KR20210052365A - 미토콘드리아를 포함하는 골관절염의 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 줄기세포로부터 분리된 미토콘드리아를 유효성분으로 포함하는 골관절염의 예방 또는 치료용 조성물 및 이를 이용하여 골관절염을 예방 또는 치료하는 방법에 관한 것으로, 골관절염 질환의 통증 및 증상을 완화시키고 TH17 세포와 Treg 세포를 동시 조절할 수 있다.

Description

미토콘드리아를 포함하는 골관절염의 예방 또는 치료용 조성물{PHARMACEUTICAL COMPOSITION FOR PREVENTING OR TREATING OSTEOARTHRITIS COMPRISING MITOCHONDRIA}

본 발명은 미토콘드리아를 유효성분으로 포함하는 골관절염의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

골관절염(osteoarthritis)은 퇴행성 관절염으로 칭해지기도 하는 관절염의 일종으로서, 윤활 관절에서 연골과 주위골에 퇴행성 변화가 나타나서 생기는 관절 염을 말한다. 즉, 골관절염은 관절 연골의 점차적인 소실과 더불어 연골 하방에 위치한 뼈의 비대, 관절 가장자리 부위의 골 생성, 및 비특이적인 활막 염증을 특징으로 하는 질환이다. 골관절염은 노화나 과도한 물리적 압박(예를 들어, 비만, 외상 등)에 의해서 연골이 손상되어 발생하는 질환이다. 따라서, 골관절염은 체중을 많이 받는 관절, 즉, 무릎(슬)관절, 엉덩이 (고)관절 등에 심한 통증과 운동 장애를 나타내며, 장기간 방치할 경우에는 관절의 변형까지 초래하게 된다.

골관절염은 연골내 수분 함량이 증가되어 부종을 일으키는 연골 변화 단계 (1 단계), 연골이 파괴되면서 연골 표면이 갈라지고 찢어지면서 손상되어 뼈가 드러나고 관절강이 좁아지는 원섬유화 (fibrillation) 단계(2 단계), 연골세포가 연골을 회복하기 위해 연골 생성을 시작하지만 연골 생성보다 연골 파괴가 더 빠르게 일어나기 때문에 전반적으로이 줄어들게 되는 단계 (3 단계), 뼈가 변형되어 관절 기형 및 기능장애를 초래하는 뼈 변화 단계 (4 단계), 및 연조직 (soft tissue) 이 두꺼워지는 관절 연조직 변화 단계 (5 단계) 로 진행되게 된다.

골관절염과 다른 분류에 속하는 류마티스 관절염(rheumatoid arthritis)은 활막 세포의 염증과 증식을 특징으로 하는, 만성 자가면역 질환(autoimmune diseases)으로서, 골관절염과 달리 관절 주위 뼈의 골다공증 및 골미란 등이 발생한다. 류마티스 관절염은 활막(synovial membrane)의 염증이 관절막(joint capsule)과 인대(ligament), 건(tendon)으로 퍼지는 단계(1 단계), 관절연골(joint cartilage)의 점차적인 파괴로 관절 간격이 좁아지고 관절막과 인대의 장력이 소실되는 단계(2 단계), 염증이 뼈로 침범하여 뼈의 부분적 침식이 발생하는 단계(3 단계), 및 관절기능이 소실되는 단계(4 단계)로 진행되게 된다. 따라서, 골관절염과 류미티스 관절염은 그 발명 원인 및 진행단계가 전혀 상이하며, 이에 대한 치료 방법도 상이하다.

현재 골관절염의 치료를 위해서는, 아세트아미노펜(acetaminophen), 트라마돌(tramadol), 비스테로이드성 항염제(nonsteroidal antiinflammatory drugs,NSAIDs), 디아세린 (diacerin), 글루코사민 (glucosamine)등의 약물이 사용되고 있다. 이들 가운데 비스테로이드성 항염제는 위, 십이지장 궤양 등의 위장관 부작용이 문제점으로 지적되고 있다. 따라서, 위장관 부작용의 위험인자를 가지고 있는 골관절염 환자에게 상기 약물들을 투여할 경우, 레바미피드 등의 점막 보호제(cytoprotective agent)나 시메티딘, 라니티딘 등의 H2-수용체 길항제, 오메프라졸 등의 프로톤 펌프 저해제등이 동시에 처방되고 있다.

