CN104958786A - 一种负载移植性神经干细胞的PF-127-LV-NFcocktail复合物及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种负载移植性神经干细胞的PF-127-LV-NFcocktail复合物及其制备方法和应用。该复合物包括：Pluronic F-127水凝胶、完全神经干细胞培养基、Lingo-1 shRNA慢病毒表达载体和神经生长因子混合物。该PF-127-LV-NFcocktail复合物的制备方法，包括：步骤一，Pluronic F-127水凝胶溶解于完全神经干细胞培养基；步骤二，加入Lingo-1 shRNA慢病毒表达载体；步骤三，加入神经生长因子混合物；步骤四，过滤除菌。该复合物能够负载移植神经干细胞、并能促进神经干细胞定向分化和神经再生。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种负载移植性神经干细胞的PF-127-LV-NFcocktail复合物及其制备方法和应用。
背景技术
针对脊髓损伤急性期的治疗主要是激素和传统手术治疗，但这些疗法对脊髓损伤所继发引起的多种神经功能障碍并无明显效果。脊髓损伤的发生发展往往与损伤后神经细胞的死亡以及与之相联系的投射神经元的进行性萎缩有关，其症状主要是因损伤导致大量神经细胞缺失，以及神经网络连接被破坏引起神经传递中断的结果。脊髓损伤后即使有一定程度的轴突再生，其再生能力也极其有限，越来越多的证据显示，内源性神经发生不足以修复损伤脊髓功能。修复脊髓损伤意味着神经网络组织结构在形态和功能两方面的修复：其目标在于重建神经通路连接并恢复一定程度的功能。因此，修复的策略重点在于替代在疾病过程中失去的神经细胞并促使神经生长，再建损伤后神经轴突与其靶器官及投射神经元联系，引导脊髓功能改善恢复。基于此，目前认为细胞替代疗法是治疗脊髓损伤富有潜力的策略。
神经干细胞（neural stem cells，NSCs）理论上是治疗脊髓损伤的首选细胞，是移植替代治疗的首选干细胞类型。许多学者尝试应用神经干细胞移植对脊髓损伤动物模型进行研究，并取得了一定的效果。国内也有多家综合实力雄厚的医院开展了初步的神经干细胞移植治疗脊髓损伤等。但实践中观察到，脊髓损伤后移植的外源性神经干细胞在受损脊髓病理微环境存活较少，可观察到移植细胞向神经元分化，但这种分化神经元的数目通常较少，且移植的神经干细胞绝大多数分化成星形胶质细胞。这种移植细胞存活少且倾向于分化为星形胶质细胞而非神经元的严重偏向是目前神经干细胞移植替代疗法的主要障碍之一。因此，使用神经干细胞移植治疗脊髓损伤的一个关键问题是如何改善移植后神经干细胞所处的损伤局部病理微环境，增加移植的神经干细胞存活生长，并使其尽可能多的定向分化为脊髓神经元。
研究发现，脊髓损伤后，髓鞘和胶质瘢痕释放的髓磷脂相关抑制因子是脊髓损伤后局部微环境中主要的抑制因素。目前发现的髓磷脂相关抑制因子主要包括轴突生长抑制因子（neurite outgrowth inhibitory A，NogoA）、髓磷脂相关糖蛋白(myelin- associated glycoprotein, MAG) 和少突胶质细胞髓磷脂糖蛋白( oligodendrocyte myelin glycoprotein, OMgp)。这些抑制因子可与神经细胞膜上的一种共受体成分-——LINGO-1（LRR and Ig domain-containing Nogo receptor interacting protein）结合。LINGO-1选择性表达在脑和脊髓的神经元和少突胶质细胞上，是细胞膜上NgR1/p75/LLNGO-1或NgR1/Troy /LINGO-1信号转导复合物的必要成分。髓磷脂抑制因子与LINGO-1结合后，引起其信号复合物活化，通过激活RhoA激酶将下游抑制信号转导入神经元和少突胶质细胞内，从而抑制中枢神经轴突生长和髓鞘形成。因此，LINGO-1的发现为改善脊髓损伤后的抑制环境提供了新的途径，即通过靶向抑制LINGO-1基因表达，减少其与损伤微环境中抑制因子的结合，并阻滞其下游信号的传导而促进神经生长。研究表明，拮抗LINGO-1对脊髓损伤后神经再生和功能恢复有明显效应。
进一步的研究发现，神经干细胞同样表达LINGO-1分子，拮抗LINGO-1的表达可增加神经干细胞的增殖，并使体外培养的神经干细胞定向神经元分化。
神经干细胞移植的另一个障碍是经胰蛋白酶处理的移植神经干细胞以细胞悬浮液形式直接移植入脊髓横断损伤部位后，多数只能存活在横断病灶边缘而不能均匀填充横断损伤的裂隙，造成分化后神经元的轴突延伸只能部分桥接损伤区域。因此，亟待有能均匀负载神经干细胞并填充损伤裂隙的支撑物，该支撑物还应能满足神经干细胞分化后神经轴突延伸生长的需要，并能降解吸收，有良好的脊髓组织相容性等。近年来日益令人瞩目的新型人工合成的智能生物材料Pluronic F-127（PF-127）水凝胶恰好能满足这些要求。PF-127是一种温度敏感型水凝胶，它在0℃左右为液态，而在37℃左右可由液态胶化转变为弹性凝胶态，能起到递送、释放药物和生物分子的运载系统以及生物支架的双重作用。PF-127已经美国FDA批准在人类使用，其生物相容性好，可生物降解吸收。有研究使用PF- 127在动物体内构建组织工程软骨和肺，其在脊髓损伤中的应用已有报道，并可在体外作为脂肪干细胞、骨髓间充质干细胞等种子干细胞三维立体培养的生物支架。PF-127在体内温度环境下胶化后内部形成三维孔洞，可为神经干细胞黏附、生长、增殖、分化及神经轴突延伸及突触形成提供有利条件。
发明内容
本发明的目的之一在于针对现有技术的不足，提供一种能负载移植性神经干细胞、并能促进神经干细胞定向分化和神经再生的的PF-127-LV-NFcocktail复合物。
本发明的目的之二在于针对现有技术的不足，提供能负载移植神经干细胞、并能促进神经干细胞定向分化和神经再生的PF-127-LV-NFcocktail复合物的制备方法。
本发明的目的之三在于针对现有技术的不足，提供PF-127-LV-NFcocktail复合物在促进移植性神经干细胞定向分化和存活中的应用。
