KR102231627B1 - Hsp 또는 hif의 활성화에 의한 줄기세포 생산 방법 - Google Patents

Hsp 또는 hif의 활성화에 의한 줄기세포 생산 방법 Download PDF

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권오경
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Abstract

HSP 또는 HIF의 활성화 단계를 포함하는 줄기세포 생산 방법, 상기 방법으로 생산된 줄기세포, 및 이의 용도를 제공한다.

Description

HSP 또는 HIF의 활성화에 의한 줄기세포 생산 방법{Method of Preparing Stem Cell by Activating HSP or HIF}
HSP 또는 HIF의 활성화 단계를 포함하는 줄기세포 생산 방법, 상기 방법으로 생산된 줄기세포, 및 이의 용도를 제공한다.
줄기세포를 이용한 난치성 세포치료는 줄기세포가 보유한 기능적 특성들의 활성화가 전제되어야 하지만, 연령, 채취부위 등에 따라 기능적 특성들에 차이가 있을 수 있다.
줄기세포의 기능적 차이의 원인인 개체차를 줄이고 더 나은 치료 효과를 얻기 위해 다양한 줄기세포 전처리 방법이 보고되어 있다.
또한, 필요한 기능을 강화시키면 더 나은 치료 효과가 기대된다. 그러나, 기능이 강화된 줄기세포라도 동결하여 보관 후 해동하여 사용하는 경우 강화된 기능이 저하되는 문제점이 있다.
따라서, 줄기세포의 기능을 강화시키면서 동시에 내동성을 개선시키는 줄기세포 전처리 기술의 개발이 필요하다.
대한민국 등록특허 제10-1870238호
본 명세서에서는 열충격단백질 (heat shock protein; HSP) 및/또는 HIF (Hypoxia induced protein)의 활성화를 통해 HSP/HIF 뿐 아니라 줄기세포의 다른 중요한 기능적 특성들도 활성화될 뿐 아니라 내동성도 개선됨을 제안한다.
일 예는 줄기세포를 고온 배양 또는 저산소 배양하는 단계를 포함하는, 줄기세포 생산 방법을 제공한다. 상기 고온 배양에 의하여 줄기세포의 HSP가 활성화될 수 있다. 상기 저산소 배양에 의하여 줄기세포의 HIF가 활성화될 수 있다.
다른 예는 줄기세포를 고온 배양 또는 저산소 배양하는 단계를 포함하는 줄기세포 전처리 방법 또는 줄기세포의 내동성 강화 또는 개선 방법이 제공된다. 상기 고온 배양에 의하여 줄기세포의 HSP가 활성화될 수 있다. 상기 저산소 배양에 의하여 줄기세포의 HIF가 활성화될 수 있다. 또한, 줄기세포의 내동성 강화 방법은, 고온 배양 또는 저산소 배양하는 단계를 포함하지 않는 경우와 비교하여, 얻어진 줄기세포의 내동성을 개선시킬 수 있는 것일 수 있다.
다른 예는 상기 방법으로 생산된 줄기세포를 제공한다.
다른 예는 상기 방법으로 생산된 줄기세포를 포함하는 세포 치료제를 제공한다.
줄기세포를　정상배양온도보다 고온에서 수시간 배양할 경우 heat shock protein (HSP)이 활성화되고, 저산소 조건에서 배양시 HIF가 활성화되며, 이러한 처리를 통해 HSP 및/또는 HIF 뿐만 아니라 줄기세포의 다른 중요한 기능적 특성들도 활성화됨을 확인하였다.
본 명세서에서 제공되는 방법은 세포치료에 필요한 줄기세포의 기능적 특성을 향상시키는 방법으로, 이와 같이 제작된 줄기세포를 급성척수손상 모델 개에 정맥주사하여 기존의 줄기세포치료보다　손상된 기능이 유의적으로 개선됨을 확인하였다. 이와 같은 결과는, 본 명세서에서 제공되는 방법에 의하여 제작된 줄기세포가 난치성 질환 치료를 위한 기능이 강화된 것이고, 의료분야에 유용하게 적용 가능함을 보여준다.
일 예는 다음의 단계를 포함하는 줄기세포 제조 방법, 강화된 줄기세포 제조 방법, 줄기세포 전처리 방법, 또는 줄기세포 강화 방법을 제공한다:
(1) 줄기세포를 15 내지 25% 산소 농도 및 40 내지 45℃에서 0.5 내지 3시간 동안 배양하는 고온 배양 단계, 또는
(2) 줄기세포를 1 내지 10% 산소 농도 및 35 내지 39℃에서 80% 내지 95% 충만까지 배양하는 저산소 배양 단계.
일 예에서, 상기 단계 (1)과 (2)는 동시에 수행되지 않는 것일 수 있다.
일 예에서, 상기 단계 (1)의 고온 배양에 의하여, 통상의 배양 조건 (예컨대, 20% 산소 농도, 5% 이산화탄소 농도, 및 37℃ 온도)에서 배양된 동종 줄기세포와 비교하여, 줄기세포의 HSP가 활성화되거나, HSP의 활성화가 강화(증가)된 것일 수 있다.
다른 예에서, 상기 단계 (2)의 저산소 배양에 의하여, 통상의 배양 조건 (예컨대, 20% 산소 농도, 5% 이산화탄소 농도, 및 37℃ 온도)에서 배양된 동종 줄기세포와 비교하여, 줄기세포의 HIF가 활성화되거나, HIF의 활성화가 강화(증가)된 것일 수 있다.
일 예에서, 상기 단계 (1)의 고온 배양은, 줄기세포를 15 내지 25%, 18 내지 22%, 또는 약 20%의 산소 농도 및 40 내지 45℃, 42 내지 44℃, 또는 약 43℃의 온도에서 0.5 내지 3시간, 0.5 내지 2시간, 또는 약 1시간 동안 배양하는 것일 수 있다.
또한, 상기 HSP 활성화를 위하여,
단계 (1)의 고온 배양 단계 이전에, (1-1) 15 내지 25%, 18 내지 22%, 또는 약 20%의 산소 농도 및 35 내지 39℃, 36 내지 38℃, 또는 약 37℃의 온도에서 80% 내지 95%, 85% 내지 95%, 또는 약 90% 충만까지 배양하는 단계를 추가로 포함하거나,
상기 단계 (1)의 고온 배양 단계 이후에, (1-2) 15 내지 25%, 18 내지 22%, 또는 약 20%의 산소 농도 및 35 내지 39℃, 36 내지 38℃, 또는 약 37℃의 온도에서 1시간 내지 5시간, 2시간 내지 4시간, 또는 약 3시간 동안 배양하는 단계를 추가로 포함하거나,
상기 단계 (1)의 고온 배양 단계 이전 및 이후에, 상기 단계 (1-1) 및 (1-2)를 추가로 포함하는 것일 수 있다.
다른 예에서, 상기 단계 (2)의 저산소 배양은, 줄기세포를 1 내지 10%, 4 내지 6%, 또는 약 5%의 산소 농도 및 35 내지 39℃, 36 내지 38℃, 또는 약 37℃의 온도에서 80% 내지 95%, 85% 내지 95%, 또는 약 90% 충만까지 배양하는 것일 수 있다.
상기 줄기세포 강화 방법은 줄기세포의 내동성 강화를 포함할 수 있다.
다른 예에서, 상기 줄기세포 제조 방법, 강화된 줄기세포 제조 방법, 또는 줄기세포 강화 방법은, 상기 단계 (1) 또는 단계 (2) 이후에, (3) 배양된 줄기 세포를 동결하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
상기 동결하는 단계는 통상적인 동결 방법 (예컨대, -100 내지 -60℃, -90 내지 -70℃, 또는 약 -80℃에서 12시간 내지 36시간, 18시간 내지 30시간, 또는 약 24시간 동결) 및/또는 동결제에 부유시켜서 수행할 수 있다. 상기 동결제 (또는 냉동액으로도 표현될 수 있음)는 DMSO (Dimethyl sulfoxide), FBS (Fetal Bovine Serum) 30 내지 50%(w/v), 또는 이들의 조합을 포함하는 것일 수 있다.
일 예에서, 상기 동결제는,
DMSO (Dimethyl sulfoxide) 5 내지 20%(w/v), 5 내지 15%(w/v), 8 내지 20%(w/v), 8 내지 15%(w/v), 8 내지 12%(w/v), 또는 약 10%(w/v);
FBS (Fetal Bovine Serum) 30 내지 50%(w/v), 30 내지 45%(w/v), 35 내지 50%(w/v), 35 내지 45%(w/v), 38 내지 42%(w/v), 또는 약 40%(w/v); 또는
이들의 조합을 포함하는 것일 수 있다.