미토콘드리아는 심혈관질환, 노화, 제 2형 당뇨병과 대사성질환, 암, 퇴행성뇌질환(알츠하이머병, 파킨슨병), 비만증, 약물중독 등의 주요 발생기작은 스트레스에 의한 미토콘드리아 손상에서 유래하는 것으로 보고되었다. 주요 질환들을 개시하고 진행 시키는 주요 기여 인자: 세포 소실(죽음; 세포사멸이나 세포괴사)미토콘드리아는 인체 활동에 필요한 에너지(ATP)를 만드는 파워플랜트의 기능을 하지만 그 과정동안 유해 산소라디칼(활성산소)을 발생시킴. 이 산소라디칼은 DNA나 각종단백질을 손상시켜 세포 소실을 일으켜 각종 질환을 야기한다(Brown Lee, Nature, 2005).

미토콘드리아 내부에 세포사와 밀접한 관계를 갖는 신호전달기전들이 존재하고 우리가 이들 신호를 해석하고 제어할 수 있다면 질병치료에 응용할 수 있다 (Biochimica et Biophysica Acta, 2006; Cell, 2005; Trends Biochem Sci, 2005; Nature Med, 2005; Nature, 2005; J Clin Invest, 2005; Heart Lung Circ, 2005; J Nat Cancer Inst, 2005, Science, 2005). 미토콘드리아 기능저하는 단일한 증상이나 질병이 아닌 인체내 다양한 기관에서 다양한 질병으로 나타날 수 있어, 병든 미토콘드리아와 연관된 병소 및 질병 특이적이 치료법의 가능성이 제기되고 있으나 현재까지 정확한 타깃이나 합당한 치료기술 개발이 시급한 상태이다. 특히 세포내 증가한 활성산소종으로 인한 산화스트레스의 증가는 최근 심혈관·대사질환은 물론 퇴행성신경 질환에서의 세포학적·분자생물학적 근본 기전으로 제시되고 있으나, 현재까지 임상 및 전임상 단계에서 사용되는 대사성치료제 또는 항산화제 치료는 효과는 아직 논란의 여지가 있다. 미토콘드리아 기능을 직접 제어할 수 있는 막단백질 및 기질 단백질의 발현을 조절할 수 있는 미세표적화치료(micro-targetingtherapy)로서의 유전자 치료법은 영구적 또는 반영구적 치료법으로서 가능성이 높은 전략일 수 있다.

따라서 면역 조절 뿐만 아니라 감염, 미토콘드리아 기능 향상을 통한 면역 조절 세포 기능 강화등을 조절 하는 면역 조절제 및 치료법 개발이 필요하다. 또한 부작용이 없고 저렴하면서도 치료 효과가 우수한 새로운 염증면역질환 치료제 및 치료방법의 개발이 필요한 실정이다.

한국등록특허 제10-1723265호

상기와 같은 문제를 해결하기 위해, 본 발명의 발명자는 골관절염 환자의 중간엽줄기세포(MSC)로부터 분리된 미토콘드리아의 투여에 의해 골관절염 질환의 통증 및 증상이 완화되고 TH17 세포와 Treg 세포가 동시 조절됨을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

이에, 본 발명은 미토콘드리아를 유효성분으로 포함하는 골관절염의 예방 또는 치료용 조성물 및 이를 이용하여 골관절염을 예방 또는 치료하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 미토콘드리아를 유효성분으로 포함하는 골관절염의 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.

