CN107185044A - 一种软骨组织工程修复支架及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种软骨组织工程修复支架。该软骨组织工程修复支架包括：多孔支架本体和附着在所述多孔支架上的包载有生长因子的聚磷腈微球。本发明实施例提供的软骨组织工程修复支架中的多孔支架本体不但用于填充修补软骨缺损区，还为包载有生长因子的聚磷腈微球提供三维空间，使包载有生长因子的聚磷腈微球滞留在软骨缺损区，通过聚磷腈微球的降解，调控释放其中的生长因子，改变生长因子释放动力学变化来促进骨软骨缺损区的修复。并且聚磷腈微球还具有生物相容性和降解无毒副作用。

Description

一种软骨组织工程修复支架及其制备方法
技术领域
本发明涉及一种软骨组织工程修复支架及其制备方法。
背景技术
软骨组织工程是一种采用组织工程学方法构建软骨组织的技术。软骨组织工程的核心要素包括种子细胞、软骨组织工程修复支架和生长因子。
软骨组织工程修复支架能够提供三维空间结构，有利于细胞的黏附、增殖，为细胞的生长提供良好的生长环境，通常将组织工程修复支架置于骨软骨缺损区，用于缺损的填充修补，来促进软骨组织和软骨下骨的再生修复。常用的组织工程修复支架主要采用天然生物支架材料制备而成，其不仅能够促进正常细胞外基质的生成及重塑，且在生物相容性、生物降解及成软骨分化(即软骨诱导能力)方面具有不可比拟的优势。
生长因子可以调控软骨细胞基质的合成、代谢以及软骨形成。生长因子的缓释是治疗骨性关节炎中恢复关节软骨功能的一个重要组成部分。在组织修复时必须考虑生物活性因子的类型，释放的方法，时间和空间释放所需达到的效果。而从促进软骨修复的生长因子的研究现状来看，多种生长因子共同释放难以完全超越单一生长因子释放的优势在于需要改进生长因子在促软骨再生过程中随时间变化的表达。人们开始认识到，生长因子在空间和时间的精确调控缓释方式应该可以引起更好的治疗效果。
类似的利用乙酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)微球不同共聚合物比例和微球直径尺寸能够达到多重突发释放的方式已经在硫酸软骨素治疗骨性关节炎中应用。最近一项研究联合类似聚丙烯腈预氧化纤维(OPF)的复合材料，使用胰岛素样生长因子(insulin-likegrowth factor，IGF)中的IGF-1和转录生长因子-β3(transfroming growth factorβ3，TGF-β3在骨软骨缺损部位联合释放进行组织修复，通过改变生长因子释放动力学变化从而促进骨软骨缺损区的修复。先前的研究已经证明软骨细胞自身修复的能力，在损伤后的急性恢复其自身能够增加内源性生长因子的表达。初始阶段细胞内TGF-β1和IGF-1增加表明自分泌和旁分泌的代谢的刺激，而后期通过持续增加TGF-β1的表达维持修复过程。这种释放方式组合可以看作是一种软骨修复控制下的生长因子释放策略。
聚磷腈是一种医用合成高分子材料，具有很好的生物相容性，可在大范围内形成性能不同的共聚物药物微球，可提高药物的稳定性，实现药物控释或缓释，具有很好的操作性，且无毒副作用。
发明内容
本发明的目的在于提供一种可缓释生长因子的软骨组织工程修复支架及其制备方法。
第一方面，本发明提供了一种软骨组织工程修复支架，包括：
多孔支架本体和附着在所述多孔支架上的包载有生长因子的聚磷腈微球。
优选地，所述多孔支架本体由生物天然材料制成。
更优选地，所述生物天然材料包括：蚕丝蛋白、纤维蛋白、胶原蛋白、明胶、琼脂糖、藻酸盐、透明质酸和壳聚糖中的至少一种。
优选地，所述多孔支架本体为脱钙骨基质。
具体地，所述生长因子为转录生长因子-β、骨形态发生蛋白、胰岛素样生长因子、成纤维细胞生长因子、血小板源性生长因子和血管内皮生长因子中的至少一种。
优选地，所述生长因子为转录生长因子-β1和胰岛素样生长因子。
优选地，所述聚磷腈微球选自聚[(甘氨酸乙酯)x(丙氨酸乙酯)(1-x)磷腈]微球和/或聚[(甘氨酸乙酯)y(丙氨酸乙酯)(1-y)磷腈]微球，其中0.1≤x≤0.4，0.6≤y≤0.9。
优选地，所述包载有生长因子的聚磷腈微球为包载有转录生长因子-β1的聚[(甘氨酸乙酯)x(丙氨酸乙酯)(1-x)磷腈]微球和包载有胰岛素样生长因子的聚[(甘氨酸乙酯)y(丙氨酸乙酯)(1-y)磷腈]微球，其中0.1≤x≤0.4，0.6≤y≤0.9。
更优选地，所述包载有生长因子的聚磷腈微球为包载有转录生长因子-β1的聚[(甘氨酸乙酯)0.3(丙氨酸乙酯)0.7磷腈]微球和包载有胰岛素样生长因子-1的聚[(甘氨酸乙酯)0.7(丙氨酸乙酯)0.3磷腈]微球。
具体地，所述包载有生长因子的聚磷腈微球的制备方法为：
先将聚磷腈分散于二氯甲烷中；
之后向含有聚磷腈的二氯甲烷中加入油性表面活性剂，以及含有生长因子的水，形成初乳液，加入含有生长因子的水的体积小于二氯甲烷的体积；
然后对所述初乳液进行超声处理；
