CN104353113A - 一种用于修复脊髓损伤的类脊髓样组织的构建 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种用于修复脊髓损伤的类脊髓样组织的构建方法，尤其是一种周围含有类白质样结构和中央含有类灰质样结构的类脊髓样组织构建方法。应用时将含有类白质样结构干细胞源性少突胶质细胞和类灰质样结构干细胞源性神经元构建的类脊髓样组织移植到横断性脊髓损伤处，按照类白质样结构对应宿主白质、类灰质样结构对应宿主灰质的配对方式整合到宿主神经网络中，更好地促进受损伤脊髓再生和功能修复。

Description

一种用于修复脊髓损伤的类脊髓样组织的构建

技术领域

本发明涉及一种用于修复脊髓损伤的类脊髓样组织的构建，尤其是一种周围含有类白质样结构和中央含有类灰质样结构的类脊髓样组织构建方法。 

背景技术

在脊髓损伤修复的研究领域，联合利用干细胞、神经营养因子和生物材料已经展示了令人鼓舞的成果。然而，目前的联合治疗策略或单一地强调替代神经元的作用，或单一的强调移植的成髓鞘细胞的修复作用。这些对于脊髓损伤的功能修复而言都是不够的。我们的前期研究基于脊髓损伤后大量丢失的神经元和成髓鞘细胞。应用过表达神经营养素-3(neurotrophin-3，NT-3)的施万细胞(Schwann cells，SCs)和过表达NT-3受体TrkC的神经干细胞(neural stem cells，NSCs)在三维明胶海绵支架中构建了有大量的可替代神经元，具有良好的突触形成潜能的，和有大量的成髓鞘细胞，具有良好的成髓鞘潜能的人工神经网络。该干细胞源性神经网络移植到大鼠脊髓全横断损伤处，不但能够提供丰富的神经营养因子促进宿主神经再生，移植的干细胞源性神经元还能与宿主神经网络良好地整合。成髓鞘细胞不仅能在体外包绕神经突起形成髓鞘，在体内也能形成大量髓鞘包绕移植神经元和宿主神经元的轴突，通过良好的成髓鞘潜能更进一步修复脊髓损伤[Lai BQ，et al.The integration of NSC-derived and host neural networks after rat spinal cord transection.Biomaterials，2013，34：2888；Lai BQ，et al.Graft ofa tissue engineered neural scaffold serves as a promising strategy to restore myelination after rat spinal cord transection.Stem Cells Dev，2014，23：910]。 

脊髓损伤后，睫状神经营养因子(ciliary neurotrophic factor，CNTF)能够作为少突胶质细胞的保护因子，促进少突胶质细胞的存活和形成髓鞘。有研究表明，CNTF可以促进少突胶质前体细胞(oligodendrocyte precursor cells，OPCs)的存活、分化、成熟，并在再生的轴突上形成髓鞘结构[Mayer M，et al.Ciliary neurotrophic factor and leukemia inhibitory factor promote the generation，maturation and survival of oligodendrocytes in vitro.Development，1994，120：143]。 

然而，目前我们仍面临着脊髓损伤修复还没有解决好的关键科学问题：即前期构建的干细胞源性神经网络中，神经元和髓鞘形成细胞的分布是随意和无序的，这有可能导致再生的神经纤维不能快速、准确地与移植的神经网络进行整合，或髓鞘形成细胞不能更有效地包绕需要髓鞘化的神经元轴突。为此，我们设想：模拟正常脊髓组织结构一灰质在内、白质在外，在体外构建一种类脊髓样组织。拟将这种类脊髓样组织移植入脊髓全横断损伤处，按照白质对应白质、灰质对应灰质的配对方式整合到宿主神经网络中，更好地修复脊髓结构和功能。 

发明内容

目前，在国内、外尚未见有文献资料报道用于修复脊髓损伤的类脊髓样组织的构建，尤其是一种周围含有类白质样结构和中央含有类灰质样结构的类脊髓样组织构建方法。本发明的目的是想克服现有临床上治疗脊髓损伤所用的方法上的不足，应用我们自行构建的类脊髓样组织治疗脊髓创伤性疾病，更好地促进受损伤脊髓再生和功能修复。 

