CN101011600A - 具有应力控释作用复合微球的脱钙骨支架及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物医学工程技术领域，涉及一种具有应力控释作用复合微球的脱钙骨支架，其特征是：由含血管内皮细胞生长因子藻酸盐微球附着在脱钙骨基质上构成，其中每100ml藻酸盐微球含血管内皮细胞生长因子1μg～30μg。本发明还涉及所述支架的制备方法。本发明由于采用密度和孔隙度大的脱钙骨基质，有利于附着藻酸盐微泡；并且脱钙骨基质在压缩过程中有利于释放藻酸盐微泡，含血管内皮细胞生长因子将以节律、脉冲控释的形式释放，较好地刺激毛细血管长入组织工程骨中，实现组织工程骨的血管化，完成骨修复的过程。

Description

具有应力控释作用复合微球的脱钙骨支架及其制备方法

技术领域

本发明涉及生物医学组织工程技术，具体的说，本发明涉及一种具有应力控释作用复合微球的脱钙骨支架及其制备方法。

背景技术

骨科临床中因严重外伤、肿瘤切除后所致的骨干及干骺端巨大骨缺损对骨移植材料的需求量甚大，目前应用于骨缺损修复的手段虽有自体骨移植以及异体骨移值，但自体骨移植的来源有限且会造成供区新的骨缺损，是一种创伤修复模式；而异体骨移植排斥反应尚未解决，在体内爬行替代所需的时间较长。现有的骨移植材料均存在不同的问题，采用活细胞与支架材料复合构建的组织工程骨具有巨大的临床需要及应用前景，用组织工程骨(tissue engineering bone，TEB)修复骨缺损的研究方兴未艾。目前大部分的TEB研究都停留在小动物(如鼠、兔)体内原位或异位成骨，修复部位大都为非负重骨缺损，新生的骨组织还不能满足临床应用的需要。目前应用大块TEB修复大段骨缺损时，其核心部位往往发生缺血坏死，使修复归于失败，其主要原因在于未能很好解决TEB的血管化问题。

血管内皮细胞生长因子(VEGF)在血管的再生中起着重要作用，它通过促进血管内皮细胞的有丝分裂、血管通透性的增加以及协助释放其它生长因子等方式促进局部血管的再生，被公认为首选的促血管化因子。在美国的多个医疗中心，已经运用VEGF腺病毒真核表达载体进行基因临床治疗，随机、双盲试验表明VEGF有强大的血管保护作用。最新的研究表明目前已有应用VEGF基因片段进行基因转染来促进微血管再生的报道，例如将重组的VEGF基因转入组织工程肌肉组织中能生成2-3倍于对照组的毛细血管数量。但是VEGF基因治疗不但很难控制其基因表达的强度、时间，并且涉及敏感的生物安全以及伦理问题；如果直接应用VEGF在体内迅速降解为无活性的片段，且VEGF在体内的半衰期较短，会很快流失在周围组织中，达不到理想的效应浓度；如果采用VEGF首次大剂量给药，易导致局部血管瘤和组织严重水肿。

应用可降解聚合物，将药物包被成微球，通过肌注或皮下给药，使药物在体内缓慢释放已成为开发蛋白类药物长效剂型的一个发展方向。可吸收材料作为微球制备的材料用于蛋白质或生长因子的释放已越来越引起众多学者的注意。这类材料包括两大类：①合成聚合物，如聚乳酸、聚丙交酯、聚乳酸羟乙酸(PLGA)、聚丙交酯乙交酯(PLCG)、聚己内酯、聚羟丁酸等。②天然聚合物，如藻酸盐、明胶、匍聚糖、自蛋白、甲壳素等(Hinds K.D.，Campbell K.M.，Holland K.M，et al.PEGylated insulin inPLGA microparticles.In vivo and in vitro analysis.Journal of Controlled Release，2005，104(3)：447-460.)。