为了实现上述目的之一，本发明采用如下技术方案：
提供一种负载移植性神经干细胞的PF-127-LV-NFcocktail复合物，它包括以下组份：Pluronic F-127水凝胶、完全神经干细胞培养基、Lingo-1 shRNA慢病毒表达载体和神经生长因子混合物；
所述神经生长因子混合物由以下组份组成：脑源性神经营养因子、神经营养因子-3、血小板源性生长因子、胰岛素样生长因子1、表皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子和胶质细胞源性神经营养因子。
所述Pluronic F-127水凝胶与所述完全神经干细胞培养基的混合比例为每100mL完全神经干细胞培养基中加入15g~25g的Pluronic F-127水凝胶；
所述Pluronic F-127水凝胶与所述神经生长因子混合物的质量比为15~25:10~20；
所述Lingo-1 shRNA慢病毒表达载体在所述Pluronic F-127水凝胶和所述完全神经干细胞培养基混合后得到的混合液中的滴度为1×107 TU/ml~4×107 TU/ml。
所述神经生长因子混合物中，所述脑源性神经营养因子、所述神经营养因子-3、所述血小板源性生长因子、所述胰岛素样生长因子1、所述表皮生长因子、所述碱性成纤维细胞生长因子和所述胶质细胞源性神经营养因子的混合质量比为3~7:3~7:0.5~1.5:0.5~1.5:0.5~1.5:0.5~1.5:0.5~1.5。
所述完全神经干细胞培养基是通过往DMEM/F-12培养基中加入胎牛血清、碱性成纤维细胞生长因子、青霉素和链霉素配制而成。
所述Lingo-1 shRNA慢病毒表达载体的基本特征如下：
Reporter Gene: GFP
Cloning Site at 5': BamHI Cloning Site at 3': EcoRI
Hairpin Loop Sequence: TCAAGAG
Target Size: 19mers。
为了实现上述目的之二，本发明采用如下技术方案：
提供一种负载移植性神经干细胞的PF-127-LV-NFcocktail复合物的制备方法，它包括以下步骤：
步骤一，Pluronic F-127水凝胶溶解于完全神经干细胞培养基：在一定温度下，并在搅拌的状态下，将配方量的Pluronic F-127水凝胶缓慢加入到配方量的完全神经干细胞培养基中，然后继续搅拌一定时间，得到混合液，然后将混合液在一定温度下静置一定时间后，得到半透明液态物；
步骤二，加入Lingo-1 shRNA慢病毒表达载体：在一定温度下，将Lingo-1 shRNA慢病毒表达载体与步骤一得到的半透明液态物以每毫升半透明液态物中含有1×107 TU/ml~4×107 TU/ml的Lingo-1 shRNA慢病毒表达载体的浓度混合，并搅拌均匀，得到第二混合液；
步骤三，加入神经生长因子混合物：在一定温度下，将配方量的神经生长因子混合物加入到步骤二得到的第二混合液中，并搅拌均匀，得到第三混合液；
步骤四，过滤除菌：将步骤三得到的第三混合液用一定孔径的微孔过滤器进行过滤除菌后，即得到PF-127-LV-NFcocktail复合物。
上述技术方案中，所述步骤一，在0℃~4℃下，并在搅拌的状态下，将配方量的Pluronic F-127水凝胶缓慢加入到配方量的完全神经干细胞培养基中，然后继续搅拌12小时~24小时，得到混合液，然后将混合液在2℃~4℃下静置22小时~26小时后，得到半透明液态物。
上述技术方案中，所述步骤二，在2℃~4℃下，将Lingo-1 shRNA慢病毒表达载体与步骤一得到的半透明液态物以每毫升半透明液态物中含有1×107 TU/ml~4×107 TU/ml的Lingo-1 shRNA慢病毒表达载体的浓度混合，并搅拌均匀，得到第二混合液；
所述步骤三，在2℃~4℃下，将配方量的神经生长因子混合物加入到步骤二得到的第二混合液中，并搅拌均匀，得到第三混合液。
上述技术方案中，所述步骤四，所述微孔过滤器的孔径为0.15μm ~0.35μm。
为了实现上述目的之三，本发明采用如下技术方案：
上述所述的PF-127-LV-NFcocktail复合物或者上述所述的PF-127-LV-NFcocktail复合物的制备方法所制得的PF-127-LV-NFcocktail复合物的应用，将PF-127-LV-NFcocktail复合物应用于负载移植性神经干细胞，能促进移植性神经干细胞的定向分化和存活，进而将移植性神经干细胞应用于治疗脊髓损伤疾病。
本发明与现有技术相比较，有益效果在于：
（1）本发明提供的一种负载移植性神经干细胞的PF-127-LV-NFcocktail复合物，能够负载移植神经干细胞、并能促进神经干细胞定向分化和神经再生。
（2）本发明提供的一种负载移植性神经干细胞的PF-127-LV-NFcocktail复合物，用于移植神经干细胞治疗脊髓损伤，该PF-127-LV-NFcocktail复合物能够抑制LINGO-1基因与髓磷脂抑制因子的结合，促进神经生长，从而使得更多的LINGO-1拮抗剂通过拮抗神经干细胞LINGO-1的表达，增加神经干细胞增殖，并促使神经干细胞向神经元分化。
（3）本发明提供的一种负载移植性神经干细胞的PF-127-LV-NFcocktail复合物，由于含有Lingo-1 shRNA慢病毒表达载体，从而能够特异性抑制神经干细胞LINGO-1基因和蛋白表达，在PF-127-LV-NFcocktail复合物负载神经干细胞的移植中，能够明显增加神经干细胞的增殖，并明显提高神经干细胞向神经细胞分化的比例。
（4）本发明提供的一种负载移植性神经干细胞的PF-127-LV-NFcocktail复合物，由于含有由脑源性神经营养因子、神经营养因子-3、血小板源性生长因子、胰岛素样生长因子1、表皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子和胶质细胞源性神经营养因子组成的神经生长因子混合物，从而使得该PF-127-LV-NFcocktail复合物在负载神经干细胞时，能够促进移植神经干细胞存活和增殖，并能为神经干细胞向神经元定向分化提供有利的微环境条件。
