CN105435310A - 一种以脐带沃顿胶体外初步构建组织工程软骨的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种以脐带沃顿胶体外初步构建组织工程软骨的方法,将新鲜人类脐带里的沃顿胶组织制作成梯度沃顿胶组织块，再经过消化冻融并冻干制作成一体化梯度脱细胞软骨支架材料；将检测合格的转化生长因子-β1缓释微球负载在支架材料上，与第3代脐带间充质干细胞进行复合诱导培养成组织工程梯度软骨复合体。本发明第一次证实了以沃顿胶制作一体化梯度天然脱细胞软骨支架材料的可行性；该支架材料的内外层之间过渡自然、连接紧密；两层的理化性能有一定区别，但主要成分和生物学性能相同，检测结果符合软骨支架的要求；该支架材料与干细胞在体外复合诱导培养后能初步得到梯度组织工程软骨复合体。

Description

一种以脐带沃顿胶体外初步构建组织工程软骨的方法

技术领域

本发明属于软骨组织工程领域，尤其涉及一种以脐带沃顿胶体外初步构建组织工程软骨的方法。

背景技术

目前，组织工程软骨材料被认为是最有应用前景的关节软骨修复材料。在软骨组织工程构建软骨的过程中，支架材料起到为细胞和生长因子提供支撑、粘附、分化、增殖及代谢场所的作用，可以把支架材料当作临时的细胞外基质。

目前并没有一种支架材料能完全满足软骨组织工程的要求，而仿生多相梯度设计已成为软骨组织工程支架设计的重要因素和必备要求之一。脱细胞基质材料因为能最大限度的继承细胞外基质成分，从而最能够充分遵循仿生设计原则。细胞外基质围绕在细胞周围，由细胞自身分泌的一系列组织，软骨支架材料通过模仿细胞外基质达到支撑细胞，为细胞和生长因子的粘附、分化、增殖、代谢及相关调控基因的表达提供场所。软骨支架材料研制的核心原则就是仿生设计，所以脱细胞软骨支架材料已成为当前软骨组织工程支架研究的热点。脱细胞软骨支架材料从来源上分类属于天然软骨支架材料的一种，具有生物组织相容性高、细胞黏附率高等优点；更重要的是，脱细胞材料降解率符合生物组织降解规律，降解产物易被机体所吸收，具备无炎症反应、毒性较小、抗原性低等优点；另外，脱细胞软骨支架材料在一定程度上仍然保留有胶原、糖胺多糖、层粘连蛋白及纤维粘连蛋白等多种天然细胞外基质成分，这些特点使得脱细胞软骨支架材料与其他类型软骨支架材料相比，能更加充分的仿生，并能更加有利于诱导细胞向其中黏附、增殖、分化及重建组织。但是，脱细胞软骨支架材料存在以下两大方面的缺陷：第一，脱细胞软骨支架材料与其它天然软骨支架材料一样，存在力学性能不佳、结构改性困难的缺点。而关节软骨在机体内的功能是承受重力或机体活动带来的力学负荷以及提供弹性润滑的接触面，这些都需要关节软骨必须具备出色的力学性能和微观结构。第二，脱细胞基质材料往往通过将同种异体或异种组织甚至器官经过脱细胞和去免疫原性等处理后获得。而关节软骨在机体内分布比例小，取材范围有限，加之取软骨操作难度大，很难将同种异体或异种关节软骨作为原材料大量成批的制备脱细胞软骨支架材料。

人工合成梯度材料因能够通过各种制备工艺控制和材料选择得到分梯度的支架材料，从而最大限度的模仿正常关节软骨的纤维走行，从而为使组织工程软骨复合体能最大限度的达到正常关节软骨的生物力学功能起到促进甚至决定作用，已经成为了当前研究的热点。但人工合成梯度材料的原材料均为人工合成，生物学性能较差，且往往不能很好的促进细胞的生物学行为的发挥，有碍软骨组织的生成和组织工程软骨组织复合体功能的发挥；并且，目前所研制的多相梯度软骨支架材料都存在过渡区域结合不牢的共同缺点，也就是说在两个不同相的接触面在抵抗剪应力时存在表现不佳的现象，而不同相接触面需要稳定的结合。找到使材料各层之间结合紧密的解决办法，或者找到一种天然过渡的连接紧密的一体化交界面也成为了当前研究的热点。

