CN114231481B - 一种重编程真皮成纤维细胞为内皮祖细胞的化学诱导方法 - Google Patents

一种重编程真皮成纤维细胞为内皮祖细胞的化学诱导方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及细胞工程技术领域，提出了一种重编程真皮成纤维细胞为内皮祖细胞的化学诱导方法。本发明筛选出合适的小分子化合物FSK，对成纤维细胞进行诱导，诱导后细胞中有明显的内皮祖细胞的特异性标志物CD31和CD34的表达，说明FSK成功实现采用单一小分子诱导真皮成纤维细胞为内皮祖细胞的技术，技术方案简单，成本低，无副反应出现，有利于临床应用，具有现实意义及临床价值。

Description

一种重编程真皮成纤维细胞为内皮祖细胞的化学诱导方法
技术领域
本发明涉及细胞工程技术领域，具体的，涉及一种重编程真皮成纤维细胞为内皮祖细胞的化学诱导方法。
背景技术
血管再生一直是再生医学的重要步骤，它涵盖多种疾病中血管的再生，包括心肌缺血修复、肝脏移植，微循环重建，皮肤附属血管的再生等等。为了促进多种器官中血管的再生，人们尝试通过转基因、干细胞、器官移植等各种方法，但多数情况下会出现移植后的排异反应，功能整合，循环功能受损、稳定性差等各种后续问题。在皮肤组织受到创伤后，结局多为瘢痕性修复，伴随组织缺血，血管再生障碍，那么后期的修复及功能恢复将受到严重影响。
曾获得诺贝尔医学奖/生理学奖的日本学者Yamanaka使用过表达四因子“OSKM”(Oct4, Sox2, Klf4, cMyc)的方式将体细胞诱导为具有向多胚层分化的多功能干细胞iPSCs，这一里程碑式的研究成果促进了通过过表达特异性转录因子诱导成纤维细胞向神经、心肌、血管分化的研究进程。因此，血管的再生性研究也迈进了新的阶段。但这与临床应用中避免使用基因操纵的原则相悖。
创面中再血管化关系皮肤损伤后修复的结局，血管性皮肤溃疡包括动脉性溃疡（缺血性溃疡）、静脉性溃疡，恢复局部血供对皮肤愈合及再生至关重要。组织修复与再构建过程中血管化仍是主要瓶颈问题之一，血管内皮细胞与材料之间的特异性粘附仍较难实现。到目前为止，有效构建具有功能的血管化皮肤组织是亟待解决的一大难题。因此寻找更为便捷有效的从成纤维细胞直接生成血管内皮细胞，甚至直接体内促血管再生的方法在皮肤创伤修复及其他血管再生障碍性疾病的治疗中具有现实意义。
近年来，小分子化学的方法已经成为操控细胞命运的重要手段，利用小分子能够实现细胞分化、转分化及重编程。目前诱导成纤维细胞向血管内皮分化的研究多集中于基因编辑及联合多种小分子化合物诱导的方法，基因编辑会带来的病毒感染及其他外源性细胞成分，使培养过程中污染及后续出现不可预测的基因变化等问题；小分子化合物诱导可以避免基因编辑带来的问题，其选择与起始细胞的特性密切相关，不同的起始细胞决定了在向内胚层祖细胞的转换过程所需要的小分子也不尽相同。由于目前还没有完全使用小分子获取内胚层的任何一种细胞类型的报道来作为参考，因此在小分子的选择上要经过详尽的调研和筛选。通常会联合多种小分子化合物进行诱导，以期获得良好的诱导效果，鲜有单独使用单个小分子化合物诱导的研究报道，因为目前研究现状表明采用单一小分子进行化学诱导，易出现副作用，想获得良好的诱导效果需要付出较高的成本和采用较为复杂的技术方法。
发明内容
本发明提出一种重编程真皮成纤维细胞为内皮祖细胞的化学诱导方法，筛选出合适的小分子化合物FSK进行诱导，实现单独小分子诱导真皮成纤维细胞为内皮祖细胞，技术方案简单，无副反应出现。
本发明的技术方案如下：
一种重编程真皮成纤维细胞为内皮祖细胞的化学诱导方法，包括以下步骤：