본 발명에 따른 조성물은 골관절염의 통증을 경감시키고 증상을 완화시키며 관절 손상이 감소시킬 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 조성물은 연골세포의 분화를 촉진하여 골관절염을 효과적으로 예방하고 치료할 수 있다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 있어서, MSC 유래 미토콘드리아에 의한 골 관절염 동물모델의 통증 측정 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 있어서, MSC 유래 미토콘드리아가 투여된 군에서의 safranin o 염색 이미지 및 임상적 관절염 평가지수를 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 있어서, MSC 유래 미토콘드리아가 투여된 동물에서 IHC 염색 이미지 및 IL-1β, MMP13 및 MCP1 의 발현을 확인한 결과이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 있어서, MSC 유래 미토콘드리아에 의한 연골손상 억제 능력을 확인한 CT 분석 결과이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 있어서, MSC 유래 미토콘드리아에 의한 TH17/Treg 세포 동시 조절 능력을 확인한 분석 결과이다
도 6은 본 발명의 일 실시예에 있어서, MSC 유래 미토콘드리아가 IL-1β에 의해 손상된 연골세포의 증식 회복 능력을 돕는다는 것을 확인한 결과이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 있어서, 아연에 의해 기능이 강화된 MSC 유래 미토콘드리아의 골관절염 치료 효과를 확인한 도이다.

이하, 본 발명의 구현예로 본 발명을 상세히 설명하기로 한다. 다만, 하기 구현예는 본 발명에 대한 예시로 제시되는 것으로, 이에 의해 본 발명이 제한되지는 않으며 본 발명은 후술하는 특허청구범위의 기재 및 그로부터 해석되는 균등 범주 내에서 다양한 변형 및 응용이 가능하다.

이하, 본 발명의 구현예로 본 발명을 상세히 설명하기로 한다. 다만, 하기 구현예는 본 발명에 대한 예시로 제시되는 것으로, 이에 의해 본 발명이 제한되지는 않으며 본 발명은 후술하는 특허청구범위의 기재 및 그로부터 해석되는 균등 범주 내에서 다양한 변형 및 응용이 가능하다.

본 발명은 미토콘드리아를 유효성분으로 포함하는 골관절염의 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.

상기 미토콘드리아는 인간을 포함하는 포유동물로부터 분리된 것일 수 있으며, 인간을 포함하는 포유동물의 지방 등의 잉여조직의 세포로부터 분리된 것일 수 있다. 예를 들어, 상기 미토콘드리아는 골관절염 환자의 체세포, 생식세포 및 줄기세포로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 세포로부터 분리된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 줄기세포는 중간엽줄기세포, 성체줄기세포, 역분화줄기세포, 배아줄기세포, 골수줄기세포, 신경줄기세포, 윤부줄기세포 및 조직 유래 줄기세포로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 세포일 수 있으며, 예를 들어 중간엽줄기세포(MSC)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

한편, 상기 미토콘드리아를 특정 세포로부터 분리하는 경우에는, 예를 들어, 특정 버퍼 용액을 사용하거나 전위차 및 자기장을 이용하는 등 공지된 다양한 방법을 통해 미토콘드리아를 분리할 수 있다.

상기 미토콘드리아 분리는 미토콘드리아 활성 유지 측면에서, 세포를 파쇄하고원심분리를 하여 수행할 수 있다. 일 구체예로, 세포를 배양하고, 이러한 세포를 포함하는 조성물을 제1차 원심분리하여 펠렛을 생성하는 단계, 상기 펠렛을 버퍼 용액에 재현탁시키고, 균질화하는 단계, 상기 균질화된 용액을 제2차 원심분리하여 상청액을 제조하는 단계 및 상기 상청액을 제3차 원심분리하여 미토콘드리아를 정제하는 단계로 수행될 수 있다. 이때, 제2차 원심분리가 수행되는 시간은 제1차 및 제3차 원심분리가 수행되는 시간보다 짧도록 조절되는 것이 세포 활성 유지 면에서 바람직하며, 제1차 원심분리에서 제3차 원심분리로 갈수록 속도를 높일 수 있다.

또한, 상기 미토콘드리아는 세포를 배양한 후 얻어진 배양액 내에서 수득할 수 있다. 이러한 배양액에는 세포가 분비한 사이토카인, 케모카인, 엑소좀 및 미세소포체 등과 미토콘드리아가 포함될 수 있다. 일 구체예로, 상기미토콘드리아 분리는 세포를 배양하고, 얻어진 배양액을 포함하는 조성물을 제1차 원심분리하여 세포잔해 등을 제거하고 상청액을 수득하는 단계, 상기 상청액을 제2차 원심분리하여 미토콘드리아를 정제하는 단계로 수행될 수 있다. 원심분리 횟수 및 샘플의 함량에 따라 적절히 조정될 수 있다.

