CN102031240B - 一种获得内皮祖细胞的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种获取内皮祖细胞的方法，它包括步骤：将接种密度8×104-6×105/cm2的骨髓细胞孵育，得到的悬浮细胞为内皮祖细胞。
Description
技术领域
本发明涉及组织工程，尤其涉及获得内皮祖细胞的方法。
背景技术
内皮祖细胞(endothelial progenitor cell，EPC)是成熟血管内皮细胞的前体细胞，自1997年Asahara等利用CD34等表面标志物经免疫磁珠法从人外周血中成功分离纯化出EPC后，有关EPC的分离、纯化、扩增及其功能和应用的研究越来越受到关注，特别是其在血管再生和心血管疾病中的作用已成为近来研究的热点。
目前内皮祖细胞的来源主要为骨髓、外周血、脐血等。但是其数目较少，扩增较难使对其研究和应用受到限制。目前获得内皮祖细胞的方式主要是骨髓、外周血、脐血经过密度梯度分离，接种于纤维粘连蛋白(fibronectin)铺层的培养皿，再加入含一定浓度的生长因子的特殊培养液如EBM添加血管内皮生长因子(VEGF)、表皮生长因子(EGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)等培养，或者利用磁珠分选或流式细胞仪分选的方式，利用一些细胞表面粘附分子如CD34、KDR、CD133等进行分选后，获得细胞再利用上述培养液进行培养扩增。近年有些报道利用上述细胞表面粘附分子培养的细胞向造血系分化，Marianna等研究发现由于血小板表面表达的粘附分子能够被单核细胞吞噬假表达于某些不能向内皮细胞分化的单核细胞上，从而使利用这些粘附分子进行分选的细胞不能向内皮细胞分化。
目前纯化和扩增EPC的方法操作过程复杂，细胞得率低，价格较为昂贵，极大地限制了其在研究和临床应用方面的发展。
因此，本领域迫切需要提供一种能获得大量纯化的EPC的高效、简便的方法。
发明内容
本发明旨在提供一种获得内皮祖细胞的方法。
本发明提供了一种获得内皮祖细胞的方法，所述方法包括步骤：将接种密度8×104-6×105/cm2的骨髓细胞孵育，得到的悬浮细胞为内皮祖细胞。
在另一优选例中，所述接种密度为1-6×105/cm2。
在另一优选例中，所述的方法包括步骤：
(a)将骨髓细胞(原代；经胰酶消化)和细胞培养液混合，得到骨髓细胞悬浮液；和
(b)将骨髓细胞悬浮液以8×104-6×105/cm2的接种密度进行孵育，得到的悬浮细胞为内皮祖细胞。
在另一优选例中，所述的细胞培养液选自IMDM、或α-MEM。
在另一优选例中，所述的细胞培养液是低糖DMEM，以培养液总体积计，其中的胎牛血清含量为8-12v/v％。
在另一优选例中，所述的骨髓细胞悬浮液是1×106-1×107/ml。
在另一优选例中，所述接种密度为1-6×105/cm2。
在另一优选例中，步骤(b)中孵育2-3周。
据此，本发明提供了一种能获得大量纯化的EPC的高效、简便的方法。
附图说明
图1显示了原代培养骨髓细胞表型(Day 6)；其中
A是相差光镜；B是Dil-Ac-LDL染色；C是DAPI核衬染；D是荧光复合。
图2显示了不同接种密度的骨髓贴壁细胞培养情况；其中
A是6×105/cm2接种培养第0天；B是6×105/cm2接种培养第7天；C是5×103/cm2接种培养第0天；D是5×103/cm2接种培养第7天。
图3显示了不同接种密度的骨髓贴壁细胞培养7天的情况；其中
A：6.4×105/cm2；B：3.2×105/cm2；C：1.6×105/cm2；D：8×104/cm2；E：4×104/cm2；F：2×104/cm2；G：1×104/cm2；H：5×103/cm2；I：2.5×103/cm2。
图4显示了高密度接种细胞表型(Day 7)；其中
A是相差光镜；B是Dil-Ac-LDL染色；C是FITC-UEA-1 Lectin染色；D是荧光复合(白色为DAPI核衬染)。