再向超声处理后的初乳液中加入稳定剂、水性表面活性剂以及水，搅拌处理，直至二氯甲烷挥发殆尽，得到含有包载有生长因子的聚磷腈微球的悬浮液；
最后对所述悬浮液反复进行洗涤和分离处理，之后冷冻干燥，得到包载有生长因子的聚磷腈微球。
第二方面，本发明提供了一种软骨组织工程修复支架的制备方法，所述制备方法包括：
将所述包载有生长因子的聚磷腈微球和所述多孔支架本体置于磷酸缓冲液中预设时间，之后过滤处理，冷冻干燥，得到第一软骨组织工程修复支架。
优选地，所述制备方法还包括：
向所述第一软骨组织工程修复支架内注射含有包载有生长因子的聚磷腈微球的磷酸缓冲液，之后冷冻干燥，得到第二软骨组织工程修复支架。
本发明实施例提供的技术方案的有益效果是：本发明实施例提供的软骨组织工程修复支架中的多孔支架本体不但用于填充修补软骨缺损区，还为包载有生长因子的聚磷腈微球提供三维空间，使包载有生长因子的聚磷腈微球滞留在软骨缺损区，通过聚磷腈微球的降解，调控释放其中的生长因子，改变生长因子释放动力学变化来促进骨软骨缺损区的修复。并且聚磷腈微球还具有生物相容性和降解无毒副作用。
附图说明
图1为实施例4制备的包载转录生长因子-β1的聚[(甘氨酸乙酯)0.3(丙氨酸乙酯)0.7磷腈]微球的扫描电镜照片；
图2为实施例4制备的包载转录生长因子-β1的聚[(甘氨酸乙酯)0.3(丙氨酸乙酯)0.7磷腈]微球的粒径直方图；
图3为实施例5制备的包载有胰岛素样生长因子-1的聚[(甘氨酸乙酯)0.7(丙氨酸乙酯)0.3磷腈]微球的扫描电镜照片；
图4为实施例5制备的包载有胰岛素样生长因子-1的聚[(甘氨酸乙酯)0.7(丙氨酸乙酯)0.3磷腈]微球的粒径直方图；
图5为实施例4制备的TGF-β1+PAGP70微球释放TGF-β1的动力学曲线图；
图6为实施例5制备的IGF-1+PAGP30微球释放IGF-1的动力学曲线图；
图7为实施例4和实施5分别制备的TGF-β1+PAGP70微球和IGF-1+PAGP30微球降解的扫描电镜照片；
图8为实施例7制备的PAGP70微球与细胞活性关系图；
图9为实施例8制备的PAGP30微球与细胞活性关系图；
图10为实施例7和实施例8分别制备的PAGP70微球和PAGP30微球与骨髓间充质干细胞的激光共聚焦显微照片；
图11为实施例11制备的TGF-β1+PAGP70微球支架和IGF-1+PAGP30微球支架的扫描电镜图；
图12为实施例11制备的四种支架与骨髓间充质干细胞共同培养的扫描电镜图；
图13为实施例11制备的四种支架修复的新西兰兔的软骨缺损的照片；
图14-1至图14-3为实施例11制备的四种支架修复的新西兰大白兔的软骨缺损的组织切片图；
图14-4为图14-1至图14-3中新西兰大白兔的软骨缺损的虚线框中的组织切片的局部放大图。
具体实施方式
为使本发明的技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明实施方式作进一步地详细描述。
在本发明的第一方面，本发明实施例提供一种软骨组织工程修复支架，包括：
多孔支架本体和附着在所述多孔支架上的包载有生长因子的聚磷腈微球。
本发明实施例提供的软骨组织工程修复支架中的多孔支架本体不但用于填充修补软骨缺损区，还为包载有生长因子的聚磷腈微球提供三维空间，使包载有生长因子的聚磷腈微球滞留在软骨缺损区，通过聚磷腈微球的降解，调控释放其中的生长因子，改变生长因子释放动力学变化来促进骨软骨缺损区的修复。并且聚磷腈微球还具有生物相容性和降解无毒副作用。
本发明实施例中的多孔支架本体由生物天然材料制成，由生物天然材料制成的多孔支架本体不但生物相容性好，而且降解产物无毒副作用。生物天然材料包括：蚕丝蛋白、纤维蛋白、胶原蛋白、明胶、琼脂糖、藻酸盐、透明质酸和壳聚糖中的至少一种，优选为蚕丝蛋白、纤维蛋白或胶原蛋白与明胶的混合制成的多孔支架本体，通过调节蚕丝蛋白、纤维蛋白或胶原蛋白与明胶的质量比，可以制作出不但机械强度高，而且降解速率与软骨的再生速率相当的多孔支架本体。
本发明实施例中的多孔支架本体也可以为脱钙骨基质。脱钙骨基质脱除了免疫原性，具有很好的生物相容性，而且机械强度高，并且孔隙率高，可为包载有生长因子的聚磷腈微球提供更多的附着空间。
在本发明实施例中，生长因子优选为调节软骨细胞基质的合成、代谢以及软骨形成的生长因子，包括：转录生长因子-β、骨形态发生蛋白、胰岛素样生长因子、成纤维细胞生长因子、血小板源性生长因子和血管内皮生长因子中的至少一种。生长因子更优选为转录生长因子-β1和胰岛素样生长因子，其中胰岛素样生长因子包括：胰岛素样生长因子-1和胰岛素样生长因子-2，优选为胰岛素样生长因子-1。转录生长因子-β1和胰岛素样生长因子可以在软骨修复的过程中，根据软骨形成的不同阶段，在时间上调控软骨修复，并且可以根据软骨形成的机制，调节转录生长因子-β1和胰岛素样生长因子的比例，通常二者的质量比可以为1:10-1:3，优选为1:5。