（1）分离培养小鼠皮肤中成纤维细胞：小鼠处死后剥离周身皮肤组织，酶解消化后得到细胞再进行传代培养即得成纤维细胞；
（2）化合物FSK对成纤维细胞诱导：向成纤维细胞中加入FSK溶液，进行诱导，即得诱导后细胞。
进一步地，所述步骤（1）中采用的小鼠为新生1天小鼠，处死后消毒、清洗再进行周身皮肤组织的剥离。
更进一步地，所述处死后小鼠消毒采用75%酒精，清洗采用生理盐水。
进一步地，所述步骤（1）中剥离周身皮肤组织后，去除皮下脂肪及血管，剪碎再进行酶解消化。
更进一步地，所述酶解消化采用0.1-0.3%的I型胶原酶消化50-120min。
进一步地，所述步骤（1）中酶解消化后得到的细胞经过70μm细胞筛过滤，然后加入0.85-0.9%生理盐水进行离心悬液，再接种到培养基中进行传代培养。
更进一步地，所述步骤（1）传代培养采用添加10%胎牛血清的H-DMEM为培养基。
进一步地，所述步骤（1）中传代培养条件为37℃的CO2培养箱中进行孵育传代培养。
更进一步地，所述步骤（1）中传代培养每2-3天后进行一次传代培养。
进一步地，所述步骤（2）中FSK溶液采用DMSO溶解，浓度为5-15μmol/L。
更进一步地，所述步骤（2）中FSK溶液浓度为10μmol/L。
进一步地，所述步骤（2）中诱导条件为37℃的CO2培养箱中进行孵育，每隔两天更换细胞培养液一次。
进一步地，所述步骤（2）中诱导孵育1-20天。
更进一步地，所述步骤（2）中诱导孵育5-14天。
更进一步地，所述步骤（2）中诱导孵育7天。
本发明的有益效果为：
1、促进损伤局部快速血管化一直是难以解决的技术难题。近年来通过基因编辑，基因沉默，体内重编程等方法可以改变细胞命运的操控。但与这些方法相比较，小分子化合物的诱导可行性更高。目前小分子化合物的方法已成为改变细胞命运的关键手段，利用小分子化合物可以实现细胞分化，转分化及重编程。但是多数采用的是多个小分子联合应用或者小分子联合基因编辑同时使用改变细胞命运，鲜有单独使用单个小分子化合物促进成纤维细胞的促血管再生能力的相关研究报道。目前，比较单一的小分子化学诱导的方法，成本较高，技术方法复杂且呈现出副作用，不利于临床推广。
本发明通过大量实验，最终筛选得到的小分子化合物FSK能够帮助实现成纤维细胞获得促体内外血管再生的能力，并进一步地确定了FSK诱导的最佳浓度和诱导时间，使得诱导方法简单，成本低，无副反应出现，有利于临床应用，具有现实意义及临床价值。
附图说明
图1为分离培养的原代成纤维细胞经Hochest33342染色的免疫荧光检测图；
图2为FSK诱导后分离培养的成纤维细胞中CD31的表达图；
图3为FSK诱导后分离培养的成纤维细胞中CD34的表达图；
图4为不同浓度的FSK诱导成纤维细胞结果图；
图5为不同诱导时间下诱导的成纤维细胞CD34表达结果图；
图6为不同诱导时间下诱导的成纤维细胞CD133表达结果图；
图7为小鼠移植原代成纤维细胞后经Hochest33342免疫荧光检测图；
图8为小鼠移植原代成纤维细胞CD31的表达图；
图9为小鼠移植经FSK诱导后成纤维细胞CD31的表达图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都涉及本发明保护的范围。
实施例1
（1）分离培养小鼠皮肤中成纤维细胞：
①新生1天的小鼠处死，经过75%酒精消毒后，用0.90%生理盐水冲洗干净，剥离周身皮肤组织；
②去除皮下脂肪及血管，剪碎，用0.2%的I型胶原酶消化1小时；
③采用70um细胞筛进行过滤，获得细胞进行离心悬液，接种到培养皿中，培养条件为高糖H-DMEM(品牌：Gibco，货号为：12430054)添加10%的胎牛血清 ，于37℃的CO2培养箱中进行孵育，每2-3天后进行一次传代培养；