Zhu GZ等研究了包被在PLGA微球和小棒中的牛血清白蛋白(BSA)的不稳定性，结果表明酸性环境(pH＜3)引发了被包被的BSA肽键的水解和非共价聚集(Zhu GZ，Mallery SR，Schwendeman SP.Stabilization of proteins encapsulated ininjectable poly(lactide-co-glycolide).Nature Biotechnol，2000，18(1)：52-57.)。

上述聚乳酸羟乙酸(PLGA)为代表的合成聚合物微球理化性质稳定，通过控制工艺条件可得到所需规格，批间质量差异小，并且能够调节体内的降解速度。但由于蛋白质药物为生物大分子，稳定性较差，物理化学性质容易遭到破坏，而使其部分或完全失去活性。蛋白质结构一旦遭到破坏后，不仅会使药效下降，而且有可能在体内产生免疫原性和一些不良反应。在PLGA微球的制备工艺过程中，往往需要搅拌、超声、使用有机溶剂，这些外界因素的干扰都可能影响蛋白质的结构，而使其发生聚集、吸附、沉淀、氧化、脱酰胺、水解等一系列物理或化学的改变，并且上述合成聚合物细胞相容性欠佳，制作微球时必须应用有机溶剂，可能影响蛋白质的生物活性；PLGA制作的微球将产生酸性降解产物(乳酸、羟乙酸)在体内逐渐蓄积，多肽、蛋白质的稳定性可能会受影响；另外PLGA制作的微球往往突释效应较大。因此，寻找一种毒副作用小，生物相容性好，可生物降解的载体材料构建VEGF控释系统，并能最大限度地提高局部促血管效应是本研究亟需解决的问题。

藻酸盐(alginate)是一种可吸收的天然材料，加入Ca2⁺可使其形成离子交联并聚合，这种聚合相当温和，能使生长因子、细胞、DNA等与藻酸盐水溶液顺利结合并可以较好地保持它们的生物活性。通过选择不同的藻酸盐浓度、交联剂(Ca2′)的浓度、反应的pH值、时间、温度等可控制藻酸盐的孔径、韧度、降解速率以及释放动力学。上述这些特性再加上藻酸盐的无抗原性，使藻酸盐制成的微球成为生长因子较佳的控释系统。用藻酸盐作为转化生长因子-β(TGF-β)的释放载体，不但能够很好保持TGF-β的生物活性并能够控释TGF-β。预实验结果也表明藻酸盐乳化微球对VEGF具有较好的控释效果，8天释放50.6％，14天释放73.5％。

Keshaw采用藻酸盐微球包裹含0.01％及0.1％(w/v)的45S5生物陶瓷和成纤维细胞，后者能够分泌VEGF，测定分泌液中的VEGF含量发现该系统能够显著促进VEGF的分泌以及血管内皮细胞的增殖。但是该系统释放VEGF需要依赖于成纤维细胞的生物活性，并且其释放的VEGF并不恒定，不能满足TEB植入初期对血供的要求(Keshaw H，Forbes A，Day RM.Release of angiogenic growth factors fromcells encapsulated in alginate beads with bioactive glass.Biomaterials，2005，26(19)：4171-4179.)。

TEB植入初期需要较多的毛细血管长入以提供营养，否则TEB将缺血坏死，VEGF在藻酸盐载体的匀速释放仍然不能满足TEB在较短时间内急需大量VEGF以发挥强大的促进血管生成的作用，并且匀速释放还存在释放时间过长，不好控制效应的问题。

发明目的

本发明的目的之一是提供一种具有应力控释作用复合微球的脱钙骨支架，该支架通过周期性压应力控释血管内皮细胞生长因子(VEGF)的方式来促进组织工程骨的血管化。本发明的另一目的是提供制备所述具有应力控释作用复合微球的脱钙骨支架的方法

