CN117771226A - 一种加快骨关节炎损伤修复的促进剂 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种加快骨关节炎损伤修复的促进剂，属于生物学技术领域。该促进剂的核心有效成分为小分子化合物A922500，其CAS号为959122‑11‑3。本发明通过实验发现A922500能够有效的促进骨髓间充质干细胞的成软骨分化且效果优于TGF‑β3。而且，A922500能够有效的抑制成骨分化后期发生的软骨细胞肥大分化，从而可以为骨关节炎损伤修复提供一种新的治疗方式。
Description
技术领域
本发明属于生物学技术领域，尤其涉及一种加快骨关节炎损伤修复的促进剂。
背景技术
骨关节炎是一种普遍见于中老年人的逐渐恶化的疾病，也是导致老年人生活质量下降、活动受限甚至残疾的主要原因。其核心病理特征包括软骨受损、骨质增生以及软骨下骨硬化。随着疾病的进展，患者可能经历严重的身体不适，不仅影响日常活动，还给患者的家庭和社会带来沉重的经济负担。
目前，传统治疗骨关节炎的方法主要是使用药物来延缓症状进展和减轻疼痛，以及进行人工关节置换手术。然而，药物治疗存在长期使用的副作用，且不能实现受损关节软骨的逆转修复。而人工置换手术不仅费用高昂，还伴随感染、假体松动和远期返修等潜在风险。因此，未来治疗骨关节炎的前景集中在软骨再生修复研究上。
骨髓间充质干细胞（BMSCs）是一种源自骨髓、能够定向分化的干细胞。由于其容易获取且能对信号刺激做出分化反应，BMSCs在再生医学和组织工程领域得到广泛应用。虽然BMSCs已广泛用于软骨损伤修复，但如何成功诱导细胞成为功能性的软骨细胞仍然是一个巨大挑战。而且，在培养后期形成的软骨细胞会出现失分化，发生软骨细胞肥大化的情况。因此，未来的研究将需要更深入的探索和创新，以克服这些挑战，从而为骨关节炎患者提供更有效的治疗方案。
老药新用是一种在医学领域中促进创新的可行途径，有助于更迅速地将科学研究成果分转化为实际的治疗方法。A922500是一种小分子化合物，其分子式为C26H24N2O4，其CAS号为959122-11-3。目前，A922500主要作为二酰基甘油酰基转移酶的抑制剂来发挥抗高血脂的作用。但是，关于A922500在骨髓间充质干细胞成软骨分化中的作用则尚不清楚。
发明内容
本发明的目的在于探究小分子化合物A922500在骨髓间充质干细胞成软骨分化中的作用，从而为骨髓间充质干细胞的成软骨分化和骨关节炎损伤的修复提供一种新的制剂。
为实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：
第一方面，本发明提供了一种小分子化合物在制备加快骨关节炎损伤修复的促进剂中的应用，所述小分子化合物为A922500，所述A922500的CAS号为959122-11-3。
进一步地，所述小分子化合物通过促进骨髓间充质干细胞的成软骨分化来实现加快骨关节炎损伤修复的效果。
进一步地，所述小分子化合物通过抑制软骨细胞的肥大分化来更好的发挥软骨细胞的骨关节炎损伤修复作用。
第二方面，本发明提供了一种小分子化合物在制备促进干细胞成软骨分化的培养基中的应用，所述小分子化合物为A922500，所述A922500的CAS号为959122-11-3。
进一步地，所述干细胞为骨髓间充质干细胞。
进一步地，所述培养基的制备方法包括如下步骤：
（1）每100mL的成软骨基础培养基的配置原料如下：97.4 mL DMEM培养基，100μL丙酮酸钠，1mL ITS添加物，300μL 抗坏血酸，100μL 脯氨酸，100μL地塞米松B ，1mL 青链霉素，混合均匀后得到成软骨基础培养基；
（2）在所述成软骨基础培养基中加入2-5%的胎牛血清，之后加入DMSO溶解并过滤除菌的A922500使其终浓度为0.5-50μM，得到成软骨分化培养基。
进一步地，所述成软骨分化培养基中的A922500的终浓度为5μM。
第三方面，本发明提供了一种小分子化合物在制备抑制软骨细胞肥大分化的培养基中的应用，所述小分子化合物为A922500，所述A922500的CAS号为959122-11-3。
进一步地，所述软骨细胞为骨髓间充质干细胞经成软骨分化所得到的软骨细胞。
第四方面，本发明提供了一种促进干细胞分化为软骨细胞的成软骨分化培养基，所述成软骨分化培养基的制备方法包括如下步骤：
