CN1932010B - 一种分离人脂肪组织中内皮祖细胞的方法 - Google Patents

Abstract

一种分离人脂肪组织中内皮祖细胞的方法，涉及组织工程学中获得种子细胞的方法。形态学改变和细胞免疫荧光证明了诱导后的细胞具有成熟内皮细胞的表型，而且具有摄取低密度脂蛋白(LDL)的功能。流式细胞仪检测结果表明本诱导体系具有很高的诱导效率。诱导组细胞在三维培养时形成“树枝样”分叉结构。

Description

一种分离人脂肪组织中内皮祖细胞的方法

技术领域

本发明涉及组织工程学中获得种子细胞的方法。

背景技术

目前组织工程血管构建所需的内皮种子细胞主要来源于大血管或微血管的成熟内皮细胞，以下原因限制了其应用：一，供体血管来源有限；二，所得细胞为终末分化细胞，扩增能力有限，不能满足组织工程对种子细胞数量的要求。

早在1997年Asahara T等发现出生后循环外周血中存在能分化为血管内皮细胞的前体细胞，考虑其与胚胎发育中血管母细胞的延续关系，将其称为血管内皮祖细胞(endothelial progenitor cell，EPC)。EPC是一类能循环、增殖并分化为血管内皮细胞，但尚未表达成熟血管内皮细胞表型，也未形成血管的前体细胞。由于其在血管新生中的重要地位，EPC一直是研究热点，大量的研究主要集中在从脐带血、骨髓以及外周血中分离EPC。然而外周血中EPC获取量极少，脐带血存在伦理问题，而骨髓穿刺比较痛苦且细胞获取量也较少，这些缺点都限制了其应用。2001年Zuk PA等报道抽脂手术得到的皮下脂肪组织中存在多向分化的干细胞以来，从脂肪中获取内皮祖细胞的研究成为热点

目前，体外分离EPC的方法有多种，免疫磁珠(magnetic activated cell sortor，MACS)分选法是最常用的一种。而免疫磁珠分选法早期一般用CD34+磁珠，近年来更多的应用CD133+磁珠，其最大特点是可以收集到较高纯度的EPC，但研究也发现分离得到的CD34+细胞数量非常少，单独培养时往往不能增殖，只能与CD34-细胞共同培养时才有增殖活性，而且免疫磁珠分选法操作复杂、费用较高。

密度梯度离心结合纤维粘连蛋白(FN)黏附法也是分离EPC的一种常用方法，早就用在从骨髓或外周血中分离EPC。但用FN从脂肪组织中分选EPC，国内外尚无此报道。

因此本领域迫切需要一种操作简便、成本低廉、有效、原材料来源广泛的分选EPC的方法。

发明内容

本发明旨在利用纤维粘连蛋白(FN)从人脂肪组织中分选内皮祖细胞(EPC)。

在本发明的一个方面，是提供一种内皮祖细胞的分离方法，它是从脂肪组织中分选，步骤包括：

(1)将脂肪组织用胶原酶消化，从而解离脂肪组织中的细胞；

(2)对步骤(1)中解离的细胞在800-1500g离心3-10分钟，去除上层的脂肪获得，获得下层细胞；

(3)将步骤(2)中获得的下层细胞，以1×10⁴-5×10⁴个/cm²接种于纤维粘连蛋白(FN)包被的培养皿，在含1％-3％胎牛血清的DMEM培养液中培养3-8小时；

(4)去除步骤(3)中培养物中游离的细胞，从而获得通过纤维粘连蛋白固定于培养皿的固定细胞，即为内皮祖细胞。

其中优选0.005-0.02％II型胶原酶消化20-60分钟；所述的脂肪组织是人脂肪组织。

上述的分离方法，还包括步骤：(5)将获得的内皮祖细胞进行传代，传代如下进行：0.05％胰酶消化，待细胞收缩变圆，终止消化；细胞收集离心；细胞计数按密度为2×10⁴个/cm²接种。

在另一优选例中，在步骤(3)或(5)中低血清培养，即含10-30ml胎牛血清/升培养液。它包括DMEM、M199或F12培养液。

上述的分离方法，还包括步骤：检测分离获得的内皮祖细胞上标志物CD34+。

在本发明的另一方面，是用上述的分离方法得到的内皮祖细胞。

在本发明的另一方面，是用上述的分离方法得到的内皮祖细胞可用于分化产生内皮细胞；用上述的分离方法得到的内皮祖细胞在组织工程中可作为内皮种子细胞；上述的分离方法得到的内皮祖细胞可用于制备内皮移植物。

在本发明的另一方面，是纤维粘连蛋白(FN)在从脂肪组织中获得内皮祖细胞的应用。

本发明所提供的内皮祖细胞分选方法操作简便、成本低廉、原材料来源广泛。

附图说明

图1细胞形态显微镜观察

图2细胞免疫荧光检测

图3流式细胞仪(FACS)检测

图4a.诱导祖细胞光镜观察(×200)

b.诱导祖细胞荧光显微镜观察

图5第2代细胞接种在甲基纤维素的半固体培养基内显微镜观察

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入的研究发现在脂肪组织中存在一定含量的内皮祖细胞(EPC)，运用纤维粘连蛋白(FN)可以从脂肪组织中有效分选EPC。由该方法所得的内皮祖细胞阳性率高，具有分化能力。