（5）本发明提供的一种负载移植性神经干细胞的PF-127-LV-NFcocktail复合物的制备方法，具有方法简单，生产成本低，无需高温，无需特殊复杂、昂贵设备，且能够适用于大规模生产的特点。
（6）本发明提供的PF-127-LV-NFcocktail复合物用于负载移植性神经干细胞，进而将负载移植性神经干细胞应用于治疗脊髓损伤疾病，由于采用PF-127-LV-NFcocktail复合物负载移植性神经干细胞，因此，既能利用Pluronic F-127水凝胶的三维多孔洞生物支架作用，为神经干细胞分化神经元及其轴突生长提供三维空间和一定的力学支撑，同时用于移植治疗脊髓损伤时还能够有效填补脊髓损伤裂隙；又能够利用Pluronic F-127水凝胶的递送而实现Lingo-1 shRNA慢病毒表达载体精确递送于脊髓损伤部位，通过阻断LINGO-1和髓磷脂抑制因子的结合，对抗损伤脊髓抑制性病理环境，促进神经干细胞定向分化和神经再生；另外，PF-127-LV-NFcocktail复合物的神经生长因子混合物则能够为神经干细胞的存活和发育分化提供有利条件，因此，该PF-127-LV-NFcocktail复合物能够有力促进神经干细胞移植治疗中枢和外周神经损伤的医学临床应用实践及前景，能够为脊髓损伤患者的治疗和康复提供新的治疗途径。
附图说明
图1是本发明的一种负载移植性神经干细胞的PF-127-LV-NFcocktail复合物包裹神经干细胞后的光学显微镜图。
具体实施方式
为了使本发明所解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
其中，本发明的PF-127-LV-NFcocktail复合物中，Lingo-1 shRNA慢病毒表达载体是根据Genebank中公布的大鼠Lingo-1 CDS序列进行设计、合成的siRNA序列。
实施例1。
一种负载移植性神经干细胞的PF-127-LV-NFcocktail复合物，它包括以下组份：Pluronic F-127水凝胶、完全神经干细胞培养基、Lingo-1 shRNA慢病毒表达载体和神经生长因子混合物；
其中，神经生长因子混合物由以下组份组成：脑源性神经营养因子、神经营养因子-3、血小板源性生长因子、胰岛素样生长因子1、表皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子和胶质细胞源性神经营养因子。
本实施例中，Pluronic F-127水凝胶与完全神经干细胞培养基的混合比例为每100mL完全神经干细胞培养基中加入20g的Pluronic F-127水凝胶；
本实施例中，Pluronic F-127水凝胶与神经生长因子混合物的质量比为20:15；
本实施例中，Lingo-1 shRNA慢病毒表达载体在Pluronic F-127水凝胶和完全神经干细胞培养基混合后得到的混合液中的滴度为2×107 TU/ml。
本实施例中，神经生长因子混合物中，脑源性神经营养因子、神经营养因子-3、血小板源性生长因子、胰岛素样生长因子1、表皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子和胶质细胞源性神经营养因子的混合质量比为5:5:1:1:1:1:1。
其中，完全神经干细胞培养基是通过往DMEM/F-12培养基中加入胎牛血清、碱性成纤维细胞生长因子、青霉素和链霉素配制而成。本实施例的完全神经干细胞培养基中，胎牛血清的质量百分比浓度为2%，碱性成纤维细胞生长因子的质量体积浓度为10ng/mL，青霉素的质量体积浓度为100μg/mL，链霉素的质量体积浓度为100μg/mL。
其中，Lingo-1 shRNA慢病毒表达载体的基本特征如下：
Reporter Gene: GFP
Cloning Site at 5': BamHI Cloning Site at 3': EcoRI
Hairpin Loop Sequence: TCAAGAG
Target Size: 19mers。
上述一种负载移植性神经干细胞的PF-127-LV-NFcocktail复合物的制备方法，它包括以下步骤：
步骤一，Pluronic F-127水凝胶溶解于完全神经干细胞培养基：在0℃下，并在搅拌的状态下，将配方量的Pluronic F-127水凝胶缓慢加入到配方量的完全神经干细胞培养基中，然后继续搅拌20小时，得到混合液，然后将混合液在2℃下静置24小时后，得到半透明液态物；
步骤二，加入Lingo-1 shRNA慢病毒表达载体：在2℃下，将Lingo-1 shRNA慢病毒表达载体与步骤一得到的半透明液态物以每毫升半透明液态物中含有2×107 TU/ml的Lingo-1 shRNA慢病毒表达载体的浓度混合，并搅拌均匀，得到第二混合液；
步骤三，加入神经生长因子混合物：在2℃下，将配方量的神经生长因子混合物加入到步骤二得到的第二混合液中，并搅拌均匀，得到第三混合液；
步骤四，过滤除菌：将步骤三得到的第三混合液用孔径为0.22μm的微孔过滤器进行过滤除菌后，即得到PF-127-LV-NFcocktail复合物。
上述PF-127-LV-NFcocktail复合物的制备方法所制得的PF-127-LV-NFcocktail复合物应用于负载移植性神经干细胞，能促进移植性神经干细胞的定向分化和存活，进而将移植性神经干细胞应用于治疗脊髓损伤疾病。
实施例2。
一种负载移植性神经干细胞的PF-127-LV-NFcocktail复合物，它包括以下组份：Pluronic F-127水凝胶、完全神经干细胞培养基、Lingo-1 shRNA慢病毒表达载体和神经生长因子混合物；
其中，神经生长因子混合物由以下组份组成：脑源性神经营养因子、神经营养因子-3、血小板源性生长因子、胰岛素样生长因子1、表皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子和胶质细胞源性神经营养因子。
本实施例中，Pluronic F-127水凝胶与完全神经干细胞培养基的混合比例为每100mL完全神经干细胞培养基中加入15g的Pluronic F-127水凝胶；