상기 방법으로 생산된 줄기세포는, 통상의 배양 조건 (예컨대, 20% 산소 농도, 5% 이산화탄소 농도, 및 37℃ 온도)에서 배양된 동종 줄기세포와 비교하여, 줄기세포의 HSP가 활성화되거나, HSP의 활성화가 강화(증가)된 것이거나, 줄기세포의 HIF가 활성화되거나, HIF의 활성화가 강화(증가)된 것일 수 있다. 또한, 상기 방법으로 생산된 줄기세포는, 내동성이 우수하여, 동결 후 해동된 경우에도, HSP가 활성화 (고온 배양) 또는 HIF의 활성화 (저산소 배양) 된 동종 줄기세포와 비교하여, 우수한 물성이 저하되지 않고 동등 이상을 유지하는 것일 수 있다.
다른 예에서, 상기 방법으로 생산된 줄기세포는, 20% O2, 5% CO2, 및 37℃의 조건에서 배양된 동종 줄기세포와 비교하여,
(i) 생존률, 증식성, 또는 이들 모두가 동등 이상 (예컨대, 높음)이거나,
(ii) 항산화능, 항염증인자 수준, 항스트레스인자 수준, 호밍(homing) 인자 수준, 성장인자 수준, 및 다분화능인자 수준으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상이 높거나,
(iii) 염증인자 수준이 낮거나,
(iv) 상기 (i) 내지 (iii)의 특성 중 2 이상의 특성을 갖는 것일 수 있다.
특히, 상기 HSP 또는 HIF 활성화된 줄기세포는, 동결 처리된 후 사용 전 해동된 경우, HSP 활성화 (고온 배양) 또는 HIF 활성화(저산소 배양) 되지 않고 동결 처리된 후 사용 전 해동된 동종 줄기세포와 비교하여,
(i) 생존률, 증식성, 또는 이들 모두가 높거나,
(ii) 항산화능, 항염증인자 수준, 항스트레스인자 수준, 호밍(homing) 인자 수준, 성장인자 수준, 및 다분화능인자 수준으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상이 높거나,
(iii) 염증인자 수준이 낮거나,
(iv) 상기 (i) 내지 (iii)의 특성 중 2 이상의 특성을 갖는 것일 수 있다.
이에, 다른 예는, 상기한 방법에 의하여 생산되고, 20% O2, 5% CO2, 및 37℃의 조건에서 배양된 동종 줄기세포와 비교하여, HSP가 활성화되거나, HSP의 활성화가 강화(증가)된 것이거나, 줄기세포의 HIF가 활성화되거나, HIF의 활성화가 강화(증가)된 것을 특징으로 하는, 줄기세포를 제공한다.
일 예에서, 상기 줄기세포는, 동결 여부와 무관하게, HSP 활성화 (고온 배양) 또는 HIF 활성화(저산소 배양) 되지 않은 동종 줄기세포와 비교하여,
(i) 생존률, 증식성, 또는 이들 모두가 동등 이상 (예컨대, 높음)이거나,
(ii) 항산화능, 항염증인자 수준, 항스트레스인자 수준, 호밍(homing) 인자 수준, 성장인자 수준, 및 다분화능인자 수준으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상이 높거나,
(iii) 염증인자 수준이 낮거나,
(iv) 상기 (i) 내지 (iii)의 특성 중 2 이상의 특성을 갖는 것일 수 있다.
특히, 상기 줄기세포는 상기한 바와 같이 HSP 활성화 (고온 배양) 또는 HIF 활성화 (저산소 배양) 됨으로써, 내동성이 증가하여, 동결 처리된 후 사용 전 해동된 경우에도, HSP 활성화 (고온 배양) 또는 HIF 활성화(저산소 배양) 되지 않고 동결 처리된 후 사용 전 해동된 동종 줄기세포와 비교하여 상기 특성들이 저하되지 않거나 오히려 강화 (증가)된 것일 수 있다.
예컨대, 상기 HSP 또는 HIF 활성화된 줄기세포는, 동결 처리된 후 사용 전 해동된 경우, HSP 활성화 (고온 배양) 또는 HIF 활성화(저산소 배양) 되지 않고 동결 처리된 후 사용 전 해동된 동종 줄기세포와 비교하여,
(i) 생존률, 증식성, 또는 이들 모두가 높거나,
(ii) 항산화능, 항염증인자 수준, 항스트레스인자 수준, 호밍(homing) 인자 수준, 성장인자 수준, 및 다분화능인자 수준으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상이 높거나,
(iii) 염증인자 수준이 낮거나,
(iv) 상기 (i) 내지 (iii)의 특성 중 2 이상의 특성을 갖는 것일 수 있다.
보다 구체적으로, 상기 HSP 또는 HIF 활성화된 줄기세포는, HSP 활성화 (고온 배양) 또는 HIF 활성화(저산소 배양) 되지 않은 동종 줄기세포 (예컨대, 20% O2, 5% CO2, 및 37℃의 조건에서 배양된 동종 줄기세포)와 비교하여, 하기의 특징 중 하나 이상을 갖는 것일 수 있다:
세포 생존률 동등 이상, 예컨대, 동등하거나, 1% 이상, 2% 이상, 3% 이상, 4% 이상, 또는 5% 이상 높음;
배양 2일째 또는 배양 3일째부터의 세포 증식성이 1.1배 이상, 1.2배 이상, 1.3배 이상, 1.4배 이상. 1.5배 이상. 1.6배 이상. 1.7배 이상, 1.8배 이상, 1.9배 이상, 또는 2배 이상 높음;
항산화능 (예컨대, Total antioxidant capacity (TAC) assay에 의하여 측정되거나 Real time quantitative PCR로 측정된 항산화인자의 mRNA 수준) 이 1.1배 이상, 1.2배 이상, 1.3배 이상, 1.4배 이상. 1.5배 이상. 1.6배 이상. 1.7배 이상, 1.8배 이상, 1.9배 이상, 또는 2배 이상 높음;
염증인자 수준 (예컨대, Real time quantitative PCR로 측정된 mRNA 수준)이 90% 이하, 80% 이하, 70% 이하, 60% 이하, 50% 이하, 40% 이하 또는 30% 이하로 낮음 (비교군 100% 대비);
항염증인자 수준(예컨대, Real time quantitative PCR로 측정된 mRNA 수준)이 1.1배 이상, 1.2배 이상, 1.3배 이상, 1.4배 이상. 1.5배 이상. 1.6배 이상. 1.7배 이상, 1.8배 이상, 1.9배 이상, 또는 2배 이상 높음;
항스트레스인자 수준(예컨대, Real time quantitative PCR로 측정된 mRNA 수준)이 1.1배 이상, 1.2배 이상, 1.3배 이상, 1.4배 이상. 1.5배 이상. 1.6배 이상. 1.7배 이상, 1.8배 이상, 1.9배 이상, 또는 2배 이상 높음;
호밍(homing) 인자 수준(예컨대, Real time quantitative PCR로 측정된 mRNA 수준)이 1.1배 이상, 1.2배 이상, 1.3배 이상, 1.4배 이상. 1.5배 이상. 1.6배 이상. 1.7배 이상, 1.8배 이상, 1.9배 이상, 또는 2배 이상 높음;
성장인자 수준(예컨대, Real time quantitative PCR로 측정된 mRNA 수준)이 1.1배 이상, 1.2배 이상, 1.3배 이상, 1.4배 이상. 1.5배 이상. 1.6배 이상. 1.7배 이상, 1.8배 이상, 1.9배 이상, 또는 2배 이상 높음; 및
다분화능인자 수준(예컨대, Real time quantitative PCR로 측정된 mRNA 수준)이 1.2배 이상, 1.3배 이상, 1.4배 이상. 1.5배 이상. 1.6배 이상. 1.7배 이상, 1.8배 이상, 1.9배 이상, 2배 이상, 2.2배 이상, 2.4배 이상, 2.5배 이상, 2.7배 이상, 또는 3배 이상 높음.