总而言之，目前尚未有理想的软骨组织工程支架材料。脱细胞支架材料虽然有着很好的应用前景，但脱细胞支架材料存在原材料来源有限以及力学性能不佳的缺点；多相梯度设计虽然被认为是目前理想软骨支架材料的必备设计要求，但多相梯度软骨支架材料几乎都为人工合成材料，生物学性能较差且无法很好的促进细胞生物学行为的发挥，并存在交界区域过渡不自然甚至不牢固的缺点。

发明内容

本发明的目的在于提供一种以脐带沃顿胶体外初步构建组织工程软骨的方法，旨在解决天然脱细胞支架力学强度差、结构改性困难、原材料来源有限，以及多相梯度软骨支架材料生物学性能不佳的问题。

本发明是这样实现的，一种以脐带沃顿胶体外初步构建组织工程软骨的方法包括：

步骤一、将新鲜人类脐带里的沃顿胶组织制作成梯度沃顿胶组织块，再经过消化冻融并冻干制作成一体化梯度脱细胞软骨支架材料。

步骤二、将检测合格的转化生长因子-β1缓释微球负载在支架材料上，与第3代脐带间充质干细胞进行复合诱导培养成组织工程梯度软骨复合体。

进一步，步骤一所述的制作分梯度的沃顿胶组织块的具体方法为：

将经过预冻的脐带标本垂直其长轴切成高20mm的圆柱体，剥离脐带外膜后完整切除中心脐血管区域，剩下呈环柱体形状的沃顿胶组织块，将环柱体沃顿胶组织块沿环柱体高度线切开，将沃顿胶拉伸展开成一大块长方体，最后选取较平整无缺损的部位将沃顿胶加工成12mm×8mm×3mm大小长方体的组织块。

进一步，步骤一所述的制作一体化梯度脱细胞软骨支架材料的具体方法为：

步骤一、将沃顿胶组织块置入含抗生素PBS液中浸泡冲洗5min，重复3次。

步骤二、双蒸水浸泡沃顿胶组织块1min。

步骤三、胰蛋白酶消化组织块15min。

步骤四、双蒸水震荡漂洗组织块5min。

步骤五、将漂洗干净的组织块装入冻存管里，快速置入含液氮罐的液氮中冷冻15min，取出后将沃顿胶组织块立即经37℃水浴快速复温，重复上述急冻急复温过程3次。

步骤六、再次将组织块置入含抗生素PBS液中，浸泡冲洗10min次。

步骤七、双蒸水浸泡组织块5小时，每15min震荡1次。

步骤八、将组织块置入－80℃的低温冰箱预冻1h从而调节孔径大小。

步骤九、真空冷冻干燥机中将组织块真空冷冻干燥12h得到沃顿胶梯度脱细胞软骨支架材料。

步骤十、将得到的沃顿胶梯度脱细胞软骨支架材料使用环氧乙烷灭菌8h后放入冰箱密封保存备用。

进一步，步骤二所述的组织工程梯度软骨复合体的制作方法包括：

步骤一、负载生长因子缓释微球到支架材料：

取制备好的包裹TGF-β1壳聚糖缓释微球粉末100mg，在20ml含抗生素的无菌双蒸水中分散，充分分散后制成缓释微球悬浊液。将制备好的沃顿胶一体化梯度脱细胞软骨支架材料放入12孔无菌培养板里，往每个孔里缓慢滴加缓释微球悬浊液，直到使支架材料里充分吸满缓释微球悬浊液并完全浸泡在缓释微球悬浊液中，最后将支架材料进行真空低温冷冻干燥12h后环氧乙烷灭菌8h备用。

步骤二、负载DMEM到支架材料：

将经过环氧已烷灭菌的支架用无菌磷酸盐缓冲液浸泡20分钟，甩掉多余水分后将支架材料置于12孔培养板内，用含15％PBS的含抗生素DMEM培养基预湿8小时，干燥备用。