本实施例中，Pluronic F-127水凝胶与神经生长因子混合物的质量比为15:10；
本实施例中，Lingo-1 shRNA慢病毒表达载体在Pluronic F-127水凝胶和完全神经干细胞培养基混合后得到的混合液中的滴度为1×107 TU/ml。
本实施例中，神经生长因子混合物中，脑源性神经营养因子、神经营养因子-3、血小板源性生长因子、胰岛素样生长因子1、表皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子和胶质细胞源性神经营养因子的混合质量比为3:3:0.5: 0.5: 0.5: 0.5: 0.5。
其中，完全神经干细胞培养基是通过往DMEM/F-12培养基中加入胎牛血清、碱性成纤维细胞生长因子、青霉素和链霉素配制而成。本实施例的完全神经干细胞培养基中，胎牛血清的质量百分比浓度为2%，碱性成纤维细胞生长因子的质量体积浓度为10ng/mL，青霉素的质量体积浓度为100μg/mL，链霉素的质量体积浓度为100μg/mL。
其中，Lingo-1 shRNA慢病毒表达载体的基本特征如下：
Reporter Gene: GFP
Cloning Site at 5': BamHI Cloning Site at 3': EcoRI
Hairpin Loop Sequence: TCAAGAG
Target Size: 19mers。
上述一种负载移植性神经干细胞的PF-127-LV-NFcocktail复合物的制备方法，它包括以下步骤：
步骤一，Pluronic F-127水凝胶溶解于完全神经干细胞培养基：在4℃下，并在搅拌的状态下，将配方量的Pluronic F-127水凝胶缓慢加入到配方量的完全神经干细胞培养基中，然后继续搅拌24小时，得到混合液，然后将混合液在4℃下静置22小时后，得到半透明液态物；
步骤二，加入Lingo-1 shRNA慢病毒表达载体：在4℃下，将Lingo-1 shRNA慢病毒表达载体与步骤一得到的半透明液态物以每毫升半透明液态物中含有1×107 TU/ml的Lingo-1 shRNA慢病毒表达载体的浓度混合，并搅拌均匀，得到第二混合液；
步骤三，加入神经生长因子混合物：在4℃下，将配方量的神经生长因子混合物加入到步骤二得到的第二混合液中，并搅拌均匀，得到第三混合液；
步骤四，过滤除菌：将步骤三得到的第三混合液用孔径为0.15μm的微孔过滤器进行过滤除菌后，即得到PF-127-LV-NFcocktail复合物。
上述PF-127-LV-NFcocktail复合物的制备方法所制得的PF-127-LV-NFcocktail复合物应用于负载移植性神经干细胞，能促进移植性神经干细胞的定向分化和存活，进而将移植性神经干细胞应用于治疗脊髓损伤疾病。
实施例3。
一种负载移植性神经干细胞的PF-127-LV-NFcocktail复合物，它包括以下组份：Pluronic F-127水凝胶、完全神经干细胞培养基、Lingo-1 shRNA慢病毒表达载体和神经生长因子混合物；
其中，神经生长因子混合物由以下组份组成：脑源性神经营养因子、神经营养因子-3、血小板源性生长因子、胰岛素样生长因子1、表皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子和胶质细胞源性神经营养因子。
本实施例中，Pluronic F-127水凝胶与完全神经干细胞培养基的混合比例为每100mL完全神经干细胞培养基中加入25g的Pluronic F-127水凝胶；
本实施例中，Pluronic F-127水凝胶与神经生长因子混合物的质量比为25:20；
本实施例中，Lingo-1 shRNA慢病毒表达载体在Pluronic F-127水凝胶和完全神经干细胞培养基混合后得到的混合液中的滴度为4×107 TU/ml。
本实施例中，神经生长因子混合物中，脑源性神经营养因子、神经营养因子-3、血小板源性生长因子、胰岛素样生长因子1、表皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子和胶质细胞源性神经营养因子的混合质量比为7:7:1.5: 1.5: 1.5: 1.5: 1.5。
其中，完全神经干细胞培养基是通过往DMEM/F-12培养基中加入胎牛血清、碱性成纤维细胞生长因子、青霉素和链霉素配制而成。本实施例的完全神经干细胞培养基中，胎牛血清的质量百分比浓度为2%，碱性成纤维细胞生长因子的质量体积浓度为10ng/mL，青霉素的质量体积浓度为100μg/mL，链霉素的质量体积浓度为100μg/mL。
其中，Lingo-1 shRNA慢病毒表达载体的基本特征如下：
Reporter Gene: GFP
Cloning Site at 5': BamHI Cloning Site at 3': EcoRI
Hairpin Loop Sequence: TCAAGAG
Target Size: 19mers。
上述一种负载移植性神经干细胞的PF-127-LV-NFcocktail复合物的制备方法，它包括以下步骤：
步骤一，Pluronic F-127水凝胶溶解于完全神经干细胞培养基：在2℃下，并在搅拌的状态下，将配方量的Pluronic F-127水凝胶缓慢加入到配方量的完全神经干细胞培养基中，然后继续搅拌12小时，得到混合液，然后将混合液在3℃下静置26小时后，得到半透明液态物；
步骤二，加入Lingo-1 shRNA慢病毒表达载体：在3℃下，将Lingo-1 shRNA慢病毒表达载体与步骤一得到的半透明液态物以每毫升半透明液态物中含有4×107 TU/ml的Lingo-1 shRNA慢病毒表达载体的浓度混合，并搅拌均匀，得到第二混合液；
步骤三，加入神经生长因子混合物：在3℃下，将配方量的神经生长因子混合物加入到步骤二得到的第二混合液中，并搅拌均匀，得到第三混合液；
步骤四，过滤除菌：将步骤三得到的第三混合液用孔径为0.35μm的微孔过滤器进行过滤除菌后，即得到PF-127-LV-NFcocktail复合物。