특히, 상기 HSP 또는 HIF 활성화된 줄기세포는, 동결 처리된 후 사용 전 해동된 경우, HSP 활성화 (고온 배양) 또는 HIF 활성화(저산소 배양) 되지 않고 (예컨대, 20% O2, 5% CO2, 및 37℃의 조건에서 배양됨) 동결 처리된 후 사용 전 해동된 동종 줄기세포와 비교하여, 하기의 특징 중 하나 이상을 갖는 것일 수 있다:
세포 생존률 동등 이상, 예컨대, 동등하거나, 1% 이상, 2% 이상, 3% 이상, 4% 이상, 또는 5% 이상 높음;
배양 2일째부터의 세포 증식성이 1.1배 이상, 1.2배 이상, 1.3배 이상, 1.4배 이상. 1.5배 이상. 1.6배 이상. 1.7배 이상, 1.8배 이상, 1.9배 이상, 또는 2배 이상 높음;
항산화능 (예컨대, Total antioxidant capacity (TAC) assay에 의하여 측정되거나 Real time quantitative PCR로 측정된 항산화인자의 mRNA 수준) 이 1.1배 이상, 1.2배 이상, 1.3배 이상, 1.4배 이상. 1.5배 이상. 1.6배 이상. 1.7배 이상, 1.8배 이상, 1.9배 이상, 또는 2배 이상 높음;
염증인자 수준 (예컨대, Real time quantitative PCR로 측정된 mRNA 수준)이 90% 이하, 80% 이하, 70% 이하, 60% 이하, 50% 이하, 40% 이하 또는 30% 이하로 낮음 (비교군 100% 대비);
항염증인자 수준(예컨대, Real time quantitative PCR로 측정된 mRNA 수준)이 1.1배 이상, 1.2배 이상, 1.3배 이상, 1.4배 이상. 1.5배 이상. 1.6배 이상. 1.7배 이상, 1.8배 이상, 1.9배 이상, 또는 2배 이상 높음;
항스트레스인자 수준(예컨대, Real time quantitative PCR로 측정된 mRNA 수준)이 1.1배 이상, 1.2배 이상, 1.3배 이상, 1.4배 이상. 1.5배 이상. 1.6배 이상. 1.7배 이상, 1.8배 이상, 1.9배 이상, 또는 2배 이상 높음;
호밍(homing) 인자 수준(예컨대, Real time quantitative PCR로 측정된 mRNA 수준)이 1.1배 이상, 1.2배 이상, 1.3배 이상, 1.4배 이상. 1.5배 이상. 1.6배 이상. 1.7배 이상, 1.8배 이상, 1.9배 이상, 또는 2배 이상 높음;
성장인자 수준(예컨대, Real time quantitative PCR로 측정된 mRNA 수준)이 1.1배 이상, 1.2배 이상, 1.3배 이상, 1.4배 이상. 1.5배 이상. 1.6배 이상. 1.7배 이상, 1.8배 이상, 1.9배 이상, 또는 2배 이상 높음; 및
다분화능인자 수준(예컨대, Real time quantitative PCR로 측정된 mRNA 수준)이 1.2배 이상, 1.3배 이상, 1.4배 이상. 1.5배 이상. 1.6배 이상. 1.7배 이상, 1.8배 이상, 1.9배 이상, 2배 이상, 2.2배 이상, 2.4배 이상, 2.5배 이상, 2.7배 이상, 또는 3배 이상 높음.
상기 염증인자는, 예컨대, COX-2, TNF-alpha, IL-6 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있고, 상기 항스트레스인자는, 예컨대, HSP 70, HSP 27 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으며, 상기 호밍 인자는, 예컨대, CXCL-12, MCP-3 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있고, 상기 항산화인자는, 예컨대, HMOX-1, SOD 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으며, 상기 항염증인자는, 예컨대, IL-10, HGF 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있고, 상기 성장인자는 예컨대, PDGF, BDNF 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으며, 상기 다분화능인자는, 예컨대, SOX2, NANOG 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기와 같은 줄기세포 특성은 줄기세포의 동결 (통상적인 동결 방법 (예컨대, -100 내지 -60℃, -90 내지 -70℃, 또는 약 -80℃에서 12시간 내지 36시간, 18시간 내지 30시간, 또는 약 24시간 동결) 및/또는 동결제에 부유)된 세포의 경우에도 유지 및/또는 달성될 수 있는 것을 특징으로 한다. 따라서, 본 명세서에서 제공되는 줄기세포는 내동성을 갖는다.
본 명세서에서, 용어 '줄기세포'는 성체 줄기세포(adult stem cells), 배아 줄기세포(embryonic stem cells), 유도 만능줄기세포(induced pluripotent stem cells; iPS cells), 전발생세포 (progenitor cells) 등으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상일 수 있다.
상기 배아줄기세포(embryonic stem cells)는 수정란에서 유래하는 줄기세포로서, 모든 조직의 세포로 분화할 수 있는 특성을 갖는 줄기세포이다. 상기 유도만능줄기세포(induced pluripotent stem cells; iPS cells) 는 역분화 줄기세포라고도 불리며, 분화가 끝난 체세포에 세포 분화 관련 유전자를 주입하여 분화 이전의 세포 단계로 되돌림으로써, 배아줄기세포처럼 만능성을 유도해 낸 세포를 의미한다. 상기 전발생세포(progenitor cells)는 줄기세포와 유사하게 특정 유형의 세포로 분화할 수 있는 능력을 갖지만, 줄기세포보다 특이적이고 표적화되어 있으며, 줄기세포와 달리 분열 횟수가 유한하다. 상기 전발생 세포는 중간엽 유래의 전발생세포일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 명세서에서 전발생세포는 줄기세포 범주에 포함되며, 특별한 언급이 없는 한, '줄기세포'는 전발생세포도 포함하는 개념으로 해석된다. 상기 성체줄기세포(adult stem cell)는 제대(탯줄), 제대혈(탯줄혈액) 또는 (성인의) 골수, 혈액, 신경, 피부, 지방 등에서 추출한 줄기세포로, 구체적 장기의 세포로 분화되기 직전의 원시세포를 의미한다. 상기 성체줄기세포는 조혈모세포 (hematopoietic stem cell), 중간엽줄기세포(mesenchymal stem cell), 신경줄기세포(neural stem cell) 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다. 성체줄기세포는 증식이 어렵고 쉽게 분화되는 경향이 강한 대신에 여러 종류의 성체줄기세포를 사용하여 실제 의학에서 필요로 하는 다양한 장기 재생을 할 수 있을 뿐 아니라 이식된 후 각 장기의 특성에 맞게 분화할 수 있는 특성을 지니고 있어서, 난치병/불치병 치료에 유리하게 적용될 수 있다.
일 예에서, 상기 줄기세포는 성체줄기세포일 수 있으며, 예컨대, 중간엽줄기세포(mesenchymal stem cell; MSC)일 수 있다. 중간엽줄기세포는 중간엽기질세포(mesenchymal stromal cell; MSC)라고도 불리며, 골모세포(osteoblasts), 연골모세포(chondrocytes), 근육세포 (myocytes), 지방세포(adipocytes) 등과 같은 다양한 형태의 세포로 분화할 수 있는 다능성 세포(multipotent stromal cell)를 의미한다. 중간엽줄기세포는 지방 조직 (adipose tissue), 태반 (placenta), 제대(umbilical cord), 제대혈(umbilical cord blood), 성체 근육(adult muscle), 각막 기질(corneal stroma), 젖니의 치아 속질(dental pulp) 등과 같은 비골수 조직(non-marrow tissues) 등으로부터 유래하는 다능성 세포들 중에서 선택된 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 줄기세포는 인간, 개, 고양이, 말, 마우스 등의 포유류에서 선택된 동물에서 분리된 줄기세포일 수 있다.
상기 줄기세포는 신경 재생, 신경 손상 또는 신경 손상 관련 질병의 예방 및/또는 치료, 염증 억제, 염증 또는 염증 관련 질병의 예방 및/또는 치료, 및/또는 항산화 효과를 갖는 것일 수 있다.
이에, 다른 예는 상기 줄기세포를 포함하는 세포 치료제를 제공한다. 상기 세포 치료제는 신경 재생, 신경 손상 또는 신경 손상 관련 질병의 예방 및/또는 치료, 염증 억제, 염증 또는 염증 관련 질병의 예방 및/또는 치료, 및/또는 항산화 효과를 갖는 것일 수 있다. 따라서, 일 예는 상기 줄기세포를 포함하는, 신경 재생, 신경 손상 또는 신경 손상 관련 질병의 예방 및/또는 치료, 염증 억제, 염증 또는 염증 관련 질병의 예방 및/또는 치료, 및/또는 항산화용 약학 조성물을 제공한다.
다른 예는 상기 줄기세포를 신경 재생, 신경 손상, 또는 신경 손상 관련 질병의 예방 및/또는 치료, 염증 억제, 염증, 또는 염증 관련 질병의 예방 및/또는 치료, 및/또는 항산화를 필요로 하는 대상에 투여하는 단계를 포함하는, 신경 재생, 신경 손상, 또는 신경 손상 관련 질병의 예방 및/또는 치료, 염증 억제, 염증, 또는 염증 관련 질병의 예방 및/또는 치료, 및/또는 항산화 방법을 제공한다.
상기 신경은 척수일 수 있다. 상기 신경 (예컨대, 척수) 손상은 산화 및/또는 염증에 의한 손상일 수 있다. 상기 신경 손상 관련 질병은 신경 (예컨대, 척수) 손상에 의하여 유발되는 질병, 예컨대, 마비, 디스크 탈출증, 중추신경 타박 등일 수 있다.
상기 투여 대상은 인간, 개, 고양이, 말, 마우스 등의 포유류에서 선택되는 동물, 예컨대, 신경 재생, 신경 손상 또는 신경 손상 관련 질병의 예방 및/또는 치료, 염증 억제, 염증 또는 염증 관련 질병의 예방 및/또는 치료, 또는 항산화를 필요로 하는 동물 등일 수 있다.