（1）每100mL的成软骨基础培养基的配置原料如下：97.4 mL DMEM培养基，100μL丙酮酸钠，1mL ITS添加物，300μL 抗坏血酸，100μL 脯氨酸，100μL地塞米松B ，1mL 青链霉素，混合均匀后得到成软骨基础培养基；
（2）在所述成软骨基础培养基中加入2-5%的胎牛血清，之后加入DMSO溶解并过滤除菌的A922500使其终浓度为0.5-50μM，得到成软骨分化培养基。
进一步地，所述干细胞为骨髓间充质干细胞。
进一步地，所述成软骨分化培养基中的A922500的终浓度为5μM。
第五方面，本发明提供了一种促进骨髓间充质干细胞分化为软骨细胞的方法，所述方法包括如下步骤：
（1）将第三代的骨髓间充质干细胞消化后，加入DMEM培养基制备成单细胞悬液；
（2）按照1×106/ml的密度将细胞接种到离心管中，离心去除DMEM培养基；
（3）在离心管中加入成软骨分化培养基，将离心管置于细胞培养箱中37℃，5%CO2环境下进行培养；
（4）每2天进行一次换液，培养14-28天后，得到软骨细胞；
所述成软骨分化培养基由上述的成软骨分化培养基的制备方法制备得到。
本发明的有益效果在于：
1.本发明发现小分子化合物A922500在合适浓度范围内对骨髓间充质干细胞表现出良好的生物相容性，并在软骨分化过程中显示了良好的促进效果，其不仅可以有效的促进骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化和促进成软骨相关基因SOX9和COL2A1的表达，且效果优于TGF-β3；
2.使用小分子化合物A922500的成软骨培养基在14天和28天时均未显著提高RUNX2表达，表明小分子化合物A922500能够有效抑制软骨细胞的后期肥大化，防止软骨细胞继续分化为骨细胞。
综上所述，本发明的研究表明小分子化合物A922500能够促进和保持骨髓间充质干细胞向软骨细胞的定向分化,抑制终分化为骨细胞，因此A922500有望成为骨关节炎损伤修复的候选药物。
附图说明
图1为PCR检测的小分子化合物A922500对于骨髓间充质干细胞成软骨分化过程中SOX9基因表达水平的影响的结果图；
图2为小分子化合物A922500对于骨髓间充质干细胞成软骨分化过程中COL2A1基因表达水平的影响的结果图；
图3为阿利新蓝染色检测的小分子化合物A922500对于骨髓间充质干细胞成软骨分化影响的结果图；
图4为Western Blot检测的小分子化合物A922500对于骨髓间充质干细胞成软骨分化后期软骨细胞肥大化影响的结果图。
具体实施方式
下面将更详细地描述本发明的优选实施方式。虽然以下描述了本发明的优选实施方式，然而应该理解，可以以各种形式实现本发明而不应被这里阐述的实施方式所限制。
实施例1
检测A922500对于骨髓间充质干细胞的细胞毒性
1.将本公司保存的骨髓间充质干细胞复苏后培养至第三代；
2.使用胰酶将骨髓间充质干细胞消化后，加入培养箱重悬制备得到细胞悬液；
3.将细胞悬液添加到96孔细胞培养板中，将培养板置于细胞培养箱中，培养至细胞完全贴壁；
4.使用DMSO溶解A922500并使用0.2um滤膜进行过滤后备用；
5.去除96孔细胞培养板中的培养基，加入新的DMEM无血清培养基，并加入A922500使其终浓度为0.5μM，5μM，50μM，500μM，对照组不添加A922500，空白对照组仅添加培养基；
6.将培养板置于细胞培养箱中继续培养24h后， 加入CCK-8试剂检测各孔450nm的吸光度并计算细胞活性（实验组吸光度-空白对照组吸光度/对照组吸光度-空白对照组吸光度×100%），实验所得到的结果如表1所示。
表1 A922500对于骨髓间充质干细胞的细胞毒性
从表1中我们可以看出，当添加的A922500的浓度为1-50μM之间时，对于骨髓间充质干细胞的细胞活性没有显著的影响，当A922500的浓度为500μM时则会对骨髓间充质干细胞产生一定程度的抑制作用。
实施例2
利用荧光定量PCR检测A922500对于骨髓间充质干细胞的成软骨标志物SOX9和COL2A1的影响
步骤A：骨髓间充质干细胞成软骨培养
1.按照如下配方配置成软骨基础培养基：97.4 mL DMEM培养基，100μL 丙酮酸钠，1mL ITS添加物（胰岛素-转铁蛋白-硒），300μL 抗坏血酸，100μL 脯氨酸，100μL地塞米松B，1mL 青链霉素，混合均匀后，得到成软骨基础培养基；