上述PF-127-LV-NFcocktail复合物的制备方法所制得的PF-127-LV-NFcocktail复合物应用于负载移植性神经干细胞，能促进移植性神经干细胞的定向分化和存活，进而将移植性神经干细胞应用于治疗脊髓损伤疾病。
实施例4。
一种负载移植性神经干细胞的PF-127-LV-NFcocktail复合物，它包括以下组份：Pluronic F-127水凝胶、完全神经干细胞培养基、Lingo-1 shRNA慢病毒表达载体和神经生长因子混合物；
其中，神经生长因子混合物由以下组份组成：脑源性神经营养因子、神经营养因子-3、血小板源性生长因子、胰岛素样生长因子1、表皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子和胶质细胞源性神经营养因子。
本实施例中，Pluronic F-127水凝胶与完全神经干细胞培养基的混合比例为每100mL完全神经干细胞培养基中加入18g的Pluronic F-127水凝胶；
本实施例中，Pluronic F-127水凝胶与神经生长因子混合物的质量比为17:12；
本实施例中，Lingo-1 shRNA慢病毒表达载体在Pluronic F-127水凝胶和完全神经干细胞培养基混合后得到的混合液中的滴度为3×107 TU/ml。
本实施例中，神经生长因子混合物中，脑源性神经营养因子、神经营养因子-3、血小板源性生长因子、胰岛素样生长因子1、表皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子和胶质细胞源性神经营养因子的混合质量比为4:5:0.7: 1.2: 0.9: 0.8: 1.1。
其中，完全神经干细胞培养基是通过往DMEM/F-12培养基中加入胎牛血清、碱性成纤维细胞生长因子、青霉素和链霉素配制而成。本实施例的完全神经干细胞培养基中，胎牛血清的质量百分比浓度为2%，碱性成纤维细胞生长因子的质量体积浓度为10ng/mL，青霉素的质量体积浓度为100μg/mL，链霉素的质量体积浓度为100μg/mL。
其中，Lingo-1 shRNA慢病毒表达载体的基本特征如下：
Reporter Gene: GFP
Cloning Site at 5': BamHI Cloning Site at 3': EcoRI
Hairpin Loop Sequence: TCAAGAG
Target Size: 19mers。
上述一种负载移植性神经干细胞的PF-127-LV-NFcocktail复合物的制备方法，它包括以下步骤：
步骤一，Pluronic F-127水凝胶溶解于完全神经干细胞培养基：在1℃下，并在搅拌的状态下，将配方量的Pluronic F-127水凝胶缓慢加入到配方量的完全神经干细胞培养基中，然后继续搅拌15小时，得到混合液，然后将混合液在2.5℃下静置23小时后，得到半透明液态物；
步骤二，加入Lingo-1 shRNA慢病毒表达载体：在2.5℃下，将Lingo-1 shRNA慢病毒表达载体与步骤一得到的半透明液态物以每毫升半透明液态物中含有3×107 TU/ml的Lingo-1 shRNA慢病毒表达载体的浓度混合，并搅拌均匀，得到第二混合液；
步骤三，加入神经生长因子混合物：在2.5℃下，将配方量的神经生长因子混合物加入到步骤二得到的第二混合液中，并搅拌均匀，得到第三混合液；
步骤四，过滤除菌：将步骤三得到的第三混合液用孔径为0.25μm的微孔过滤器进行过滤除菌后，即得到PF-127-LV-NFcocktail复合物。
上述PF-127-LV-NFcocktail复合物的制备方法所制得的PF-127-LV-NFcocktail复合物用于促进移植性神经干细胞定向分化和存活的应用，即，将PF-127-LV-NFcocktail复合物用于负载移植神经干细胞，然后用于治疗脊髓损伤的应用。
实施例5。
一种负载移植性神经干细胞的PF-127-LV-NFcocktail复合物，它包括以下组份：Pluronic F-127水凝胶、完全神经干细胞培养基、Lingo-1 shRNA慢病毒表达载体和神经生长因子混合物；
其中，神经生长因子混合物由以下组份组成：脑源性神经营养因子、神经营养因子-3、血小板源性生长因子、胰岛素样生长因子1、表皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子和胶质细胞源性神经营养因子。
本实施例中，Pluronic F-127水凝胶与完全神经干细胞培养基的混合比例为每100mL完全神经干细胞培养基中加入22g的Pluronic F-127水凝胶；
本实施例中，Pluronic F-127水凝胶与神经生长因子混合物的质量比为23:18；
本实施例中，Lingo-1 shRNA慢病毒表达载体在Pluronic F-127水凝胶和完全神经干细胞培养基混合后得到的混合液中的滴度为2.5×107 TU/ml。
本实施例中，神经生长因子混合物中，脑源性神经营养因子、神经营养因子-3、血小板源性生长因子、胰岛素样生长因子1、表皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子和胶质细胞源性神经营养因子的混合质量比为6:4:1.3: 0.8: 1.4: 1.2: 0.9。
其中，完全神经干细胞培养基是通过往DMEM/F-12培养基中加入胎牛血清、碱性成纤维细胞生长因子、青霉素和链霉素配制而成。本实施例的完全神经干细胞培养基中，胎牛血清的质量百分比浓度为2%，碱性成纤维细胞生长因子的质量体积浓度为10ng/mL，青霉素的质量体积浓度为100μg/mL，链霉素的质量体积浓度为100μg/mL。
其中，Lingo-1 shRNA慢病毒表达载体的基本特征如下：
Reporter Gene: GFP
Cloning Site at 5': BamHI Cloning Site at 3': EcoRI
Hairpin Loop Sequence: TCAAGAG
Target Size: 19mers。
上述一种负载移植性神经干细胞的PF-127-LV-NFcocktail复合物的制备方法，它包括以下步骤：