상기 약학 조성물은, 유효성분인 줄기세포를 약학적 및/또는 치료적 유효량으로 포함하는 것일 수 있으며, 상기 줄기세포에 더하여, 약학적으로 허용 가능한 담체를 추가로 포함할 수 있다. 상기 담체는 핵산을 포함하는 약물의 제제화에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 식염수, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘, 미네랄 오일 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 약학 조성물은 또한 약학 조성물 제조에 통상적으로 사용되는 희석제, 부형제, 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 추가로 포함할 수 있다.
줄기세포를 이용한 세포치료가 성공하기 위해서는 줄기세포가 가진 기능적 특성들이 잘 유지되거나 특정 기능이 강화되어야 목적하는 효과를 최대한 발휘할 수 있다. 본 명세서에서 제공되는 줄기세포는, 기존의 지방유래 줄기세포보다 HSP가 활성화되고, 이에 의하여 항산화, 항염 기능의 증가뿐 만 아니라 동결에 의한 기능저하도 억제할 수 있음을 확인하였다. 　
특히, 급성척수손상에서와 같이 1차적인 물리적 손상뿐만 아니라 이차적인 산화손상에 의한 정상신경 조직으로의 손상의 파급이 문제되는 질환에서 기존의 줄기세포보다 항산화 기능이 강화된 본 명세서에서 제공되는 줄기세포는 보다 가치가 있을 것으로 기대된다.　　　
도 1은 일 실시예에 따른 HIF 활성화 줄기세포, HSP 활성화 줄기세포, 및 HIF와 HSP 활성화 줄기세포의 생존률을 보여주는 그래프이다.
도 2는 일 실시예에 따른 HIF 활성화 줄기세포, HSP 활성화 줄기세포, 및 HIF와 HSP 활성화 병행 줄기세포의 증식성을 보여주는 그래프이다.
도 3은 일 실시예에 따른 HIF 활성화 줄기세포, HSP 활성화 줄기세포, 및 HIF와 HSP 활성화 병행 줄기세포의 항산화능을 보여주는 그래프이다.
도 4는 일 실시예에 따른 HIF 활성화 세포군, HSP 활성화 세포군, 및 HIF와 HSP 활성화 병행 세포군의 HSP-70 및 HSP-27의 mRNA 발현량을 보여주는 그래프이다.
도 5는 일 실시예에 따른 HIF 활성화 세포군, HSP 활성화 세포군, 및 HIF와 HSP 활성화 병행 세포군의 HO-1 및 HGF의 mRNA 발현량을 보여주는 그래프이다.
도 6은 일 실시예에 따른 HIF 활성화 세포군, HSP 활성화 세포군, 및 HIF와 HSP 활성화 병행 세포군의 VEGF mRNA 발현량을 보여주는 그래프이다.
도 7은 일 실시예에 따른 HIF 활성화 세포군, HSP 활성화 세포군, 및 HIF와 HSP 활성화 병행 세포군의 SOX-2와 OCT-4 mRNA 발현량을 보여주는 그래프이다.
도 8은 동결제 종류에 따른 HSP활성화 줄기세포의 생존성을 보여주는 그래프이다.
도 9는 동결제 종류에 따른 HSP활성화 줄기세포의 증식성을 보여주는 그래프이다.
도 10은 동결제 종류에 따른 HSP활성화 줄기세포의 항산화능을 보여주는 그래프이다.
도 11은 동결제 종류에 따른 HSP 활성화 줄기세포의 SOD-1 및 HO-1의 mRNA 발현량을 보여주는 그래프이다.
도 12는 동결제 종류에 따른 HSP 활성화 줄기세포의 HSP 27 및 HSP 70의　mRNA 발현량을 보여주는 그래프이다.
도 13은 동결제 종류에 따른 HSP 활성화 줄기세포의 염증인자 COX-2, TNF-alpha, 및 IL-6의 mRNA 발현량을 보여주는 그래프이다.
도 14는 동결제 종류에 따른 HSP 활성화 줄기세포의 항염증인자 IL-10 및 HGF의 mRNA 발현량을 보여주는 그래프이다.
도 15는 동결제 종류에 따른 HSP 활성화 줄기세포의 homing 인자 CXCL-12 및 MCP-3의 mRNA 발현량을 보여주는 그래프이다.
도 16은 동결제 종류에 따른 HSP 활성화 줄기세포의 성장인자 PDGF, VEGF, 및 BDNF 의 mRNA 발현량을 보여주는 그래프이다.
도 17은 동결제 종류에 따른 HSP 활성화 줄기세포의 다분화능인자 SOX-2, OCT-4, 및 NANOG 들의 mRNA 발현량을 보여주는 그래프이다.
도 18a는 일 실시예에서 밸룬 압박으로 척수 손상이 유발되어 후지 완전마비를 일으키는 동물모델의 척추체의 투시 영상 (좌) 및 전산화 단층 촬영 영상 (우)이다.
도 18b는 척수손상 모델에서의 줄기세포 처리에 따른 후지기능 회복 정도를 cBBB 점수로 보여주는 그래프이다.
도 19는 척수손상 모델에서의 줄기세포 처리에 따른 척수 손상 정도를 정량화하여 보여주는 그래프이다.
도 20은 척수손상 모델에서의 줄기세포 처리에 따른 척수 손상부의 섬유화 정도를 보여주는 H&E 염색 결과이다.
도 21은 척수손상 모델에 줄기세포 이식 4주째 손상척수에서의 MSCs의 분포를 보여주는 형광 이미지이다.
도 22는 척수손상 모델에 줄기세포 이식 4주째 손상척수에서의 신경세포의 분포를 보여주는 형광 이미지이다.
이하 본 발명을 다음의 실시예에 의하여 보다 구체적으로 설명하고자 한다. 그러나 이들은 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐이며, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의하여 제한되는 것은 아니다.
실시예 1. 내동성이 강한 줄기세포 선정
1.1. 시험 세포의 준비
개 지방유래 줄기세포 (canine adipose derived mesenchymal stromal cells)는 2세령의 비글견 수컷의 둔부에서 채취한 지방에서 분리 및 배양하여 줄기세포 항원 마커 및 분화시험을 거친 3계대의 세포를 열충격 단백질 (heat shock protein; HSP) 활성화 처리(43℃, 5%CO2 부란기에 1시간 배양)한 후, 37℃에 3시간 두었다가 동결시킨 세포를 실험에 사용하였다.
1.2. 내동성이 강한 줄기세포 선정을 위한 전처리
가) HSP 및　HIF (Hypoxia induced protein)의 활성화 처리
상기 실시예 1에서 준비된 줄기세포를 20% O2, 5% CO2, 및 37℃의 조건에서 배양하고, 다음과 같이 HSP 활성화, HIF 활성화, 또는 이들 모두를 수행하였다:
HIF 활성화 처리
상기 실시예 1에서 준비된 3계대 지방유래 중간엽줄기세포 (1x105)를 저 산소 농도배양기 (5% O2, 5% CO2, 37℃)에서 배양한 후, 배양 용기(150mm 배양 플레이트)의 90% 충만되면 다음 실험에 이용하였다.
상기 배양은 10% FBS and 1% penicillin 및 streptomycin (PS, 10000 U/mL, GIBCO)를 포함하는 DMEM (low glucose pyruvate, GIBCO BRL, Grand Island, NY, USA) 배지에서 수행하였으며, 24시간 후, 세포를 PBS로 세척하여 조직 잔해와 부유 세포를 제거하고, 90% confluence가 될 때까지 48시간마다 배지를 신선한 배지로 교체해주었다. Confluent cells을 계대배양하거나 냉동 보존하였다. 이와 같이 얻어진 지방유래 중간엽줄기세포를 이후 시험에 사용하였다.
HSP 활성화 처리
상기 실시예 1에서 준비된 3계대 지방유래 중간엽줄기세포 (1x105)를 20% O2, 5% CO2, 37℃에서 배양 용기(150mm 배양 플레이트)의 90% 충만될 때까지 배양한 후, 기존 배양온도보다 높은 온도 (20% O2, 5% CO2, 43℃) 부란기에서 1시간 배양한 후,　20% O2, 5% CO2, 37℃ 부란기로 옮겨 3시간 배양 후 다음 실험에 이용하였다. 사용된 배양 배지는 앞서 설명한 바와 같다.
HIF 활성화와 HSP 활성화 병행 처리
상기 실시예 1에서 준비된 3계대 지방유래 중간엽줄기세포 (1x105)를 저 산소 농도 (5% O2, 5% CO2, 37℃)에서 배양하여 배양 용기(150mm 배양 플레이트)의 90% 충만되면 기존 배양온도보다 높은 온도 (5% O2, 5% CO2,43℃) 부란기에서 1시간 배양한 후, 5% O2, 5% CO2, 37℃ 부란기로 옮겨 3시간 배양 후 다음 실험에 이용하였다. 사용된 배양 배지는 앞서 설명한 바와 같다.