Fibronectin(FN)是细胞外基质中的一种糖蛋白，参与细胞黏附、细胞运动、伤口愈合等细胞功能性活动，本发明的一个方面在利用FN从人脂肪组织中分选EPC，应用低血清培养，其步骤包括：

(1)将脂肪组织用胶原酶消化，从而解离脂肪组织中的细胞；

(2)对步骤(1)中解离的细胞在800-1500g离心3-10分钟，去除上层的脂肪获得，获得下层细胞；

(3)将步骤(2)中获得的下层细胞，以1×10⁴-5×10⁴个/cm²接种于纤维粘连蛋白(FN)包被的培养皿，在含1％-3％胎牛血清的培养液中培养3-8小时；

(4)去除步骤(3)中培养物中游离的细胞，从而获得通过纤维粘连蛋白固定于培养皿的固定细胞，即为内皮祖细胞。

本发明所述的胶原酶是II型胶原酶，其中优选0.005-0.02％II型胶原酶消化20-60分钟；本发明所述的低血清培养液是含10-30ml胎牛血清/升培养液，它包括DMEM、M199或F12培养液。本发明是从人脂肪组织中分选、培养内皮祖细胞EPC。

CD34是内皮祖细胞主要的分子标志，本发明得到的细胞传至第二代CD34+阳性率高达72.39±13.45％，而不表达CD45(造血干/祖细胞的标志)及PECAM-1(成熟内皮细胞的标志)，如图3所示。本发明涉及的分离方法为组织工程血管构建找到了新的种子细胞来源。

本发明的另一个方面是用上述方法所获得的内皮祖细胞EPC，所述的EPCCD34+阳性率高；能分化为成熟内皮细胞；可以作为组织工程中的种子细胞。

本发明的主要优点在于：

1.分离方法的原材料来源广泛，不存在道德伦理问题；

2.分离方法操作简便、成本低廉；

3.所获得的EPC具有理想的分化能力。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1

人脂肪组织中分离内皮祖细胞的方法

(1)将人脂肪组织用0.01％II型胶原酶消化30分钟；

(2)1200g离心5分钟；

(3)以5×10⁴个/cm²接种于纤维粘连蛋白(FN)包被的培养皿，用含2％胎牛血清的DMEM培养液培养，6小时换液；

(4)待细胞融合至80-90％时，进行传代，传代密度为2×10⁴个/cm²，体外扩增至第二代后，进行诱导。

实施例2

细胞诱导

用实施例1所述的方法获得的第二代细胞分诱导组与非诱导组，非诱导组用含2％胎牛血清的DMEM培养液培养；诱导组用含2％胎牛血清和VEGF，bFGF等生长因子的EGM-2培养基培养。

实施例3

检测

1.细胞形态观察

结果见图1，诱导12天后细胞呈典型内皮细胞“铺路石”样结构。原代细胞为梭形细胞(图1a)；第二代细胞非诱导组仍为梭形(图1b)，而诱导组细胞呈典型的“铺路石”样排列(图1c)。

正常内皮细胞是“铺路石”样形态。我们把收到的“梭形”细胞，在合适的培养条件下转化为内皮样形态。从形态上讲，“梭形”细胞转化为正常内皮细胞样形态，结果表明分离得到“梭形”细胞是内皮细胞的前体细胞(即其祖细胞)。

2.细胞免疫荧光检测：

分别培养和诱导12天后，用乙醇∶乙酸(99∶1)固定细胞15min；其中准备检测VWF的爬片加0.25％Triton X-100作用10min，以增加细胞膜的通透性，其它爬片加PBS 10min；0.5％BSA 37℃封闭30min；0.5％BSA 1∶200稀释鼠抗人CD34、VEGFR-2、VWF和PECAM-1单抗(美国Santa Cruz公司产品)37℃孵育60min；加0.5％BSA 1∶50稀释FITC标记羊抗鼠二抗37℃孵育30min；PBS漂洗；碘化丙啶(PI)(1∶1000，美国Sigma公司)37℃孵育10min；PBS漂洗后封片，荧光显微镜观察。

结果见图2，第二代细胞非诱导组CD34有表达(图2a)，而VEGFR-2、VWF和PECAM-1未见明显的阳性表达细胞；诱导组VWF和PECAM-1为阳性(图2b、2c)，而CD34、VEGFR-2未见阳性表达。CD34是未分化细胞的标志，VWF和PECAM-1又名CD31，是成熟内皮细胞主要标志之一。

结果表明分离得到的非诱导细胞细胞表达CD34，(内皮祖细胞的标志之一)，是内皮祖细胞(EPC)。在合适的培养条件下转转化为VWF阳性、PECAM-1阳性(成熟内皮细胞)。从另一角度说明“梭形”细胞能转化为内皮细胞。是对形态学的补充，表明“梭形”细胞是内皮细胞的前体细胞(即其祖细胞)。