步骤一，Pluronic F-127水凝胶溶解于完全神经干细胞培养基：在3℃下，并在搅拌的状态下，将配方量的Pluronic F-127水凝胶缓慢加入到配方量的完全神经干细胞培养基中，然后继续搅拌22小时，得到混合液，然后将混合液在3.5℃下静置25小时后，得到半透明液态物；
步骤二，加入Lingo-1 shRNA慢病毒表达载体：在3.5℃下，将Lingo-1 shRNA慢病毒表达载体与步骤一得到的半透明液态物以每毫升半透明液态物中含有2.5×107 TU/ml的Lingo-1 shRNA慢病毒表达载体的浓度混合，并搅拌均匀，得到第二混合液；
步骤三，加入神经生长因子混合物：在3.5℃下，将配方量的神经生长因子混合物加入到步骤二得到的第二混合液中，并搅拌均匀，得到第三混合液；
步骤四，过滤除菌：将步骤三得到的第三混合液用孔径为0.30μm的微孔过滤器进行过滤除菌后，即得到PF-127-LV-NFcocktail复合物。
上述PF-127-LV-NFcocktail复合物的制备方法所制得的PF-127-LV-NFcocktail复合物应用于负载移植性神经干细胞，能促进移植性神经干细胞的定向分化和存活，进而将移植性神经干细胞应用于治疗脊髓损伤疾病。
实施例6。
一种负载移植性神经干细胞的PF-127-LV-NFcocktail复合物，它包括以下组份：Pluronic F-127水凝胶、完全神经干细胞培养基、Lingo-1 shRNA慢病毒表达载体和神经生长因子混合物；
其中，神经生长因子混合物由以下组份组成：脑源性神经营养因子、神经营养因子-3、血小板源性生长因子、胰岛素样生长因子1、表皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子和胶质细胞源性神经营养因子。
本实施例中，Pluronic F-127水凝胶与完全神经干细胞培养基的混合比例为每100mL完全神经干细胞培养基中加入19g的Pluronic F-127水凝胶；
本实施例中，Pluronic F-127水凝胶与神经生长因子混合物的质量比为24:16；
本实施例中，Lingo-1 shRNA慢病毒表达载体在Pluronic F-127水凝胶和完全神经干细胞培养基混合后得到的混合液中的滴度为3.5×107 TU/ml。
本实施例中，神经生长因子混合物中，脑源性神经营养因子、神经营养因子-3、血小板源性生长因子、胰岛素样生长因子1、表皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子和胶质细胞源性神经营养因子的混合质量比为5:6:0.9: 0.6: 0.6: 1.4: 1.3。
其中，完全神经干细胞培养基是通过往DMEM/F-12培养基中加入胎牛血清、碱性成纤维细胞生长因子、青霉素和链霉素配制而成。本实施例的完全神经干细胞培养基中，胎牛血清的质量百分比浓度为2%，碱性成纤维细胞生长因子的质量体积浓度为10ng/mL，青霉素的质量体积浓度为100μg/mL，链霉素的质量体积浓度为100μg/mL。
其中，Lingo-1 shRNA慢病毒表达载体的基本特征如下：
Reporter Gene: GFP
Cloning Site at 5': BamHI Cloning Site at 3': EcoRI
Hairpin Loop Sequence: TCAAGAG
Target Size: 19mers。
上述一种负载移植性神经干细胞的PF-127-LV-NFcocktail复合物的制备方法，它包括以下步骤：
步骤一，Pluronic F-127水凝胶溶解于完全神经干细胞培养基：在1.5℃下，并在搅拌的状态下，将配方量的Pluronic F-127水凝胶缓慢加入到配方量的完全神经干细胞培养基中，然后继续搅拌18小时，得到混合液，然后将混合液在3℃下静置24.5小时后，得到半透明液态物；
步骤二，加入Lingo-1 shRNA慢病毒表达载体：在3℃下，将Lingo-1 shRNA慢病毒表达载体与步骤一得到的半透明液态物以每毫升半透明液态物中含有3.5×107 TU/ml的Lingo-1 shRNA慢病毒表达载体的浓度混合，并搅拌均匀，得到第二混合液；
步骤三，加入神经生长因子混合物：在3℃下，将配方量的神经生长因子混合物加入到步骤二得到的第二混合液中，并搅拌均匀，得到第三混合液；
步骤四，过滤除菌：将步骤三得到的第三混合液用孔径为0.18μm的微孔过滤器进行过滤除菌后，即得到PF-127-LV-NFcocktail复合物。
上述PF-127-LV-NFcocktail复合物的制备方法所制得的PF-127-LV-NFcocktail复合物应用于负载移植性神经干细胞，能促进移植性神经干细胞的定向分化和存活，进而将移植性神经干细胞应用于治疗脊髓损伤疾病。
应用实验
一、PF-127-LV-NFcocktail复合物包裹神经干细胞三维培养的实验
1．种子细胞的分离、培养鉴定
大鼠胚胎神经干细胞取材及培养：取孕龄为14天的SD大鼠处死，然后利用浓度为75％的乙醇浸泡处死后的SD大鼠以进行消毒，然后在无菌条件下打开SD大鼠的腹腔，取出胎鼠，然后取出胎鼠的大脑皮质并移至培养皿，然后将胎鼠的大脑皮质剪碎并轻轻吹打其呈悬浊状，过200目筛网，离心弃去上清液，将沉淀用不完全神经干细胞培养基（DMEM/F-12必需培养基，内加10ng/ml的碱性成纤维细胞生长因子，100μ/ml青霉素和100μg / ml链霉素）重悬，然后种入培养瓶中培养。培养条件参照[AbematsuM et al，J Clin Invest，2010]。
培养方法：在显微镜下观察细胞，神经干细胞悬浮成“神经球”生长，通常情况下，每两天换液一次，每四天传代一次。然后置于37℃、5%CO2的培养箱中培养，传代至3~5代的细胞用于移植。
培养神经干细胞鉴定：用神经干细胞标志蛋白Nestin荧光免疫染色检测鉴定生长的神经球。结果显示培养细胞确为神经干细胞。