研究证明，在生理环境条件下，骨组织受到的最重要应力之一就是周期性的压应力，通过机械应力刺激来调节VEGF的释放，可以促进组织工程骨血管化。与其它常见的可吸收生物支架如(聚乳酸PLA，聚羟基乙酸PGA，聚羟乳酸PGLA等)相比较，研究发现脱钙骨基质(decalcified bone matrix，DBM)除了良好的生物相容性、生物可吸收性外，它的最大优势是具有高强度、高弹性模量，可随应力的施加与消失而变形和恢复，在体内经12周基本降解，而且形变达到50％后仍可恢复原来的形态。因此，通过用DBM作为承受应力的支架系统，使支架可随应力的施加和撤除而自动形变和恢复形状。

藻酸盐与脱钙骨基质(DBM)复合后，非均匀性应力能使藻酸盐微球-DBM系统形变，从而使藻酸盐微球体积变小，藻酸盐微球的表面积也将进一步减少，表面积的减少将导致吸附于藻酸盐微球单位面积的VEGF减少，从而增加VEGF的释放，完成其脉冲释放的过程；当压应力消失后，藻酸盐微球-DBM系统恢复原来的形状，藻酸盐微球体积恢复，VEGF的释放又恢复至受力前的水平。通过这种周期性释放模式将应力刺激信号和生长因子(VEGF)的控制释放偶联起来。一旦血液循环重建以及骨组织形成后，在受到生理应力负荷时，组织工程骨(TEB)刚度增加而导致藻酸盐微球-DBM系统形变减小，VEGF的释放随之减少，从而避免VEGF长期局部浓度高可能导致血管瘤的副作用。预试验表明，DBM支架复合藻酸盐乳化微球能够在人平均步态频率0.5Hz及压应力5mPa条件(生理条件下人胫骨受到的平均应力)下对不同浓度的白蛋白(5mg～100mg)以及VEGF(15μg，30μg)有脉冲控释效果。

在生理周期性压应力的作用下，VEGF将以节律、脉冲控释的形式释放，较好地刺激毛细血管长入TEB中，实现TEB的血管化，完成骨修复的过程。

为实现本发明的目的之一而采用的技术方案是这样的，即一种具有应力控释作用复合微球的脱钙骨支架，由含血管内皮细胞生长因子藻酸盐微球附着在脱钙骨基质上构成，其中每100ml藻酸盐微球含血管内皮细胞生长因子(VEGF)1μg～30μg。

所述藻酸盐微球包括：藻酸盐、橄榄油、非例子表面活性剂和氯化钙溶液，按体积百分比：

藻酸盐：                            80％～90％

橄榄油：                            7％～10％

非离子表面活性剂(司盘-80、吐温-80)：1％～2.5％

氯化钙：                            2％～9％。

为实现本发明的目的之二而采用的技术方案是这样的，即一种具有应力控释作用复合微球的脱钙骨支架的制备方法：包括：

1、支架的制备：采用现有技术制备脱钙骨基质；

2、藻酸盐微球的制备；采用乳化离子交联法制备。制备工艺如下：25℃～60℃下配制1.0％～2.5％的海藻酸钠溶液100ml，加入5μg～30μg血管内皮细胞生长因子(VEGF)混合均匀；加入橄榄油12ml，加入1.5ml司盘-80和0.4ml吐温-80，混合均匀。1000rpm搅拌5min，搅拌中滴入0.15mol/100ml氯化钙溶液10ml，形成W/O乳剂；然后改用磁力搅拌器慢速30min，交联固化；将乳剂转移至试管中，静置8h，取下层2000r/min冷冻离心3min，分离微球，用蒸馏水洗涤3次，置-70°冰箱预冻4h，然后冷冻干燥机中冷冻干燥12h，保存备用。