2.在成软骨基础培养基中加入2%的胎牛血清，之后分别加入A922500（DMSO溶解后过滤除菌）使其终浓度为0.5μM，5μM，50μM，得到成软骨完全培养基a，b，c（实验组a，b，c）以及不含有A922500的成软骨完全培养基d（阴性对照）和添加有1%TGF-β3的完全培养基e（阳性对照组），0.22μm过滤后，备用；
3.将第三代的骨髓间充质干细胞使用胰酶消化后，加入DMEM完全培养基终止消化并制备成单细胞悬液；
4.按照1×106/ml的密度将细胞接种到15mL离心管中，1000rpm离心5min后，小心去除培养基；
5.在离心管中加入2mL步骤2所配置的成软骨完全培养基a，b，c，d和e置于细胞培养箱中进行培养（37℃ 5% CO2）；
6.每2天进行一次换液，共培养21天。
B:骨髓间充质干细胞RNA提取和荧光定量检测
1.小心的去除培养基后，使用PBS轻轻洗涤两次，然后离心去除上清液；
2.小心的将软骨球取出并置于1.5mL EP 管中，加入1ml TRIZOL试剂进行反复吹打；
3.将EP管置于冰上放置10分钟，然后将离心机参数调整为4℃，速度设置为12000r/min，将EP管放入离心机中离心5分钟，然后将上清液转移到新的1.5mL EP管中。
4.在EP管中加入200μL氯仿，反复震荡直至液面分层消失后，将EP管置于冰上放置5分钟，然后放入离心机以4℃ 12000r/min离心15分钟。
5.取出EP管，小心使用移液枪吸取最上层的水相；
6.将水相加入到新的EP管中，加入等体积的4℃异丙醇试剂，反复颠倒EP管后在冰上静置10分钟，然后将EP管放入离心机以4℃ 12000r/min离心10分钟；
7.取出EP管，小心去除上清液，加入75%乙醇溶液，上下颠倒EP管充分洗涤后，在4℃ 12000r/min下离心5分钟，然后使用移液器吸取上层溶液，常温烘干去除残余乙醇。
8.在 EP 管中加入20μL 无酶水，移液器反复吹打至RNA完全溶解。
9.使用TaKaRa反转录试剂盒PrimeScript™ RT reagent Kit将RNA反转录为cDNA；
10.使用TaKaRa一步法荧光染料法RT-qPCR试剂盒对SOX9和COL2A1的相对表达量进行检测。
PCR检测的结果如图1和图2所示，在图1中，溶液a组的SOX9基因的相对表达量为1.75±0.12，溶液b组的SOX9基因的相对表达量3.08±0.15，溶液c组的SOX9基因的相对表达量为3.17±0.15，阳性对照组的相对表达量为2.10±0.18；
在图2中，溶液a组的COL2A1基因的相对表达量为2.06±0.12，溶液b组的COL2A1基因的相对表达量为4.06±0.14，溶液c组的COL2A1基因的相对表达量为4.05±0.15，阳性对照组的相对表达量为2.25±0.13。
从上述的结果可以看出，相较于对照组，实验a，b和c组的SOX9基因和COL2A1基因的相对表达量均显著的升高（P＜0.05）；相较于溶液a组，实验b和c组的SOX9基因和COL2A1基因的相对表达量也显著的升高（P＜0.05），说明A922500促进SOX9基因和COL2A1基因时具有剂量依赖性；实验b和实验c组的SOX9基因和COL2A1基因的相对表达量无明显的差异，说明5μM A922500已经达到最佳效果；实验b和c组的SOX9基因和COL2A1基因的相对表达量也显著高于阳性对照组，说明A922500促进成软骨标志基因表达的效果优于TGF-β3。
实施例3
利用阿利新蓝染色检测A922500对于骨髓间充质干细胞的成软骨分化的影响
步骤A：骨髓间充质干细胞成软骨培养
1.按照如下配方配置成软骨基础培养基：97.4 mL DMEM培养基，100μL 丙酮酸钠，1mL ITS添加物（胰岛素-转铁蛋白-硒），300μL 抗坏血酸，100μL 脯氨酸，100μL地塞米松B，1mL 青链霉素，混合均匀后，得到成软骨基础培养基；
2.在成软骨基础培养基中加入2%的胎牛血清，之后分别加入A922500使其终浓度为5μM，得到成软骨完全培养基A（实验组A）以及不含有A922500的成软骨完全培养基B（阴性对照组）和添加有1%TGF-β3的完全培养基C（阳性对照组），0.22μm过滤后，备用；
3.将第三代的骨髓间充质干细胞使用胰酶消化后，加入DMEM完全培养基终止消化并制备成单细胞悬液；
