KR20220038630A

KR20220038630A - 중간엽 줄기세포를 포함하는 퇴행성 신경계 질환의 치료용 조성물

Info

Publication number: KR20220038630A
Application number: KR1020220032028A
Authority: KR
Inventors: 김경숙; 이태용; 석경호; 이호원; 김상룡
Original assignee: 코아스템(주)
Priority date: 2020-01-08
Filing date: 2022-03-15
Publication date: 2022-03-29
Also published as: US20230047040A1; KR20210089517A; EP4088728A4; WO2021141446A1; EP4088728A1; JP2023510512A

Abstract

본 발명은 퇴행성 신경계 질환 치료용 약학적 조성물에 관한 것으로, 구체적으로 본 발명은 중간엽 줄기세포를 유효성분으로 포함하는 소뇌의 퇴행성 신경계 질환 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 중간엽 줄기세포를 포함하는 약학적 조성물은 신경염증 감소, M1 미세아교세포의 억제 및 M2 미세아교세포의 활성, 푸르키니예 세포(purkinje cell)의 세포사멸 억제, 신경세포(Neuron) 사멸 억제, 운동능력 개선등에 있어서 현저한 효과를 나타내는 바, 소뇌실조증 및 다계통위축증을 포함하는 퇴행성 신경계 질환의 완화 및 치료에 유용하게 활용될 수 있다.

Description

중간엽 줄기세포를 포함하는 퇴행성 신경계 질환의 치료용 조성물{THERAPEUTIC COMPOSITION OF DEGENERATIVE NEUROLOGICAL DISEASES INCLUDING MESENCHYMAL STEM CELLS}

본 발명은 퇴행성 신경계 질환 치료용 약학적 조성물에 관한 것으로, 구체적으로 본 발명은 중간엽 줄기세포를 유효성분으로 포함하는 소뇌의 퇴행성 신경계 질환 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.

소뇌실조증(cerebellar ataxia, CA) 및 다계통위축증(multiple system atrophy, MSA)등의 질환은 소뇌 또는 이와 관련된 경로에 영향을 주는 병리학적 과정에 의해 발병하는 운동성 퇴행성 신경계 질환이다. 소뇌실조증 및 다계통위축증은 특징적으로 보행 장애와 같은 움직임의 비정상적인 협응 및 불균형을 나타낸다.

소뇌실조증 및 다계통위축증은 유전적 결함, 산발적인 신경변성 장애, 후천적 질병 (예를 들어, 감염, 독성 반응, 알코올, 및 비타민 부족), 및 다른 알려지지 않은 원인에 의해 발병할 수 있다. 최근의 많은 임상적, 전임상적 연구에 의해 소뇌 염증이 소뇌실조증 및 다계통위축증의 진행에 중요한 역할을 할 것이라는 점이 증명되었다. 예를 들어, 미세아교세포 및 성상세포의 활성화에 의한 염증성 분자의 생성을 포함하는 신경독성 염증 반응이 유전적 소뇌실조증, 특히 척수소뇌실조증(spinoerebellar ataxia) 환자 및 동물 모델에서 관찰되었다. 신경교세포의 활성은 염증성 분자의 생성을 일으키는데, 많은 소뇌실조증 및 다계통위축증 동물 모델에서 관찰되었을 뿐만 아니라, 신경교세포의 활성이 소뇌실조증 및 다계통위축증 환자의 소뇌에서 발견되었다. 소뇌 염증은 푸르키니예 세포(Purkinje cells)의 손실을 유도하며, 결과적으로 소뇌의 기능장애를 일으키는 것으로 알려져 있다. 또한, 소뇌는 특히 독극물 및 중독에 치명적이며 바이러스 감염 및 독극물 노출(알코올, 약물, 및 환경 독성)에 의한 염증 반응에 의해 후천적 소뇌실조증 및 다계통위축증이 나타날 수도 있다. 그러나 이와 같은 유전적 원인, 소뇌 신경독성, 및 물리적 손상과 관련된 소뇌실조증 및 다계통위축증의 발병에 대한 연구 결과로부터 질환 동물 모델이 일부 개발되었음에도 불구하고, 생체 내(in vivo)에서 소뇌실조증 및 다계통위축증을 연구하기에 적합한 동물 모델은 없는 실정이다.

소뇌실조증 및 다계통위축증 등을 포함하는 신경변성질병의 근본적인 메커니즘은 신경 세포의 기능적, 양적 손상이 점진적으로 나타나는 것이다. 현재 소뇌실조증 및 다계통위축증 등의 퇴행성 신경계 질환은 예방 및 치료가 불가능하며, 극히 예외적인 경우의 치료 또는 증상의 경감만이 가능하다.

최근 중간엽 줄기세포(mesenchymal stem cells, MSCs)의 항염 기능, 재생 능력, 및 낮은 면역반응성 때문에 퇴행성 신경계 질병의 치료 후보로 주목을 받고 있다. 인간 중간엽 줄기세포(human mesenchymal stem cells, hMSCs)는 자기 재생능 및 여러 전문화된 세포로 분화될 수 있는 능력을 가진 다능성 세포이다. 손상된 뇌에서 hMSC는 선택적으로 손상 부위를 표적화하고, 항-세포사멸, 혈관생성, 항염증, 면역조절, 및 화학유인과 같은 광범위한 활성을 갖는 것으로 알려진 다양한 성장인자, 사이토카인, 및 케모카인을 분비한다. hMSC는 알츠하이머 병, 파킨슨 병, 및 뇌졸증과 같은 신경 질환에 대한 치료 효과를 가질 수 있다고 알려져 있으나, 소뇌의 퇴행성 신경계 질환 환자 및 동물 모델에 있어서 중간엽 줄기세포의 치료 효과에 대한 정보는 거의 없는 실정이다.

이에, 본 발명자들은 소뇌실조증 및 다계통위축증을 포함하는 소뇌의 퇴행성 신경계 질환에서 hMSC의 효과를 확인하기 위하여, 소뇌에 직접 지질다당류(lipopolyssacharide, LPS)를 주사하거나, Ara-C(cytarabine)를 복강에 주사하여 동물 모델을 확립하였으며, 유전자 변형을 통한 유전적 동물 모델인 SCA2 질환 동물 모델을 포함한 상기 세 종류의 동물 모델에서 인간 중간엽 줄기세포(human mesenchymal stem cells, hMSCs)의 치료 효과를 확인하고자 하였다.

본 발명의 목적은 줄기세포(stem cells)를 유효성분으로 포함하는 소뇌의 퇴행성 신경계 질환 증상 완화 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

그러나, 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

본 발명은 상술한 문제점을 해결하기 위한 것으로, 줄기세포를 유효성분으로 포함하는 소뇌의 퇴행성 신경계 질환의 증상 완화 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명은 모델 동물에 LPS를 투여하여 소뇌에 염증을 유발시키거나, Ara-C를 투여하여 소뇌의 발달을 저해시킴으로써 퇴행성 신경계 질환 동물 모델을 확립하였고, 5세대를 거쳐 유전적으로 안정화된 SCA2 유전자 변형 질환 동물 모델을 구축하였다. 다음으로 이러한 다양한 병리기전을 가지는 퇴행성 신경계 질환 동물 모델 3종에서 중간엽 줄기세포(MSCs)의 치료 효과를 실험하였다.

본 발명에서 "소뇌의 퇴행성 신경계 질환"은 소뇌의 기능 이상으로 인해 동작이 서투르고 동작간의 협조가 되지 않는 증상이 나타나는 신경 질환을 의미하는 것으로, 다양한 내과적, 신경과적 질환 또는 유전적 소인에 의해 유발되는 퇴행성 신경계 질환을 모두 포함한다. 본 발명에 있어서, 상기 소뇌의 퇴행성 신경계 질환은 염증으로 유발된 퇴행성 신경계 질환, 독소에 의해 유발된 퇴행성 신경계 질환 또는 유전자 변형에 의한 퇴행성 신경계 질환을 포함한다.

본 발명에서 상기 소뇌의 퇴행성 신경계 질환은 소뇌실조증 또는 다계통위축증을 포함한다.

