ＩＬ－１β及びＴＮＦα等の炎症性サイトカインの発現レベルもまた、ＬＰＳ注入後７日目に無傷の対照群と比較して２．４倍及び２．６倍まで有意に増加した（図１Ａ；＊＊ｐ＜０．０１、＊ｐ＜０．０５対ＣＯＮ）。一方で、ＰＢＳを用いて処理されたマウスでのグリア細胞及び炎症性サイトカインの発現レベルは、対照群のものと異ならなかった。
加えて、本実施例では、炎症性細胞及び間葉系幹細胞に対する化学誘引物質として知られるＭＩＰ－１α及びＭＣＰ－１等の炎症性ケモカインの産生を、ＬＰＳを注入された小脳で確認した。ウエスタンブロット分析結果（図１Ａ）に示される通り、小脳でのＭＩＰ－１α及びＭＣＰ－１の発現は、対照群と比較してＬＰＳ注入後の１日間で有意に増加し（＊＊ｐ＜０．０１対ＣＯＮ）、７日間後にそこから減少した。
最終動物モデルの好適性を確認するために、マウスの運動性欠陥及びプルキンエ細胞喪失を、ロータロッド試験を通して確認した。結果として、回転ロッド上での滞留時間は、正常対照群と比較してＬＰＳ注入後１週間で有意に低下し、低下した値が４週間維持された（図１Ｂ；＊＊＊ｐ＜０．００１ ＬＰＳ注入後２週間及び３週間対ＣＯＮ、＊＊ｐ＜０．０１ ＬＰＳ注入後４週間対ＣＯＮ）。加えて、カルビンジンタンパク質は、正常対照群と比較してＬＰＳを注入されたマウスのＬＰＳ注入後の７日目の小脳で有意に減少し、これはプルキンエ細胞の喪失を示す（図１Ｂ；＊＊＊ｐ＜０．００１対ＣＯＮ）。
２．細胞分裂抑制剤により誘導される神経変性疾患の動物モデル
細胞分裂抑制剤により誘導される神経変性疾患の動物モデルを確立するために、Ａｒａ－Ｃを出生後１～３日間にわたって１日１回、腹腔内注入した。
細胞分裂抑制剤により誘導される神経変性疾患の動物モデルを確立するために、Ａｒａ－Ｃを出生後１～３日間にわたって１日１回、腹腔内注入した。
図２Ａの結果に示される通り、小脳の構造、ニューロン、及びプルキンエ細胞を、組織病理学的染色を通して確認した。結果として、Ａｒａ－Ｃを投与された動物の小脳の発達が阻害されていることが確認され、且つ小脳のニューロン及びプルキンエ細胞が形成されていないことが確認された。
さらに、疾患動物モデルを、行動評価を通して評価した。結果として、平行、懸垂、及び歩行等、対照群と比較した行動的平衡障害があることが確認された（図２Ｂ）。
３．遺伝子改変を介した遺伝学的神経変性疾患の動物モデル
遺伝子改変を介して遺伝学的神経変性疾患の動物モデルを確立するために、マウスＰｃｐ２プロモーターへとヒトＳＣＡ２遺伝子を挿入及び過剰発現させることにより、Ｂ６Ｄ２－Ｔｇ（Ｐｃｐ２－ＳＣＡ２）１１Ｐｌｔ／Ｊマウスを確立した。しかしながら、確保されたＢ６Ｄ２－Ｔｇ（Ｐｃｐ２－ＳＣＡ２）１１Ｐｌｔ／Ｊマウスは、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ卵子とＤＢＡ／２Ｊ精子との受精により確立された動物モデルであった。遺伝的バックグラウンドが均一でなかったので、第５世代まで交配を行い、第５世代はＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスと繰り返し戻し交配することを介して、９４％の遺伝的安定性を示した。