3、藻酸盐微球与脱钙骨基质(DBM)的复合：

将含有VEGF的藻酸盐微球滴入DBM支架中，藻酸盐微球填充DBM达50％～80％，每100ml藻酸盐微球含5μg～30μg的VEGF。经37℃孵育固化后，构建藻酸盐微球-脱钙骨基质(DBM)系统，应用模拟生理周期应力刺激器在不同频率和大小的应力作用下，脉冲释放VEGF。

发明的积极效果如下：

(1)脱钙骨基质密度和孔隙度大，有利于附着藻酸盐微泡：DBM的密度约为0.15～0.18g/ml之间，平均为0.16±0.01g/ml。孔隙度为63±2.1％。DBM的平均孔径为420±30μm。

(2)脱钙骨基质在压缩过程中有利于释放藻酸盐微泡：DBM压缩不同体积后释放率(％)(见表1)由表1可见，对脱钙骨基质的体积压缩越大，藻酸盐微球的释放率就越高。

表1  完全亲水DBM压缩不同体积后释放率(％)

压缩体积	5％	10％	20％	30％	40％	50％
							释放率	15.7±1.2	25.6±1.6	41.7±1.2	51.3±1.5	57.0±1.1	65.0±1.0

(3)DBM亲水释水率：DBM吸水率为417.7±45.2％。

附图说明

图1为藻酸盐微球的显微观察图；

其中A冻干微球，B显示微球在PBS中分散均匀。

图2为含血管内皮细胞生长因子藻酸钙微球体外释放曲线；

图3为VEGF压应力脉冲释放曲线；

图4为骨密度扫描结果对比图，表明本发明的支架移植显著促进骨密度增加。

图5为Masson VG染色观察图，表明本发明的支架移植使新骨沉积良好。

图6为Masson染色观察图，表明本发明的支架移植使新骨沉积良好。

图7为HE染色VEGF观察图，表明本发明的支架移植使新生血管形成良好。

图8为VIII因子免疫组化染色观察图，表明本发明的支架移植使新生血管形成良好。

具体实施方式

实施例1制备工艺

1、脱钙骨基质(DBM)的制备

脱钙骨基质的制备采用现有技术，具体步骤是：筛选供者，取松质骨切割成小块，40℃蒸馏水反复冲洗，1∶1等体积比的氯仿/甲醛脱脂，超声清洗，0.6M盐酸脱钙，大量蒸馏水冲洗，套封，γ射线灭菌。置-80℃超低温冷冻箱内冷冻3-60个月作为支架备用。

上述DBM的理化特性和生物力学测定如下：

(1)DBM密度和孔隙度测试：参照Zhang氏液体置换法。

(2)DBM的孔径测量：取等体积约5mm×5mm×5mm两种材料锐刀横切，真空干燥，横截面喷金，用AMRAY-1000B(美国)扫描电子显微镜观察其横截面超微结构，并随机选择不同区域，游标卡尺测量材料样品孔径范围。

(3)DBM生物力学测定：5％、10％、20％、30％、40％、50％压缩形变，电脑通过配置的软件系统记录发生形变的最小和最大极限强度。解除载荷后，再观察DBM形变恢复情况，记录形变瞬时恢复率、完全恢复率及完全恢复时间。

(4)DBM亲水释水率测定：用下面公式计算：吸水率＝[(吸水后样品重量-吸水前样品重量)/吸水前样品重量]×100％。

2、藻酸盐微球的制备

采用乳化离子交联法制备。制备工艺如下：

在37℃下配制2.5％的海藻酸钠溶液100ml，加入30μg血管内皮细胞生长因子(VEGF)混合均匀；加入橄榄油12ml，加入1.5ml司盘-80和0.4ml吐温80，混合均匀。1000rpm搅拌5min，搅拌中滴入0.15mol/100ml氯化钙溶液10ml，形成W/O乳剂；然后改用磁力搅拌器慢速30min，交联固化；将乳剂转移至试管中，静置8h，取下层2000r/min冷冻离心3min，分离微球，用蒸馏水洗涤3次，置-70°冰箱预冻4h，然后冷冻干燥机中冷冻干燥12h，保存备用。