본 발명의 용어 "줄기세포"는 다양한 신체 조직으로 분화할 수 있는 능력을 갖는 미분화 세포로서, 보다 구체적으로 어느 특정한 또는 복수 개의 기능적 세포로 분화되는 능력 및 스스로 동일한 세포를 반복적으로 생산할 수 있는 자기 복제 능력을 가진, 미분화 세포를 포함할 수 있다. 이것은 태아의 발생과정 중 모든 조직에서 생겨나며, 성인이 되어서도 골수, 상피조직 등 세포가 활발히 교체되는 일부 조직에서 발견될 수 있다.

본 발명의 상기 줄기세포는 성체줄기세포일 수 있으며, 상기 성체줄기세포는 중간엽 줄기세포(mesenchymal stem cells, MSC), 중간엽 기질세포(mesenchymal stromal cells) 및 다분화능 줄기세포로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 상기 줄기세포는 인간 중간엽 줄기세포(human mesenchymal stem cells, hMSC)일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

또한, 본 명세서에서 사용된 용어 “중간엽 줄기세포(mesenchymal stem cell, MSC)”는 뼈(bone), 연골(cartilage), 지방(fat), 신경 조직(nerve tissue), 섬유아세포(fibroblast), 근육(muscle cell)등의 구체적인 장기의 세포로 분화되기 전 다 분화능을 가지는 줄기세포(multipotent stem cell)를 말한다. 상기 중간엽 줄기세포는 바람직하게는 제대, 제대혈, 골수, 지방, 근육, 신경, 피부, 양막, 융모막, 탈락막, 및 태반으로 구성된 군에서 선택되는 것으로부터 유래될 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 일 실시예에서는, 상기 줄기세포는 동종골수유래 중간엽 줄기세포를 사용하였다.

본 발명의 줄기세포를 수득하기 위하여, 골수를 채취, 분리하는 방법으로 정상 및 건강한 공여자로부터 공여받은 골수를 CSBM-A06배지로 1:2 희석한 후 미리 준비한 골수 동량의 Ficoll층 위에 점적한다. 400 ×g에서 30분간 원심분리하고, 얻어진 단핵구 세포층을 분리하고 CSBM-A06 배지로 2회 세척한 후 37℃, 5% CO₂가 유지되는 배양 조건 하에 배양할 수 있다. 배양 48시간 이후 플라스크 바닥에 부착되지 않은 세포는 새로운 배지를 교환하는 방식으로 제거시키고, 바닥에 부착한 세포들은 3 ~ 4일에 한 번씩 배지를 갈아주며 배양한다. 배양된 세포가 80% 정도 자랐을 때 새 플라스크로 계대하여 배양하고, 배양한 세포는 일부 계속 계대배양하며 일부는 DMSO가 포함된 동결보존액에 혼탁하여 동결 보관하였다.

본 발명에서 줄기세포의 분리 및 배양에 사용 가능한 배양 배지로는 10% FBS를 포함하는 세포 배양용 배지를 사용할 수 있으며, 세포 배양용 배지로는 둘베코 변형 이글 배지(Dulbecco's modified eagle medium, DMEM), 최소 필수 배지(minimal essential medium, MEM), 알파-최소 필수 배지(-MEM), 맥코이스(McCoys) 5A 배지, 이글스 기본 배지(eagle's basal medium), CMRL(Connaught Medical Research Laboratory) 배지, 글래스고우(Glasgow) 최소 필수 배지, Ham's F-12 배지, IMDM(Iscove's modified Dulbecco's medium), 리보비츠(Liebovitz') L-15 배지, RPMI(Roswell Park Memorial Institute) 1640 배지 등 당업계에서 통상적으로 사용되는 세포 배양용 배지는 모두 사용 가능하다.

본 발명에 따른 상기 줄기세포는 CD29, CD44, CD73, CD90 또는 CD105를 포함하는 중간엽 줄기세포 양성 표면 마커가 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상 발현되는 것이며, CD34 또는 CD45를 포함하는 음성 표면마커가 5% 이하, 바람직하게는 3% 이하 발현되는 것이다.

본 발명에 따른 줄기세포는 퇴행성 신경계 질환 동물 모델의 대조(cisterna magna)에 직접 이식할 경우 소뇌의 항염 활성을 유도하고, 염증성 사이토카인(IL-1β 또는 TNFα) 또는 염증성 케모카인(MIP-1α또는 MCP-1)의 발현을 감소시킬 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 줄기세포는 염증성 신경교세포인 M1형 미세아교세포(M1-microglia)의 활성을 억제하며, 항염성 신경교세포인 M2형 미세아교세포(M2-microglia)를 활성화시킴으로써 소뇌의 항염 활성을 유도할 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 줄기세포는 푸르키니예 세포 손상을 억제시킴으로써 결과적으로 비정상적인 행동학적 운동장애 증상을 완화 또는 치료하는 데 유용하게 사용될 수 있다. 다계통위축증본 발명의 약학적 조성물은 줄기세포와 함께 퇴행성 신경계 질환의 치료 효과를 갖는 공지의 유효성분을 1종 이상 더 함유할 수 있다.

본 발명의 조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 현탁제를 포함할 수 있다. 예를 들어, 주사제의 경우에는 보존제, 무통화제, 가용화제 또는 안정화제 등을, 국소 투여용 제제의 경우에는 기제(base), 부형제, 윤활제 또는 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.

본 발명에서 사용되는 용어 "투여"는 임의의 적절한 방법으로 개체에게 소정의 본 발명의 조성물을 제공하는 것을 의미한다. 바람직한 효과를 위해서, 줄기세포의 투여량은 2.0×10⁴ ~ 1.0×10⁶ 세포수/마리로 1회 또는 수 회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나, 유효성분의 실제 투여량은 치료하고자 하는 질환, 질환의 중증도, 투여 경로, 개체의 체중, 연령 및 성별 등의 여러 관련 인자에 비추어 결정되어야 하는 것으로 이해되어야 하며, 따라서, 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

본 발명의 약학적 조성물은 주사 제형일 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 개체에게 다양한 경로로 투여될 수 있다. 척수강내, 정맥내, 근육내, 동맥내, 골수내, 뇌경막내, 신경내, 뇌실내(뇌실하 영역), 뇌혈관내 등 투여일 수 있으며, 바람직하게는 치료가 필요한 개체의 뇌경막 내에 직접 이식하는 것이 가능하나 이에 한정되지는 않는다.

본 발명에서 "치료"는 소뇌의 퇴행성 신경계 질환과 관련된 질환의 증상을 개선시키는 것을 포괄적으로 지칭하고, 이는 이러한 질환을 치유(정상 개체와 실질적으로 동일한 상태로 되는 것)하거나, 실질적으로 예방(질환의 발병을 억제하거나 지연 시키는 것)하거나, 또는 상태를 완화(증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 것)시키는 것을 포함할 수 있으며, 소뇌실조증 및 다계통위축증과 관련된 질환으로부터 비롯된 한 가지 증상 또는 대부분의 증상을 완화시키거나, 치유하거나 예방하는 것을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.

또한, 본 발명은 인간을 제외한 동물의 소뇌에 염증유발물질을 주입하는 단계를 포함하는 퇴행성 신경계 질환 동물 모델의 제조 방법 및 이를 이용하여 제조된 질환 동물 모델을 제공한다.

본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 염증유발물질은 LPS(lipopolysaccharide)일 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서, 상기 동물 모델은 마우스의 소뇌에 주사기를 이용하여 LPS를 직접 주사함으로써 제조하였다. 바람직하게, 본 발명의 일실시예에서는 마우스의 소뇌에 5㎍/5㎕의 농도의 LPS를 직접 주사함으로써 제조하였으나, 제조하고자 하는 동물 모델의 종류, 연령, 무게 등에 따라 당업자의 기술상식 범위에서 각 물질의 농도 및 주사량, 세대는 조절될 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 염증유발물질에 의한 퇴행성 신경계 질환 동물 모델은 LPS를 소뇌에 직접 투여함으로써 소뇌에만 국한되게 염증 반응을 활성화시키고, 염증 환경에서 소뇌실조증 환자 및 동물 모델에서 관찰되는 푸르키니예 세포의 기능 장애 및 손상에 의한 운동실조 증상이 나타나도록 하는 것이다.