遺伝子改変を介して遺伝学的神経変性疾患の動物モデルを確立するために、マウスＰｃｐ２プロモーターへとヒトＳＣＡ２遺伝子を挿入及び過剰発現させることにより、Ｂ６Ｄ２－Ｔｇ（Ｐｃｐ２－ＳＣＡ２）１１Ｐｌｔ／Ｊマウスを確立した。しかしながら、確保されたＢ６Ｄ２－Ｔｇ（Ｐｃｐ２－ＳＣＡ２）１１Ｐｌｔ／Ｊマウスは、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ卵子とＤＢＡ／２Ｊ精子との受精により確立された動物モデルであった。遺伝的バックグラウンドが均一でなかったので、第５世代まで交配を行い、第５世代はＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスと繰り返し戻し交配することを介して、９４％の遺伝的安定性を示した。
したがって、図３Ａに示される通り、遺伝的安定化を、戻し交配を介して行い、続いて、ＳＣＡ２遺伝子発現を確認することにより、遺伝学的神経変性疾患の動物モデルを確立した。
さらに、図３Ｂの結果に示される通り、行動評価であるロータロッド試験を通して、対照群（野生型、ＷＴ）動物と比較して行動的平衡障害があることが確認された。
４．間葉系幹細胞治療剤（ｈＭＳＣ）の特性
骨髄から単離された間葉系幹細胞治療剤の特性を確認するために、幹細胞治療剤の特性を、形状、マーカー、及び分化能の分析を通して確認し、幹細胞の機能的特性はまた、分泌されるサイトカインも通して確認した。
骨髄から単離された間葉系幹細胞治療剤の特性を確認するために、幹細胞治療剤の特性を、形状、マーカー、及び分化能の分析を通して確認し、幹細胞の機能的特性はまた、分泌されるサイトカインも通して確認した。
最初に、ｈＭＳＣの特徴を、線維芽細胞様細胞の形態、ｈＭＳＣ関連表面マーカーの発現パターン、及び国際細胞治療学会（ＩＳＣＴ）の基準に従った分化可能性により決定した。
骨髄から単離されたｈＭＳＣでは、紡錘状の線維芽細胞形状の幹細胞の元来の形状を、視覚的に確認することができた（図４Ａ）。加えて、各継代に関するｈＭＳＣのＰＤＴを、幹細胞の増殖能を確認するために評価した。初期継代段階でのｈＭＳＣは高い増殖能（３７～５１時間）を示したが、後期継代段階（第７継代後）ではｈＭＳＣの増殖能は乏しいことが確認された（図４Ｂ）。
フローサイトメトリーの結果として、初期ｈＭＳＣのうちの９５％以上が、ＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０、及びＣＤ１０５等のｈＭＳＣ関連ＣＤマーカーに関して陽性であったが、ＣＤ３４及びＣＤ４５等の造血幹細胞関連ＣＤマーカーに関しては陰性であった（図４Ｃ）。
骨髄由来ｈＭＳＣの分化能を確認するために、初期段階（第２～第４継代）での幹細胞を、脂肪形成培地、骨形成培地及び軟骨形成培地中で２～４週間培養して、脂肪細胞、骨芽細胞及び軟骨細胞への分化を確認した。この確認を通じて、間葉系幹細胞の固有の特性を有する単離／生成された間葉系幹細胞治療剤が、第７継代まで幹細胞の特性を良好に維持することが見出された（図４Ｄ）。
神経変性疾患での治療効果を予測するために、神経栄養因子を特定することにより、間葉系幹細胞治療剤の分泌タンパク質を明らかにした。結果として、神経保護因子並びにニューロンの成長及び分化に密接に関連するＡＮＧ、ＢＤＮＦ、及びＩＧＦの発現が確認された。間葉系幹細胞治療剤は神経変性疾患に対して有益となり得ると考えられる（図４Ｅ）。
上記の結果に基づいて、第５継代以内（Ｐ１～Ｐ５）のｈＭＳＣのみを、後続の実験で用いた。
５．炎症により誘導される神経変性疾患の動物モデルでのｈＭＳＣの治療効果