나)　세포 수거 방법
상기 준비된 150mm 배양플레이트에 PBS를 10ml씩 주입하여 2회 세척한 후, 0.05% trypsin-EDTA (Sigma- Aldrich, Saint Louis, USA)로 37℃, 5% CO2 부란기에서 15분간 처리하고, 내용물을 회수하였다. 그 후, 4℃에서 2,500rpm으로 5분간 원심분리 후, 상층액은 버리고, 줄기세포를 수거하여 실험에 사용하였다.
1.3. 세포의 생존성 및 증식성 측정
Tryphan blue exclusion assay (Gibco),　MTS assay 키트, 및 automatic cell counter (Countess II FL Automated Cell Counter, Thermo Fisher scientific)를 이용하여, HIF 및 HSP 활성화 처리 후의 세포 생존성, 증식성 및 기타 특성을 확인하였다. 대조군으로 상기 활성화 처리가 되지 않은 무처치 MSC를 사용하였다.
상기 얻어진 3계대 배양 HIF 활성화 줄기세포, HSP 활성화 줄기세포, 및 HIF와 HSP 활성화 줄기세포의 생존률을 측정하여, 도 1에 나타내었다. 도 1에 나타난 바와 같이, 시험된 모든 군에서 3계대 배양 세포의 생존성이 90% 이상으로 확인되었다.
상기 얻어진 HIF 활성화 줄기세포, HSP 활성화 줄기세포, 및 HIF와 HSP 활성화 병행 줄기세포의 증식성 측정 결과를 도 2에 나타내었다. 도 2에 나타난 바와 같이, HIF와 HSP 각각 단독 활성화한 세포군이 이들을 병행 활성화한 세포군 또는 무처치 세포군보다 배양 3일째 생존성이 유의적으로 높게 나타났다.
1.4. 항산화능 분석
Total antioxidant capacity (TAC) assay kit (Sigma-Aldrich, CS0790)를 사용하여, 상기 준비된 세포의 항산화능을 측정하였다.
상기 얻어진 결과를 도 3에 나타내었다. 도 3에 나타난 바와 같이, HSP 활성화 세포군이 다른 군들보다 유의적으로 높게 나타났다.
1.5. 특성 확인
Real time quantitative PCR을 이용하여 사이토카인, 성장인자 및 stemness인자의 활성도를 측정하였다. 　
본 실시예에서의 Quantitative Real-Time PCR에 사용된 프라이머를 아래의 표 1에 정리하였다:
Genes Primer Sequence (5'→3')
Forward Reverse
GAPDH CATTGCCCTCAATGACCACT (서열번호 1) TCCTTGGAGGCCATGTAGAC(서열번호 19)
VEGF CTATGGCAGGAGGAGAGCAC(서열번호 2) GCTGCAGGAAACTCATCTCC(서열번호 20)
PDGF CCCTGAGGGATGGTACTGAA(서열번호 3) GCAATGAGCACCGTACGTAGT(서열번호 21)
BDNF GCTGGCGGTTCATAAGGATA(서열번호 4) GTTTCCCTTCTGGTCATGGA(서열번호 22)
CXCL-12 GTGGCGGCCGCTCGAGATGAACGCCAAGGTCGCC(서열번호 5) GCCCTCTAGACTCGAGTTACTTGTTTAGAGCTTTCTCC(서열번호 23)
MCP-3 GTGGCGGCCGCTCGAGATGAAGGTCTCCGCAGCG(서열번호 6) GCCCTCTAGACTCGAGTCACAGCTTTGGGGCTTGGG(서열번호 24)
IL-10 CCTGGGAGAGAAGCTCAAGA(서열번호 7) TGTTCTCCAGCACGTTTCAG(서열번호 25)
HGF ATGGGGAATGAGAATGCAG(서열번호 8) GACAAAAATGCCAGGACGAT(서열번호 26)
IL-6 TTTTCTGCCAGTGCCTCTTT(서열번호 9) GGCTACTGCTTTCCCTACCC(서열번호 27)
COX2 ACCCGCCATTATCCTAATCC　(서열번호 10) TCGGAGTTCTCCTGGCTTTA　(서열번호 28)
TNF-α ACCACACTCTTCTGCCTGCT(서열번호 11) TGGAGCTGACAGACAACCAG(서열번호 29)
SOD AGTGGGCCTGTTGTGGTATC(서열번호 12) AGTCACATTGCCCAGGTCTC(서열번호 30)
HO-1 GCGTCGACTTCTTCACCTTC(서열번호 13) GGTCCTCAGTGTCCTTGCTC(서열번호 31)
HSP-70 CAAGATCACCATCACCAACG(서열번호 14) TCCAGCACCTTCTTCTTGTC(서열번호 32)
HSP-27 TAACTGGCAAGCACGAAGAG(서열번호 15) TCGAAGGTGACGGGAATAGT(서열번호 33)
Nanog　 CCTGCATCCTTGCCAATGTC(서열번호 16) TCCGGGCTGTCCTGAGTAAG(서열번호 34)
OCT-4 GTCACCACTCTGGGCTCTCC(서열번호 17) TCCCCGAAACTCCCTGCCTC(서열번호 35)
Sox-2 GTCCAGCACTACCAGAGCG(서열번호 18) CTTACTCTCCTCCCATTTCC(서열번호 36)
(GAPDH, Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase; VEGF, Vascular endothelial growth factor;　 PDGF, Platelete derived growth factor; BDNF, Brain derived neurotrophic factor; CXCL-12, Stromal cell derived growth factor 1; MCP-3, Monocyte chemotactic protein-3; IL-10, Interleukin-10; HGF, Hepatocyte growth factor; IL-6, Interleukin-6; COX2, Cyclooxygenase-2; TNF-α, Tumor necrosis factor-alpha; SOD, Superoxide dismutase-1;　 HO-1, Heme oxygenase-1; HSP-70, Heat shock protein 70; HSP-27, Heat shock protein-27; OCT-4, Octamer-binding transcription factor 4 ; Sox-2, SRY-box 2)상기와 같이 측정된 HIF 활성화 세포군, HSP 활성화 세포군, 및 HIF와 HSP 활성화 병행 세포군의 HSP-70 및 HSP-27의 mRNA 발현량 결과를 도 4에, HO-1 및 HGF의 mRNA 발현량을 도 5에, VEGF mRNA 발현량을 도 6에, SOX-2와 OCT-4 mRNA 발현량을 도 7에 각각 나타내었다. 도 4 내지 도 7에 나타난 바와 같이, 대부분의 시험된 세포군에서 HSP-70, HSP-27, HO-1, HGF, VEGF, SOX-2, 및 OCT-4의 발현량이 증가하였다. 보다 구체적으로, HSP 활성화 세포군의 경우, 시험된 모든 인자 (HSP-70, HSP-27, HO-1, HGF, VEGF, SOX-2, 및 OCT-4)의 발현량이 유의미한 정도로 현저히 증가하였으며, HIF 활성화 세포군의 경우, 특히 HGF, VEGF, SOX-2, 및 OCT-4의 발현량이 유의미한 정도로 현저히 증가하였다.
상기 결과들은 HIF와 HSP를 동시에 활성화시킨 경우와 비교하여, HIF와 HSP를 단독으로 활성화시킨 경우에 보다 우수한 기능적 특성을 가짐을 보여준다.
1.6. HSP 활성화 줄기세포의 동결제 종류에 따른 세포 생존성 , 증식성, 항산화성 및 특성 측정
상기 실시예 1.2에서 준비된 세포를 사용하여, 실시예 1.3 내지 1.5의 과정을 참조하여, HSP 활성화 세포군에 대하여 동결제 종류를 달리하여 세포의 생존성 및 증식성 및 특성을 시험하였다. 대조군으로 상기 활성화 처리가 되지 않은 무처치 MSC(무처치군)를 사용하였다.
상기 실시예 1.2에서 준비된 줄기세포를 다음의 조성을 갖는 냉동액(동결제)의 어느 하나에 부유시켜 냉동하였다
I. DMSO (Dimethyl sulfoxide) 10%(w/v) + FBS (Fetal Bovine Serum) 40%(w/v)
II. DMSO 1%(w/v) + FBS 10%(w/v)
III. DMSO 1%(w/v).
그 후, cryovial (1.2 ml, Sigma-Aldrich, Saint Louis, USA)에 옮겨 4℃ 냉장고에 10분간, 그 후　 -80℃에서 24시간 두어, 분당 1℃씩 감온되도록 한 후, -150℃에서 1주간 보관하였다.
해동은 동결 바이알을 37℃ 수조에 넣어 급속적으로 하였으며 PBS로 3호 세정후 다음 실험에 사용하였다.
동결제 종류에 따른 HSP활성화 줄기세포의 생존성을 측정하여 도 8에 나타내었다. 도 8에 나타난 바와 같이, 동일한 동결제를 사용한 군 간 비교 결과, HSP 활성화 줄기세포가 무처치군보다 생존성이 유의적으로 높았다.