본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 LPS의 주사 후 M1형 미세아교세포(M1-microglia)의 활성을 유도하였으며, IL-1β 및 TNFα와 같은 전염증성 사이토카인 또는 MIP-1 및 MCP-1과 같은 전염증성 케모카인의 발현을 증가시킴으로써 소뇌의 신경 염증 반응을 유도하였다. 또한 상기 LPS의 주사 후 푸르키니예 세포(Purkinje cells)의 손상 또는 세포자멸이 유도되었다.

또한, 본 발명은 인간을 제외한 동물의 소뇌에 세포분열 억제물질(anti-miotic agent)을 직접 주입하는 단계를 포함하는 퇴행성 신경계 질환 동물 모델의 제조 방법 및 이를 이용하여 제조된 질환 동물 모델을 제공한다.

본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 세포분열 억제물질은 Ara-C(cytarabine)일 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서, 상기 동물 모델은 마우스의 복강에 주사기를 이용하여 Ara-C를 직접 주사함으로써 제조하였다. 바람직하게, 본 발명의 일 실시예에서는 생후 1-3일의 동물의 복강 내로 40㎍/kg의 Ara-C를 주사함으로써 제조하였으나, 제조하고자 하는 동물 모델의 종류, 연령, 무게 등에 따라 당업자의 기술상식 범위에서 각 물질의 농도 및 주사량, 세대는 조절될 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 세포분열 억제물질에 의한 퇴행성 신경계 질환 동물 모델은 소뇌 발달이 진행되기 이전인 생후 1일에서 3일 사이에 연속적으로(1일 1회, 총 3회) 동물의 복강에 Ara-C를 직접 투여함으로써 소뇌의 발달을 저해하고, 인위적인 실조가 일어나도록 하는 것이다. 마우스의 경우 생후 14일 이후까지 소뇌 발생이 일어난다. 배아 13일에 푸르키니예 세포가(purkinje cell) 관찰되고, 출생 후 소뇌의 외부 과립층(external granule layer), 푸르키니예 세포 층(purkinje cell layer) 및 내부 과립층(internal granule layer)이 형성된다. 소뇌의 경우 유일하게 출생 이후 발생하는 기관으로, 이 시점에 세포분열 억제물질을 직접 투여함으로써 소뇌 성숙장애를 유발하여 퇴행성신경계 질환을 유도할 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 Ara-C의 주사 후 소뇌의 발달이 저해된 것을 해부학적으로 확인 할 수 있었으며, 소뇌의 염색을 통해 소뇌발달이 저해됨을 알 수 있었다.

또한, 본 발명은 인간을 제외한 동물의 유전자를 과발현 또는 억제하는 단계를 포함하는 유전적 퇴행성 신경계 질환 동물 모델의 제조 방법 및 이를 이용하여 제조된 질환 동물 모델을 제공한다.

본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 과발현 유전자는 SCA2일 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서, 상기 유전적 동물 모델은 5세대까지 C57BL/6J 마우스와의 반복적 역교배(Backcross)를 통해 유전적으로 안정화된 질환 동물 모델을 활용하였으나, 제조하고자 하는 동물 모델의 종류, 연령, 무게 등에 따라 당업자의 기술상식 범위에서 각 물질의 농도 및 주사량, 세대는 조절될 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서 있어서, 상기 유전자 변형에 의한 퇴행성 신경계 질환 동물 모델은 Pcp2 프로모터에 인간 SCA2 유전자가 삽입되고 과발현되어 있는 B6D2-Tg(Pcp2-SCA2)11Plt/J 마우스로서 운동실조 및 비틀거림 등의 신경학적이상 증상이 8주부터 나타나며 푸르키니예 세포 (purkinje cell)가 24 ~ 27주에 약 50% 소실되는 것을 사용할 수 있다.

본 발명에 따른 중간엽 줄기세포를 포함하는 약학적 조성물은 신경염증 감소, M1 미세아교세포의 억제 및 M2 미세아교세포의 활성, 푸르키니예 세포(purkinje cell)의 세포사멸 억제, 신경세포(Neuron) 사멸 억제, 운동능력 개선등에 있어서 현저한 효과를 나타내는 바, 소뇌실조증 및 다계통위축증을 포함하는 퇴행성 신경계 질환의 완화 및 치료에 유용하게 활용될 수 있다.