本发明的基本方案包括：这种类脊髓样组织是以圆柱体的多孔隙明胶为主体支架，分别由周围和中央两部分的明胶结构装配而成。周围部分的明胶结构是一种圆环状的支架(圆环外直径为3mm、圆环壁厚度为0.5mm、圆环高度为2mm)，用来种植睫状神经营养因子(CNTF)基因修饰的少突胶质前体细胞(OPCs)；中央部分的明胶结构是一种圆柱体的支架(圆柱体直径为2mm、高度为2mm)，用于种植神经营养素-3(NT-3)基因及其受体TrkC基因修饰的的神经干细胞(NSCs)。应用时，将其移植到成年大鼠脊髓全横断损伤处。 

本发明的优点显著：本研究选择构建一种含有睫状神经营养因子基因修饰的少突胶质前体细胞(CNTF-OPCs)、神经营养素-3基因修饰的的神经干细胞(NT-3-NSCs)和NT-3受体TrkC基因修饰的的神经干细胞(TrkC-NSCs)的类脊髓样组织，用来促进受损伤的中枢神经元轴突再生，对危害人民健康较大的创伤性中枢神经疾病如脊髓损伤等进行防治基础性研究，将会有力地推动整个创伤性中枢神经疾病防治研究领域的发展。这对延长人类寿命，提高伤病者生存质量，减轻社会和家庭负担，促进我国社会经济发展都具有重要意义。本发明将使我国的创伤性中枢神经疾病防治水平居于国际领先水平。 

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明所用的主要仪器、可降解生物材料、可降解高分子材料、实验细胞和试剂作详尽的描述： 

1.主要仪器 

超净工作台(苏州净化电子设备厂)；普通离心机(久保田日本)；恒温水浴箱(北京医疗设备厂)；5％CO₂培养箱(Queue美国)；倒置相差显微镜(Olympus日本)；荧光显微镜(Leica德国)；扫描电镜(Philips荷兰)；透射电镜(Philips荷兰)；激光共聚焦成像系统(Carl Zeiss德国)；低温烤箱(上海跃进医疗器械厂)；高温烤箱(上海跃进医疗器械厂)；高压消毒锅(江阴滨江医疗设备厂)；恒冷箱切片机(Shandon英国)；超纯水仪(Molsheim法国)；酶联免疫检测仪(Bio-Rad美国)；电泳仪电源(Bio-Rad美国)；垂直板电泳槽(Bio-Rad美国)；电转仪(Bio-Rad美国)；超高速低温离心机(Beckman美国)；-80℃超低温冰箱(Revco Tech美国)；JY92-2D超声波细胞粉碎机(宁波新芝生物科技股份有限公司)；EPC-10膜片钳信号放大器(Heka德国)；玻璃微电极(Sutter美国)；微电极拉 制仪(Sutter美国)。 

2.可降解生物材料 

制备类脊髓样组织的多孔隙明胶圆柱体支架材料是购自于南京金陵药业股份有限公司的产品---医用明胶海绵。 

3.可降解高分子材料 

包绕在多孔隙明胶圆柱体支架周围形成外壳薄壁的PLGA(50∶50)薄膜是购自于济南岱罡生物科技公司的产品。 

4.实验细胞 

由中山大学实验动物中心提供SD大鼠，自行从其大脑海马中分离、培养获取神经干细胞。 

5.主要试剂 

DMEM-LG(Gibico)，优级胎牛血清(TBD)，多聚赖氨酸(Sigma)，D-Hank’s平衡液(自配)，胰蛋白酶(Sigma)，EDTA(Sangon)，0.01mol/l PBS(中杉金桥)，MTT(Ameresco公司)，二甲基亚砜(DMSO)(Sangon)，Hoechst33342(Sigma)，DAPI(Sigma)，山羊血清(中杉金桥)，小鼠抗BrdU单克隆抗体(Sigma)，Cy3标记羊抗小鼠IgG(Jackson Immuno Research)，calcein-AM/EthD-III Live/Dead kit(Biotium)，兔抗NT-3多克隆抗体(Santa Cruz)，鼠抗人TrkC单克隆抗体(RD)，小鼠抗大鼠Nestin抗体(Sigma)，兔抗大鼠PSD95多克隆抗体(Abcam)，兔抗大鼠GFP多克隆抗体(Millipore)，兔抗大鼠NF单克隆抗体(Sigma)，小鼠抗大鼠NF单克隆抗体(Sigma)，兔抗大鼠GFAP多克隆抗体(Sigma)，小鼠抗大鼠synaptophysin(Sigma)，小鼠抗大鼠MBP单克隆抗体(Millipore)，兔抗大鼠ChAT多克隆抗体(Millipore)，兔抗大鼠GABA多克隆抗体(Boster)，兔抗大鼠glutamine多克隆抗体(Boster)，山羊抗小鼠FITC(Jackson Immunological Research)，Cy3标记的羊抗小鼠IgG(Jackson ImmunoResearch)Cy3标记羊抗兔IgG(Jackson ImmunoResearch)，Dylight405标记的羊抗小鼠IgG(Jackson ImmunoResearch)，AMCA标记羊抗兔IgG(Jackson ImmunoResearch)，山羊抗兔HRP(Jackson ImmunoResearch)，蛋白定量检测试剂盒(鼎国)，细胞裂解液(Boster)，蛋白酶抑制剂cocktail(Sigma)，ECL发光底物检测试剂盒(康为世纪)，Epon-812(Ted Pella)，考马斯亮蓝(Bio-rad)，30％聚丙烯酰胺溶液(康为世纪)，X感光胶片(Kodak)。 