3.流式细胞仪检测：

检测细胞为第二代诱导组与非诱导组细胞。0.05％胰酶消化收集细胞；PBS洗两遍；分装入Eppendorf管，分别加荧光标记的鼠抗人CD34、CD45(DAKO公司)，CD133(R&D SYSTEMS公司)，VEGFR-2、PECAM-1(Sigma公司)抗体，一管加入荧光标记的非特异IgG作为同型对照，37℃孵育30min；PBS洗三遍；4％多聚甲醛固定，流式细胞仪检测。

结果见表1和图3，第2代非诱导组细胞有70％以上表达未分化细胞的标志CD34，诱导后祖细胞标志CD34消失，却有67.41±13.35％细胞表达成熟内皮细胞标志CD31。

表1其中的数值是阳性率(％)

	CD34	CD45	VEGFR-2	CD133	PECAM-1
						非诱导组	72.39±13.45	5.26±2.31	5.95±2.40	6.70±2.83	6.73±2.21
诱导组	16.06±3.86<sup>**</sup>	6.26±1.43<sup>◇</sup>	6.83±2.61<sup>◇</sup>	6.60±2.70<sup>◇</sup>	67.41±13.35<sup>**</sup>

^**诱导组与非诱导组差异具有显著性(P＜0.01)

^◇诱导组较之非诱导组，差异没有显著性(P＞0.01)

结果表明本实验诱导体系具有很高的诱导效率。梭形细胞表达CD34，而不表达CD45(目的是为了排除所得到的细胞是造血干细胞，因为造血干细胞CD34、CD45同时为阳性)。PECAM-1同图2的免疫荧光一样证明了在合适的培养条件下EPC转化为成熟内皮，阳性率高达67.41±13.35％。

图3为统计分析，表明EPC同成熟内皮细胞不一样。尽管EPC是其前体细胞。表现在EPC表达CD34而不表达CD31，而成熟内皮细胞却相反。

4.内皮细胞功能检测：

用培养液稀释DiI-ac-LDL(Biomedical Technologies Inc.公司)至10μg/ml，细胞换液；37℃培养箱孵育4h；PBS洗3次；荧光显微镜观察。

结果见图4，诱导祖细胞荧光显微镜观察可见摄取DiI-ac-LDL后发出红色荧光(×200)；非诱导组未见阳性结果，(图4)。

形态学改变和细胞免疫荧光证明了诱导后的细胞具有成熟内皮细胞的表型，但不能说明这些细胞是否具有内皮细胞的功能，摄取低密度脂蛋白(LDL)是内皮细胞的功能之一，结果表明EPC转化为成熟内皮细胞后具有内皮细胞的功能。

5.三维培养：

配制含0.09％甲基纤维素的半固体培养基，培养的细胞以1×10⁴个/mL接种在此培养基中，3天后倒置偏光显微镜观察。

统计学方法：数据采用均数±标准差表示，应用配对t检验分析。

结果见图5，第二代细胞接种在甲基纤维素的半固体培养基内3天后形成“树枝样”分叉结构(图5)。

细胞平面培养难以说明内皮细胞形成血管样结构的情况，设置三维培养模型，使细胞在立体情况下生长，模拟体内血管生成，甲基纤维素培养基是一种半固体培养基，EPC能够在其内成“树枝样”生长，结果观察到诱导组细胞在型，使细胞在立体情况下生长，模拟体内血管生成，甲基纤维素培养基是一种半固体培养基，EPC能够在其内成“树枝样”生长，结果观察到诱导组细胞在三维培养时形成“树枝样”分叉结构。表明EPC转化为成熟内皮细胞后具有内皮细胞的功能。

Claims (4)

1.一种内皮祖细胞的分离方法，其特征在于，从脂肪组织中分选，步骤包括：

(1)将脂肪组织用0.005-0.02％II型胶原酶消化20-60分钟，从而解离脂肪组织中的细胞；

(2)对步骤(1)中解离的细胞在800-1500g离心3-10分钟，去除上层的脂肪获得下层细胞；

(3)将步骤(2)中获得的下层细胞，以1×10⁴-5×10⁴个/cm²接种于纤维粘连蛋白(FN)包被的培养皿，在含1％-3％胎牛血清的培养液中培养3-8小时；

(4)去除步骤(3)中培养物中游离的细胞，从而获得通过纤维粘连蛋白固定于培养皿的固定细胞，即为内皮祖细胞。

2.如权利要求1所述的分离方法，其特征在于，所述的脂肪组织是人脂肪组织。

3.如权利要求1所述的分离方法，其特征在于，还包括步骤：(5)将获得的内皮祖细胞进行传代，传代如下进行：0.05％胰酶消化，待细胞收缩变圆，终止消化；细胞收集离心；细胞计数按密度为2×10⁴个/cm²接种。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，还包括步骤：检测分离获得的内皮祖细胞上标志物CD34+。

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