동결제 종류에 따른 HSP활성화 줄기세포의 증식성을 측정하여 도 9에 나타내었다. 도 9에 나타난 바와 같이, HSP 활성화 줄기세포는 DMSO 10%와 FBS 40% 동결제로 동결하였을 때, 다른 동결제를 사용한 경우 및 무처치군과 비교하여, 24시간 이후 유의적으로 증식성이 높게 나타났다.
동결제 종류에 따른 HSP활성화 줄기세포의 항산화능을 측정하여, 도 10에 나타내었다. 도 10에 나타난 바와 같이, HSP활성화 줄기세포에서 DMSO 10%와 FBS 40% 동결제로 동결하였을 때, 다른 동결제를 사용한 경우 및 무처치군과 비교하여, 항산화능이 유의적으로 높게 나타났다.
동결제 종류에 따른 HSP 활성화 줄기세포의 SOD-1 및 HO-1의 mRNA 발현량을 측정하여, 도 11에 나타내었다. HSP 처리군에서 DMSO 10%와 FBS 40% 동결제로 동결하였을 때, 다른 동결제를 사용한 경우 및 무처치군과 비교하여, SOD-1 및 HO-1 mRNA 발현량이 유의적으로 높게 나타났다.
동결제 종류에 따른 HSP 활성화 줄기세포의 HSP 27 및 HSP 70의　mRNA 발현량을 측정하여, 도 12에 나타내었다. HSP 처리군에서 DMSO 10%와 FBS 40% 동결제로 동결하였을 때, 다른 동결제를 사용한 경우 및 무처치군과 비교하여, HSP 27 및 HSP 70의 발현량이 유의적으로 높게 나타났으며, 특히 HSP 70의 발현량이 월등히 높게 나타났다.
동결제 종류에 따른 HSP 활성화 줄기세포의 염증인자 COX-2, TNF-alpha, 및 IL-6의 mRNA 발현량을 측정하여, 도 13에 나타내었다. HSP활성화 줄기세포에서, DMSO 10%+FBS 40% 동결제로 동결하였을 때, 다른 동결제를 사용한 경우와 비교하여, 염증인자인 COX-2, TNF-alpha, 및 IL-6의 발현량이 유의적으로 낮게 나타났다.　
동결제 종류에 따른 HSP 활성화 줄기세포의 항염증인자 IL-10 및 HGF의 mRNA 발현량을 측정하여, 도 14에 나타내었다. HSP활성화 줄기세포에서 DMSO 10%+FBS 40%를 동결제로 동결하였을 때, HSP활성화 줄기세포를 다른 동결제로 동결한 경우 및 HSP 무처치군과 비교하여, IL-10 및 HGF의 발현량이 높제 나타났다.
동결제 종류에 따른 HSP 활성화 줄기세포의 homing 인자 CXCL-12 및 MCP-3의 mRNA 발현량을 측정하여, 도 15에 나타내었다. HSP활성화 줄기세포에서 DMSO 10%+FBS 40%를 동결제로 동결하였을 때, 동일한 동결제를 사용한 무처치군과 비교하여, CXCL-12와 MCP-3 발현량이 유의적으로 높았다.
동결제 종류에 따른 HSP 활성화 줄기세포의 성장인자 PDGF, VEGF, 및 BDNF 의 mRNA 발현량을 측정하여, 도 16에 나타내었다. HSP 활성화 줄기세포에서, DMSO 10%+FBS 40%를 동결제로 동결하였을 때, 다른 동결제를 사용한 HSP 활성화 줄기세포 및 무처치군과 비교하여, PDGF 및 BDNF 발현량이 유의적으로 높았다. VEGF 발현량은 HSP 활성화 줄기세포에서, 무처치군과 비교하여 높게 나타났으며, 동결제 종류에 따른 차이는 크지 않았다.
동결제 종류에 따른 HSP 활성화 줄기세포의 다분화능인자 SOX-2, OCT-4, 및 NANOG 들의 mRNA 발현량을 측정하여, 도 17에 나타내었다. HSP 활성화 줄기세포에서, DMSO 10%+FBS 40%를 동결제로 동결하였을 때, 다른 동결제를 사용한 HSP활성화 줄기세포 및 무처치군과 비교하여, SOX-2 및 NANOG 발현량이 유의적으로 높았다. OCT-4 발현량은 HSP 활성화 줄기세포 간 동결제 종류에 따른 발현량의 차이는 크지 않았다.
상기 결과에서 확인되는 바와 같이, HSP 활성화 처리된 지방유래 중간엽줄기 세포가 활성화 처리되지 않은 세포보다 동결 해동 후의 생존성이 유의적으로 높았다.　 HSP 활성화 세포의 동결제로 DMSO 10%+FBS 40%를 사용한 경우 다른 동결제 사용군 및 무처치군과 비교하여, 24시간 이후 증식성이 유의적으로 높게 나타났다. 또한, HSP 활성화 줄기세포는 동결 및 해동 후 항스트레스인자의 증가 (HSP 70, HSP 27), homing인자의 증가 (CXCL-12, MCP-3), 항산화인자의 증가 (HMOX-1, SOD), 항염증인자의 증가 (IL-10, HGF), 염증인자의 감소 (COX-2, TNF-alpha, IL-6), 성장인자의 증가 (PDGF, BDNF), 다분화능인자의 증가 (SOX2, NANOG)를 보였다. 이상의 결과를 종합하면 HSP 활성화 지방유래 중간엽줄기 세포를 DMSO 10%+FBS 40%의 동결제로 동결한 경우 생존성과 기능이 개선된 동결 줄기세포 제작이 가능함이 제안된다.
실시예 2. 척수손상 모델 개에 대한 줄기세포 효과시험
2.1. 실험동물의 준비
척수손상에 대한 줄기세포의 효과를 알아보기 위하여, 건강한 2-3세, 체중 12-15 kg의 비글 성견 수컷 12마리를 서울대학교 실험동물윤리위원회 (IACUC)의 승인(SNU-181214-3)을 받아 아래와 같이 배치하였다.
　
2.2. 시험 과정
상기 준비된 동물에 대하여 하기 실시예 2.3의 방법으로 척수손상을 유발시킨 후, 무작위로 아래와 같이 배치하였다 (이하, 용어 '신선'은 동결되지 않은 것을 의미함):　
(i) 신선 MSCs군　(무처리 MSC 투여군) 4마리　　
(ii) 신선 HSP-MSCs군　(HSP 활성화 MSC 투여군) 4마리
(iii) 동결 HSP-MSCs군　(HSP 활성화 및 동결된 MSC 투여군) 4마리
(iv) 동결 HSP HO1 MSCs군　(HSP 활성화 및 동결된 HO1 과발현 MSC 투여군) 4마리.
상기 HSP 활성화 및 동결된 HO1 과발현 MSC는 등록특허 제10-1870238호의 실시예 1을 참조하여 다음의 과정으로 제작된 HO1 과발현 MSC을 실시예 1.2에 기재된 HSP 활성화 처리 및 실시예 1.6의 동결 처리한 줄기세포이다:
HEK293T 세포 (Thermo Scientific Waltham, MA, 미국)를 10% FBS와 1% 페니실린/스트렙토마이신을 포함하는 DMEM에서 37℃ 및 5% CO2 조건 하에서 배양하였다. 트랜스펙션 24시간 전에, 4x106개의 HEK293T 세포를 100mm dish에 접종하였다. 다음날, TurboFect (Thermo Scientific, Waltham, MA, 미국)를 사용하여, 바이러스 단백질 Gag-Pol, Rev, 및 VSV-G를 암호화하는 Lentiviral packaging mix (System Biosciences, San Diego, CA, 미국) 20ul와 상기 실시예 1.2에서 제작된 lentiviral expression vector 2 ug 을 상기 준비된 HEK293T 세포 (렌티바이러스 생산용 세포)에 트랜스펙션시켰다. 초록 형광 단백질 (green fluorescent protein; GFP)로 표지된 HO-1 유전자 (cDNA:NM_001194969.1)가 클로닝된lentiviral expression vector가 도입 및 발현된 바이러스 입자들은 수집하고, 세포 계대 1의 개의 지방조직 유래 중간엽줄기세포 (Canine adipose tissue-derived MSCs (cADMSCs)에 형질도입하였다. cADMSCs가 90%의 confluence에 도달한 후에, 퓨로마이신 (3 ug/ml, Gibco-BRL)을 사용하여 성공적으로 형질도입된 세포 선별을 수행하였다. 퓨로마이신 선별 결과 대략 40%의 세포들이 성공적으로 형질도입된 것으로 확인되었다. 이와 같은 과정으로 외래 HO-1 유전자가 도입된 (즉, HO-1을 과발현하는) 재조합 cADMSCs(HO-1 MSC)를 준비하였다.