在本发明实施例中，所述聚磷腈微球选自聚[(甘氨酸乙酯)x(丙氨酸乙酯)(1-x)磷腈]微球和/或聚[(甘氨酸乙酯)y(丙氨酸乙酯)(1-y)磷腈]微球，其中0.1≤x≤0.4，0.6≤y≤0.9。聚[(甘氨酸乙酯)x(丙氨酸乙酯)(1-x)磷腈]微球相对于聚[(甘氨酸乙酯)y(丙氨酸乙酯)(1-y)磷腈]微球具有较强的疏水性，聚[(甘氨酸乙酯)x(丙氨酸乙酯)(1-x)磷腈]微球相对于聚[(甘氨酸乙酯)y(丙氨酸乙酯)(1-y)磷腈]微球在体内的降解速率慢，持续释放生长因子的时间相对长，使得在体内包载在聚[(甘氨酸乙酯)x(丙氨酸乙酯)(1-x)磷腈]微球中的生长因子可以长期地发挥促进软骨缺损修复的作用。
甘氨酸乙酯与丙氨酸乙酯共取代制备聚[(甘氨酸乙酯)x(丙氨酸乙酯)(1-x)磷腈]，其中0.1≤x≤0.4的方法如下：
(1)通过六氯环三磷腈单体在无水无氧条件下，220-280℃开环聚合48-192小时，制备平均分子量为103-105Da、聚合度为50～5000的线性聚二氯磷腈。将线性聚二氯磷腈溶于干燥四氢呋喃中得溶液A，其中-PNCl2-单元的浓度为0.01-0.25毫摩尔/毫升。
(2)将丙氨酸乙酯盐酸盐溶于干燥四氢呋喃中，溶液浓度为0.01-0.25毫摩尔/毫升，向其中加入三乙胺，丙氨酸乙酯盐酸盐与三乙胺的摩尔比为1:2，回流6小时后减压抽滤，得溶液B。
(3)将甘氨酸乙酯盐酸盐溶于干燥四氢呋喃中，溶液浓度为0.01-0.25毫摩尔/毫升，向其中加入三乙胺，甘氨酸乙酯盐酸盐与三乙胺的摩尔比为1:2，回流6小时后减压抽滤，得溶液C。
(4)将步骤(2)准备的溶液B逐滴加入步骤(1)制备的溶液A，丙氨酸乙酯与-PNCl2-单元的摩尔比为0.8:1-1.2:1，机械搅拌下，在35-60℃反应12-48hr，得反应混合物溶液D。
(5)将步骤(3)准备的溶液C逐滴加入步骤(4)制备的溶液D，甘氨酸乙酯与-PNCl2-单元的摩尔比为0.3:1-0.7:1，机械搅拌下，在35-60℃反应12-48hr，得反应混合物溶液E。
(8)反应结束后，将反应混合物溶液E过滤，滤液经旋转蒸发去除一部分四氢呋喃后得到粘稠状液体，将此粘稠液体置于透析袋(截留分子量3500Da)中，用四氢呋喃透析纯化3天，每6-12小时更换一次溶剂。透析结束后，将透析袋内的溶液自然挥发、真空干燥即得聚[(甘氨酸乙酯)x(丙氨酸乙酯)(1-x)磷腈]，其中0.1≤x≤0.4。
制备聚[(甘氨酸乙酯)y(丙氨酸乙酯)(1-y)磷腈]，其中0.6≤y≤0.9的方法与上述聚[(甘氨酸乙酯)x(丙氨酸乙酯)(1-x)磷腈]，其中0.1≤x≤0.4的区别仅在于，在步骤(4)中甘氨酸乙酯与-PNCl2-单元的摩尔比为0.1:1-0.5:1，在步骤(5)中甘氨酸乙酯与-PNCl2-单元的摩尔比为1:1-1.4:1。即可制备成聚[(甘氨酸乙酯)y(丙氨酸乙酯)(1-y)磷腈]，其中0.6≤y≤0.9。
将聚[(甘氨酸乙酯)x(丙氨酸乙酯)(1-x)磷腈]，其中0.1≤x≤0.4，聚[(甘氨酸乙酯)y(丙氨酸乙酯)(1-y)磷腈]，其中0.6≤y≤0.9，分别制备成聚[(甘氨酸乙酯)x(丙氨酸乙酯)(1-x)磷腈]微球，其中0.1≤x≤0.4和聚[(甘氨酸乙酯)y(丙氨酸乙酯)(1-y)磷腈]微球，其中0.6≤y≤0.9的方法请参见实施例7和实施例8。
在本发明的实施例中，包载有生长因子的聚磷腈微球优选为包载有转录生长因子-β1的聚[(甘氨酸乙酯)x(丙氨酸乙酯)(1-x)磷腈]微球和包载有胰岛素样生长因子的聚[(甘氨酸乙酯)y(丙氨酸乙酯)(1-y)磷腈]微球，其中0.1≤x≤0.4，0.6≤y≤0.9。由于转录生长因子-β1可诱导充质干细胞，持续作用于软骨修复过程，而胰岛素样生长因子可以促进软骨细胞增殖、刺激细胞分泌细胞外基质及抑制细胞外基质降解酶，在软骨修复的前期发挥着重要的作用。因此，将转录生长因子-β1包载在降解速率相对缓慢的聚[(甘氨酸乙酯)x(丙氨酸乙酯)(1-x)磷腈]微球，形成包载有转录生长因子-β1的聚[(甘氨酸乙酯)x(丙氨酸乙酯)(1-x)磷腈]微球，其中0.1≤x≤0.4，将胰岛素样生长因子-1包载在降解相对快速的聚[(甘氨酸乙酯)y(丙氨酸乙酯)(1-y)磷腈]微球中，形成包载有胰岛素样生长因子-1的聚[(甘氨酸乙酯)y(丙氨酸乙酯)(1-y)磷腈]微球，其中0.6≤y≤0.9，在时间和空间精确控制转录生长因子-β1和胰岛素样生长因子-1的释放，以达到更好的修复软骨缺损的效果。
进一步地，包载有生长因子的聚磷腈微球为包载有转录生长因子-β1的聚[(甘氨酸乙酯)0.3(丙氨酸乙酯)0.7磷腈]微球和包载有胰岛素样生长因子的聚[(甘氨酸乙酯)0.7(丙氨酸乙酯)0.3磷腈]微球。包载有转录生长因子-β1的聚[(甘氨酸乙酯)0.3(丙氨酸乙酯)0.7磷腈]微球和包载有胰岛素样生长因子的聚[(甘氨酸乙酯)0.7(丙氨酸乙酯)0.3磷腈]微球具有相对的疏水性和亲水性，使二者在体内表现出不同的降解速率，这样的降解速率差异更符合转录生长因子-β1和胰岛素样生长因子对软骨的修复机制，从而更利于修复软骨缺损。
本发明实施例中的包载有生长因子的聚磷腈微球，可以通过以下制备方法制得：