步骤三、细胞-支架复合物的构建。

进一步，所述细胞-支架复合物的构建方法为：

步骤一、获取及调整细胞密度：

将P3代MSCs(脐带间充质干细胞)，状态为生长至接近融合，用0.25％胰蛋白酶+0.02％EDTA消化，之后收集并调整MSCs细胞密度到6×10⁷/mL；

步骤二、接种和孵育：

取准备好的负载生长因子缓释微球和负载DMEM的两类支架，放置在12孔培养板内，吸取100ulMSCs细胞悬液，全部匀速滴加到支架材料上，每块支架上滴加100ulMSCs细胞悬液；之后将这些滴了细胞悬液的支架材料置于37℃、100％饱和湿度、5％C0₂的培养箱内孵育l小时，之后翻转这些支架材料，再按每块支架上滴加100ulMSCs细胞悬液的浓度操作一遍，之后放入37℃、100％饱和湿度、5％C0₂的培养箱内继续孵育2小时。

步骤三、成软骨诱导培养：

首先取已接种充分支架材料的培养板，向每个培养孔中缓慢小心地加入2ml的含15％PBS的含抗生素DMEM培养基，再放置于37℃、100％饱和湿度、5％CO₂的培养箱中培养12小时。

之后改用高糖成软骨诱导培养基诱导培养，每周更换培养基3次，每2-3天一次，更换培养基时仔细观察细胞的粘附、增殖、分化及形态改变，直到第21天停止。

进一步，按以下步骤制备包裹TGF-β1壳聚糖缓释微球：

步骤一、制备TGF-β1溶液：

室温下，取10μgTGF-β1及与2mL浓度为4mmol/L的HCl液体，将两者充分混合制成TGF-β1溶液2ml。

步骤二、制备壳聚糖溶液：

室温下，取100mg壳聚糖溶解于浓度为2％的4ml乙酸溶液中，置入磁力搅拌器中充分搅拌，待完全溶解后得到壳聚糖溶液4ml。

步骤三、制备TGF-β1-壳聚糖混合溶液：

室温下，将2mlTGF-β溶液与4ml壳聚糖溶液充分混合制备成TGF-β1-壳聚糖混合溶液。

步骤四、乳化TGF-β1-壳聚糖混合溶液：

室温下，按1:20的比例制作聚山梨酯-80与正辛醇混合液，比例为聚山梨酯-80∶正辛醇＝5％，将TGF-β1-壳聚糖混合溶液缓慢地添加到10ml乳化剂-T80与正辛醇混合液中，再使用磁力搅拌器将其快速搅拌，使之成为TGF-β1-壳聚糖乳化液，静置20min备用。

步骤五、交联TGF-β1-壳聚糖乳化溶液：

室温下，向TGF-β-1壳聚糖乳化溶液中缓慢倒入浓度为100g/L的10mL多聚磷酸钠溶液，使TGF-β1-壳聚糖交联成微球，并逐渐沉淀在混合液中。

步骤六、缓释微球的提取：

室温下，将沉淀有TGF-β1壳聚糖微球的混合液离心，用大量的异丙醇和蒸馏水反复洗涤沉淀微球，将湿的微球团块取出经真空低温冷冻干燥10h后备用。

人类(动物)的软骨本身是分层规律的结构，靠近关节面的软骨组织纤维平行与关节面分布，远离关节面的软骨组织纤维与关节面垂直。目前，除了本产品外，国内外还没有一款材料既是生物材料(生物新能好)，又是一体化梯度材料(天然仿生，模仿软骨本身的结构)。

相对于现有技术，本发明的有益效果为：本发明第一次证实了以沃顿胶制作一体化梯度天然脱细胞软骨支架材料的可行性，丰富了软骨组织工程的研究并为进一步更深入的研究提供了实验依据；该支架材料的内外层之间过渡自然、连接紧密；两层的理化性能有一定区别，但主要成分和生物学性能相同，检测结果符合软骨支架的要求；该支架材料与干细胞在体外复合诱导培养后能初步得到梯度组织工程软骨复合体，且该支架材料的外侧层比内测层更有助于软骨干细胞的生物学行为。