도 1은 LPS의해 유도된 질환 동물 모델의 구축을 확인한 결과이다.
도 1a는 LPS 투여 후 1일 및 7일째 소뇌에서 Iba1(미세아교세포) 및 염증성 사이토카인(IL-1β 및 TNFα), 염증성 케모카인의(MCP-1 및 MIP-1α) 발현 수준을 소뇌에서 확인한 결과이다. Iba1: ^** p < 0.01 및 ^*** p < 0.001 vs. CON, ^$$$ p < 0.001 vs. PBS (7일 차), ^## p < 0.01 vs. PBS (1일 차). IL-1β: ^** p < 0.01 vs. CON, ^$ p < 0.05 vs. PBS (7일 차), ^## p < 0.01 vs. PBS (1 d). TNFα: ^** p < 0.01 및 ^* p < 0.05 vs. CON. MCP-1: ^** p < 0.01 vs. CON (t-test 분석; 각 실험군 n = 3). MIP-1α: ^** p < 0.01 vs. CON, ^# p < 0.05 vs. PBS (1일 차)(one-way ANOVA 및 Tukey's post-hoc 분석; 각 실험군 n = 3).
도 1b는 LPS 투여 후 4주간 로타로드 테스트(rotarod test) 및 소뇌의 푸르키니예 세포(purkinje cell)의 발현 수준을 확인한 결과로 염증에 의한 퇴행성 신경계 질환 동물 모델의 확립을 확인한 결과이다. 4주 간의 로타로드 테스트: ^** p < 0.01 및 ^*** p < 0.001 vs. CON (t-test 분석; CON, n = 6; PBS, n = 4; LPS, n = 3). Cal-D28K: ^*** p < 0.001 vs. CON (one-way ANOVA 및 Tukey's post-hoc 분석; 각 실험군 n = 4).
도 2은 Ara-C의해 유도된 질환 동물 모델의 구축을 확인한 결과이다:
도 2a는 생후 1 ~ 3일차 Ara-C 주사 후 성체의 미성숙된 소뇌를 NISSL과 면역 염색, 해부학적 형성 상태 및 뇌 무게를 확인한 결과이다. ^* p < 0.05 (t-test 분석; CON, n = 4; Ara-C, n = 4)
도 2b는 Ara-C에 의해 유도된 질환 동물의 몸무게 및 행동장애 개선 평가의 결과로 퇴행성 신경계질환의 동물 모델 확립을 확인한 결과이다. ^*** p < 0.001 (t-test 분석; CON, n = 4; Ara-C, n = 4)
도 3은 유전자 변형을 통해 유도된 SCA2질환 동물 모델의 구축을 확인한 결과이다:
도 3a는 유전자 변형을 통한 퇴행성 신경계 질환 모델이 SCA2 동물 모델로 5세대까지 역교배 하여 유전적 안정성을 확보한 질환 동물 모델의 확립 결과이다.
도 3b는 5세대의 유전자 변형 SCA2 질환동물의 행동학적 운동평가를 진행하고자 로타로드 테스트를 진행한 결과이다.
도 4는 중간엽줄기세포(hMSC)의 특징을 확인한 실험 결과이다.
도 4a는 초기 배양 hMSC(P5 이내)의 방추형 형태를 나타내는 현미경 관찰 결과이다.
도 4b는 10 계대 이내의 hMSC의 집단배가시간(PDT) 분석 결과이다. ^** p < 0.01 및 ^*** p < 0.001 vs. P6 (one-way ANOVA 및 Tukey's post-hoc 분석; 각 실험군 n = 4).
도 4c는 초기 단계 hMSC의 세포 표면 마커의 발현 프로파일에 대한 면역표현형 분석 결과이다.
도 4d는 hMSC의 다중 계통 분화능을 확인한 결과이다.
도 4e는 hMSC에서 발현하는 neurotropic factor를 배양액에서 확인한 결과로 신경보호 및 생장인자로 잘 알려져 있는 ANG, BDNF, IGF의 발현을 확인한 결과이다.
도 5는 LPS에 의해 유도된 행동 장애, 염증, 및 푸르키니예 세포의 세포자멸사에 관한 hMSC의 치료 효과를 확인한 결과이다:
도 5a는 LPS에 의해 소뇌염증 반응이 유도된 마우스에 hMSC를 이식한 후 4주 동안 로타로드 테스트를 수행한 결과이다. 대조군(CON) 또는 LPS+hMSCs과 LPS 단독 또는 LPS+HTS 그룹 사이에 11주령부터 실험 기간 내내 유의미한 차이가 나타나기 시작하였다 (^*** p < 0.001, one-way ANOVA 및 Tukey's post-hoc 분석; 각 실험군 n = 5).
도 5b는 hMSC를 이식한 후 4주 동안 행동장애 개선 평가를 수행한 결과이다. ^** p < 0.01 vs. CON, ^## p < 0.01 vs. LPS (t-test 분석; 각 실험군 n = 5).
도 5c는 hMSC 이식 7일 후 LPS에 노출된 소뇌에서 Iba1(미세아교세포 관련) 발현 수준을 확인한 결과이다. ^* p < 0.05 vs. CON, ^# p < 0.05 및 ^## p < 0.01 vs. LPS (one-way ANOVA 및 Tukey's post-hoc 분석; 각 실험군 n = 3).
도 5d는 hMSC 이식 7일 후 소뇌에서 전염증성 사이토카인(IL-1β 및 TNFα)의 발현 수준을 확인한 결과이다. IL-1β: ^** p < 0.01 vs. CON, ^## p < 0.01 및 ^### p < 0.001 vs. LPS (one-way ANOVA 및 Tukey's post-hoc 분석; 각 실험군 n = 3). TNFα: ^* p < 0.05 vs. CON, ^# p < 0.05 및 ^## p < 0.01 vs. LPS (one-way ANOVA 및 Tukey's post-hoc 분석; 각 실험군 n = 3).
도 5e는 hMSC 이식 7일 후 소뇌에서 Cal-D28K(푸르키니예 세포 관련)의 발현 수준을 확인한 결과이다. ^* p < 0.05 vs. CON, ^# p < 0.05 vs. LPS (one-way ANOVA 및 Tukey's post-hoc 분석; 각 실험군 n = 4).
도 5f는 hMSC 이식 7일 후 소뇌에서 CD86 및 CD206의 발현 수준을 확인한 결과이다. CD86: ^* p < 0.05 vs. CON, ^# p < 0.05 및 ^### p < 0.001 vs. LPS (one-way ANOVA 및 Tukey's post-hoc 분석; 각 실험군 n = 3). CD206: ^## p < 0.01 vs. LPS (one-way ANOVA 및 Tukey's post-hoc 분석; 각 실험군 n = 3)
도 6은 Ara-C에 의해 유도된 퇴행성 질환 동물 모델에서 hMSC의 효과를 확인한 결과로 소뇌 크기, 신경운동 장애, 신경세포(Neuron)의 개선을 확인한 결과이다.
도 6a는 Ara-C에 의해 유도된 신경독성 질환동물 모델에서 hMSC의 투여 농도 및 횟수 따른 운동 능력 개선 효과를 확인한 결과이다(로타로드 테스트).
도 6b는 Ara-C에 의해 유도된 신경독성 질환 동물 모델에서 hMSC 투여 횟수에 따른 소뇌 크기 개선 효과를 확인한 결과이다. ^*** p < 0.001 vs. CON (one-way ANOVA 및 Tukey's post-hoc 분석; 각 실험군 n = 3).
도 6c는 Ara-C에 의해 유도된 신경독성 질환 동물 모델에서 hMSC 투여 농도 및 횟수 따른 일반 운동 활성 개선 효과를 비교한 결과이다. ^* p < 0.05 vs. WT, ^# p < 0.05 및 ^## p < 0.01 vs. Ara-C(one-way ANOVA 및 Tukey's post-hoc 분석; 각 실험군 n = 3).
도 6d는 Ara-C에 의해 유도된 신경독성 질환 동물 모델에서 hMSC 투여 횟수에 따른 신경세포(Neuron)의 단백질양의 증가를 확인한 결과이다.^*** p < 0.001 vs. con, ^### p < 0.01 vs. Ara-C(one-way ANOVA 및 Tukey's post-hoc 분석; 각 실험군 n = 3).
도 6e는 Ara-C에 의해 유도된 신경독성 질환 동물 모델에서 hMSC 투여 용량 및 횟수에 따른 신경운동 장애 개선을 확인한 결과이다. ^*** p < 0.001 vs. WT, ^# p < 0.05 vs. Ara-C(one-way ANOVA 및 Tukey's post-hoc 분석; 각 실험군 n = 3).
도 7은 유전자 변형 SCA2 유전질환 동물 모델에서의 hMSC 투여 용량에 따른 운동 능력 개선의 효과를 확인한 결과이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

<실험 재료 및 방법>

동물

수컷 C57BL/6 마우스(대한바이오링크, 한국), B6D2-Tg(Pcp2-SCA2)11Plt/J 마우스를 12시간 광주기를 갖는 제어된 환경에서 사육하였고, 음식은 자유롭게 배급하였다. 모든 동물 실험 과정은 경북대학교 동물실험윤리위원회의 규정을 따라 수행되었다(No. KNU 2016-42).

LPS 주사에 의한 염증성 퇴행성 질환 동물 모델 및 인간 중간엽 줄기세포(hMSC) 이식

염증 관련 소뇌성운동실조증은 마우스의 소뇌에 지질다당류(LPS, 5 μg/5 μL)를 직접 주사함으로써 유도하였다. 구체적으로, 생후 10주된 마우스의 복강에 115 mg/kg의 케타민(ketamine; 유한, 한국) 및 23 mg/kg의 롬푼(Rompun; 바이엘 코리아, 한국)를 주사하여 마취시킨 후, 스테레오탁식 장치(David Kopf Instruments, Tujunga, CA, USA)에 고정시켰다. 소뇌에 주사를 하기 위해, 중앙 시상 절개로 두개골을 노출시킨 후 천두술을 수행하였다. 소뇌에 해밀턴 주사기(10 μL, 30G)와 연결된 주사 펌프(KD Scientific, New Hope, PA, USA)를 통해 총 5 μL의 LPS(1 mg/mL) 또는 인산염완충액(phosphate buffered saline, PBS)을 주사하였다(AP: -0.25 cm; DV: -0.25 cm, relative to the lambda). 주사관을 따른 역류를 제어하기 위해 5분 동안 바늘을 그대로 두었다.

다음으로, 상기 LPS가 주사된 마우스의 머리를 스테레오탁식 장치에서 몸쪽으로 약 90°로 돌렸다. 밑에 있는 경뇌막을 노출시킨 후, 주사 펌프에 연결된 해밀턴 주사기(25 μL, 30G)를 사용하여 대조(cisterna magna) 안으로 hMSCs(1 Х 10⁵ cells/20 μL 또는 1 Х 10⁶ cells/20 μL)를 이식하였다. 바늘은 10분 후에 제거하였으며, 실크 봉합사로 절개 부위를 봉합하였다.

Ara-C 주사에 의한 소뇌실조증 동물 모델 및 인간 중간엽 줄기세포(hMSC) 이식

마우스에서 염증과 무관한 소뇌실조증을 유도하기 위하여 세포분열 억제 물질(anti-miotic agent)인 Ara-C를 이용하였다. 구체적으로, 마우스 생후 1일때부터 3일째까지 매일 40 mg/kg 농도의 Ara-C를 복강 투여함으로써 신경독성 유도 소뇌실조증 동물 모델을 만들었다.