（2）化合物FSK对成纤维细胞诱导；
①FSK中加入DMSO溶解，配置为10μmol/L溶液，加入步骤（1）得到的成纤维细胞中，，继续置于37℃的CO2培养箱中进行孵育7天，每隔两天更换一次细胞培养液，即得内皮祖细胞。
实施例2
（1）分离培养小鼠皮肤中成纤维细胞：
①新生1天的小鼠处死，经过75%酒精消毒后，用生理盐水冲洗干净，剥离周身皮肤组织；
②去除皮下脂肪及血管，剪碎，用0.1%的I型胶原酶消化2小时；
③采用70μm细胞筛进行过滤，获得细胞进行离心悬液，接种到培养皿中，培养条件为高糖H-DMEM(品牌：Gibco，货号为：12430054)添加10%的胎牛血清 ，于37℃的CO2培养箱中进行孵育，每2-3天后进行传代培养；
（2）化合物FSK对成纤维细胞诱导；
①FSK中加入DMSO溶解，配置为5μmol/L溶液，加入步骤（1）得到的成纤维细胞中，，继续置于37℃的CO2培养箱中进行孵育10天，每隔两天更换一次细胞培养液，即得内皮祖细胞。
实施例3
（1）分离培养小鼠皮肤中成纤维细胞：
①新生1天的小鼠处死，经过75%酒精消毒后，用生理盐水冲洗干净，剥离周身皮肤组织；
②去除皮下脂肪及血管，剪碎，用0.3%的I型胶原酶消化50min；
③采用70um细胞筛进行过滤，获得细胞进行离心悬液，接种到培养皿中，培养条件为高糖H-DMEM(品牌：Gibco，货号为：12430054)添加10%的胎牛血清 ，于37℃的CO2培养箱中进行孵育，每2-3天后进行传代培养；
（2）化合物FSK对成纤维细胞诱导；
①FSK中加入DMSO溶解，配置为15μmol/L溶液，加入步骤（1）得到的成纤维细胞中，，继续置于37℃的CO2培养箱中进行孵育1天，即得内皮祖细胞。
实验例1诱导剂筛选和FSK诱导效果的初步确定
CD31是成熟血管内皮的特异性标志物，CD34是内皮祖细胞的特异性标志物。因此采用小分子诱导剂对小鼠成纤维细胞进行诱导后（具体诱导方法见实施例1），测定细胞中CD31和CD34的表达情况，可以判断成纤维细胞是否成功转化为内皮祖细胞，具体测定方法和步骤详见免疫荧光检测试剂盒（品牌：Elabscience，货号为：E-IR-R328）。
本发明最初筛选了大量的小分子诱导剂，除FSK作为诱导剂时，细胞中出现CD31和CD34的表达（红色）外，其他小分子诱导均无CD31和CD34的表达。采用FSK诱导结果见图1-3，图2和3中出现的阴影代表CD31和CD34的阳性表达，说明本发明采用FSK能够成功将成纤维细胞重编程为内皮祖细胞。
实验例2诱导剂FSK浓度的确定
本发明在确定FSK为小分子诱导剂后，首先对FSK的浓度进行了筛选，在经过大量实验后初步确定FSK的浓度范围在0-20μmol/L相对合适，因此进一步选用0.5μmol/L，2μmol/L，5μmol/L，10μmol/L，20μmol/L五个不同的浓度，分别于第1天，2天，3天，4天四个时间段测定细胞的增殖情况，详细的操作步骤和方法见CCK-8检测试剂盒（品牌：MCE货号：HY-K0301），结果见图4。
图4显示随着时间的延长，FSK浓度增加对细胞的增殖有轻微的上调，浓度为5-20μmol/L时，细胞增殖相对较好，但是20μmol/L时出现一定的抑制增殖现象。而10μmol/L时，细胞增殖最为明显，且没有产生明显的细胞增殖抑制影响，因此细胞在该浓度下具有较好的耐受性。
实验例3诱导剂FSK诱导时间的确定
前期经过大量实验，初步将诱导时间缩限在0-14天，本实验例以不添加诱导剂的为对照组，具体在第5天、7天、14天，采用qPCR检测试剂盒（品牌Invitrogen：货号：C11744-100）,检测诱导后内皮祖细胞相关基因CD34、CD133的表达情况，结果见图5-6。