4.按照1×106/ml的密度将细胞接种到15mL离心管中，1000rpm离心5min后，小心去除培养基；
5.在离心管中加入2mL步骤2所配置的成软骨完全培养基A，B和C置于细胞培养箱中进行培养（37℃ 5% CO2）；
6.每2天进行一次换液，共培养21天。
步骤B：阿利新蓝染色
1. 小心的去除培养基后，使用PBS轻轻洗涤两次，然后离心去除上清液；
2.每管中加入2mL 4%多聚甲醛，在室温下固定24h；
3.固定结束后，弃去4%多聚甲醛，用 5mL 的自来水浸泡 30 分钟；
4.去除自来水，依次浸泡于浓度为 65%、85%酒精中过夜；
5.将各组的软骨球使用石蜡包埋后切片；
6.脱蜡和脱水后，使用100μL阿利辛蓝染液室温染色 30 分钟；
7.用自来水缓慢冲洗3分钟之后，用蒸馏水冲洗1次，之后置于显微镜下进行观察和拍照。
从图3可以看出，实验组A的经成软骨培养后被阿利辛蓝染色的软骨细胞明显多于阴性对照组，且效果优于TGF-β3，说明在成软骨培养基中添加A922500可以显著的促进骨髓间充质干细胞的成软骨分化。
实施例4
检测A922500对于骨髓间充质干细胞成软骨分化后期肥大化的影响
步骤A：骨髓间充质干细胞成软骨培养
1.按照如下配方配置成软骨基础培养基：97.4 mL DMEM培养基，100μL 丙酮酸钠，1mL ITS添加物（胰岛素-转铁蛋白-硒），300μL 抗坏血酸，100μL 脯氨酸，100μL地塞米松B，1mL 青链霉素混合均匀后，得到成软骨基础培养基；
2.在成软骨基础培养基中加入2%的胎牛血清，之后分别加入A922500使其终浓度为5μM，得到成软骨完全培养基A（实验组A）以及不含有A922500的成软骨完全培养基B（阴性对照组）和添加有1% TGF-β3的成软骨完全培养基C（阳性对照组），0.22μm过滤后，备用；
3.将第三代的骨髓间充质干细胞使用胰酶消化后，加入DMEM完全培养基终止消化并制备成单细胞悬液；
4.按照1×106/ml的密度将细胞接种到15mL离心管中，1000rpm离心5min后，小心去除培养基；
5.在离心管中加入2mL步骤2所配置的成软骨完全培养基A，B和C置于细胞培养箱中进行培养（37℃ 5% CO2）；
6.每2天进行一次换液，共培养28天。
B:骨髓间充质干细胞蛋白提取和Western Blot检测
分别选择培养14天和28天的实验组A和阳性对照组以及培养28天的阴性对照组来进行实验
1.首先，小心的去除培养基后，使用PBS轻轻洗涤两次，然后离心去除上清液；
2.小心的将软骨球取出并置于1.5mL EP 管中，加入150μL RIPA裂解液冰上放置30min，每隔10min进行一次涡旋震荡；
3. 4℃，12000g离心30分钟后，吸取上清到新的EP管中，使用BCA法测定蛋白浓度，调整蛋白浓度为2μg/μL，之后置于100℃水浴加热5分钟；
4.配制SDS-PAGE电泳胶，配制好后，组装电泳架且每孔加入10μL蛋白溶液，开始电泳；
5.电泳结束后，按照经典的“三明治”模式进行电转夹的组装，加入冰盒后进行转膜，250mA转膜1.5h；
6.转膜结束后，将膜取出放置到5%的牛奶中，室温下封闭1h；
7.按照抗体说明书稀释RUNX2和β-actin一抗，添加一抗后，置于4℃冰箱中孵育过夜；
8.第二天，回收一抗，使用TBST洗膜后，加入二抗，室温下避光孵育1h；
9.使用TBST洗膜后，将洗好的膜进行曝光，得到的结果如图4所示。
从图4中可以看出，使用含1%的TGF-β3的成软骨完全培养基C培养14天时，细胞中RUNX2的表达水平并没有显著升高，而当培养28天时，细胞中RUNX2的表达水平发生了显著的升高，说明成软骨分化后的软骨细胞开始发生肥大化；
对于使用成软骨完全培养基A培养的细胞，在14天和28天时均未出现RUNX2表达量显著升高，说明使用添加小分子化合物A922500的成软骨培养基能够有效的抑制软骨细胞发生肥大化。
实施例5
一种用于骨髓间充质干细胞成软骨分化的成软骨分化培养基1
1.配置成软骨基础培养基（100mL）：97.4 mL DMEM培养基，100μL 丙酮酸钠，1mLITS添加物（胰岛素-转铁蛋白-硒），300μL 抗坏血酸，100μL 脯氨酸，100μL地塞米松B ，1mL青链霉素；
2.在成软骨基础培养基中加入2%的胎牛血清，之后加入DMSO溶解并过滤除菌的A922500使其终浓度为0.5μM，得到成软骨分化培养基1。