다음으로, 상기와 동일한 방법으로 Ara-C가 주사된 마우스의 척수강(cisterna magna) 안으로 hMSCs(1 Х 10⁵cells/20 μL 또는 1 Х 10⁶ cells/20 μL)를 이식하였다.

hMSC 분리 및 줄기세포 특성 분석

칠곡 경북대학교병원의 임상연구심의위원회(IRB: 2017-11-015-007)의 승인을 받은 절차에 따라 8명의 건강한 기증자로부터 인간 골수 시료를 확보하였다.

Ficoll(Ficoll-Paque Premium; GE Healthcare Bio-Sciences AB)을 사용한 밀도 구배 원심분리로 골수로부터 단핵세포를 분리하고, CSBM-A06 배지(코아스템, 한국)에 약 1 Х 10⁵ cells/cm²밀도로 심은 후 10% FBS(fetal bovine serum; Life Technologies, Grand Island, NY, USA), 2.5 mM L-알라닐-L-글루타민(L-alanyl-L-glutamine; Biochrom AG, Berlin, Germany), 및 1% 페니실린-스트렙토마이신(penicillin-streptomycin; Biochrom AG)과 함께 배양하였다. 깨끗한 배지로 부착되지 않은 세포들을 제거한 후 배지를 3~4일에 한번씩 갈아 주었다. 70-80% 밀집도로 자란 세포를 계대 0(passage zero, P0)으로 정의하였다. 이후 실험 전에 세포는 계대 10(P10)까지 계대배양 하였다.

집단배가시간(Population doubling time, PDT): PTD는 연속 계대배양에서 측정하고 다음 식을 이용하여 계산하였다:

여기서 T0은 세포 이식 시간, T는 세포 수확 시간, N0은 최초 세포 수, 및 N은 수확된 세포의 수를 의미한다.

다계통 분화능 분석(Multilineage differentiation assays): 세포 분화는 종래 기술에 따라 유도하였다. 구체적으로, hMSC를 24-웰 플레이트에 배양하고 hMSC functional identification 키트(R&D Systems, Minneapolis, MN, USA)를 사용하여 지방형성 계통, 골형성 계통 및 연골발생 계통을 따라 분화하도록 자극하였다. 분화 후, 지방세포의 지방 방울은 오일 레드 O 염색약(oil red O staining; Sigma, Saint Louis, MO, USA)를 이용하여 시각화하였다. 골형성 분화는 알리자린 레드(alizarin red; Sigma, Saint Louis, MO, USA)에 의한 칼슘 축적을 염색함으로써 확인하였으며, 연골발생 분화는 알시안 블루 염색약(alcian blue staining; Sigma, Saint Louis, MO, USA)으로 확인하였다.

면역표현형(Immunophenotyping): hMSC의 특징을 확인하기 위하여, 다섯 개 계대 내의 세포를 세포 표면 마커인 CD29, CD73, CD90, CD105, CD34, CD45(BD Pharmingen, Heidelberg, Germany), 및 CD44(BD Biosciences, San Diego, CA)로 염색하였다. 유세포 분석기(BD FACS Canto II)를 이용하여 세포 표면 마커의 발현을 측정하였고, hMSC는 CD29/CD44/CD73/CD105^- 양성 및 CD34/CD45^-음성 세포인 것으로 확인되었다.

행동 검사

동물 모델 행동 검사는 hMSC 이식 하루 전과 hMSC 이식 후 4주 간 매주 로타로드 테스트(rotarod test)를 수행하였고, hMSC 이식 후 4주차에 한 번 단순 복합 표현형 점수 평가법(simple composite phenotype scoring system)을 수행하였다.

로타로드 테스트(rotarod test): 로타로드 테스트는 종래 문헌(Zhang MJ, Sun JJ, Qian L, Liu Z, Zhang Z, Cao W, Li W, Xu Y: Human umbilical mesenchymal stem cells enhance the expression of neurotrophic factors and protect ataxic mice. Brain Res 2011, 1402:122-131)에 개시된 방법에 따라 운동 협응 및 균형을 평가하기 위해 사용되었다. 실험 마우스를 4주 동안 매주 회전하는 막대 위에 조심스럽게 올려 두었다. 회전 속도는 4 rpm에서 40 rpm까지 선형으로 5분 동안 증가시켰고, 같은 속도(40 rpm)를 5분 간 유지시켰다. 마우스가 균형을 잃고 바닥에 떨어질 때까지의 시간(latency), 즉, 마우스가 회전 막대 위에 머물 수 있는 총 시간을 기록하였다. 근육의 피로를 방지하기 위해, 각각의 마우스는 각 실험 사이에 10분간 휴식을 취하도록 했다.

단순 복합 표현형 점수 평가법(simple composite phenotype scoring system): LPS-유도 소뇌성운동실조증 마우스 모델에서 질환의 심각성을 정량 분석하기 위하여, 종래 알려진 점수 평가법에 레지 테스트(ledge test)과 뒷다리 쥠 테스트(hindlimb clasping test)를 조합하여 사용하였다(Guyenet SJ, Furrer SA, Damian VM, Baughan TD, La Spada AR, Garden GA: A simple composite phenotype scoring system for evaluating mouse models of cerebellar ataxia. J Vis Exp 2010). 점수 평가는 14주령 마우스를 대상으로 하였으며, 모든 시험은 0-3점 척도로 평가하였고 복합 표현형 점수 0-6점을 더하였다: 0점은 관련 표현형이 없는 것을 의미하고, 3점은 가장 심각한 증상을 의미한다. 각각의 시험은 세 번씩 수행되었다.

레지 테스트(ledge test): 레지 테스트를 통해 운동 불균형 및 실조증을 평가하였다. 마우스가 전반적으로 균형을 잃지 않고 선반을 따라 걷는 경우는 0점, 마우스가 선반을 따라 불균형적인 자세로 걷는 경우는 1점, 마우스가 선반을 따라 걷는 동안 발을 헛디디는 경우는 2점, 마우스가 뒷다리를 효과적으로 사용하지 못하는 경우에 3점을 적용하였다.

뒷다리 쥠 테스트(Hindlimb clasping test): 이 시험은 소뇌성운동실조증 마우스 모델에서 질환 진행의 마커로 사용되었다(Chou AH, Yeh TH, Ouyang P, Chen YL, Chen SY, Wang HL: Polyglutamine-expanded ataxin-3 causes cerebellar dysfunction of SCA3 transgenic mice by inducing transcriptional dysregulation. Neurobiol Dis 2008, 31:89-101). 마우스의 뒷다리가 모두 일관적으로 복부에서 벌어지는 경우 0점, 한쪽 뒷다리가 측정 시간의 50% 이상 복부를 향해 움츠러드는 경우 1점, 양쪽 뒷다리가 측정 시간의 50% 이상 복부를 향해 부분적으로 움츠러드는 경우 2점, 양쪽 뒷다리가 측정 시간의 50% 이상 복부를 향해 완전히 움츠러들거나 복부에 닿는 경우 3점을 적용하였다.

일반운동성 테스트(open-field test): 흰색 아크릴 상자(40×40×40 cm) 중앙에 마우스를 한 마리 넣은 후 5분 간 자유롭게 움직이게 한 후, 마우스의 움직임을 Smart video tracking software (Panlab Harvard Apparatus)를 이용하여 측정하였다.

웨스턴 블럿 분석

웨스턴 블럿을 위해 LPS가 주사된 마우스의 경우 소뇌 충부(vermis)를 Ara-C가 주사된 마우스의 경우 소뇌 전체에서 나온 총 세포 용해물을 준비하였다. 소뇌 충부를 분리하고 각각의 조직을 용해 완충액(58 mM Tris-HCl, pH 6.8; 10% glycerol; and 2% SDS) 내에서 프로테아제 억제제 혼합물(protease inhibitor cocktail, 1:100, Millipore, Burlington, MA, USA) 및 포스파타아제 억제제 혼합물(phosphatase inhibitor cocktail, 1:100, Cell Signaling Technology)과 함께 균질화시켰다. 상기 용해물을 원심분리한 후, BCA 키트(Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA)를 이용하여 단백질 농도를 정량하였다. 겔 전기영동법을 이용하여 단백질을 분리한 후 전기영동 이동 시스템(Bio-Rad Laboratories)을 이용하여 멤브레인 위에 이동시켰다. 상기 멤브레인을 다음의 1차 항체와 함께 4℃에서 하룻밤 동안 배양하였다: 항-Iba1(anti-ionized calcium-binding adapter molecule 1, 1:1500, Wako, Osaka, Japan), 항-GFAP(anti-glial fibrillary acidic protein, 1:2000, Millipore, Billerica, MA, USA), 항-TNFα(anti-tumor necrosis factor alpha, 1:1000, Abcam, Cambridge, UK), 항-IL-1β(anti-interleukin 1 beta, 1:1000, Abcam, Cambridge, MA, USA), 항-MCP-1(anti-monocyte chemoattractant protein 1, 1:500, Abcam, Cambridge, UK), 항-MIP-1α(anti-macrophage inflammatory protein 1 alpha, 1:1000, R&D Systems, Minneapolis, MN, USA), 항-Cal-D28K (anti-calbindin-D-28K, 1:2000, Sigma, St. Louis, MO, USA), 항-절단 카스파제-3(anti-cleaved caspase-3, 1:1000, Cell Signaling, Beverly, MA, USA), 항-카스파제-3(anti-caspase-3, 1:1000, Cell Signaling, Beverly, MA, USA), 항-CD86(anti-cluster of differentiation 86, 1:1000, Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), 항-CD206(anti-cluster of differentiation 206, 1:1000, R&D Systems, Minneapolis, MN, USA), 항-iNOS(anti-inducible nitric oxide synthase, 1:1000, Abcam, Cambridge, UK), 항-IL-10(anti-interleukin 10, 1:1000, Abcam, Cambridge, MA, USA), 항-TSG-6(anti-TNFα stimulated gene-6, 1:1000, GeneTex, Irvine, CA, USA)), 및 항-베타액틴(anti-β-actin, 1:2000, Santa Cruz, CA, USA).

다음으로 HRP와 결합된 2차 항체(Amersham Biosciences, Piscataway, NJ, USA)와 함께 배양한 후, 화학발광 웨스턴 블럿 검출 시약(Amersham Biosciences)으로 웨스턴 블럿을 수행하였다. 반정량분석을 위해, ImageQuant LAS 500 imager(GE Healthcare Life Science)를 이용하여 밴드 밀도를 측정하였다. 각 단백질 밴드의 강도는 Multi Gauge V3.0 software(Fuji Film, Tokyo, Japan)로 계산하였고, 이에 상응하는 베타액틴(β-actin) 밴드의 강도로 표준화하였다.

통계적 분석

모든 통계 분석은 SigmaPlot 소프트웨어 12.0(Systat Software, San Leandro, CA)을 이용하여 수행하였다. 데이터는 평균±표준오차(standard error of the mean, SEM)로 나타내었다. 통계적 유의성은 ANOVA(one-way analysis of variance) 후, 그룹 간 다중 비교를 위해 터키 사후검증(Tukey's post hoc test) 또는 두 그룹 비교를 위해 스튜던트 t-검증(Student's t-test)을 사용하여 결정하였다.

<실험 결과>

1. 염증유발 물질(LPS)에 의한 퇴행성 신경계 질환 동물 모델

염증으로 유도되는 퇴행성 신경계 질환 동물 모델을 확립하기 위해, 염증성 신경변성의 효과적인 물질로 LPS를 소뇌에 직접적으로 주사하였다.

도 1a의 웨스턴 블럿 결과에 나타난 바와 같이, Iba1(미세아교세포) 발현이 LPS 주입에 의해 시간에 따라 유의적으로 증가하였다(LPS-주입 후 1일째 ^**p < 0.01 및 ^***p < 0.001, LPS-주입 후 7일째 ^***p < 0.001 vs. 대조군, CON). Iba1 발현 결과와 같이, IL-1β 및 TNFα과 같은 염증성 사이토카인의 발현 수준 역시 LPS 주입 후 7일차에 온전한 대조군과 비교하여 2.4배 및 2.6배 유의적으로 증가하였다(도 1A; ^**p < 0.01, ^*p < 0.05 vs. CON). 한편 PBS를 처리한 마우스에서 교세포 및 염증성 사이토카인의 발현 수준은 대조군과 차이가 나타나지 않았다.

또한, 본 실시예에서는 LPS를 주입한 소뇌에서 염증 세포 및 중간엽 줄기세포에 대한 화학유인물질(chemoattractant)로 알려진 MIP-1α 및 MCP-1와 같은 염증성 케모카인의 생성을 확인하였다. 웨스턴 블럿 분석 결과(도 1a에 나타난 바와 같이, 소뇌에서 MIP-1α 및 MCP-1의 발현은 대조군과 비교하여 LPS 주입 1일 후에 유의적으로 증가하였으며(^**p < 0.01 vs. CON), 7일 후에는 이로부터 감소하였다.

최종적인 동물 모델의 적합성을 확인하기 위해 로타로드 테스트를 통해 마우스의 운동성 결함 및 푸르키니예 세포(Purkinje cell) 손실여부를 확인하였다. 그 결과, 정상 대조군에 비하여 LPS 주사 1주 후에 회전 막대기 위에 체류 시간이 현저하게 감소하였고, 4주 동안 감소된 값이 유지되었다(도 1b ^***p < 0.001 LPS 주사 후 2주 및 3주vs. CON, ^**p < 0.01 LPS 주사 후 4주 vs. CON). 또한 정상 대조군 마우스에 비하여 LPS가 주사된 마우스는 LPS 주사 후 7일차에 소뇌에서 유의적으로 칼빈딘 단백질(calbindin protein)이 감소하였으며, 이는 푸르키니예 세포의 손실을 나타낸다(도 1B; ^***p < 0.001 vs. CON).

2. 세포분열 억제물질에 의한 퇴행성 신경계 질환 동물 모델

세포분열 억제물질로 유도되는 퇴행성 신경계 질환 동물 모델을 확립하기 위해, 생후 1~3일 동안 매일 Ara-C를 복강내로 주사하였다.

도 2a의 결과와 같이 병리조직학적 염색을 통해 소뇌의 구조, 신경세포, 푸르키니예 세포(Purkinje cell)를 확인하였다. 그 결과 Ara-C를 투여한 동물의 소뇌 발달이 저해된 것을 확인할 수 있었고 소뇌의 신경세포 및 푸르키니예 세포(Purkinje cell)가 형성되지 못함을 확인할 수 있었다.

추가적으로 행동학적 평가를 통해 질환 동물 모델을 평가하였으며, 그 결과 평행 및 매달림, 보행 등 대조군(Control) 대비 행동학적 불균형이 있음을 확인하였다(도 2b).

3. 유전자변형을 통한 유전적 퇴행성 신경계 질환 동물 모델

유전자 변형을 통한 유전적 퇴행성 신경계 질환 동물 모델을 확립하기 위해 마우스 Pcp2 프로모터에 인간 SCA2 유전자를 삽입하여 과발현 하게 만든 B6D2-Tg(Pcp2-SCA2)11Plt/J 마우스를 확립하였다. 하지만 확보된 B6D2-Tg(Pcp2-SCA2)11Plt/J마우스는 C57BL/6J 난자와 DBA/2J 정자가 수정되어 확립된 동물 모델로 유전적 배경이 균일하지 않아서 C57BL/6J 마우스와 반복적인 역교배(Backcross)를 통해 94%의 유전적 안정성을 보이는 5세대까지 교배를 진행하였다.

따라서 도 3a에 나타낸 바와 같이, 역교배를 통한 유전적 안정화를 진행하였고 이후 SCA2 유전자 발현을 확인하여 유전적 퇴행성 신경계 질환 동물 모델을 확립하였다.

추가적으로 도 3b의 결과와 같이 행동학적 평가인 로타로드 테스트를 통해 대조군(Wild type, WT) 동물 대비 행동학적 불균형이 있는 것을 확인하였다.