先将聚磷腈分散于二氯甲烷中；
之后向含有聚磷腈的二氯甲烷中加入油性表面活性剂，以及含有生长因子的水，形成初乳液，加入含有生长因子的水的体积小于二氯甲烷的体积；
然后对所述初乳液进行超声处理；
再向超声处理后的初乳液中加入稳定剂、水性表面活性剂以及水，搅拌处理，直至二氯甲烷挥发殆尽，得到含有包载有生长因子的聚磷腈微球的悬浮液；
最后对所述悬浮液反复进行洗涤和分离处理，之后冷冻干燥，得到包载有生长因子的聚磷腈微球。
从上述的包载有生长因子的聚磷腈微球的制备过程中可以看出，生长因子是在聚磷腈形成聚磷腈微球的过程中，同时包埋在聚磷腈微球中的，使聚磷腈微球作为生长因子的载体，在其降解的过程中，将生长因子缓慢释放出来，促进软骨缺损修复。
本发明实施例中的聚磷腈的分子式为：
其中，R1可以为氯、氨基酸酯，氨基酸酯，可以是甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、脯氨酸的甲酯、乙酯、丙酯、异丙酯和丁酯中的任意一种；
R2可以为氯、氨基酸酯，氨基酸酯，可以是甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、脯氨酸的甲酯、乙酯、丙酯、异丙酯和丁酯中的任意一种；
R1与R2可以相同也可以不同，R1与R2的摩尔比相加为1。
本发明实施例中所使用的生长因子为如前文所提及的生长因子，在此不作赘述。
下面对包载有生长因子的聚磷腈微球的制备过程进行解释说明。如下：
聚磷腈与二氯甲烷的比例可以为2％-5％(w/v)；
所使用的油性表面活性剂可以降低二氯甲烷的表面张力，油性表面活性剂具体可以为失水山梨醇单油酸酯溶液(俗称司班80溶液)；
加入含有生长因子的水，并且加入的体积小于二氯甲烷的体积，是为了使二氯甲烷包住水和其中的生长因子，含有生长因子的水团聚成一个个小球；
对初乳液进行超声处理，超声处理的目的是使形成的小球的粒径比较均匀，超声处理的功率可以为150-250w，超声处理的时间可以为8-3min；
向超声处理后的初乳液中加入稳定剂、水性表面活性剂以及水，降低水表面的张力，形成外水向，即水包住二氯甲烷，稳定剂可以为聚乙烯醇或明胶，水性表面活性剂可以为聚氧乙烯山梨糖醇酐单硬酸酯(俗称吐温60)；
搅拌的速率可以为1000转/min，待二氯甲烷挥发殆尽后可以停止搅拌，对所含有杂质的包载有生长因子的聚磷腈微球反复水洗，水洗次数可以为3至5次，将残留在包载有生长因子的聚磷腈微球的试剂清除。
在本发明第二方面，本发明实施例还提供了一种软骨组织工程修复支架的制备方法，所述制备方法包括：将所述包载有生长因子的聚磷腈微球和所述多孔支架本体置于磷酸缓冲液中预设时间，之后过滤处理，冷冻干燥，得到第一软骨组织工程修复支架。
在本发明实施例中，磷酸缓冲液(PBS)的pH值可以为6.8-7.4。此处所提及的预设时间可以为5分钟以上，使包载有生长因子的聚磷腈微球与多孔支架本体充分接触，尽可能地使更多的包载有生长因子的聚磷腈微球附着在多孔支架本体的孔隙中。
为了使多孔支架本体上附着更多的包载有生长因子的聚磷腈微球，所述制备方法还包括：向所述第一软骨组织工程修复支架内注射含有包载有生长因子的聚磷腈微球的磷酸缓冲液，之后冷冻干燥，得到第二软骨组织工程修复支架。
在实施的过程中，可以利用注射器吸取含有包载有生长因子的聚磷腈微球的磷酸缓冲液注射到多孔支架本体的孔隙中，增加多孔支架本体对包载有生长因子的聚磷腈微球的负载量，更多的生长因子更有利于软骨的形成。
实施例1
本发明实施例提供了一种甘氨酸乙酯与丙氨酸乙酯共取代聚膦腈的方法。该方法如下：
(1)通过六氯环三磷腈单体在无水无氧条件下，220-280℃开环聚合48-192小时，制备平均分子量为103-105Da、聚合度为50～5000的线性聚二氯磷腈。将线性聚二氯磷腈溶于干燥四氢呋喃中得溶液A，其中-PNCl2-单元的浓度为0.01-0.25毫摩尔/毫升。
(2)将丙氨酸乙酯盐酸盐溶于干燥四氢呋喃中，溶液浓度为0.01-0.25毫摩尔/毫升，向其中加入三乙胺，丙氨酸乙酯盐酸盐与三乙胺的摩尔比为1:2，回流6小时后减压抽滤，得溶液B。
(3)将甘氨酸乙酯盐酸盐溶于干燥四氢呋喃中，溶液浓度为0.01-0.25毫摩尔/毫升，向其中加入三乙胺，甘氨酸乙酯盐酸盐与三乙胺的摩尔比为1:2，回流6小时后减压抽滤，得溶液C。
(4)将步骤(2)准备的溶液B逐滴加入步骤(1)制备的溶液A，丙氨酸乙酯与-PNCl2-单元的摩尔比为1:1，机械搅拌下，在35-60℃反应12-48hr，得反应混合物溶液D。
(5)将步骤(3)准备的溶液C逐滴加入步骤(4)制备的溶液D，甘氨酸乙酯与-PNCl2-单元的摩尔比为0.5:1，机械搅拌下，在35-60℃反应12-48hr，得反应混合物溶液E。
(8)反应结束后，将反应混合物溶液E过滤，滤液经旋转蒸发去除一部分溶剂后得到粘稠状液体，将此粘稠液体置于透析袋(截留分子量3500Da)中，用四氢呋喃透析纯化3天，每6-12小时更换一次溶剂。透析结束后，将透析袋内的溶液自然挥发、真空干燥，即得聚[(甘氨酸乙酯)0.3(丙氨酸乙酯)0.7磷腈]。