上述微球在光学显微镜下观察微球的形状和重新分散性能，可见微球分散均匀，无粘连，表面光滑圆整，球体均匀度好。扫描电镜下观察可见球体均匀，表面光整(图1)，粒径在200-300μm，平均230±60μm。包封率为61％；微球的体外释药速率平稳，周期达2周余。绘制体外释放曲线，24小时的突释率为21±2.8％(图2)。

3、藻酸盐微球与脱钙骨基质的复合

将含有VEGF的藻酸盐微球滴入DBM支架中，藻酸盐微球填充DBM达50％～80％，每100ml藻酸盐微球含5～30μg的VEGF。经37℃孵育固化后，构建藻酸盐微球-脱钙骨基质(DBM)系统，应用模拟生理周期应力刺激器在不同频率和大小的应力作用下，脉冲释放VEGF。

实施例2  VEGF应力脉冲释放试验

采用周期应力刺激器对本发明支架进行应力刺激，3分钟(min)压缩，7分钟(min)松弛，使支架产生10％形变，周期为3次/分钟，以未受力作为对照。以时间(min)为横轴，VEGF释放率(ug/min)为纵轴绘制VEGF释放曲线(图3)。上述VEGF藻酸钙微球-DBM系统在周期应力刺激器(频率70次/分，应力6公斤，刺激时间2小时)作用下能够明显促进人血管内皮细胞增殖。

将上述含VEGF藻酸钙微球与DBM复合制成的支架移植进入山羊骨缺损处，通过伊红-苏木素染色、VIII因子免疫组化染色、墨汁灌注染色、骨核素扫描、骨密度测定、X线摄片等检测，证实其能够显著加快缺损区新生血管形成和新骨沉积(图4-图8)。

Claims (4)

1、一种具有应力控释作用复合微球的脱钙骨支架，其特征是：由含血管内皮细胞生长因子藻酸盐微球附着在脱钙骨基质上构成，其中每100ml藻酸盐微球含血管内皮细胞生长因子1μg～30μg。

2、根据权利要求1所述的具有应力控释作用复合微球的脱钙骨支架，其特征是：所述藻酸盐微球包括：藻酸盐、橄榄油、非例子表面活性剂和氯化钙溶液，按体积百分比：

藻酸盐：80％～90％

橄榄油：7％～10％

非离子表面活性剂：1％～2.5％

氯化钙：2％～9％。

3、根据权利要求2所述的具有应力控释作用复合微球的脱钙骨支架，其特征是：非离子表面活性剂为司盘-80和吐温-80。

4、一种制备如权利要求1所述的具有应力控释作用复合微球的脱钙骨支架的方法：包括

1)、藻酸盐微球的制备；采用乳化离子交联法制备，在25℃～60℃下配制1.0％～2.5％的海藻酸钠溶液100ml，加入5μg～30μg血管内皮细胞生长因子混合均匀；加入橄榄油12ml，加入1.5ml司盘-80和0.4ml吐温80，混合均匀，1000rpm搅拌5min，搅拌中滴入0.15mol/100ml氯化钙溶液10ml，形成W/O乳剂；然后改用磁力搅拌器慢速30min，交联固化；将乳剂转移至试管中，静置8h，取下层2000r/min冷冻离心3min，分离微球，用蒸馏水洗涤3次，置-70°冰箱预冻4h，然后冷冻干燥机中冷冻干燥12h，保存备用。

2)、藻酸盐微球与脱钙骨基质的复合：将含有血管内皮细胞生长因子的藻酸盐微球滴入DBM支架中，藻酸盐微球填充脱钙骨基质达50％～80％，每100ml藻酸盐微球含5μg～30μg的血管内皮细胞生长因子：经37℃孵育固化后即得复合了藻酸盐微球的脱钙骨基质支架。

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