制备移植神经干细胞悬浮液：在生物安全柜或者超净台中，将培养瓶中的含有神经球的培养基转移到15ml离心管中，然后进行500rpm离心5分钟，收集神经干细胞。 加入1ml 浓度为0.125%含有EDTA的胰酶，在超净工作台中轻轻吹打10次，注意不要消化太久，消化的目的是缩小神经球的体积，分散成单个神经干细胞，而不是消化神经干细胞。 然后加入5ml培养基，吹打均匀后进行1000rpm 离心5分钟，去掉上清液，得到神经干细胞。
2．PF-127-LV-NFcocktail复合物包裹神经干细胞
在0℃~4℃下，用PF-127-LV-NFcocktail复合物重悬上述得到的神经干细胞，得到神经干细胞悬浮液，准备移植。待移植的神经干细胞细胞悬浮液在PF-127-LV-NFcocktail复合物中的配制浓度约为2×103个/μL，然后在无菌条件下轻轻搅拌神经干细胞悬浮液使PF-127-LV-NFcocktail复合物与神经干细胞包裹均匀，然后将神经干细胞悬浮液接种到培养板中，并将培养板保持在37℃、5％CO2的细胞培养箱中5分钟，以诱导凝胶形成，并利用光学显微镜确认神经干细胞被PF-127-LV-NFcocktail复合物均匀包裹，见图1。即完成PF-127-LV-NFcocktail复合物对神经干细胞的包裹负载。然后用常规完全神经干细胞培养基覆盖培养板孔（不超过板孔体积1/2），并在含37℃、5％CO2的培养箱中继续培养。
3．PF-127-LV-NFcocktail复合物包裹三维培养神经干细胞的效果观察检测
表1 活/死（Live/Dead）染色检测不同方式培养神经干细胞4天后的存活细胞百分比（x ±s）
| 对照组（%） | PF-127-LV-NFcocktail复合物负载神经干细胞培养组（%） | |
| 存活细胞百分比 | 73.67±2.91 | 89.61±3.24 |
培养组与对照组（Pluronic F-127水凝胶平面二维培养）比较p<0.01
由表1可知，培养组的神经干细胞存活率明显高于对照组，从而说明PF-127-LV-NFcocktail复合物负载三维培养神经干细胞能够显著提高神经干细胞的存活率。
表2 免疫荧光染色检测不同方式培养神经干细胞7天后的Nestin（神经干细胞标志蛋白）染色阳性细胞比例（x ±s）
| 对照组（%） | PF-127-LV-NFcocktail复合物负载神经干细胞培养组（%） | |
| Nestin染色阳性细胞比例 | 61.79±2.67 | 82.51±4.36% |
培养组与对照组（培养皿正常培养基悬浮培养）比较p<0.01。
由表2可知，培养组的Nestin染色阳性细胞比例明显高于对照组，从而说明了PF-127-LV-NFcocktail复合物负载三维培养神经干细胞能够明显提高神经干细胞的增殖率。
表3 免疫荧光检测不同方式培养神经干细胞14天后其分化为不同谱系细胞的比例（x ±s）
| 对照组（%） | PF-127-LV-NFcocktail复合物负载神经干细胞培养组（%） | |
| βⅢtublin染色阳性细胞比例 | 46.79±3.43 | 62.81±2.35% |
| GFAP染色阳性细胞比例 | 43.61±2.72 | 26.55±2.12 |
| CNPase染色阳性细胞比例 | 10.24±1.03 | 11.05±3.14 |
培养组与对照组（培养皿贴壁诱导分化培养）比较p<0.01。
分别进行神经元标志蛋白分子βⅢtublin、星型胶质细胞标志蛋白神经胶质纤维酸性蛋白（GFAP）、少突胶质细胞标志蛋白2’,3’-环核苷酸 3’-磷酸二酯酶(CNPase)的免疫荧光染色检测，由表3可以看出，PF-127-LV-NFcocktail复合物负载培养神经干细胞组分化为神经元的比例（即βⅢtublin染色阳性细胞比例）明显优于对照组。培养组少突胶质细胞分化比例（即CNPase染色阳性细胞比例）较对照组略有增加，而培养组中分化成星型胶质细胞的比例（即GFAP染色阳性细胞比例）较对照组下降。
二、PF-127-LV-NFcocktail复合物包裹神经干细胞移植治疗脊髓损伤
1．脊髓全横断大鼠模型制作：
雌性SD大鼠，体重180g~220g，施行T10脊髓全横断手术，然后用10%水合氯醛（3.5mg/kg）麻醉，切除锥板，暴露T10胸段脊髓，用尖细的手术刀横向切除脊髓组织，造成脊髓纵向约2mm宽的损伤裂隙。手术尽量遵循无菌操作。依次缝合肌肉和皮肤。术后护理：一日三次人工协助膀胱排尿，直至大鼠膀胱反射功能恢复自主排尿。其他常规喂饲。
2．PF-127-LV-NFcocktail复合物包裹神经干细胞移植
移植总量均为10μL。移植的神经干细胞细胞悬浮液在PF-127-LV-NFcocktail复合物中的配制浓度约为2×103个/μL。大鼠手术一周后，在脊髓损伤裂隙中用微量注射器植入。注意微量注射器尖端谨慎插入脊髓横断损伤裂隙中心位置，尽量勿触及周围脊髓，植入后依次缝合肌肉和皮肤。术后护理：一日三次人工协助膀胱排尿，直至大鼠膀胱反射功能恢复自主排尿。其他常规喂饲。所有大鼠每日一次皮下注射环孢素A免疫抑制剂（10 mg/kg）与庆大霉素（8 mg/kg）。
3．PF-127-LV-NFcocktail复合物包裹神经干细胞移植
表4 Tunnel染色检测PF-127-LV-NFcocktail复合物负载神经干细胞移植7天后大鼠脊髓损伤局部及其邻近部位细胞比例（x ±s）
| 对照组（%） | 移植组（%） | |
| Tunnel染色阳性细胞比例 | 31 ± 4.3 | 13.4 ± 2.8 |
移植组与对照组（脊髓损伤后单纯移植神经干细胞）比较 p<0.01。
由表4可知，PF-127-LV-NFcocktail复合物负载神经干细胞移植治疗脊髓损伤与单纯移植神经干细胞对照组相比，能够明显减少移植脊髓损伤的神经干细胞及邻近脊髓组织细胞凋亡。
表5 尼氏染色检测PF-127-LV-NFcocktail复合物负载神经干细胞移植28天后大鼠脊髓损伤部位及其邻近神经元数量（个）（x ±s）
| 对照组 | 移植组 | |
| 神经元计数 | 421±10.45 | 683±15.82 |
移植组与对照组（脊髓损伤后单纯移植神经干细胞）比较p<0.01。