髄腔内移植されたｈＭＳＣがＬＰＳにより誘導される神経変性疾患の動物モデルで有益な作用を有するか否かを評価するために、１０週齢マウスを用いて、ｈＭＳＣ移植後の４週間にわたって週１回、ロータロッド試験を用いて、運動協調及び平衡を評価した。対照群マウスには、低温で幹細胞を保存するために用いられる最適な保存料であるＨＴＳ（ＨｙｐｏＴｈｅｒｍｏｓｏｌ）を投与した。結果として、ＬＰＳ投与前には、全ての群のマウスが同様のレベルの運動協調を示したが、ＬＰＳ投与後には、疾患動物は対照群と比較して徐々に低下する運動性を有することが確認された。幹細胞治療剤を低用量（１×１０５細胞／マウス）及び高用量（１×１０６細胞／マウス）で移植した場合、疾患動物の運動実行能力が、対照群と比較して有意に増強されることが確認された（図５Ａ）。複合運動失調表現型スコアリングシステムを介して行動障害を評価した場合、間葉系幹細胞治療剤を投与された群では、行動障害が有意に改善されることが確認された（図５Ｂ）。
髄腔内移植されたｈＭＳＣがＬＰＳにより誘導される神経変性疾患の動物モデルで有益な作用を有するか否かを評価するために、１０週齢マウスを用いて、ｈＭＳＣ移植後の４週間にわたって週１回、ロータロッド試験を用いて、運動協調及び平衡を評価した。対照群マウスには、低温で幹細胞を保存するために用いられる最適な保存料であるＨＴＳ（ＨｙｐｏＴｈｅｒｍｏｓｏｌ）を投与した。結果として、ＬＰＳ投与前には、全ての群のマウスが同様のレベルの運動協調を示したが、ＬＰＳ投与後には、疾患動物は対照群と比較して徐々に低下する運動性を有することが確認された。幹細胞治療剤を低用量（１×１０５細胞／マウス）及び高用量（１×１０６細胞／マウス）で移植した場合、疾患動物の運動実行能力が、対照群と比較して有意に増強されることが確認された（図５Ａ）。複合運動失調表現型スコアリングシステムを介して行動障害を評価した場合、間葉系幹細胞治療剤を投与された群では、行動障害が有意に改善されることが確認された（図５Ｂ）。
次に、行動指標だけでなく、炎症性応答の低下、プルキンエ細胞のアポトーシスの阻害、並びにＭ１型及びＭ２型ミクログリアの発現レベルもまた確認することにより、様々なメカニズムでの間葉系幹細胞治療剤の作用を確認した。
間葉系幹細胞治療剤の炎症性応答の低下を確認するために、ＬＰＳ炎症性応答により誘導されるグリア細胞の活性化を確認した。対照群と比較して間葉系幹細胞治療剤を投与された群では、Ｉｂａ１が有意に減少することが確認され（図５Ｃ）、且つ炎症性サイトカインＩＬ－１β及びＴＮＦ－αもまた小脳で減少することも確認された（図５Ｄ）。このことは、間葉系幹細胞治療剤の抗炎症作用及び免疫調節作用により確認される。
加えて、炎症性応答により誘導されるプルキンエ細胞のアポトーシスを阻害及び保護することが可能な幹細胞治療剤の保護作用を確認した。プルキンエ細胞マーカーＣａｌ－Ｄ２８Ｋは疾患動物の小脳では減少したが、マーカーの発現は、対照群と比較して間葉系幹細胞治療剤を投与された群では高いことが確認された（図５Ｅ）。加えて、Ｍ１型及びＭ２型ミクログリアの極性化での変化を確認するために、Ｍ１型マーカーとしてのＣＤ８６及びＭ２型マーカーとしてのＣＤ２０６を特定した場合に、ＣＤ８６のＭ１型ミクログリアが減少し、且つＣＤ２０６のＭ２型ミクログリアが増加することが確認された（図５Ｆ）。この結果は、Ｍ１型ミクログリアが、組織再生に関連するＭ２型ミクログリアへと極性化することを示し、この結果は、幹細胞の二次的治療改善作用を表すことができる。
６．細胞分裂抑制剤により誘導される神経変性疾患の動物モデルでのｈＭＳＣの治療効果