本发明详细的具体操作技术说明如下： 

1.大鼠神经干细胞(NSCs)的体外分离培养及鉴定 

选用出生3～5天的SD乳鼠，在无菌条件下断头取脑，将脑置于冷的D-Hank’s液中，解 剖显微镜下用器械分离出海马。采用机械吹打法培养NSCs：先用眼科剪将海马组织剪碎，再连同D-Hank’s液移入离心管中用细头玻璃吸管轻轻吹打数次，直至肉眼见不到明显的组织块，吹打时应慢速并用力适度，避免产生气泡，以1000rpm离心5min，去上清，重复操作一次，用NSCs培养液重新吹打悬浮细胞沉淀，计数并调整细胞密度约为1×10⁵/ml，将此细胞悬液移入培养瓶，于37℃、5％CO₂培养箱中进行悬浮培养。当观察到大量的细胞克隆球开始形成时，隔天用细头玻璃吸管机械吹打分离NSCs克隆球进行传代。传代2周后，取第2代的NSCs漂浮法进行nestin免疫荧光细胞化学鉴定。 

2.NSCs定向诱导为少突胶质前体细胞(OPCs) 

取第2代培养的NSCs，轻轻吹打分散神经球后以5×10⁵个细胞/ml密度接种于多聚赖氨酸包被培养瓶，在原有神经干细胞培养液的基础上加入30ng/ml的三碘甲状腺氨酸(triiodothyronine，T3)、10ng/ml的血小板衍生生长因子(platelet-derived growth factor，PDGF)及10％胎牛血清作为诱导培养液。待贴壁的细胞球大量迁出、并布满培养瓶的底部时用胰酶消化法进行传代。传2代后的OPCs用于后续的免疫荧光细胞化学鉴定或者基因修饰。 

3.三种基因修饰细胞的制备 

3.1NSCs和0PCs的腺病毒载体感染率的测定 

用不同感染复数(multiplicity of infection，MOI)的AdLacZ(报告基因重组腺病毒载体)在无血清培养液中分别感染NSCs和OPCs3小时，弃病毒残液，加入正常培养液继续培养12～24小时，然后用光镜观察阳性染色细胞的百分比(感染率)，确定一个感染率在90％以上的病毒剂量。 

3.2TrkC基因或NT-3基因修饰NSCs的制备 

用一定剂量(按测定感染率的)AdTrkC或AdNT-3在无血清培养液中感染NSCs3小时，弃病毒残液，加入正常培养液继续培养24小时。取少量细胞用于免疫组织化学鉴定TrkC基因或NT-3基因修饰NSCs的比例，用Western blot方法测定TrkC基因修饰NSCs中TrkC的表达量，用ELISA方法测定NT-3基因修饰NSCs培养液上清中NT-3的含量，并检测其生物活性。 

3.3睫状神经营养因子(CNTF)基因修饰OPCs的制备 

方法基本同上(用ELISA方法测定CNTF基因修饰OPCs培养液上清中CNTF的含量，并检测其生物活性)。 

4.多孔隙明胶圆柱体支架的构建 

所述的多孔隙明胶圆柱体支架主体可分为两部分：周围部分的明胶结构是一种圆环状的支架(圆环外直径为3mm、圆环壁厚度为0.5mm、圆环高度为2mm)，中央部分的明胶结构是 一种圆柱体的支架(圆柱体直径为2mm、高度为2mm)。这些支架材料是购自于南京金陵药业股份有限公司无菌医用明胶海绵，在超净工作台中将其剪裁制备成上述的形貌的周围和中央两部分的明胶结构。 