상기 중간엽줄기세포 유래 미토콘드리아는 골관절염 환자의 지방으로부터 분리된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 조성물에 의해 골관절염의 상황을 악화시킨다고 알려진 인자인 IL-1β, MMP13, MCP1 등을 발현하는 세포침윤이 감소되어, 골관절염의 증상을 완화시키고 개선할 수 있다.

상기 조성물에 의해 TH17/Treg 세포의 발현이 동시에 조절되어 Treg 세포는 증가하는 반면 TH17의 발현은 감소될 수 있다.

상기 미토콘드리아는 염증성 인자 발현 면역 세포 침윤을 감소시키고, IL-17 발현 염증성 Th17 세포의 활성을 감소시켜, 관절 염증뿐만 아니라 전신 면역 시스템 병인 조절을 할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 중간엽줄기세포 유래 미토콘드리아는 연골 세포의 대사 인자의 활성을 저해하여, 연골세포 손상/ 연골 조직 손상을 제어할 수 있어 관절을 보호할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

따라서, 본 발명의 중간엽줄기세포 유래 미토콘드리아는

(1)연골 손상을 제어하고,

(2)연골세포의 분화를 제어하며,

(3)Th17의 활성을 저해하며,

(4)Treg를 활성화시킴으로서, 골관절염을 치료하는 것을 특징으로 할 수 있다.

또한, 골관절염환자의 미토콘드리아의 주입으로 면역거부반응의 확률을 줄일 수 있도록 골관절염 환자 본인으로부터 분리된 미토콘드리아를 주입할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 조성물에 의해 골관절염의 상황을 악화시킨다고 알려진 인자인 IL-1b, MMP13, MCP1 등을 발현하는 세포들의 수가 감소되어 골관절염의 증상을 완화시키고 개선할 수 있다.

본 발명의 일측면에서, 중간엽줄기세포 유래의 미토콘드리아를 유효성분으로 포함하는, 골관절염 예방 또는 치료에 있어서, (1)연골세포 손상을 보호하고, (2)연골세포의 분화를 제어하며, (3)Th17의 활성을 저해하고, Treg를 활성화시키고 및 (4)IL-1β, MMP13 및 MCP1을 발현하는 세포들의 침윤을 감소시키기 위한 약학적 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명의 다른 일측면에서, 중간엽줄기세포 유래의 미토콘드리아를 유효성분으로 포함하는 골관절염 예방 또는 치료용 약학적 조성물로서, 상기 골관절염은 IL-1β에 의하여 유도되는, 조성물을 제공한다.

또한, 일측면에서, 중간엽줄기세포 유래의 미토콘드리아를 유효성분으로 포함하는 골관절염 예방 또는 치료용 약학적 조성물로서, 상기 골관절염은 Th17의 활성이 증가하고, Treg의 활성이 저하된 골관절염인 것인, 조성물을 제공한다.

또한, 일측면에서, 중간엽줄기세포 유래의 미토콘드리아를 유효성분으로 포함하는 골관절염 예방 또는 치료용 약학적 조성물로서, 상기 골관절염은 IL-1β, MMP13 및 MCP1을 발현하는 세포들의 침윤이 증가된 골관절염인 것인 조성물을 제공한다.

본 발명에 따른 조성물은 골관절염을 예방 및 치료할 수 있는 약학 조성물, 또한 이의 증상의 완화에 사용될 수 있으며, 상기 약학 조성물은 약학적으로 허용되는 담체를 추가로 포함할 수 있다. 상기에서 "약학적으로 허용되는"이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 통상적으로 위장 장애, 현기증 등과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 조성물을 말한다. 약학적으로 허용되는 담체로는, 예를 들면, 락토스, 전분, 셀룰로스 유도체, 마그네슘 스테아레이트, 스테아르산 등과 같은 경구투여용 담체 및 물, 적합한 오일, 식염수, 수성 글루코스 및 글리콜 등과 같은 비경구 투여용 담체 등이 있으며, 안정화제 및 보존제를 추가로 포함할 수 있다. 적합한 안정화제로는 아황산수소나트륨, 아황산나트륨 또는 아스코르브산과 같은 항산화제가 있다. 적합한 보존제로는 벤즈알코늄 클로라이드, 메틸- 또는 프로필-파라벤 및 클로로부탄올이 있다. 그 밖의 약학적으로 허용되는 담체로는 다음의 문헌에 기재되어 있는 것을 참고로 할 수 있다(Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th ed, Mack Publishing Company, Easton, PA, 1995).

본 발명에 따른 약학 조성물은 상술한 바와 같은 약학적으로 허용되는 담체와 함께 당업계에 공지된 방법에 따라 적합한 형태로 제형화될 수 있다. 즉, 본 발명의 약학 조성물은 공지의 방법에 따라 다양한 비경구 또는 경구 투여용 형태로 제조될 수 있으며, 비경구 투여용 제형의 대표적인 것으로는 주사용 제형으로 등장성 수용액 또는 현탁액이 바람직하다. 주사용 제형은 적합한 분산제 또는 습윤제 및 현탁화제를 사용하여 당업계에 공지된 기술에 따라 제조할 수 있다. 예를 들면, 각 성분을 식염수 또는 완충액에 용해시켜 주사용으로 제형화될 수 있다. 또한, 경구 투여용 제형으로는, 분말, 과립, 정제, 환약 및 캡슐 등이 있고, 이에 한정되는 것은 아니다.

또한, 본 발명은 상기 골관절염 예방 또는 치료용 조성물을 치료가 필요한 개체에 투여하는 단계를 포함하는 골관절염의 예방 또는 치료 방법을 제공한다.

본 발명의 치료 방법은 상기 골관절염 예방 또는 치료용 조성물을 치료적 유효량으로 개체에 투여하는 것을 포함한다. 특정 개체에 대한 구체적인 치료적 유효량은 달성하고자 하는 반응의 종류와 정도, 경우에 따라 다른 제제가 사용되는지의 여부를 비롯한 구체적 조성물, 개체의 연령, 체중, 일반건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료기간, 구체적 조성물과 함께 사용되거나 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자와 의약 분야에 잘 알려진 유사 인자에 따라 다르게 적용하는 것이 바람직하다. 따라서 본 발명의 목적에 적합한 조성물의 유효량은 전술한 사항을 고려하여 결정하는 것이 바람직하다.

상기 개체는 임의의 포유동물에 적용가능하며, 상기 포유동물은 인간 및 영장류뿐만 아니라, 소, 돼지, 양, 말, 개 및 고양이 등의 가축을 포함한다.

이하, 본 발명을 실시예를 통하여 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

[실시예]

실시예 1. 골관절염 환자 유래 MSC 미토콘드리아의 제조

골관절염 환자의 지방 조직을 잘게 자르고 100um 필터로 조직 부산물을 걸러주고, 4℃에서 3분간 200g에서 원심분리하였다. 위에 뜬 노란색 지방만을 수거하여, 콜라게나아제(Collagenase)를 이용하여 조직을 하나의 세포단위로 분리시켰다. 한 시간 후에, 4℃에서 3분간 200g을 원심분리하여 가라앉은 펠렛만 남기고 세척하고 40um 필터로 세포를 분리하였다. 분리된 세포는 10% FBS를 포함하는 MEM 배지에서 배양하였다. 배양물을 4℃에서 3분간 200g으로 원심분리한 후, 펠렛은 IBM buffer에 현탁하고 Homogenizer를 이용하여 세포막을 터트렸다. 그런 다음 원심분리하여 미토콘드리아 펠렛을 수득하였다.

실시예 2. 골관절염 환자 유래 MSC 미토콘드리아의 골관절염의 치료 효과

본 발명자들은 골관절염 환자 유래 MSC 미토콘드리아의 골관절염 치료 효과를 확인하기 위하여, 골관절염이 유발된 동물모델에 줄기세포 유래 미토콘드리아를 주입한 후 치료 효과를 분석하는 실험을 수행하였다.

동물모델에게 MIA 유도 후, 하루 뒤에 MIA 모델의 관절강으로(i.a) 실시예 1에서와 같이 분리한 중간엽줄기세포 유래 미토콘드리아를 10ug/100ul의 농도로 주 1회 총 3주 관절강내로 주입하였다. weight bearing 평가는 MIA 유도 후부터 평가 하였으며, 주 1회 측정하였다.

그런 다음, MIA 유도 후 3주차에 마우스를 희생하였으며, 관절의 연골을 safranin O 염색하여 관절 연골 조직의 손상정도를 조직 분석하였다.

그 결과, 골관절염이 유도된 랫트에 골관절염 환자 유래 MSC 미토콘드리아를 주입한 경우 1차 실험 및 2차 실험 모두에서 골관절염 유발 모델인 MIA 그룹에 비해 통증이 감소됨을 확인하였다(도 1). 또한, 골관절염이 유도된 랫트에 골관절염 환자 유래 MSC 미토콘드리아를 주입한 경우 골관절염 유발 모델인 MIA 그룹에 비해 임상적 관절염 지수가 낮아짐을 확인하였다(도 2).

실시예 3. 중간엽줄기세포 유래 미토콘드리아에 의한 골관절염 관련 인자 억제 효과

본 발명자들은 골관절염이 유도된 동물모델에서 중간엽줄기세포 유래 미토콘드리아에 의하여 항체 조절 효과를 있는지 확인하는 실험을 수행하였다.

동물모델에게 MIA 유도 후 3주차에 마우스를 희생하였으며, 관절 조직 내의 염증성 인자 발현 면역 세포 침윤을 분석하기 위해 IHC 면역 염색하였다. 각 특이적 항체를 이용하여 관절 조직 내에 IL-1β, mmp13, mcp-1 발현 세포를 분석하였다.

그 결과, 중간엽줄기세포 유래 미토콘드리아가 주입된 랫트에서는 골관절염 유발 모델인 MIA 그룹에 비해 골관절염의 상황을 악화시킨다고 알려진 인자인 IL-1b, MMP13 및 MCP1을 발현하는 세포들의 침윤이 감소함을 확인하였다(도 3).

실시예 4. 중간엽줄기세포 유래 미토콘드리아에 의한 무릎관절 손상 보호효력

골관절염이 유도된 동물모델에서 중간엽줄기세포 유래 미토콘드리아에 의하여 관절의 손상이 저해되는지 확인하였다.

도 5는 골관절염을 유도하지 않은 랫트 (WT), 골관절염을 유도한 랫트 (MIA) 그리고 골관절염을 유도후 중간엽줄기세포 유래 미토콘드리아를 투여한 랫트(MIA+MSC mitochondria)의 3그룹에서 CT를 통해 무릎 관절을 비교한 것으로, WT 에서는 관절이 거의 손상되지 않았지만 MIA 에서는 굉장히 많이 손상된 모습을 관찰할 수 있다. 반면 MSC 미토콘드리아를 투여한 그룹에서는 MIA 대비 손상도가 덜 한 것을 알 수 있다.

실시예 5. 중간엽줄기세포 유래 미토콘드리아에 의한 TH17/Treg 세포 조절 효과

본 발명자들은 골관절염이 유도된 동물모델에서 중간엽줄기세포 유래 미토콘드리아에 의하여 TH17/Treg 세포가 제어되는지를 분석하였다. MIA 유도후 3주차에 랫트을 희생하고, 각 랫트의 비장 조직에서 세포를 분리하였으며, Th17, Treg 세포 활성을 유세포 분석하였다. 유세포 분석을 위해서 CD4-PerCP, IL-17 APC, Foxp3-ECD, CD25-FITC 염색하고, 염색된 세포는 유세포 분석하였다.

그 결과, MIA 유도된 골관절염 동물몰델의 비장 조직내에 IL-17을 발현하는 Th17 세포의 활성이 증가되었으며, 중간엽줄기세포 유래 미토콘드리아의 관절강 주입에 의해서 IL-17 발현 염증성 Th17 세포의 활성이 비장 조직 내에서 감소됨을 확인하였다(도 4). 이러한 결과는 중간엽줄기세포 유래 미토콘드리아에 의해 관절 염증뿐만 아니라 전신 면역 시스템 병인 조절을 할 수 있음을 시사하는 것이다.

실시예 6. 중간엽줄기세포 유래 미토콘드리아에 의한 관절세포 증식 조절

사람의 관절세포 (Chondrocyte)에서 중간엽줄기세포 유래 미토콘드리아가 세포수준에서 효력이 있는지 검증하였다.