4. 중간엽 줄기세포 치료제의 특성 (hMSC)

골수에서 분리한 중간엽 줄기세포 치료제의 특성을 확인하기 위해 성상, 마커, 분화능 분석을 통해 줄기세포 치료제의 특성을 확인하였으며 분비되는 싸이토카인을 통해 줄기세포의 기능적 특성도 확인하였다.

먼저 hMSC의 특징은 국제세포치료학회(International Society for Cellular Therapy, ISCT)의 기준에 따라 섬유아세포(fibroblastoid)의 형태, hMSC 관련 표면 마커의 발현 패턴, 및 분화 가능성으로 결정된다.

골수에서 분리한 hMSC는 방추형 섬유아세포 모양의 줄기세포 본연의 성상을 육안으로 확인할 수 있었다(도 4a). 또한 줄기세포는 증식력을 확인하기 위해 각 계대별 hMSC의 PDT를 평가하였으며, 초기 계대 단계의 hMSC는 높은 증식력을 나타내지만(37 - 51시간), 후기 계대 간계에서는(Passage7 이후) hMSC의 증식력이 좋지 못함을 확인할 수 있었다(도 4b).

유세포분석 결과, 초기 hMSC의 95% 이상이 CD29, CD44, CD73, CD90, 및 CD105와 같은 hMSC 관련 CD 마커들에 대해 양성인 반면, CD34 및 CD45와 같은 조혈모세포 관련 CD 마커들에 대해 음성을 나타내었다(도 4C).

골수 유래 hMSC의 분화능을 확인하기 위하여 초기 단계의(Passage 2 ~ 4) 줄기 세포를 지방형성 배지, 골형성 배지 및 연골발생 배지에서 2 ~ 4주 간 배양하여 지방세포, 조골세포 및 연골세포로 분화된다는 것을 확인하였으며, 이는 중간엽 줄기세포 고유의 특성으로 분리/생산한 중간엽 줄기세포 치료제가 7번째 계대까지 줄기세포의 특성을 잘 유지한다는 것을 알 수 있었다(도 4D).

퇴행성 신경계 질환에서의 치료적 효과를 예측하기 위해 중간엽 줄기세포 치료제의 분비 단백질을 확인하고자 neurotropic factor를 확인하였다. 그 결과 신경세포 보호인자 및 신경세포의 성장, 분화와 관련 깊은 ANG, BDNF, IGF의 발현을 확인할 수 있었다. 이는 중간엽 줄기세포 치료제가 퇴행성 신경계 질환에 유익할 수 있을 것으로 사료된다(도 4E).

상기 결과에 기초하여 이후 실험에는 5번 계대 이내의 hMSC(P1-P5)만 사용되었다.

5. 염증 유발에 의한 퇴행성 신경계 질환 동물 모델의 hMSC의 치료 효과

척추 강내 이식된 hMSC가 LPS에 의해 유도된 퇴행성 신경계 질환 동물 모델에서 유익한 효과가 있는지 평가하기 위하여, 10주령 마우스를 이용하여 hMSC 이식 후 4주 동안 매주 로타로드 테스트를 이용하여 운동 협응 및 균형을 평가하였다. 대조군 마우스에는 저온에서 줄기세포를 보관하는 데 사용되는 최적 보존제인 HTS(HypoThermosol)를 투여하였다. 그 결과, LPS 투여 전에는 모든 그룹의 마우스가 비슷한 수준의 운동 조화를 보였지만, LPS 투여 후 질환 동물은 대조군과 비교하여 점차적으로 운동성이 떨어지는 것을 확인하였다. 줄기세포 치료제 저용량(1 Х 10⁵ cells/mouse) 및 고용량(1 Х 10⁶ cells/mouse) 이식한 경우 질환 동물의 운동 수행력이 대조군 대비 현저히 향상되는 것을 확인할 수 있었으며(도 5a), 복합 실조증 표현형 점수 평가법을 통해 행동학적 장애를 평가하였을 때 중간엽 줄기세포 치료제 투여 군에서 유의미하게 행동장애의 개선을 확인할 수 있었다(도 5b).

다음으로, 행동학적 지표뿐만 아니라 염증 반응의 감소 및 푸르키니예 세포(purkinje cell)의 사멸 억제, M1- 및 M2-형 미세아교세포의 발현 수준 등을확인하여 다양한 기전에서의 중간엽 줄기세포 치료제의 효과를 확인하였다.

중간엽 줄기세포 치료제의 염증반응 감소 확인하기 위하여 LPS 염증반응으로 유도된 교세포의 활성을 확인하였다. 대조군 대비 중간엽 줄기세포 치료제 투여군에서는 Iba1이 현격하게 감소하는 것을 확인할 수 있었으며(도 5c), 또한 염증성 싸이토카인인 IL-1β, TNF-α도 소뇌에서 감소하는 것을 확인할 수 있었다(도 5d). 이는 중간엽 줄기세포 치료제가 항염증 및 면역 조절 작용의 효과로 확인된다.

또한, 염증 반응으로 유도되는 푸르키니예 세포(purkinje cell)의 사멸을 억제하고 보호할 수 있는 줄기세포 치료제의 보호 효과를 확인하였다. 질환 동물의 소뇌에서 감소한 푸르키니예 세포의 마커 Cal-D28K가 중간엽 줄기세포 치료제 투여군에서 대조군 대비 마커 발현이 높은 것을 확인할 수 있었다(도 5e). 또한 M1- 및 M2-형 미세아교세포의 분극의 변화를 확인하기 위하여 M1형 마커로 CD86을, M2형 마커로 CD206을 확인하였을 때 CD86의 M1형 미세아교세포는 감소하고 CD206의 M2형 미세아교세포는 증가하는 것을 확인할 수 있었다 도 5f). 이는 M1형의 미세아교세포가 조직재생과 관련한 M2형 미세아교세포로 분극된 것으로 줄기세포의 2차적인 치료적 개선 효과를 대변할 수 있다.

6. 세포분열 억제물질에 의한 퇴행성 신경계 질환 동물 모델의 hMSC의 치료 효과

세포분열 억제물질 인 Ara-C로 유도 소뇌실조증 동물 모델에서 저용량 (2Х10⁴ 또는 6Х10⁴ cells)의 줄기세포 치료제의 투여방법에 따른 운동 능력 개선 효과를 비교하기 위해, 줄기세포 투여 시점(10주령)으로부터 12주간 2주 간격으로 로타로드 테스트를 수행하여 운동 협응 및 균형을 평가하였다. 본 실시예에서 줄기세포는 하기 4가지 방법으로 투여하였다:

① 2Х10⁴ cells의 1회 투여(n=2)

② 2Х10⁴ cells의 4주 간격(10w, 14w, 18w) 3회 반복 투여(n=3)

③ 6Х10⁴ cells의 1회 투여(n=3)

④ 6Х10⁴ cells의 4주 간격(10w, 14w, 18w) 3회 반복 투여(n=3)

그 결과, 정상 대조군(WT)에 비해 Ara-C를 투여한 소뇌실조증 모델(Ara-C) 마우스의 경우 로타로드 테스트에서 균형을 유지하지 못하고 떨어졌다. 한편, Ara-C 모델 마우스에 hMSC를 투여하였을 때 투여 용량 및 방법에 따라 운동 수행력 향상에 차이를 보였다. 구체적으로, 2Х10⁴cells을 1회 투여한 경우는 줄기세포를 투여하지 않은 경우와 큰 차이를 보이지 않았다. 2Х10⁴cells을 반복 투여한 경우와 6Х10⁴cells을 1회 투여한 경우, 생후 16주까지 균형 능력이 점차 상승하였으나, 그 이후에는 다시 떨어졌다. 마지막으로, 6Х10⁴cells을 반복 투여한 경우 지속적으로 균형 능력이 상승하는 것을 확인할 수 있었다(도 6a). 이를 통해 질환 동물에서 중간엽 줄기세포 효과는 최소 6Х10⁴cells이상 단회 또는 반복으로 투여하였을 때 행동학적 개선 효과가 나타난다는 점을 확인할 수 있었다.