　　　　
2.3. 척수손상 유발
상기 준비된 동물을 전신 마취하고, 요추 4번 좌측 편측추궁절제술로 창을 내고 척수강에 밸륜카테터 (8Fr.)를 삽입하여 흉추 1번까지 이동시킨 후, 조영제 (The SCI was induced by the balloon compression method under general anesthesia18. A mini hemi-laminectomy was performed by creating 3-5 mm hole at the fourth lumbar vertebral arch (L4) using a high-speed pneumatic burr. A 6 Fr embolectomy catheter (Sorin, Biomedica, Salugia, VC, Italy) was inserted and advanced to the cranial margin of the first lumbar vertebra (L1), using fluoroscopic guidance. The balloon was distended with contrast agent (Omnipaque, Amersham Health, Carrington Hill, Ireland) diluted in normal saline (50:50) at a dose rate of 50 ml/kg body weight. The catheter was removed after 12 h.)를　50ul/kg 용량으로 주입하여 밸룬을 척추체의 80% 정도까지 부풀렸다.　 밸룬에 의한 척수압박 6시간 후 카테터를 제거하였다.
그 후, 상기 척추체를 투시로 촬영하여 얻어진 영상을 도 18a 좌측에 나타내고, 전산화 단층 촬영기로 촬영하여 얻어진 영상을 도 18a의 우측에 나타내었다. 상기 결과는 요추 1번 부위에서 80% 정도 압박된 것을 보여준다.
상기 시험 결과, 한 척수체 크기의 80% 정도 부풀려진 것을 확인하고,　척수압박 6시간 후 후지 신경계 검사에서 후지 완전마비,　통각 완전 소실됨을 확인하였다.　
2.4. 줄기세포 정맥주사
상기　척수손상 유발 6시간 후부터 줄기세포 (신선MSCs, 신선HSP-MSCs, 동결HSP-MSCs, 동결HSP HO 1 MSCs)를 연속 3일간 1일 1회 주입하였다 (줄기세포 1x107개를 생리식염수 10ml에 희석하여 완두정맥에 주사). 손상 무처치군은 식염수를 정맥주사하였다.
　　　　
2.5. 후지 기능검사
Song, R.B 등(2016) (Song RB, Basso DM, da Costa RC, Fisher LC, Mo X, Moore SA. Adaptation of the Basso-Beattie-Bresnahan locomotor rating scale for use in a clinical model of spinal cord injury in dogs. J Neurosci Methods. 2016;268:117-124.)의 방법에 따라, 아래와 같은 cBBB 점수로 후지 기능의 개선 정도를 척수손상 유발 후 4주까지 매주 평가하였다:
cBBB (Canine basso beattie bresnahan score)
0.　 후지 움직임 없음.
1.　 한 두 관절이 조금씩 움직임.
2.　 한 관절이 크게 움직이거나 혹은 다른 관절도 조금 움직임.
3.　 두 관절이 크게 움직임.
4.　 세 관절이 모두 조금씩 움직임.
5.　 두 관절은 조금씩 움직이고 세 번째 관절은 크게 움직임.
6.　 두 관절은 크게 움직이고 세 번째 관절은 조금 움직임.
7.　 세 관절 모두가 크게 움직임.
8.　 발바닥으로 부중 할 수 없음.
9.　 정지해있을 때 만 발바닥으로 부중하거나 때때로, 자주 혹은 항상 발등으로 걷지만 발바닥으로는 할 수 없음.
10. 가끔 발바닥으로 걸을 수 있지만 좌우의 조화로운 걸음걸이는 볼 수 없음.
11. 자주 혹은 항상 발바닥으로 걸을 수 있지만 좌우의 조화로운 걸음걸이는 볼 수 없음.
12. 자주 혹은 항상 발바닥으로 걸을 수 있고 좌우의 조화로운 걸음걸이는 가끔 볼 수 있음.
13. 자주 혹은 항상 발바닥으로 걸을 수 있고 좌우의 조화로운 걸음걸이는 자주 볼 수 있음.
14. 항상 발바닥으로 걸을 수 있고 좌우의 조화로운 걸음걸이도 항상 볼 수 있고 발을 딪거나 들기 직전에　발의 자세가 외회전 된다.
15. 항상 발바닥으로 걸을 수 있고 좌우의 조화로운 걸음걸이도 항상 볼 수 있고 발톱을 자주 끔. 발의 자세는 체와 평행하거나 딪을 때 내회전한다.
16. 항상 발바닥으로 걸을 수 있고 좌우의 조화로운 걸음걸이도 항상 볼 수 있고 발톱을 가끔 끔. 발의 자세는 체와 평행하거나 딪을 때 내회전하고 들 때 외회전 한다.
17. 항상 발바닥으로 걸을 수 있고 좌우의 조화로운 걸음걸이도 항상 볼 수 있고 발톱을 가끔 끔. 발의 자세는 딪을 때나 들 때 체와 평행하거나 내회전함.
18. 항상 발바닥으로 걸을 수 있고 좌우의 조화로운 걸음걸이도 항상 볼 수 있고 발톱은 끌지않음. 발의 자세는 딪을 때나 들 때 체와 평행하거나 내측으로 향하고 몸체의 불안정성이 존재함.
19. 항상 발바닥으로 걸을 수 있고 좌우의 조화로운 걸음걸이도 항상 볼 수 있고 다리를 전진하는 동안에도 발톱을 끌지않음. 발의 자세는 딪을 때나 들 때 체와 평행하거나 내측으로 향하고 몸체의 불안정성을 볼 수 없음.
상기 기준에 따라서 cBBB 점수를 산출하고, 이를 통하여 후지기능 회복정도를 확인하여, 그 결과를 도 18b에 나타내었다. 도 18b에서와 같이, 밸륜압박 6시간 후에는 전 시험군에서 통각이 없는 완전 후비마비 상태인 0을 기록하였으나, 1주후부터 점진적으로 증가 하였다. 2주차 이후에는 동결 HSP HO1 MSCs군이 신선 MSC군과 동결 HSP MSCs군보다 유의적으로 후지기능이 개선되었다(p<0.05). 신선 HSP-MSCs군은 동결 HSP HO1 MSCs군보다는 기능 개선이 떨어지는 경향을 보였지만 동결 HSP-MSCs 군과 신선 MSCs군보다 4주차에서 유의적으로 좋았다. 동결 HSP-MSCs는 신선 MSCs와 기능 개선이 비슷한 경향을 보였다.
2.6. 병리조직학적 검사
척수손상 4주째 안락사하여 각 장기를 채취하여 육안 검사한 후에 포르말린에 보존한 후 병리조직 표본을 제작하여 병리조직학적 검사를 하였다.
손상부의 섬유화 정도를 평가하기 위해 H&E 염색을 하였다. Image J software (Version 1.37; NlH, USA)를 사용하여 손상정도를 정량화 하였다.
상기 얻어진 결과를 도 19에 나타내었다.
줄기세포 이식 4주째의 손상척수를 H&E염색한 결과를 도 20에 나타내었다. 도 20에서 병리조직학적 소견에서 확인된 섬유화 정도를 화살표로 표시하였다. 손상부에서의 섬유화 정도는 동결 HSP HO1 MSCs군에서 다른 군들보다 적었다.
2.7. 체내 주입한 줄기세포 분포확인
GFP 형광 유전자를 도입한 줄기세포를 주입한 개체에 대해 줄기세포 이식 4주째의 병리조직 표본을 이용하여, 폐, 간, 신장, 손상 척수에서의 형광발색을 통해 줄기세포 분포를 확인하였다.
줄기세포 이식 4주째 손상척수에서의 MSCs의 분포를 도 21에 나타내었다. HSP활성화하지 않은 신선 MSCs군에서, HSP활성화군들과 비교하여, 이식한 줄기세포가 적게 분포하는 경향을 보였다. 신선 HSP-MSCs군에서 더 많은 MSCs가 확인되었다.
줄기세포 이식 4주째 손상척수에서의 신경세포분포를 도 22에 나타내었다. Nestin과 Beta 3-tubulin은, 손상척수에서의 주입 줄기세포의 분포와 비슷하게, HSP 활성화하지 않은 신선 MSCs군에서 HSP처리군들보다 적게 발현되었다.
2.8. 통계학적 분석
cBBB 점수를 매주 군별로 측정하여 평균 및 표준오차를 구한다.　 실험군과 대조군 사이의 후지기능 회복 정도에 대한 차이를　Kruskal-Wallis test로 군간들 사이의 유의성을 알아보고 Mann-Whitney U test로 두 군간의 유의성을 확인하였다. 병리조직학적 소견에서 섬유화에 대한 군간의 차이도 알아보았다.