图5显示了血管内皮细胞诱导分化的情况；其中
A：普通密度接种的间充质细胞培养第0天；B：普通密度接种的间充质细胞诱导第10天；C：高密度接种的悬浮细胞培养第0天；D：高密度接种的悬浮细胞诱导第10天。
图6显示了悬浮细胞血管内皮细胞分化与成血管能力；其中
A：诱导第10天细胞vWF染色阳性；B：诱导第10天细胞在Matrigel上形成血管网状结构。
具体实施方式
发明人经过广泛而深入的研究，发现采用局部高密度接种全骨髓细胞的培养方法，在不需要进行细胞分选和添加任何生长因子的条件下，就能获得大量纯化的EPC，为EPC体外纯化、扩增提供了一种简便高效的方法。
内皮祖细胞
本发明提供的获得内皮祖细胞的方法包括步骤：将接种密度8×104-6×105/cm2(优选1-6×105/cm2)的骨髓细胞孵育，得到的悬浮细胞为内皮祖细胞。
本发明提供的将高密度接种的骨髓细胞进行培养的方法，是先将骨髓细胞(原代细胞或经胰酶消化的原代细胞)和细胞培养液混合，得到骨髓细胞悬浮液；然后将骨髓细胞悬浮液以8×104-6×105/cm2(优选1-6×105/cm2)的接种密度进行孵育，得到的悬浮细胞为内皮祖细胞。
可以使用本领域熟知的方法得到原代细胞。
可以使用本领域熟知的细胞培养液进行培养，例如但不限于，IMDM，<-MEM，优选低糖DMEM(含8-12％FBS)，待大部分细胞贴壁后，收集悬浮细胞。
本发明的主要优点在于：
1、获得EPC的方法高效、简便。
2、本发明提供的方法可以得到大量纯化的EPC。
下面将结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(NewYork：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则所有的百分比和份数按重量计。
本发明中的重量体积百分比中的单位是本领域技术人员所熟知的，例如是指在100毫升的溶液中溶质的重量。
除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
实施例
获得内皮祖细胞
材料和方法
一、全骨髓细胞原代培养
取新生小猪股骨骨髓约2ml，PBS漂洗离心后吸弃上清，接种于10cm培养皿中，用低糖DMEM(Gibco，美国)，含10％胎牛血清(FBS)(Hyclone，美国)的培养液培养4天，换液去除未贴壁细胞，继续培养5-6天至90％融合后传代。
二、局部高密度接种传代
原代细胞经胰酶消化，用含10％FBS的DMEM培养液重新悬浮至1.6x106-1x107/ml，取50ul细胞悬液滴至6孔板内，放入培养箱内孵育30分钟，待大部分细胞贴壁后加入培养液3ml，置入含5％CO2的37℃培养箱培养。2-3周后收集悬浮细胞。
三、Dil-Ac-LDL、FITC-UEA-1 Lectin染色
加入含Dil-Ac-LDL(invitrogen，美国)10μg/ml的培养液中避光孵育6小时，然后以2％的多聚甲醛固定10分钟，PBS漂洗后再加FITC标记的UEA-1 Lectin(sigma，美国)10μg/ml避光孵育1h，PBS漂洗后荧光显微镜下观察。显示红色荧光的为Dil-Ac-LDL阳性细胞，显示绿色荧光的为UEA-1 Lectin阳性细胞。
四、血管内皮细胞诱导分化
将高密度接种形成的悬浮细胞吸出，将1x104个细胞接种于3.5cm的培养皿中，添加含50ng/ml血管内皮细胞生长因子(VEGF，Peprotech，美国)的EGM-2培养液(Clonetics，美国)诱导分化，10天后细胞以2％多聚甲醛固定10分钟，PBS漂洗3遍后用0.1％Triton(上海化学试剂公司)破膜处理10分钟，血清封闭非特异抗原37℃30分钟，后加抗vWF(Dako，美国)一抗4℃过夜，加FITC标记的二抗(invitrogen，美国)染色1小时，荧光显微镜观察。
五、体外成血管能力鉴定