实施例6
一种用于骨髓间充质干细胞成软骨分化的成软骨分化培养基2
1.配置成软骨基础培养基（100mL）：97.4 mL DMEM培养基，100μL 丙酮酸钠，1mLITS添加物（胰岛素-转铁蛋白-硒），300μL 抗坏血酸，100μL 脯氨酸，100μL地塞米松B ，1mL青链霉素；
2.在成软骨基础培养基中加入2%的胎牛血清，之后加入DMSO溶解并过滤除菌的A922500使其终浓度为5μM，得到成软骨分化培养基2。
实施例7
一种用于骨髓间充质干细胞成软骨分化的成软骨分化培养基3
1.配置成软骨基础培养基（100mL）：97.4 mL DMEM培养基，100μL 丙酮酸钠，1mLITS添加物（胰岛素-转铁蛋白-硒），300μL 抗坏血酸，100μL 脯氨酸，100μL地塞米松B ，1mL青链霉素；
2.在成软骨基础培养基中加入5%的胎牛血清，之后加入DMSO溶解并过滤除菌的A922500使其终浓度为50μM，得到成软骨分化培养基3。
Claims (10)
1.一种小分子化合物在制备加快骨关节炎损伤修复的促进剂中的应用，其特征在于，所述小分子化合物为A922500，所述A922500的CAS号为959122-11-3。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述小分子化合物通过促进骨髓间充质干细胞的成软骨分化来实现加快骨关节炎损伤修复的效果。
3.一种小分子化合物在制备促进干细胞成软骨分化的成软骨分化培养基中的应用，其特征在于，所述小分子化合物为A922500，所述A922500的CAS号为959122-11-3。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述干细胞为骨髓间充质干细胞。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述成软骨分化培养基的制备方法包括如下步骤：
（1）每100mL的成软骨基础培养基的配置原料如下：97.4 mL DMEM培养基，100μL 丙酮酸钠，1mL ITS添加物，300μL 抗坏血酸，100μL 脯氨酸，100μL地塞米松B，1mL 青链霉素，混合均匀后得到成软骨基础培养基；
（2）在所述成软骨基础培养基中加入2-5%的胎牛血清，之后加入DMSO溶解并过滤除菌的A922500使其终浓度为0.5-50μM，得到成软骨分化培养基。
6.一种小分子化合物在制备抑制软骨细胞肥大分化的培养基中的应用，其特征在于，所述小分子化合物为A922500，所述A922500的CAS号为959122-11-3。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述软骨细胞为骨髓间充质干细胞经成软骨分化所得到的软骨细胞。
8.一种促进干细胞分化为软骨细胞的成软骨分化培养基，其特征在于，所述成软骨分化培养基的制备方法包括如下步骤：
（1）每100mL的成软骨基础培养基的配置原料如下：97.4 mL DMEM培养基，100μL 丙酮酸钠，1mL ITS添加物，300μL 抗坏血酸，100μL 脯氨酸，100μL地塞米松B，1mL 青链霉素，混合均匀后得到成软骨基础培养基；
（2）在所述成软骨基础培养基中加入2-5%的胎牛血清，之后加入DMSO溶解并过滤除菌的A922500使其终浓度为0.5-50μM，得到成软骨分化培养基。
9.根据权利要求8所述的成软骨分化培养基，其特征在于，所述干细胞为骨髓间充质干细胞。
10.一种促进骨髓间充质干细胞分化为软骨细胞的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
（1）将第三代的骨髓间充质干细胞消化后，加入DMEM培养基制备成单细胞悬液；
（2）按照1×106/ml的密度将细胞接种到离心管中，离心去除DMEM培养基；
（3）在离心管中加入成软骨分化培养基，将离心管置于细胞培养箱中37℃，5% CO2环境下进行培养；
（4）每2天进行一次换液，培养14-28天后，得到软骨细胞；
所述成软骨分化培养基由权利要求8所述的制备方法制备得到。
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