<110> Seoul National University R&DB Foundation <120> Method of Preparing Stem Cell by Activating HSP or HIF <130> DPP20194228KR <160> 36 <170> koPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F primer_GAPDH <400> 1 cattgccctc aatgaccact 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F primer_VEGF <400> 2 ctatggcagg aggagagcac 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F primer_PDGF <400> 3 ccctgaggga tggtactgaa 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F primer_BDNF <400> 4 gctggcggtt cataaggata 20 <210> 5 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F primer_CXCL-12 <400> 5 gtggcggccg ctcgagatga acgccaaggt cgcc 34 <210> 6 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F primer_MCP-3 <400> 6 gtggcggccg ctcgagatga aggtctccgc agcg 34 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F primer_IL-10 <400> 7 cctgggagag aagctcaaga 20 <210> 8 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F primer_HGF <400> 8 atggggaatg agaatgcag 19 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F primer_IL-6 <400> 9 ttttctgcca gtgcctcttt 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F primer_COX2 <400> 10 acccgccatt atcctaatcc 20 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F primer_TNF-alpha <400> 11 accacactct tctgcctgct 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F primer_SOD <400> 12 agtgggcctg ttgtggtatc 20 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F primer_HO-1 <400> 13 gcgtcgactt cttcaccttc 20 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F primer_HSP-70 <400> 14 caagatcacc atcaccaacg 20 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F primer_HSP-27 <400> 15 taactggcaa gcacgaagag 20 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F primer_Nanog <400> 16 cctgcatcct tgccaatgtc 20 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F primer_OCT-4 <400> 17 gtcaccactc tgggctctcc 20 <210> 18 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F primer_Sox-2 <400> 18 gtccagcact accagagcg 19 <210> 19 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> R primer_GAPDH <400> 19 tccttggagg ccatgtagac 20 <210> 20 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> R primer_VEGF <400> 20 gctgcaggaa actcatctcc 20 <210> 21 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> R primer_PDGF <400> 21 gcaatgagca ccgtacgtag t 21 <210> 22 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> R primer_BDNF <400> 22 gtttcccttc tggtcatgga 20 <210> 23 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> R primer_CXCL-12 <400> 23 gccctctaga ctcgagttac ttgtttagag ctttctcc 38 <210> 24 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> R primer_MCP-3 <400> 24 gccctctaga ctcgagtcac agctttgggg cttggg 36 <210> 25 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> R primer_IL-10 <400> 25 tgttctccag cacgtttcag 20 <210> 26 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> R primer_HGF <400> 26 gacaaaaatg ccaggacgat 20 <210> 27 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> R primer_IL-6 <400> 27 ggctactgct ttccctaccc 20 <210> 28 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> R primer_COX2 <400> 28 tcggagttct cctggcttta 20 <210> 29 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> R primer_TNF-alpha <400> 29 tggagctgac agacaaccag 20 <210> 30 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> R primer_SOD <400> 30 agtcacattg cccaggtctc 20 <210> 31 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> R primer_HO-1 <400> 31 ggtcctcagt gtccttgctc 20 <210> 32 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> R primer_HSP-70 <400> 32 tccagcacct tcttcttgtc 20 <210> 33 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> R primer_HSP-27 <400> 33 tcgaaggtga cgggaatagt 20 <210> 34 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> R primer_Nanog <400> 34 tccgggctgt cctgagtaag 20 <210> 35 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> R primer_OCT-4 <400> 35 tccccgaaac tccctgcctc 20 <210> 36 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> R primer_Sox-2 <400> 36 cttactctcc tcccatttcc 20

Claims (17)

  1. (1) 줄기세포를 15 내지 25% 산소 농도 및 40 내지 45℃에서 0.5 내지 3시간 동안 배양하는 고온 배양 단계, 및
    (2) 상기 (1) 단계에서 배양된 줄기세포를 동결하는 단계
    를 포함하는, 줄기세포 생산 방법으로서,
    상기 생산된 줄기세포는, 사용 전 해동된 경우, 20% O2, 5% CO2, 및 37℃의 조건에서 배양되고 동결 처리된 후, 사용 전 해동된 동종 줄기세포와 비교하여,
    (i) 생존률, 증식성, 또는 이들 모두가 동등 이상이거나,
    (ii) 항산화능, 항염증인자 수준, 항스트레스인자 수준, 호밍(homing) 인자 수준, 성장인자 수준, 및 다분화능인자 수준으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상이 높거나,
    (iii) 염증인자 수준이 낮거나,
    (iv) 상기 (i) 내지 (iii) 중 2 이상의 특성을 갖는 것인,
    내동성을 가지는 줄기세포 생산 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 단계 (1)은,
    줄기세포를 18 내지 22% 산소 농도 및 42 내지 44℃에서 0.5 내지 2시간 동안 배양하는 고온 배양 단계인, 내동성을 가지는 줄기세포 생산 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 단계 (1)은,
    상기 고온 배양 단계 이전에, (1-1) 15 내지 25% 산소 농도 및 35 내지 39℃에서 80% 내지 95% 충만까지 배양하는 단계를 추가로 포함하거나,
    상기 고온 배양 단계 이후에, (1-2) 15 내지 25% 산소 농도 및 35 내지 39℃에서 1시간 내지 5시간 배양하는 단계를 추가로 포함하거나,
    상기 고온 배양 단계 이전 및 이후에, 상기 단계 (1-1) 및 (1-2)를 추가로 포함하는 것인,
    내동성을 가지는 줄기세포 생산 방법.
  4. 삭제
  5. 제1항에 있어서, 상기 동결하는 단계는 DMSO (Dimethyl sulfoxide) 5 내지 20%(w/v), FBS (Fetal Bovine Serum) 30 내지 50%(w/v), 또는 이들의 조합을 포함하는 동결제에서 수행하는 것인, 내동성을 가지는 줄기세포 생산 방법.
  6. 제5항에 있어서, 상기 동결하는 단계는 DMSO (Dimethyl sulfoxide) 8 내지 12%(w/v) 및 FBS (Fetal Bovine Serum) 35 내지 45%(w/v)를 포함하는 동결제에서 수행하는 것인, 내동성을 가지는 줄기세포 생산 방법.
  7. 제1항 내지 제3항, 제5항 및 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 줄기세포는 성체 줄기세포(adult stem cells), 배아 줄기세포(embryonic stem cells), 유도 만능줄기세포(induced pluripotent stem cells; iPS cells), 및 전발생세포 (progenitor cells)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인, 내동성을 가지는 줄기세포 생산 방법.
  8. 삭제
  9. 삭제
  10. 제1항 내지 제3항, 제5항 및 제6항 중 어느 한 항의 방법에 의하여 생산되고, 20% O2, 5% CO2, 및 37℃의 조건에서 배양되고, 동결 처리된 후, 사용 전 해동된 동종 줄기세포와 비교하여,
    (i) 생존률, 증식성, 또는 이들 모두가 동등 이상이거나,
    (ii) 항산화능, 항염증인자 수준, 항스트레스인자 수준, 호밍(homing) 인자 수준, 성장인자 수준, 및 다분화능인자 수준으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상이 높거나,
    (iii) 염증인자 수준이 낮거나,
    (iv) 상기 (i) 내지 (iii) 중 2 이상의 특성을 갖는 것인,
    내동성을 가지는 줄기세포.
  11. 삭제
  12. 제10항에 있어서,
    상기 줄기세포는 동결된 것이고, 동결 후 사용 전 해동시,
    20% O2, 5% CO2, 및 37℃의 조건에서 배양되고 동결 후 사용전 해동된 동종 줄기세포와 비교하여, 하기의 특징 중 하나 이상을 갖는, 내동성을 가지는 줄기세포:
    세포 생존률이 1% 이상 높음;
    배양 2일째부터의 세포 증식성이 1.1배 이상 높음;
    항산화능이 1.1배 이상 높음;
    염증인자 수준이 90% 이하로 낮음 (비교군 100% 대비);
    항염증인자 수준이 1.1배 이상 높음;
    항스트레스인자 수준이 1.1배 이상 높음;
    호밍(homing) 인자 수준이 1.1배 이상 높음;
    성장인자 수준이 1.1배 이상 높음; 및
    다분화능인자 수준이 1.2배 이상 높음.
  13. 제10항에 있어서, 상기 줄기세포는 성체 줄기세포(adult stem cells), 배아 줄기세포(embryonic stem cells), 유도 만능줄기세포(induced pluripotent stem cells; iPS cells), 및 전발생세포 (progenitor cells)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인, 내동성을 가지는 줄기세포.
  14. 제10항의 줄기세포를 포함하는, 세포 치료제.
  15. 제14항에 있어서, 신경 손상 치료에 사용하기 위한, 세포 치료제.
  16. 제12항의 줄기세포를 포함하는, 세포 치료제.
  17. 제16항에 있어서, 신경 손상 치료에 사용하기 위한, 세포 치료제.
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KR101870238B1 (ko) 2016-02-19 2018-06-22 서울대학교산학협력단 헴 옥시게나아제-1을 과발현하는 줄기세포 및 이를 포함하는 약학 조성물
KR20180109797A (ko) * 2015-07-17 2018-10-08 의료법인 성광의료재단 Nt세포의 보관방법 및 뱅킹 시스템

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