細胞分裂抑制剤であるＡｒａ－Ｃにより誘導される小脳性運動失調の動物モデルでの低用量（２×１０４又は６×１０４細胞）での幹細胞治療剤の投与方法に従って運動能力を改善する作用を比較するために、幹細胞投与時点（１０週齢）から１２週間にわたって２週間毎にロータロッド試験を行い、運動協調及び平衡を評価した。本実施例では、幹細胞は、以下の４種類の様式で投与した：
（１）２×１０４細胞の１回投与（ｎ＝２）
（２）４週間間隔（１０ｗ、１４ｗ、１８ｗ）での２×１０４細胞の３回反復投与（ｎ＝３）
（３）６×１０４細胞の１回投与（ｎ＝３）
（４）４週間間隔（１０ｗ、１４ｗ、１８ｗ）での６×１０４細胞の３回反復投与（ｎ＝３）。
細胞分裂抑制剤であるＡｒａ－Ｃにより誘導される小脳性運動失調の動物モデルでの低用量（２×１０４又は６×１０４細胞）での幹細胞治療剤の投与方法に従って運動能力を改善する作用を比較するために、幹細胞投与時点（１０週齢）から１２週間にわたって２週間毎にロータロッド試験を行い、運動協調及び平衡を評価した。本実施例では、幹細胞は、以下の４種類の様式で投与した：
（１）２×１０４細胞の１回投与（ｎ＝２）
（２）４週間間隔（１０ｗ、１４ｗ、１８ｗ）での２×１０４細胞の３回反復投与（ｎ＝３）
（３）６×１０４細胞の１回投与（ｎ＝３）
（４）４週間間隔（１０ｗ、１４ｗ、１８ｗ）での６×１０４細胞の３回反復投与（ｎ＝３）。
結果として、Ａｒａ－Ｃを投与された小脳性運動失調モデル（Ａｒａ－Ｃ）マウスは、正常対照群（ＷＴ）と比較して、平衡を維持することができず、ロータロッド試験で落下した。一方で、Ａｒａ－ＣモデルマウスにｈＭＳＣを投与した場合、投与用量及び方法による運動実行能力の強化での差異があった。具体的には、マウスに２×１０４細胞を投与した場合、幹細胞を投与されなかったマウスと比較して有意差はなかった。２×１０４細胞を繰り返し投与した場合及び６×１０４細胞を１回投与した場合、平衡能力は１６週齢まで徐々に増加したが、その後に再び低下した。最後に、６×１０４細胞を繰り返し投与した場合には、平衡能力は継続的に増加することが示された（図６Ａ）。この結果を通じて、疾患動物での間葉系幹細胞の作用に関連して、少なくとも６×１０４細胞を１回で又は反復して投与した場合に、行動改善作用が現れることが確認された。
加えて、解剖学的変化を確認するために、間葉系幹細胞治療剤の投与後の小脳のサイズ及び重量の変化を確認した。結果として、正常対照群（ＷＴ）と比較してＡｒａ－Ｃを投与された小脳性運動失調モデル（Ａｒａ－Ｃ）マウスでは小脳のサイズが有意に減少するが、幹細胞の投与後には小脳のサイズは若干増加することが確認された（図６Ｂ）。
加えて、全身運動活性を測定するために、オープンフィールド試験を行った。本実施例では、幹細胞を２種類の濃度（１×１０５又は１×１０６細胞）で１回又は繰り返し投与し、結果を比較した。具体的には、各濃度での幹細胞を、１０週齢で１回投与するか又は４週間間隔で繰り返し３回投与し、続いて、２２週齢で、全身運動性を、オープンフィールド試験を介して測定した。結果として、正常対照群（ＷＴ）と比較してＡｒａ－Ｃを投与された小脳性運動失調モデル（Ａｒａ－Ｃ）マウスでは運動性が有意に低下するが、幹細胞の投与後には運動性が増強されることが確認された。運動活性を改善する作用は、幹細胞を１回投与した場合よりも、幹細胞を繰り返し投与した場合でより顕著であり、単回投与及び反復投与の両方で、幹細胞を１×１０５細胞の濃度で投与した場合に、運動活性を改善する作用がより高かった（図６Ｃ）。