在不同处理取材脊髓损伤纵切面经尼氏染色检测，由表5可看出，PF-127-LV-NFcocktail复合物负载神经干细胞的移植组大鼠标本其脊髓损伤部位及其邻近神经元数量明显多于对照组，从而说明了PF-127-LV-NFcocktail复合物负载神经干细胞移植一方面能够促进移植神经干细胞对脊髓损伤大鼠分化为脊髓神经元，且有显著作用。
最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细地说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
Claims (10)
1.一种负载移植性神经干细胞的PF-127-LV-NFcocktail复合物，其特征在于：它包括以下组份：Pluronic F-127水凝胶、完全神经干细胞培养基、Lingo-1 shRNA慢病毒表达载体和神经生长因子混合物；
所述神经生长因子混合物由以下组份组成：脑源性神经营养因子、神经营养因子-3、血小板源性生长因子、胰岛素样生长因子1、表皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子和胶质细胞源性神经营养因子。
2.根据权利要求1所述的一种负载移植性神经干细胞的PF-127-LV-NFcocktail复合物，其特征在于：所述Pluronic F-127水凝胶与所述完全神经干细胞培养基的混合比例为每100mL完全神经干细胞培养基中加入15g~25g的Pluronic F-127水凝胶；
所述Pluronic F-127水凝胶与所述神经生长因子混合物的质量比为15~25:10~20；
所述Lingo-1 shRNA慢病毒表达载体在所述Pluronic F-127水凝胶和所述完全神经干细胞培养基混合后得到的混合液中的滴度为1×107 TU/ml~4×107 TU/ml。
3.根据权利要求1所述的一种负载移植性神经干细胞的PF-127-LV-NFcocktail复合物，其特征在于：所述神经生长因子混合物中，所述脑源性神经营养因子、所述神经营养因子-3、所述血小板源性生长因子、所述胰岛素样生长因子1、所述表皮生长因子、所述碱性成纤维细胞生长因子和所述胶质细胞源性神经营养因子的混合质量比为3~7:3~7:0.5~1.5:0.5~1.5:0.5~1.5:0.5~1.5:0.5~1.5。
4.根据权利要求1所述的一种负载移植性神经干细胞的PF-127-LV-NFcocktail复合物，其特征在于：所述完全神经干细胞培养基是通过往DMEM/F-12培养基中加入胎牛血清、碱性成纤维细胞生长因子、青霉素和链霉素配制而成。
5.根据权利要求1所述的一种负载移植性神经干细胞的PF-127-LV-NFcocktail复合物，其特征在于：所述Lingo-1 shRNA慢病毒表达载体的基本特征如下：
Reporter Gene: GFP
Cloning Site at 5': BamHI Cloning Site at 3': EcoRI
Hairpin Loop Sequence: TCAAGAG
Target Size: 19mers。
6.权利要求1至5任意一项所述的一种负载移植性神经干细胞的PF-127-LV-NFcocktail复合物的制备方法，其特征在于：它包括以下步骤：
步骤一，Pluronic F-127水凝胶溶解于完全神经干细胞培养基：在一定温度下，并在搅拌的状态下，将配方量的Pluronic F-127水凝胶缓慢加入到配方量的完全神经干细胞培养基中，然后继续搅拌一定时间，得到混合液，然后将混合液在一定温度下静置一定时间后，得到半透明液态物；
步骤二，加入Lingo-1 shRNA慢病毒表达载体：在一定温度下，将Lingo-1 shRNA慢病毒表达载体与步骤一得到的半透明液态物以每毫升半透明液态物中含有1×107 TU/ml~4×107 TU/ml的Lingo-1 shRNA慢病毒表达载体的浓度混合，并搅拌均匀，得到第二混合液；
步骤三，加入神经生长因子混合物：在一定温度下，将配方量的神经生长因子混合物加入到步骤二得到的第二混合液中，并搅拌均匀，得到第三混合液；
步骤四，过滤除菌：将步骤三得到的第三混合液用一定孔径的微孔过滤器进行过滤除菌后，即得到PF-127-LV-NFcocktail复合物。
7.根据权利要求6所述的一种负载移植性神经干细胞的PF-127-LV-NFcocktail复合物的制备方法，其特征在于：所述步骤一，在0℃~4℃下，并在搅拌的状态下，将配方量的Pluronic F-127水凝胶缓慢加入到配方量的完全神经干细胞培养基中，然后继续搅拌12小时~24小时，得到混合液，然后将混合液在2℃~4℃下静置22小时~26小时后，得到半透明液态物。
8.根据权利要求6所述的一种负载移植性神经干细胞的PF-127-LV-NFcocktail复合物的制备方法，其特征在于：所述步骤二，在2℃~4℃下，将Lingo-1 shRNA慢病毒表达载体与步骤一得到的半透明液态物以每毫升半透明液态物中含有1×107 TU/ml~4×107 TU/ml的Lingo-1 shRNA慢病毒表达载体的浓度混合，并搅拌均匀，得到第二混合液；
所述步骤三，在2℃~4℃下，将配方量的神经生长因子混合物加入到步骤二得到的第二混合液中，并搅拌均匀，得到第三混合液。
9.根据权利要求6所述的一种负载移植性神经干细胞的PF-127-LV-NFcocktail复合物的制备方法，其特征在于：所述步骤四，所述微孔过滤器的孔径为0.15μm ~0.35μm。
10.权利要求1至5任意一项所述的一种负载移植性神经干细胞的PF-127-LV-NFcocktail复合物或者权利要求6至9任意一项所述的一种负载移植性神经干细胞的PF-127-LV-NFcocktail复合物的制备方法所制得的PF-127-LV-NFcocktail复合物的应用，其特征在于：将PF-127-LV-NFcocktail复合物应用于负载移植性神经干细胞，能促进移植性神经干细胞的定向分化和存活，进而将移植性神经干细胞应用于治疗脊髓损伤疾病。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |