CN106635993A

CN106635993A - 一种诱导人胎盘绒膜间充质干细胞分化为神经样干细胞的方法

Info

Publication number: CN106635993A
Application number: CN201510720242.2A
Authority: CN
Inventors: 冯文峰; 黄鹏; 昌芒
Original assignee: Guangzhou Stemove Biotechnology Co Ltd
Current assignee: Guangzhou Stemove Biotechnology Co Ltd
Priority date: 2015-10-30
Filing date: 2015-10-30
Publication date: 2017-05-10

Abstract

本发明公开了诱导人胎盘绒膜间充质干细胞三维培养分化成神经样干细胞的方法，包括以下步骤：将三维材料和聚胶溶液混合，在37℃聚胶30分钟；再加入人胎盘绒膜间充质干细胞，于37℃，5%CO₂培养，隔日更换培养液；所述聚胶溶液为I型胶原溶液、聚乳酸溶液或丝素蛋白溶液。本发明利用三维培养技术为神经分化提供一种体内样的三维立体生长环境，促进了细胞之间的联系，使细胞形成多层生长，同时可以更好地维持干细胞的自我更新和多向分化特性；无化学诱导因子的作用，分化后神经样干细胞可直接用于后续临床试验，更安全。

Description

一种诱导人胎盘绒膜间充质干细胞分化为神经样干细胞的方法

技术领域

本发明涉及一种诱导人胎盘绒膜间充质干细胞分化为神经样干细胞的方法，具体涉及一种无化学诱导因子的人胎盘绒膜间充质干细胞三维培养方法分化为神经样干细胞的方法。

背景技术

神经样干细胞(neural stem cell，NSCs)是一类具有分裂潜能和自更新能力的母细胞，它可以通过不对等的分裂方式产生神经组织的各类细胞。长期以来，人们一直认为成年哺乳动物脑内神经细胞不具备更新能力，一旦受损乃至死亡不能再生。这种观点使人们对中枢神经系统疾病的治疗受到了很大限制。虽然传统的药物、手术及康复治疗取得了一定的进展，但是仍不能达到满意的效果。神经样干细胞的发现，解决传统药物治疗固有的缺点，神经样干细胞治疗是把健康的干细胞移植到病人或自己体内，以达到修复病变细胞或重建功能正常的细胞和组织的目的。该疗法就像给机体注入新的活力，是从根本上治疗许多疾病的有效方法。

三维培养指在一定的环境条件下，将细胞种植在三维支架中，构建出具有特定形态和功能细胞的方法。三维球状形态（或者克隆形态）与干细胞特性密切相关，如胚胎干细胞在滋养层上以克隆形态生长，神经样干细胞以神经球的形态生长；克隆形成实验是鉴定干细胞的重要手段，干细胞分化后失去克隆样形态；多项研究也表明三维培养可以更好地维持干细胞的自我更新和多向分化特性。

目前，三维培养在诱导间充质干细胞向软骨细胞或肝样细胞等分化中有报道。但是，由于每种细胞的特性不同，尚没有可以通用的培养方式，且目前还没有利用三维培养诱导人胎盘绒膜间充质干细胞分化为神经样干细胞的相关报道。

发明内容

本发明提供了一种诱导人胎盘绒膜间充质干细胞分化为神经样干细胞的方法，所述方法无化学诱导因子加入，解决了现有神经细胞无法再生的问题。

本发明采用如下技术方案：

一种诱导人胎盘绒膜间充质干细胞分化为神经样干细胞的方法，包括以下步骤：

（1）人胎盘绒膜间充质干细胞的获得；

（2）三维材料的聚焦，将三维材料和聚胶溶液混合，在37℃聚胶30分钟；

（3）细胞的分化及培养，加入人胎盘绒膜间充质干细胞，于37℃，5%CO₂培养，隔日更换培养液。

所述聚胶溶液为I型胶原溶液、聚乳酸溶液或丝素蛋白溶液。

进一步的，所述I型胶原溶液的浓度为3mg/mL，所述聚乳酸溶液的浓度为2.5 mg/mL；所述丝素蛋白溶液的浓度为5mg/mL。

步骤（4）中所述细胞的分化与培养时间为14天。

步骤（4）中加入的人胎盘绒膜间充质干细胞的浓度为5×10⁵cells/孔。

所述

有益效果：

1、本发明所述诱导人胎盘绒膜间充质干细胞分化为神经样干细胞的方法，不依赖基因、RNA及蛋白的导入，更易于诱导分化成熟；无化学诱导因子的作用，分化后神经样干细胞可直接用于后续临床试验，更安全；

2、利用三维培养技术为神经分化提供一种体内样的三维立体生长环境，促进了细胞之间的联系，使细胞形成多层生长，同时可以更好地维持干细胞的自我更新和多向分化特性；

3、胎盘绒膜来源的干细胞可跨胚层分化为神经样干细胞，无任何伦理问题，细胞增殖能力强。

附图说明

图1为人胎盘绒膜间充质干细胞及诱导分化后的神经样干细胞形态图。图A为人胎盘绒膜间充质干细胞形态图，图B为诱导分化7天后神经样干细胞形态图，图C为诱导分化14后神经样干细胞形态图，比例尺50um。

图2为荧光定量PCR检测基因相对表达水平图。左侧柱形图表示对照人胎盘绒膜间充质干细胞的表达水平，中间柱形图表示诱导分化7天后神经样干细胞的相对表达水平，右侧柱形图表示诱导分化14天后神经样干细胞的相对表达水平。

具体实施方式

为了更好的理解本发明，下面结合具体实施方式做进一步说明。本领域的公知常识、常用的物质检测、鉴定方法等，因是本领域技术人员所熟知的，本发明未一一赘述。本发明中使用的各种试剂都是市售试剂。

实施例1

（1）获得离体人胎盘绒膜来源的间充质干细胞。

取5g胎盘绒膜组织，用无菌的手术剪刀或者小刀剪碎，得到边长小于3毫米的组织块。将所得组织块收集于15ml离心管，加入等体积的磷酸盐缓冲液，剧烈震荡后室温静至5分钟，待组织块分为两层后小心收集上层部分，收集的上层部分组织块使用磷酸盐缓冲液洗涤3遍；向收集的上层组织块中加入等体积的0.075%的胶原酶I， 37℃水浴30min；加入等体积的含10%胎牛血清的DMEM培养基终止消化，充分混匀后室温静至10min分层；去掉上层（脂质/碎片），20℃，280g离心5min收集下层部分细胞（基质血管部分、干细胞、红细胞）；裂解红细胞，将收集的下层部分细胞使用160 mM NH₄Cl重悬3min，使用40μm滤膜过滤，将滤液加入到含5 mL DMEM，10% FBS的离心管中；20℃，280g离心5min收集细胞，并于1%青霉素/链霉素、10% FBS的DMEM培养基中培养，即获得人胎盘绒膜间充质干细胞。

（2）诱导人胎盘绒膜间充质干细胞向神经样干细胞的分化。

I型胶原溶液的配制(3 mg/mL)：称取30mg I型胶原，溶于无菌预冷的8mL NaOH溶液，于冰上混匀，使用无菌预冷的dH₂O定容为10mL。

三维材料的聚胶:将制备好的3 mg/mL I型胶原加入到含有三维材料的12孔培养板中，25μL /孔，37°C培养箱中聚胶30min，即可得到多孔的已聚胶的I型胶原三维支架。

在已聚胶的I型胶原三维支架上加入混匀的人胎盘绒膜间充质干细胞悬液，使细胞密度为5×10⁵cells/孔。加入人胎盘绒膜间充质干细胞培养液500ul（L-DMEM+10%FBS+100u/L青霉素+100u/L链霉素），置于培养箱中37℃，5%CO₂进行培养，隔日换液。

（3）获得神经样干细胞。于倒置显微镜下观察细胞形态的变化，结果见图1。左图中人胎盘绒膜间充质干细胞呈纤维状，中图为诱导分化7天后细胞形态图，细胞变圆；右图为诱导分化14后细胞形态图，细胞呈典型的神经样干细胞形态。

实施例2

（1）获得离体人胎盘绒膜来源的间充质干细胞：同实施例1。

（2）诱导人胎盘绒膜间充质干细胞向神经样干细胞的分化。

三维支架的聚胶:将2.5 mg/mL聚乳酸溶液加入到含有三维材料的12孔培养板中，25μL /孔，37°C培养箱中聚胶30min，即可得到多孔的已聚胶的三维支架。

在已聚胶的三维支架上加入混匀的人胎盘绒膜间充质干细胞悬液，使细胞密度为5×10⁵cells/孔。加入人胎盘绒膜间充质干细胞培养液500ul（L-DMEM+10%FBS+100u/L青霉素+100u/L链霉素），置于培养箱中37℃，5%CO₂进行培养，隔日更换培养液。

（3）获得神经样干细胞。

实施例3

（2）诱导人胎盘绒膜间充质干细胞向神经样干细胞的分化。

三维支架的聚胶:将5mg/mL丝素蛋白溶液加入到含有三维材料的12孔培养板中，25 μL/孔，37°C培养箱中聚胶30min，即可得到多孔的已聚胶的三维支架。

在已聚胶的三维支架上加入混匀的人胎盘绒膜间充质干细胞悬液，使细胞密度为5×10⁵cells/孔。加入人胎盘绒膜间充质干细胞培养液500ul（L-DMEM+10%FBS+100u/L青霉素+100u/L链霉素），置于培养箱中37℃，5%CO₂进行培养，隔日换培养液。

（3）获得神经样干细胞。

实施例4

荧光定量聚合酶反应（Realtime-PCR）验证神经样干细胞特异性基因表达。未分化的人胎盘绒膜间充质干细胞作为对照组，实施例1中使用本发明所述方法诱导分化7天的人胎盘绒膜间充质干细胞作为实验组1，实施例1中使用本发明所述方法诱导分化14天的人胎盘绒膜间充质干细胞作为实验组2。

采用Invitrogen公司总RNA提取试剂盒提取细胞总RNA，使用TAKARA公司的反转录试剂盒制备cDNA，使用Promega公司的GoTaq®qPCR Master Mix试剂盒进行Real time-PCR，以b-Actin作为内参基因，检测神经样干细胞特异性基因Nestin、MaP2的表达。

具体操作步骤如下：

1. 总RNA的提取：按照Invitrogen公司总RNA提取试剂盒进行。

2. cDNA合成：按照TAKARA公司cDNA合成说明书进行操作，步骤如下：

（1）反应体系如下：

total RNA	10 ng-2 μg
		oligo(dT)₁₅(50 μM)	1 μL
random 6 mers(50 μM)	1 μL
		10 mM dNTP mix	1 μL
无核酸酶水	to 18 μL

（2）将反应液在PCR仪上65-70℃条件下孵育5分钟，然后在冰上至少放2分钟；

（3）制备cDNA合成混合物，按顺序添加反应物，体系如下：

5×RT Buffer	5 μL
		M-MLV Reverse Transcriptase	1 μL
RNase Inhibitor(40 U/μL)	1 μL

（4）将7 μL的cDNA合成混合物加到步骤（2）中的反应液中，轻轻混合，短暂离心收集；

（5）反转录：42℃，60 min；85℃，5 min；

（6）反应完成后，合成的cDNA保存在-20℃备用。

3. Real time-PCR

将反转录得到的cDNA进行real time RT-PCR，反应体系如下：

GoTaq^®qPCR Master Mix， 2X	12.5 μL
		无核酸酶水	8.5 μL
上游引物	1 μL
		下游引物	1 μL
cDNA	2 μL

Nestin的上游引物和下游引物的序列分别如下：

cgaaagagaa agcgaaccag tatc（SEQ ID NO.1）

agaaccacac tcggaccaca tc （SEQ ID NO.2）

Map2的上游引物和下游引物的序列分别如下：

gcaaaaaagg aagacaaggt cc（SEQ ID NO.3）

ccttctgcgt cacaccattg（SEQ ID NO.4）

Gfap的上游引物和下游引物的序列分别如下：

cccccggcgg caatagca（SEQ ID NO.5）

tcggcgccgg ggagatacat（SEQ ID NO.6）

B-actin的上游引物和下游引物的序列分别如下：

tcctgtggca tccacgaaac t（SEQ ID NO.7）

gaagcatttg cggtggacga t（SEQ ID NO.8）

Real time-PCR扩增条件为：95℃ 10 min，95℃ 15 s，56℃ 1 min，在Bio-Rad Real-Time PCR System 中进行40个循环，结果见图2。

整体上，实验组2的表达水平比实验组1的表达水平高。Nestin的表达水平变化最大，实验组1中Nestin 的相对表达水平为3，实验组2中Nestin 的相对表达水平为9。

综上，本发明所述方法可以很好的诱导人胎盘绒膜间充质干细胞向神经样细胞的分化。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims

1.一种诱导人胎盘绒膜间充质干细胞分化为神经样干细胞的方法，包括以下步骤：

（1）人胎盘绒膜间充质干细胞的获得；

（2）三维材料的聚胶，将三维材料和聚胶溶液混合，在37℃孵育30分钟，完成聚胶；

2.根据权利要求1所述一种诱导人胎盘绒膜间充质干细胞分化为神经样干细胞的方法，其特征在于：步骤（2）中所述的聚焦溶液为I型胶原溶液、聚乳酸溶液或丝素蛋白溶液中的一种。

3.根据权利要求2所述一种诱导人胎盘绒膜间充质干细胞分化为神经样干细胞的方法，其特征在于：所述I型胶原溶液的浓度为3mg/mL。

4.根据权利要求2所述一种诱导人胎盘绒膜间充质干细胞分化为神经样干细胞的方法，其特征在于：所述聚乳酸溶液的浓度为2.5 mg/mL。

5.根据权利要求2所述一种诱导人胎盘绒膜间充质干细胞分化为神经样干细胞的方法，其特征在于：所述丝素蛋白溶液的浓度为5mg/mL。

6.根据权利要求1所述一种诱导人胎盘绒膜间充质干细胞分化为神经样干细胞的方法，其特征在于：步骤（3）的细胞分化及培养时间为14天。

7.根据权利要求1所述的一种诱导人胎盘绒膜间充质干细胞分化为神经样干细胞的方法，其特征在于：步骤（3）中所述的加入人胎盘绒膜间充质干细胞的浓度为5×10⁵cells/孔。