또한 해부학적 변화를 확인 하기 위해 중간엽 줄기세포 치료제 투여 후 소뇌의 크기 및 무게의 변화를 확인하였다. 그 결과 정상 대조군(WT)에 비해 Ara-C를 투여한 소뇌실조증 모델(Ara-C) 마우스의 경우 소뇌 크기가 현저히 감소하였으나, 줄기세포를 투여한 후 소뇌 크기가 소폭 상승한 것을 확인할 수 있었다(도 6b).

더불어 일반 운동 활성을 측정하기 위해 Open-field 테스트를 수행하였다. 본 실시예에서 줄기세포는 2가지 농도(1Х10⁵또는 1Х10⁶cells)로 1회 또는 반복 투여하여 그 결과를 비교하였다. 구체적으로 상기 각 농도의 줄기세포를 10주령에 1회 투여하거나, 4주 간격으로 3회 반복 투여한 후, 22주령 때 Open-field 테스트를 통해 일반 운동성을 측정하였다. 그 결과, 정상 대조군(WT)에 비해 Ara-C를 투여한 소뇌실조증 모델(Ara-C) 마우스의 경우 운동성이 현저히 떨어졌으나, 줄기세포를 투여한 후 운동성 향상을 확인할 수 있었다. 줄기세포를 1회 투여한 경우보다 반복 투여 시 운동 활성 개선 효과가 더욱 현저하게 나타났으며, 1회 투여 및 반복 투여의 경우 모두 줄기세포를 1Х10⁵cells 농도로 투여하였을 때 운동 활성 개선 효과가 더 높이 나타났다(도 6c).

치료제의 효과는 단백질의 변화에서도 확인할 수 있었다. 질환 동물에서 1Х10⁵ cells 농도로 중간엽 줄기세포 투여 후 신경세포 단백질 NeuN 과 신경모세포 및 신경세포 전구체 마커인 DCX(doublecortin)의 발현이 현저하게 증가함을 확인 하였으며 이는 소뇌의 성숙장애 개선으로 인한 치료적 효과로 사료된다(도 6d).

신경행동학적 검사인 복합 표현형 점수 평가법에서는 중간엽 줄기세포 치료제를 2가지 농도(1Х10⁵또는 1Х10⁶cells)로 1회 또는 반복 투여하여 그 결과를 비교하였다. 구체적으로 상기 각 농도의 줄기세포를 10주령에 1회 투여하거나, 4주 간격으로 3회 반복 투여한 후, 22주령 때 상기 복합 표현형 점수 평가를 통해 행동장애 개선 효과를 측정하였다. 그 결과, Ara-C를 투여한 소뇌실조증 모델(Ara-C) 마우스의 경우에 비해, 줄기세포를 투여한 후 총 평균 점수가 현저하게 감소하였으며, 1회 투여보다 반복 투여의 경우, 1Х10⁶cells농도로 투여한 경우 보다 1Х10⁵cells 농도로 투여한 경우 신경행동학적 증상이 더욱 완화되는 것을 확인할 수 있었다(도 6e).

7. 유전자 변형을 통한 SCA2 퇴행성 신경계 질환 동물 모델의 hMSC의 치료 효과

척추강내 이식된 hMSC가 유전적 변형 질환 동물 모델(SCA2)에 치료적 효과가 있는지 평가하기 위하여, 10주령 마우스에 hMSC를 이식하고 4주 동안 매주 로타로드 테스트를 통한 운동 협응 및 균형을 평가하였다. 그 결과, SCA2 유전자 변이 동물 모델에서는 행동학적 불균형을 확인할 수 있었고, 중간엽 줄기세포 치료제 저용량(6 Х 10⁴ cells/mouse) 및 고용량(1 Х 10⁵ cells/mouse)을 이식한 경우 질환 동물의 운동 수행력이 대조군 대비 향상되는 것을 확인할 수 있었다. 이는 앞서 인위적으로 물질로 유도한 질환 동물 모델과 더불어 유전질환 동물 모델에서도 중간엽 줄기세포의 치료적 효과를 확인한 결과로 다양한 병리 기전에도 중간엽 줄기세포 치료제는 치료적 효과가 있다는 것을 확인하였다(도 7).

Claims

줄기세포를 유효성분으로 포함하는 소뇌의 퇴행성 신경계 질환 증상 완화 또는 치료용 약학적 조성물.
제1항에 있어서,
상기 줄기세포는 성체줄기세포인 것을 특징으로 하는 소뇌의 퇴행성 신경계 질환 증상 완화 또는 치료용 약학적 조성물.
제2항에 있어서,
상기 성체줄기세포는 중간엽 줄기세포(mesenchymal stem cells, MSC), 중간엽 기질세포(mesenchymal stromal cells) 및 다분화능 줄기세포로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는 소뇌의 퇴행성 신경계 질환 증상 완화 또는 치료용 약학적 조성물.
제1항에 있어서,
상기 줄기세포는 인간 중간엽 줄기세포(human mesenchymal stem cells, hMSC)인 것을 특징으로 하는 소뇌의 퇴행성 신경계 질환 증상 완화 또는 치료용 약학적 조성물.
제1항에 있어서,
상기 줄기세포는 소뇌의 항염 활성을 유도하는 것을 특징으로 하는 소뇌의 퇴행성 신경계 질환 증상 완화 또는 치료용 약학적 조성물.
제1항에 있어서,
상기 줄기세포는 염증성 사이토카인 또는 염증성 케모카인의 발현을 감소시키는 것을 특징으로 하는 소뇌의 퇴행성 신경계 질환 증상 완화 또는 치료용 약학적 조성물.
제1항에 있어서,
상기 줄기세포는 염증성 신경교세포의 활성을 억제하고, 항염성 신경교세포를 활성화시키는 것을 특징으로 하는 소뇌의 퇴행성 신경계 질환 증상 완화 또는 치료용 약학적 조성물.
제1항에 있어서,
상기 줄기세포는 푸르키니예 세포 손상을 억제하는 것을 특징으로 하는 소뇌의 퇴행성 신경계 질환증상 완화 또는 치료용 약학적 조성물.
제1항에 있어서,
상기 소뇌의 퇴행성 신경계 질환은 염증으로 유발된 퇴행성 신경계 질환, 독소에 의해 유발된 퇴행성 신경계 질환, 및 유전자 변형에 의한 퇴행성 신경계 질환으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는 소뇌의 퇴행성 신경계 질환 증상 완화 또는 치료용 약학적 조성물.
제1항에 있어서,
상기 소뇌의 퇴행성 신경계 질환은 소뇌실조증 또는 다계통위축증을 포함하는 것인 소뇌의 퇴행성 신경계 질환 증상 완화 또는 치료용 약학적 조성물.
제1항에 있어서,
상기 줄기세포는 CD29, CD44, CD73, CD90 또는 CD105를 포함하는 양성 표면 마커를 90% 이상 발현하거나, CD34 또는 CD45를 포함하는 음성 표면 마커를 5% 이하 발현하는 것을 특징으로 하는 소뇌의 퇴행성 신경계 질환 증상 완화 또는 치료용 약학적 조성물.
제1항에 있어서,
상기 약학적 조성물은 주사 제형인 것을 특징으로 하는 소뇌의 퇴행성 신경계 질환 증상 완화 또는 치료용 약학적 조성물.
제1항에 있어서,
상기 약학적 조성물은 보존제, 현탁화제 및 부형제로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 소뇌의 퇴행성 신경계 질환 증상 완화 또는 치료용 약학적 조성물.
제1항에 있어서,
상기 약학적 조성물은 단회 투여 또는 반복 투여용 제형인 것을 특징으로 하는 소뇌의 퇴행성 신경계 질환 증상 완화 또는 치료용 약학적 조성물.
제1항에 있어서,
상기 약학적 조성물은 척수강내, 정맥내, 근육내, 동맥내, 골수내, 뇌경막내, 신경내, 뇌실내 및 뇌혈관내로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 투여 경로를 통해 투여되는 제형인 것을 특징으로 하는 소뇌의 퇴행성 신경계 질환 증상 완화 또는 치료용 약학적 조성물.