PLGA外壳薄壁是包绕多孔隙明胶圆柱体支架的聚乳酸-聚羟基乙酸共聚物(poly D，L-lactic-co-glycolic acid，PLGA)，其由可降解的高分子材料PLGA(聚乳酸与聚羟基乙酸比值为50∶50，分子量为100000)构成，厚度为0.02毫米。材料的构建方法如下：取一定量的PLGA溶解于二氯甲烷中，配成5％溶液，待PLGA完全溶解后，浇注与已调水平的聚四氟模具中，室温(控制温度在20℃)，挥发24小时，第二天小心揭下薄膜，反置于模具中24小时，剪裁到适宜大小后干燥保存。将薄膜包绕在直径为3.5毫米的不锈钢圆柱磨具上一圈，边缘用丙酮粘贴，形成直径为3.5毫米的圆筒状PLGA外壳。使用时将PLGA外壳剪成2毫米长度，酒精浸泡15分钟，随后用无菌D-Hank’s清洗三次，每次10分钟。将消毒好的PLGA外壳薄壁置干无菌干燥处保存待用。使用PLGA外壳薄壁的目的是，增加多孔隙明胶圆柱体支架的柔韧性。 

上述构建的周围部分的明胶结构用于种植CNTF基因修饰的OPCs，将形成类似脊髓白质结构；中央部分的明胶结构用于种植NT-3基因和TrkC基因修饰的NSCs，将形成类似脊髓灰质结构。 

5.类脊髓样组织的体外培养 

5.1类白质样结构的培养(附图) 

将包绕PLGA外壳的周围部分明胶结构固定在培养皿内，将CNTF基因修饰的OPCs按照2.5×10⁵的细胞总量，缓慢悬滴到该结构的两端，加入常规培养液，于37℃、5％CO₂在旋转式生物反应器内培养7天。 

5.2类灰质样结构的培养(附图) 

将中央部分的明胶结构固定在培养皿内，将NT-3基因和TrkC基因分别修饰的NSCs，细胞总量为7.5×10⁵，按照1∶1的比例，缓慢悬滴到该结构的两端，加入常规培养液，于37℃、5％CO₂。在旋转式生物反应器内培养7天。 

5.3类白质样结构和类灰质样结构的共培养(附图) 

将培养构建的类灰质样结构安置入培养构建的类白质样结构的圆环内，加入常规培养液，于37℃、5％CO₂在旋转式生物反应器内培养7天。 

6.类脊髓样组织神经网络结构的检测 

用免疫细胞化学、共聚焦荧光显微镜和免疫电镜等技术观察类脊髓样组织内NSCs分化 的神经元之间建立突触联系以及合成神经递质情况，验证其是否形成以神经元为主的神经网络，以及验证该神经网络是否有突触形成潜能。同时观察类脊髓样组织的类白质样结构OPCs干细胞源性少突胶质细胞形成的髓鞘包绕。附图是用具有良好的生物相容性的多孔隙明胶构建类脊髓样组织。A：类白质样结构(多孔隙明胶)，圆环直径为3mm、厚度为0.5mm、高度为2mm，用来种植CNTF基因修饰的OPCs(CNTF-OPCs)；B：类灰质样结构(多孔隙明胶)，圆柱体直径为2mm、高度为2mm，用于种植NT-3基因和TrkC基因修饰的NSCs(NT-3-NSCs和TrkC-NSCs)；C：将类灰质样结构安置入培养构建的类白质样结构的圆环内，构建成类脊髓样组织；D：将类脊髓样组织置于37℃、5％CO₂在旋转式生物反应器内培养。 

Claims (3)

1.一种用于修复横断性脊髓损伤的含有类白质样结构和类灰质样结构共同构建的类脊髓样组织；其形貌特征是：类脊髓样组织表面包裹着由聚乳酸-聚羟基乙酸共聚物(poly D，L-lactic-co-glycolic acid，PLGA)薄膜构成的薄壁，类脊髓样组织中央是类灰质样结构，PLGA薄壁与类灰质样结构之间是类白质样结构。

2.根据权利要求1所述的用于修复横断性脊髓损伤的含有类白质样结构和类灰质样结构构建的类脊髓样组织；其形貌特征是：所述的类白质样结构是生长着由睫状神经营养因子基因修饰的少突胶质前体细胞分化的少突胶质细胞。

3.根据权利要求2所述的用于修复横断性脊髓损伤的含有类白质样结构和类灰质样结构构建的类脊髓样组织；其形貌特征是：所述的类灰质样结构是生长着由神经营养素-3基因修饰的的神经干细胞(NT-3-NSCs)和NT-3受体TrkC基因修饰的神经干细胞分化的神经元。