图5-6中，*代表FSK试验组与对照组相比具有显著性差异（*P<0.05），**代表FSK试验组与对照组相比具有极显著性差异（**P<0.01）。因此，5、7、14天都具有较好的诱导效果，与对照组具有显著性差异，甚至是极显著差异，其中诱导7天时，效果最佳。
实验例4诱导后细胞体内血管形成能力的测试
FSK诱导前后的成纤维细胞（诱导后成纤维细胞按照实施例1方案进行）用Dil-green标记，具体的操作方法参见染色试剂盒（品牌：碧云天生物科技有限公司，货号：C1993S），在染好色的细胞中均匀加入100ml的基质胶（品牌：BD, 货号：354234）后分别将负载基质胶的细胞移植到裸鼠体内，具体移植方法为：将成纤维细胞进行皮下注射，每点注射含有细胞的100ml基质胶，在每只小鼠背部选择三个注射点，两周后，取注射位置的全层皮肤，进行冰冻切片，具体方法为：将组织浸没于包埋剂OCT中，然后至于恒温冰冻切片机内快速降温至-20℃，在制成冻块后，按照冰冻切片机使用流程（品牌：LEICA, 型号为：CM10950）将组织切成厚度为6μm的切片并贴附于载玻片，将切片浸于组织固定液（品牌：Solarbio，货号：G1101）10分钟后，参考上述免疫荧光检测试剂盒的操作流程进行免疫荧光染色，通过对CD31等染色标志物的检测结果，间接测定体内血管的形成能力，结果见图7-9。
图9出现CD31的表达，结果表明， FSK诱导后成纤维细胞中CD31表达明显增多，说明FSK诱导后细胞已被重编程为内皮祖细胞，进而移植到小鼠体内，具有较强的体内血管形成能力。
以上仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种重编程真皮成纤维细胞为内皮祖细胞的化学诱导方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）分离培养小鼠皮肤中成纤维细胞：小鼠处死后剥离周身皮肤组织，酶解消化后得到的细胞再进行传代培养即得成纤维细胞；
（2）化合物FSK对成纤维细胞诱导：向步骤（1）的成纤维细胞中加入FSK溶液，进行诱导，即得诱导后细胞；
所述步骤（2）中FSK溶液采用DMSO溶解，浓度为5-15μmol/L；
所述步骤（2）中诱导孵育5-14天；
所述步骤（1）中采用的小鼠为新生1天小鼠。
2.根据权利要求1所述的重编程真皮成纤维细胞为内皮祖细胞的化学诱导方法，其特征在于，所述步骤（1）中采用的小鼠为新生1天小鼠，处死后消毒、清洗再进行周身皮肤组织的剥离。
3.根据权利要求2所述的重编程真皮成纤维细胞为内皮祖细胞的化学诱导方法，其特征在于，所述消毒采用75%酒精，清洗采用0.85～0.9%的生理盐水。
4.根据权利要求1所述的重编程真皮成纤维细胞为内皮祖细胞的化学诱导方法，其特征在于，所述步骤（1）中酶解消化采用0.1-0.3%的I型胶原酶消化50-120min。
5.根据权利要求1所述的重编程真皮成纤维细胞为内皮祖细胞的化学诱导方法，其特征在于，所述步骤（1）中传代培养的培养基为添加10%胎牛血清的H-DMEM。
6.根据权利要求1所述的重编程真皮成纤维细胞为内皮祖细胞的化学诱导方法，其特征在于，所述步骤（1）中传代培养在37℃CO2培养箱中进行孵育传代培养。
7.根据权利要求1所述的重编程真皮成纤维细胞为内皮祖细胞的化学诱导方法，其特征在于，所述步骤（2）中FSK溶液浓度为10μmol/L。
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