治療剤の作用を、タンパク質の差異によっても確認した。疾患動物での１×１０５細胞の濃度での間葉系幹細胞の投与後に、ニューロンタンパク質ＮｅｕＮ並びに神経芽細胞及びニューロン前駆細胞マーカーＤＣＸ（ダブルコルチン）の発現が有意に増加することが確認された。これは、小脳の成熟障害の改善に起因する治療効果であると考えられる（図６Ｄ）。
神経行動試験である複合表現型スコアリングシステムでは、間葉系幹細胞治療剤を２種類の濃度（１×１０５又は１×１０６細胞）で１回又は繰り返し投与し、結果を比較した。具体的には、各濃度での幹細胞を、１０週齢で１回投与するか又は４週間間隔で繰り返し３回投与し、続いて、２２週齢で、行動障害を改善する作用を、複合表現型スコアリングシステムを介して測定した。結果として、Ａｒａ－Ｃを投与された小脳性運動失調モデル（Ａｒａ－Ｃ）マウスと比較して幹細胞投与後には合計平均スコアは有意に減少し、１回投与された場合よりも繰り返し投与された場合に、且つ１×１０６細胞の濃度で投与された場合よりも１×１０５細胞の濃度で投与された場合に、神経行動症状はより軽減されることが確認された（図６Ｅ）。
７．遺伝子改変を介したＳＣＡ２神経変性疾患の動物モデルでのｈＭＳＣの治療効果
髄腔内移植されたｈＭＳＣが遺伝子改変疾患（ＳＣＡ２）の動物モデルでの治療効果を有するか否かを評価するために、１０週齢のマウスへのｈＭＳＣの移植後に４週間にわたって週１回ロータロッド試験を用いて、運動協調及び平衡を評価した。結果として、ＳＣＡ２遺伝子突然変異動物モデルでの行動的平衡障害が確認された。加えて、間葉系幹細胞治療剤を低用量（６×１０４細胞／マウス）及び高用量（１×１０５細胞／マウス）で移植した場合に、対照群と比較して疾患動物の運動実行能力が増強されることが確認された。この結果は、遺伝学的疾患の動物モデル並びに物質により人工的に誘導された疾患の動物モデルでの間葉系幹細胞の治療効果を確認する結果であり、間葉系幹細胞治療剤が様々な病理メカニズムに対する治療効果を有することが確認された（図７）。
髄腔内移植されたｈＭＳＣが遺伝子改変疾患（ＳＣＡ２）の動物モデルでの治療効果を有するか否かを評価するために、１０週齢のマウスへのｈＭＳＣの移植後に４週間にわたって週１回ロータロッド試験を用いて、運動協調及び平衡を評価した。結果として、ＳＣＡ２遺伝子突然変異動物モデルでの行動的平衡障害が確認された。加えて、間葉系幹細胞治療剤を低用量（６×１０４細胞／マウス）及び高用量（１×１０５細胞／マウス）で移植した場合に、対照群と比較して疾患動物の運動実行能力が増強されることが確認された。この結果は、遺伝学的疾患の動物モデル並びに物質により人工的に誘導された疾患の動物モデルでの間葉系幹細胞の治療効果を確認する結果であり、間葉系幹細胞治療剤が様々な病理メカニズムに対する治療効果を有することが確認された（図７）。
本発明に従う間葉系幹細胞を用いる治療方法又は治療組成物は、神経炎症の低減、Ｍ１ミクログリアの阻害、Ｍ２ミクログリアの活性化、プルキンエ細胞のアポトーシスの阻害、ニューロン死滅の阻害、運動能力の改善等での卓越した効果を有し、したがって、小脳性運動失調及び多系統萎縮症をはじめとする神経変性疾患の軽減及び治療で効果的に用いることができ、すなわち、高い産業上の利用可能性を有する。
Claims (21)
- 小脳の神経変性疾患を有する患者に有効成分として幹細胞を含む組成物を投与するステップを含む、小脳の神経変性疾患を治療するための方法。
- 前記幹細胞が成体幹細胞である、請求項１に記載の小脳の神経変性疾患を治療するための方法。