같은 수의 관절세포를 배양시킨 후, 아무것도 처리하지 않은 조건, IL-1β를 처리한 조건 그리고 IL-1β 처리 후 중간엽줄기세포 유래 미토콘드리아를 복합 처리한 그룹으로 나누어 총 3일간 실험을 진행하였다.

그 결과, IL-1β 에 의해 관절세포는 손상되어 증식력이 아무것도 처리하지 않은 관절세포에 비해 떨어지는 것을 확인하였지만, IL-1β 로 손상을 준 관절세포에 중간엽줄기세포유래 미토콘드리아를 처리했을 때 증식력이 회복되어 손상을 주지 않은 세포와 동등한 수준으로 올라가는 것을 확인하였다 (도 6).

실시예 7. 아연 처리된 중간엽줄기세포 유래 미토콘드리아에 의한 골관절염치료효과

골관절염이 유발된 동물모델에 아연에 의해 기능 강화된 중간엽줄기세포 유래 미토콘드리아를 주입한 후 치료 효과를 분석하는 실험을 수행하였다.

골관절염 환자로부터 분리한 중간엽줄기세포는 황하아연 ZnSO4 10uM로 24시가 자극하였으며, 배양 24시간 후 미토콘드리아를 위아 동일한 방법으로 분리하였다.

동물모델에게 MIA 유도 후, 하루 뒤에 MIA 모델의 관절강으로(i.a) 실시예 1에서와 같이 분리한 중간엽줄기세포 유래 미토콘드리아를 10ug/100ul의 농도로 주 1회 총 3주 관절강내로 주입하였다. weight bearing 평가는 MIA 유도 후부터 평가 하였으며, 주 1회 측정하였다.

그 결과, 골관절염이 유도된 랫트에 아연이 처리된 골관절염 환자 유래 MSC 미토콘드리아를 주입한 경우 줄기세포 유래 미토콘드리아 단독 군 보다 통증이 감소됨을 확인하였다(도 7).

이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허 청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

Claims (9)

1. 중간엽줄기세포 유래의 미토콘드리아를 유효성분으로 포함하는 골관절염 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
2. 제 1항에 있어서, 상기 중간엽줄기세포는 환자유래의 중간엽줄기세포인 것인, 조성물.
3. 제1항에 있어서, 상기 환자는 골관절염 환자인 것인, 조성물.
4. 제 1항에 있어서, 상기 조성물은
   (1)연골 손상을 제어하고,
   (2)연골세포의 분화를 제어하며,
   (3)Th17의 활성을 저해하며,
   (4)Treg를 활성화시킴으로서, 골관절염을 치료하는 것을 특징으로 하는, 조성물.
5. 제 1항에 있어서, 상기 중간엽줄기세포는 탯줄, 제대혈, 골수, 지방, 근육, 신경, 피부, 양막, 태반, 활액, 정소, 골막 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나로부터 수득된 것인, 조성물.
6. 중간엽줄기세포 유래의 미토콘드리아를 유효성분으로 포함하는, 골관절염 예방 또는 치료에 있어서, (1)연골세포 손상을 보호하고, (2)연골세포의 분화를 제어하며, (3)Th17의 활성을 저해하고, Treg를 활성화시키고 및 (4)IL-1β, MMP13 및 MCP1을 발현하는 세포들의 침윤을 감소시키기 위한 약학적 조성물.
7. 중간엽줄기세포 유래의 미토콘드리아를 유효성분으로 포함하는 골관절염 예방 또는 치료용 약학적 조성물로서, 상기 골관절염은 IL-1β에 의하여 유도되는, 조성물.
8. 중간엽줄기세포 유래의 미토콘드리아를 유효성분으로 포함하는 골관절염 예방 또는 치료용 약학적 조성물로서, 상기 골관절염은 Th17의 활성이 증가하고, Treg의 활성이 저하된 골관절염인 것인, 조성물.
9. 중간엽줄기세포 유래의 미토콘드리아를 유효성분으로 포함하는 골관절염 예방 또는 치료용 약학적 조성물로서, 상기 골관절염은 IL-1β, MMP13 및 MCP1을 발현하는 세포들의 침윤이 증가된 골관절염인 것인, 조성물.
   
   

Images