实施例2
与实施例1的区别仅在于，丙氨酸乙酯与-PNCl2-单元的摩尔比为0.3:1，甘氨酸乙酯与-PNCl2-单元的摩尔比为1.2:1，制得的产物为聚[(甘氨酸乙酯)0.7(丙氨酸乙酯)0.3磷腈]。
实施例3
分别对实施例1和实施例2制得的聚[(甘氨酸乙酯)0.3(丙氨酸乙酯)0.7磷腈]和聚[(甘氨酸乙酯)0.7(丙氨酸乙酯)0.3磷腈]进行核磁共振(Nuclear Magnetic Resonance，简称NMR)检测。将聚[(甘氨酸乙酯)0.3(丙氨酸乙酯)0.7磷腈]和聚[(甘氨酸乙酯)0.7(丙氨酸乙酯)0.3磷腈]分别溶解于氘代氯仿(CDCl3)中，结果如表1所示：
表1磷元素和氢元素核磁共振检测
其中，PAGP70代表聚[(甘氨酸乙酯)0.3(丙氨酸乙酯)0.7磷腈]，PAGP30代表聚[(甘氨酸乙酯)0.7(丙氨酸乙酯)0.3磷腈]；Gly代表甘氨酸乙酯，Ala代表丙氨酸乙酯。
实施例4
本发明实施例提供了一种双乳液法制备包载有转录生长因子-β1的聚[(甘氨酸乙酯)0.3(丙氨酸乙酯)0.7磷腈]微球的方法。方法如下：
称取实施例1制得的聚[(甘氨酸乙酯)0.3(丙氨酸乙酯)0.7磷腈]0.6g溶于20ml二氯甲烷中，磁力搅拌以保证溶解完全；
然后加入2ml质量分数为1％的司班80溶液、2ml含有40微克/毫升转录生长因子-β1的去离子水，配制成初乳液；
将配制好的初乳液进行超声处理，超声功率为200W，超声时间为3min；
向超声处理后的初乳液中加入200ml质量分数为1％的聚乙烯醇溶液和2ml10％吐温60溶液，搅拌1000转/分，待二氯甲烷挥发4h后，停止搅拌，先用去去离子水洗涤、过滤后再离心，如此反复操作5遍，直至将残留在包载有转录生长因子-β1(TGF-β1)的聚[(甘氨酸乙酯)0.3(丙氨酸乙酯)0.7磷腈]微球中的聚乙烯醇清除掉，之后冷冻干燥机中冷冻干燥36小时，得到如图1所示的包载有转录生长因子-β1(TGF-β1)的聚[(甘氨酸乙酯)0.3(丙氨酸乙酯)0.7磷腈]微球，记为TGF-β1+PAGP70微球。
图2为包载转录生长因子-β1(TGF-β1)的聚[(甘氨酸乙酯)0.3(丙氨酸乙酯)0.7磷腈]微球的粒径直方图，由图2可知，TGF-β1+PAGP70微球的平均粒径为54.22±19.19μm。
实施例5
本发明实施例提供了一种双乳液法制备包载有胰岛素样生长因子-1的聚[(甘氨酸乙酯)0.7(丙氨酸乙酯)0.3磷腈]微球的方法。方法如下：
称取实施例2制得的聚[(甘氨酸乙酯)0.7(丙氨酸乙酯)0.3磷腈]0.6g溶于20ml二氯甲烷中，磁力搅拌以保证溶解完全；
然后加入2ml质量分数为1％的司班80溶液、2ml含有200微克/毫升胰岛素样生长因子-1(IGF-1)的去离子水，配制成初乳液；
将配制好的初乳液进行超声处理，超声功率为200W，超声时间为3min；
向超声处理后的初乳液中加入200ml质量分数为1％的聚乙烯醇溶液和2ml10％吐温60溶液，搅拌1000转/分，待二氯甲烷挥发4h后，停止搅拌，先用去去离子水洗涤、过滤后再离心，如此反复操作5遍，直至将残留在包载有IGF-1的聚[(甘氨酸乙酯)0.7(丙氨酸乙酯)0.3磷腈]微球中的聚乙烯醇清除掉，冷冻干燥机中冷冻干燥36小时，得到如图3所示的包载有IGF-1的聚[(甘氨酸乙酯)0.7(丙氨酸乙酯)0.3磷腈]微球，记为IGF-1+PAGP30微球。
图4为包载有胰岛素样生长因子-1的聚[(甘氨酸乙酯)0.7(丙氨酸乙酯)0.3磷腈]微球的粒径直方图，由图4可知IGF-1+PAGP30微球的平均粒径为34.11±18.82μm。
实施例6
分别对实施例4和实施例5制备的TGF-β1+PAGP70微球和IGF-1+PAGP30微球进行降解实验。
分别称取5毫克TGF-β1+PAGP70微球和IGF-1+PAGP30微球分别浸入1ml pH值为7的磷酸缓冲溶液(PBS)中，并置于温度为37℃，转速为40rpm的摇床中。在预定的时间点(1，2，4，7，10，14，21，28，35和42天)，通过离心分离分别采集上清液后，再补充PBS对两种微球进行再悬浮。通过ELISA检测试剂盒分别测定上清液中TGF-β1和IGF-I的含量，结果分别如图5和图6所示。同时，通过扫描电镜监测两种微球长达90天的降解形态，结果如图7所示。
由图5的结果可知，TGF-β1+PAGP70微球释放TGF-β1主要有两个的阶段，在第1天，TGF-β1+PAGP70微球累积释放TGF-β1占其所包载的TGF-β1总量的33.09％±7.24％，随后缓慢持续释放，在第42天，TGF-β1+PAGP70微球累积释放TGF-β1占其所包载的TGF-β1总量的82.63％±5.08％。