- 前記成体幹細胞が、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）、間葉系間質細胞、及び多能性幹細胞からなる群より選択される少なくとも１つである、請求項２に記載の小脳の神経変性疾患を治療するための方法。
- 前記幹細胞が小脳の抗炎症活性を誘導する、請求項１に記載の小脳の神経変性疾患を治療するための方法。
- 前記幹細胞が炎症性サイトカイン又は炎症性ケモカインの発現を減少させる、請求項１に記載の小脳の神経変性疾患を治療するための方法。
- 前記幹細胞が炎症性神経膠細胞の活性化を阻害し、且つ抗炎症性神経膠細胞を活性化する、請求項１に記載の小脳の神経変性疾患を治療するための方法。
- 前記幹細胞がプルキンエ細胞の損傷を阻害する、請求項１に記載の小脳の神経変性疾患を治療するための方法。
- 前記小脳の神経変性疾患が、炎症により誘導される神経変性疾患、毒物により誘導される神経変性疾患、及び遺伝子改変により引き起こされる神経変性疾患からなる群より選択される少なくとも１つである、請求項１に記載の小脳の神経変性疾患を治療するための方法。
- 前記小脳の神経変性疾患が、小脳性運動失調又は多系統萎縮症を含む、請求項１に記載の小脳の神経変性疾患を治療するための方法。
- 前記幹細胞のうちの９０％以上が、ＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０若しくはＣＤ１０５を含む陽性表面マーカーを発現するか、又は前記幹細胞のうちの５％以下が、ＣＤ３４若しくはＣＤ４５を含む陰性表面マーカーを発現する、請求項１に記載の小脳の神経変性疾患を治療するための方法。
- 前記投与が、髄腔内、静脈内、筋内、動脈内、髄内、硬膜内、神経内、脳室内及び脳血管内からなる群より選択される少なくとも１つの投与経路を介して行われる、請求項１に記載の小脳の神経変性疾患を治療するための方法。
- 有効成分として幹細胞を含む、小脳の神経変性疾患の症状を軽減又は治療するための組成物。
- 前記幹細胞が成体幹細胞である、請求項１２に記載の組成物。
- 前記成体幹細胞が、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）、間葉系間質細胞、及び多能性幹細胞からなる群より選択される少なくとも１つである、請求項１２に記載の組成物。
- 前記幹細胞が小脳の抗炎症活性を誘導する、請求項１２に記載の組成物。
- 前記幹細胞が炎症性サイトカイン又は炎症性ケモカインの発現を減少させる、請求項１２に記載の組成物。
- 前記幹細胞が炎症性神経膠細胞の活性化を阻害し、且つ抗炎症性神経膠細胞を活性化する、請求項１２に記載の組成物。
- 前記幹細胞がプルキンエ細胞の損傷を阻害する、請求項１２に記載の組成物。
- 前記小脳の神経変性疾患が、炎症により誘導される神経変性疾患、毒物により誘導される神経変性疾患、及び遺伝子改変により引き起こされる神経変性疾患からなる群より選択される少なくとも１つである、請求項１２に記載の組成物。
- 前記幹細胞のうちの９０％以上が、ＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０若しくはＣＤ１０５を含む陽性表面マーカーを発現するか、又は前記幹細胞のうちの５％以下が、ＣＤ３４若しくはＣＤ４５を含む陰性表面マーカーを発現する、請求項１２に記載の組成物。
- 前記小脳の神経変性疾患が、小脳性運動失調又は多系統萎縮症を含む、請求項１２に記載の組成物。
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