取500ul Matrigel(BD，美国)铺于24孔板底，成胶后将内皮诱导10天后的细胞计数，以1x104个细胞接种于Matrigel上，加入EGM-2培养液后置入5％CO2 37℃培养箱培养，3小时后显微镜观察。
结果
1 全血培养法原代细胞
骨髓贴壁细胞培养第5-6天克隆间已接近90％融合，倒置显微镜下观察发现局部细胞聚集成团，呈高透亮特征，Dil-Ac-LDL染色显示细胞团及周边细胞染色阳性(图1)，提示这类细胞为内皮或内皮祖细胞。
2 局部高密度接种传代培养骨髓贴壁细胞
原代骨髓细胞融合后消化，在新的培养皿中行局部高密度接种(1×105-6×105/cm2)，培养3周后高密度接种盘见大量悬浮状细胞团，而常规密度接种(5000/cm2)的盘内无悬浮细胞团形成(图2)。
另外，原代骨髓细胞融合后消化，在新的培养皿中行局部细胞接种(密度范围：6.4×105-2.5×103/cm2)，培养7天后高密度接种(＞8×104/cm2)盘见大量悬浮状细胞团，而常规密度接种(＜5×103/cm2)的盘内几乎无悬浮细胞团形成(图3)。
结构表明，只有在高密度接种情况下才能形成悬浮状细胞团。
3 悬浮细胞表型鉴定
为了鉴定高密度培养获得的细胞，我们将培养7天后的细胞做Dil-Ac-LDL、FITC-UEA-1 Lectin双染，荧光显微镜观察上层悬浮细胞核较小，几乎100％的细胞为Dil-Ac-LDL、FITC-UEA-1 Lectin双阳性，而下层贴壁细胞染色为阴性(图4)，提示悬浮细胞为内皮或内皮祖细胞，贴壁细胞为间充质细胞。
4 悬浮细胞内皮分化及功能鉴定
为了验证悬浮细胞为内皮祖细胞，我们将高密度接种形成的悬浮细胞吸出，以含50ng/mlVEGF的EGM-2培养液诱导分化细胞，细胞呈贴壁生长，诱导10天后见大量铺路石样克隆，而普通密度培养的贴壁细胞虽经VEGF诱导，无明显扩增，形态呈多角形老化状态(图5)。诱导后的细胞免疫荧光显示细胞vWF染色呈阳性(图6A)。为了进一步验证内皮细胞的功能，我们将VEGF诱导10天后的细胞消化，接种于Matrigel上培养，3小时内就发现细胞逐渐形成血管网络样结构(图6B)。
讨论
本发明提供了一种新的EPC扩增的方法，在不需要进行分选和添加任何附加生长因子的条件下，就可以获得大量EPC。发明人用局部高密度接种原代骨髓贴壁细胞，用低糖DMEM、10％FBS进行培养2周-3周就可获得大量悬浮的细胞团，经过检测这些细胞Dil-Ac-LDL、FITC-UEA-1 Lectin染色呈双阳性；经过VEGF诱导后大量扩增，呈铺路石样生长，表达成熟内皮细胞的标志vWF；将这些细胞接种于matrigel上会出现大量血管网络样结构，说明该细胞具有血管内皮祖细胞的特点，这些结果充分证实了通过高密度接种法获得的悬浮细胞是EPC。
骨髓细胞原代细胞培养中可见贴壁细胞间分布Dil-Ac-LDL阳性细胞，呈小圆形高透亮，与文献提到的EPC的形态较为相似，说明原代培养的骨髓贴壁细胞中含有内皮祖细胞，但是经过普通的传代方法，这些细胞很快就消失，剩下的为较大的长梭形细胞，发明人利用局部高密度的方法可以获得大量高透亮的细胞。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
Claims (2)
1.一种获得内皮祖细胞的方法，其特征在于，所述方法包括步骤：
（a）将经胰酶消化的原代骨髓细胞和细胞培养液混合，得到骨髓细胞悬浮液；和
（b）将骨髓细胞悬浮液以1－6×105/cm2的接种密度进行孵育2－3周，得到的悬浮细胞为内皮祖细胞；
所述的细胞培养液是低糖DMEM，以培养液总体积计，其中的胎牛血清含量为8－12v/v％；
所述方法不需要进行细胞分选和添加任何生长因子。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的骨髓细胞悬浮液是1×106－1×107/ml。
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