由图6的结果可知，在第1天IGF-1+PAGP30微球累积释放IGF-1为61.74％±8.57％，在第28天，IGF-1+PAGP30微球累积释放IGF-1为98.24％±1.43％，也就是说，IGF-1+PAGP30微球包载的IGF-1几乎释放完毕。说明IGF-1+PAGP30微球释放IGF-1快于TGF-β1+PAGP70微球释放TGF-β1。
由图7的结果可知，TGF-β1+PAGP70微球的外表面较光滑，有许多不规则的孔，在15天内的降解过程中，外形保持完整，在第30天形态发生变化，外表面出现较多的裂纹，孔径也在变大；IGF-1+PAGP30微球相对于TGF-β1+PAGP70微球具有粗糙的表面和更密集的孔，15天以后其表面粗糙度明显增加，在第90天球形结构完全破裂，其降解速率明显快于TGF-β1+PAGP70微球。
综合图5、图6和图7的结果可知，生长因子的释放动力学与上述微球的降解速率正相关。IGF-1+PAGP30微球具有较快降解速率，因此，IGF-1在其降解前期表现出火山喷发般地释放，而TGF-β1+PAGP70微球相对于IGF-1+PAGP30微球具有疏水性，因而降解速率相对较慢，可以缓慢地释放TGF-β1。这样的释放方式与软骨修复过程中对TGF-β1和IGF-1的需要相符合，可以更好地促进受损软骨的修复。
通过TGF-β1+PAGP70微球和IGF-1+PAGP30微球分别在制备过程中TGF-β1和IGF-1的用量，以及在二者降解过程中TGF-β1和IGF-1的释放量，分别计算这两种微球中TGF-β1和IGF-1的加载量，结果为TGF-β1+PAGP70微球中TGF-β1的加载量为90.34纳克/毫克，IGF-1+PAGP30微球中IGF的加载量为569.57纳克/毫克。
实施例7
本发明实施例提供了一种双乳液法制备聚[(甘氨酸乙酯)0.3(丙氨酸乙酯)0.7磷腈]微球的方法。
实施例7与实施例4的区别仅在于实施例7中去离子水不含有转录生长因子-β1，从而制成了聚[(甘氨酸乙酯)0.3(丙氨酸乙酯)0.7磷腈]微球，记为PAGP70微球。
实施例8
本发明实施例提供了一种双乳液法制备聚[(甘氨酸乙酯)0.7(丙氨酸乙酯)0.3磷腈]微球。
实施例8与实施例5的区别仅在于实施例8中的去离子水不含有胰岛素样生长因子-1，从而制成了聚[(甘氨酸乙酯)0.7(丙氨酸乙酯)0.3磷腈]微球，记为PAGP30微球。
实施例9
测定实施例7制备的聚[(甘氨酸乙酯)0.3(丙氨酸乙酯)0.7磷腈]微球和实施例8制备的聚[(甘氨酸乙酯)0.7(丙氨酸乙酯)0.3磷腈]微球对细胞毒性和与骨髓间充质干细胞的的生物相容性。
骨髓间充质干细胞(BMSCs)源自于六周大的Spraguee Dawley(SD)大鼠，并经过两次继代培养的骨髓间充质干细胞。
继代培养的具体操作为：
将骨髓间充质干细胞培养在α-DMEM培养基含10％(V/V)血清和诱导分化的软骨细胞分化培养基(rasmx-90041；赛业生物公司、森尼维耳、CA、美国)于37℃5％浓度的CO2条件下孵育。
细胞活性检测：
于96孔中每个孔接种5×103个BMSCs，分为PAGP70微球组和PAGP30微球组，其中两组中的各自微球的浓度梯度均为0.125、0.25、0.5、1.0和2.0mg/mL，并且分别在孵育第1天、第3天和第5天加入10μL CCK-8(Dojindo美国)和200μLα-DMEM培养基，利用的酶标仪在450nm波长下测定吸光度，结果如图8和图9所示：采用CCK-8法检测细胞活性，随着PAGP70微球和PAGP30微球用量增加，PAGP70微球组和PAGP30微球组的细胞存活率均略有下降，5天培养后这两组的细胞存活率均在70％以上。此结果证明，本发明实施例中的聚[(甘氨酸乙酯)x(丙氨酸乙酯)(1-x)磷腈]微球和聚[(甘氨酸乙酯)y(丙氨酸乙酯)(1-y)磷腈]微球，其中0.1≤x≤0.4，0.6≤y≤0.9，不会增加BMSCs细胞毒性反应，不会引起炎症反应，2毫克/毫升以下浓度为安全浓度。
生物相容性检测：
6×105个骨髓间充质干细胞(BMSCs)分别与2毫克PAGP70微球和PAGP30微球接种在激光共聚焦小皿内单层共培养24h，与罗丹明-鬼笔环肽染色(160nm；细胞骨架的公司，丹佛、CO、美国)1小时37℃、复染用Hoechst 33258(1:800；西格玛，圣路易斯，穆村，美国)，在激光共聚焦显微镜(SP2倒置显微镜；徕卡，曼海姆，德国)下观察，结果如图10所示：PAGP70微球和PAGP30微球的多孔的表面适合细胞粘附。也就是说，本发明实施例中的聚[(甘氨酸乙酯)x(丙氨酸乙酯)(1-x)磷腈]微球和聚[(甘氨酸乙酯)y(丙氨酸乙酯)(1-y)磷腈]微球，其中0.1≤x≤0.4，0.6≤y≤0.9生物相容性好。
实施例10
本发明实施例提供了一种脱钙骨基质的制备方法，该制备方法如下：
将股骨上附着的肌肉、筋膜、脂肪等软组织剔去，仅保留骨性成分。修整的股骨进行切割，选取骨骺端，利用生理盐水冲洗残留的骨髓3次。将冲洗后的骨骺切割成4×4×2cm3大小的骨块，悬浸于脱脂液(甲醇∶氯仿＝1:1v/v)内，进行脱脂处理48小时；
脱钙液配制：用去离子水配制0.5M乙二胺四乙酸脱钙液，控制其pH＝8.3，脱钙液保存及脱钙过程均在4℃下用塑料容器盛载(避免玻璃容器)；
生理盐水冲洗脱脂后骨块，浸泡于脱钙液中，脱钙液每日更换。脱钙完全度检测：每日换下的脱钙液用原子吸收分光光度计检测钙离子浓度以监测脱钙进程，当脱钙液中的钙(Ca)螯合物浓度<0.5g/L，即为完全脱钙，得到脱钙骨基质。
实施例11
本发明实施例提供了一种软骨组织工程修复支架的制备方法，该制备方法如下：
分别将磷酸缓冲液，含有2mg/mL的TGF-β1+PAGP70微球的磷酸缓冲液、含有2mg/mL的IGF-1+PAGP30微球的磷酸缓冲液，以及含有1mg/mL的TGF-β1+PAGP70微球和1mg/mL的IGF-1+PAGP30微球的磷酸缓冲液，其中磷酸缓冲液的pH值均为7.4，滴加到脱钙骨基质上，并冷冻干燥，从而制备出脱钙骨基质支架、TGF-β1+PAGP70微球支架、IGF-1+PAGP30微球支架、以及TGF-β1+PAGP70微球和IGF-1+PAGP30微球支架。TGF-β1+PAGP70微球支架、IGF-1+PAGP30微球支架的扫描电镜图如图11所示，表明包载有TGF-β1的聚[(甘氨酸乙酯)x(丙氨酸乙酯)(1-x)磷腈]微球，其中0.1≤x≤0.4可粘附在脱钙骨基质上，包载有IGF-1的聚[(甘氨酸乙酯)y(丙氨酸乙酯)(1-y)磷腈]微球，其中0.6≤y≤0.9可粘附在脱钙骨基质上，软骨组织工程修复支架制备成功。
对上述这四种支架在含有1×106个骨髓间充质干细胞(BMSCs)的悬浮液培养三天后，添加钙黄绿和乙二聚体试剂(Invitrogen公司、美国)30分钟后利用tcs-sp8共焦显微镜分别在488nm和568nm的激发光下观察四种支架上细胞的整体分布情况，并从不同的层面得到的三维结构图像。结果如图12所示，其中，绿色荧光表明活细胞，而红色荧光表明死细胞；每个区域的总体积为1740×1740×240μM3(X，Y，Z轴)。可见，脱钙骨基质支架的绿色荧光最少，说明其上骨髓间充质干细胞粘附和存活的少，而TGF-β1+PAGP70微球支架、IGF-1+PAGP30微球支架、以及TGF-β1+PAGP70微球和IGF-1+PAGP30微球支架上的绿色荧光较多，说明这三种支架可有效地支持骨髓间充质干细胞的粘附和增殖。
实施例12
本发明实施例提供了对实施例11制备的四种支架进行动物体内关节软骨缺损重建实验。具体步骤如下：
36只新西兰大白兔，体重2.5～3.0kg，随机分为四组，即脱钙骨基质支架组、TGF-β1+PAGP70微球支架组、IGF-1+PAGP30微球支架组、以及TGF-β1+PAGP70微球和IGF-1+PAGP30微球支架组。在兔膝关节内侧髌旁行纵向切口切开关节囊，髌骨外翻后显露膝关节。在兔股骨滑车沟区使用角膜环钻制造软骨缺损(直径为4毫米，深度3毫米)，利用微骨折技术释放缺损区骨髓间充质干细胞后分别填充上述四种支架。分别在术后6周，12周和24周，对组织修复进行大体观察，结果如图13所示，术后6周时脱钙骨基质支架组的软骨缺损未有效填补，缺损仍很明显。而在TGF-β1+PAGP70微球支架组、IGF-1+PAGP30微球支架组、以及TGF-β1+PAGP70微球和IGF-1+PAGP30微球支架组虽然软骨缺损仍然存在，但其表面均覆盖有白色半透明再生组织。随着时间的推移，12周时脱钙骨基质支架缺损区中心部仍存在，而TGF-β1+PAGP70微球支架组、IGF-1+PAGP30微球支架组、以及TGF-β1+PAGP70微球联合IGF-1+PAGP30微球支架组修复的再生组织光滑并且与周围正常软骨有明显的连接。第24周时，TGF-β1+PAGP70微球支架组、IGF-1+PAGP30微球支架组、以及TGF-β1+PAGP70微球和IGF-1+PAGP30微球支架组均有一个模糊的边界，再生软骨组织的表面类似于相邻的正常软骨，由此可以看出，TGF-β1+PAGP70微球支架、IGF-1+PAGP30微球支架、以及TGF-β1+PAGP70微球和IGF-1+PAGP30微球支架对受损软骨的修复效果均优于脱钙骨基质支架，并且TGF-β1+PAGP70微球和IGF-1+PAGP30微球支架对受损软骨的修复效果最好。
分别对术后6，12周和24周的软骨缺损进行组织学评价。新西兰大白兔的股骨远端置于4％多聚甲醛溶液中固定48小时，再置于实施例10提及的脱钙液中7天，通过脱水，石蜡包埋，制成切片，进行H&E染色、番红-O染色和II型胶原免疫组化染色，其结果分别如图14-1至14-3所示。在术后6周，软骨缺损组织修复如图14-1所示，在脱钙骨基质支架组软骨缺损区的边缘仍存在间隙，软骨细胞外基质粘多糖(GAG)红染在番红-O染色中并未发现新生组织，而在其他三组均可见新生组织填塞缺损区。经过12周的愈合，如图14-2所示，H&E染色观察软骨下骨再生结构，其他三组明显比脱钙骨基质支架组新生骨组织多，并且微球支架组均有明显的软骨下骨桥连接，这在TGF-β1-PAGP70微球组以及TGF-β1+PAGP70微球和IGF-1+PAGP30微球支架组更为明显，说明包载有生长因子的支架更有利于促进软骨下骨新生骨组织修复，并且二型胶原免疫组化染色提示含有微球的支架组中新生软骨组织中细胞外基质中二型胶原含量更高。如图14-3所示在24周，脱钙骨基质支架组的缺损区填充一层薄薄的纤维软骨，并且新生软骨表层多出现无软骨细胞区域，TGF-β1-PAGP70微球组以及TGF-β1+PAGP70微球和IGF-1+PAGP30微球支架组中的缺损区的修复组织表现为均匀的番红-O红染新生软骨，新生软骨组织中GAG含量明显较脱钙骨基质支架组的高。
图14-4对番红-O染色切片的再生修复组织边缘进行高倍图像采集(N代表缺损区边缘的正常软骨；R代表缺损区的新生软骨组织)，在第6周时，脱钙骨基质支架组的正常软骨与再生软骨之间仍存在裂隙，而其他三组的再生软骨和正常软骨区整合度比脱钙骨基质支架组高。在12周时，脱钙骨基质支架组的新生软骨组织和正常区软骨组织仍然存在结构上的差异，番红-O染色为绿染，而其他三组的再生骨组织可见清晰的软骨细胞结构，并且细胞外基质染色为红染，表明软骨细胞外基质中粘多糖含量明显增多，这对新生软骨组织的抗压缩能力及软骨细胞微环境的建立均有明显促进作用。最后在24周时其他三组新生软骨组织和周围正常软骨组织结构更为相似，这其中TGF-β1+PAGP70微球和TGF-β1+PAGP70微球和IGF-1+PAGP30微球支架组表现出更佳的新生软骨组织完整性，尤其是TGF-β1+PAGP70微球和IGF-1+PAGP30微球支架组。
由上述实施例可知，本发明提供的软骨组织工程修复支架能够明显促进骨软骨缺损的修复速度和软骨再生效果，能够在一期手术治疗中同时发挥生长因子时空缓释刺激促进软骨组织修复，可为组织工程提供新的思路，具有广泛的临床应用前景。
以上所述仅是为了便于本领域的技术人员理解本发明的技术方案，并不用以限制本发明。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (12)

1.一种软骨组织工程修复支架，其特征在于，包括：
多孔支架本体和附着在所述多孔支架上的包载有生长因子的聚磷腈微球。
2.根据权利要求1所述支架，其特征在于，所述多孔支架本体由生物天然材料制成。
3.根据权利要求2所述支架，其特征在于，所述生物天然材料包括：蚕丝蛋白、纤维蛋白、胶原蛋白、明胶、琼脂糖、藻酸盐、透明质酸和壳聚糖中的至少一种。
4.根据权利要求1所述支架，其特征在于，所述多孔支架本体为脱钙骨基质。
5.根据权利要求1所述支架，其特征在于，所述生长因子为转录生长因子-β、骨形态发生蛋白、胰岛素样生长因子、成纤维细胞生长因子、血小板源性生长因子和血管内皮生长因子中的至少一种。
6.根据权利要求1所述支架，其特征在于，所述生长因子为转录生长因子-β1和胰岛素样生长因子。
7.根据权利要求1所述支架，其特征在于，所述聚磷腈微球选自聚[(甘氨酸乙酯)x(丙氨酸乙酯)(1-x)磷腈]微球和/或聚[(甘氨酸乙酯)y(丙氨酸乙酯)(1-y)磷腈]微球，其中0.1≤x≤0.4，0.6≤y≤0.9。
8.根据权利要求1所述支架，其特征在于，所述包载有生长因子的聚磷腈微球为包载有转录生长因子-β1的聚[(甘氨酸乙酯)x(丙氨酸乙酯)(1-x)磷腈]微球和包载有胰岛素样生长因子的聚[(甘氨酸乙酯)y(丙氨酸乙酯)(1-y)磷腈]微球，其中0.1≤x≤0.4，0.6≤y≤0.9。
9.根据权利要求8所述支架，其特征在于，所述包载有生长因子的聚磷腈微球为包载有转录生长因子-β1的聚[(甘氨酸乙酯)0.3(丙氨酸乙酯)0.7磷腈]微球和包载有胰岛素样生长因子-1的聚[(甘氨酸乙酯)0.7(丙氨酸乙酯)0.3磷腈]微球。
10.根据权利要求1所述支架，其特征在于，所述包载有生长因子的聚磷腈微球的制备方法为：
先将聚磷腈分散于二氯甲烷中；
之后向含有聚磷腈的二氯甲烷中加入油性表面活性剂，以及含有生长因子的水，形成初乳液，加入含有生长因子的水的体积小于二氯甲烷的体积；
然后对所述初乳液进行超声处理；
再向超声处理后的初乳液中加入稳定剂、水性表面活性剂以及水，搅拌处理，直至二氯甲烷挥发殆尽，得到含有包载有生长因子的聚磷腈微球的悬浮液；
最后对所述悬浮液反复进行洗涤和分离处理，之后冷冻干燥，得到包载有生长因子的聚磷腈微球。
11.一种软骨组织工程修复支架的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括：
将所述包载有生长因子的聚磷腈微球和所述多孔支架本体置于磷酸缓冲液中预设时间，之后过滤处理，冷冻干燥，得到第一软骨组织工程修复支架。
12.根据权利要求11所述的制备方法，其特征在于，所述制备方法还包括：
向所述第一软骨组织工程修复支架内注射含有包载有生长因子的聚磷腈微球的磷酸缓冲液，之后冷冻干燥，得到第二软骨组织工程修复支架。
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