附图说明

图1是本发明实施例提供的以脐带沃顿胶体外初步构建组织工程软骨的方法流程图。

图2是本发明实施例提供的材料内外侧层支架壁纳米显微硬度、支架壁纳米弹性模量、孔径大小、密度、GAGs含量和II型胶原含量的柱状统计图。

图3是本发明实施例提供的材料内外侧层孔隙率、2周降解率、4周降解率和吸水率的柱状统计图。

具体实施方式

为能进一步了解本发明的发明内容、特点及功效，兹例举以下实施例，并配合附图详细说明如下。

本发明是这样实现的，一种以脐带沃顿胶体外初步构建组织工程软骨的方法包括：

S101、将新鲜人类脐带里的沃顿胶组织制作成梯度沃顿胶组织块，再经过消化冻融并冻干制作成一体化梯度脱细胞软骨支架材料。

S102、将检测合格的转化生长因子-β1缓释微球负载在支架材料上，与第3代脐带间充质干细胞进行复合诱导培养成组织工程梯度软骨复合体。

进一步，步骤一所述的制作分梯度的沃顿胶组织块的具体方法为：

将经过预冻的脐带标本垂直其长轴切成高20mm的圆柱体，剥离脐带外膜后完整切除中心脐血管区域，剩下呈环柱体形状的沃顿胶组织块，将环柱体沃顿胶组织块沿环柱体高度线切开，将沃顿胶拉伸展开成一大块长方体，最后选取较平整无缺损的部位将沃顿胶加工成12mm×8mm×3mm大小长方体的组织块。

进一步，步骤一所述的制作一体化梯度脱细胞软骨支架材料的具体方法为：

步骤一、将沃顿胶组织块置入含抗生素PBS液(庆大霉素：1万单位/100ml，青霉素：5万单位/100ml)中浸泡冲洗5min，重复3次。

步骤二、双蒸水浸泡沃顿胶组织块1min。

步骤三、胰蛋白酶(2.5g/l)消化组织块(37℃，反复震荡)15min。

步骤四、双蒸水震荡漂洗组织块5min。

步骤五、将漂洗干净的组织块装入冻存管里，快速置入含液氮罐的液氮(－196℃)中冷冻15min，取出后将沃顿胶组织块立即经37℃水浴快速复温，重复上述急冻急复温过程3次。

步骤六、再次将组织块置入含抗生素PBS液(庆大霉素：1万单位/100ml，青霉素：5万单位/100ml)中，浸泡冲洗10min次。

步骤七、双蒸水浸泡组织块5小时，每15min震荡1次。

步骤八、将组织块置入－80℃的低温冰箱预冻1h从而调节孔径大小。

步骤九、真空冷冻干燥机中将组织块真空冷冻干燥12h得到沃顿胶梯度脱细胞软骨支架材料。

步骤十、将得到的沃顿胶梯度脱细胞软骨支架材料使用环氧乙烷灭菌8h后放入冰箱(温度为4℃)密封保存备用。

进一步，步骤二所述的组织工程梯度软骨复合体的制作方法包括：

步骤一、负载生长因子缓释微球到支架材料：

取制备好的包裹TGF-β1壳聚糖缓释微球粉末100mg，在20ml含抗生素的无菌双蒸水(庆大霉素：1万单位/100ml，青霉素：5万单位/100ml)中分散，充分分散后制成缓释微球悬浊液。将制备好的沃顿胶一体化梯度脱细胞软骨支架材料放入12孔无菌培养板里，往每个孔里缓慢滴加缓释微球悬浊液，直到使支架材料里充分吸满缓释微球悬浊液并完全浸泡在缓释微球悬浊液中，最后将支架材料进行真空低温冷冻干燥12h后环氧乙烷灭菌8h备用。

步骤二、负载DMEM到支架材料：

将经过环氧已烷灭菌的支架用无菌磷酸盐缓冲液(PBS)浸泡20分钟，甩掉多余水分后将支架材料置于12孔培养板内，用含15％PBS的含抗生素DMEM培养基(庆大霉素：1万单位/100ml，青霉素：5万单位/100ml)预湿8小时，干燥备用。

步骤三、细胞-支架复合物的构建。

进一步，所述细胞-支架复合物的构建方法为：

步骤一、获取及调整细胞密度：

将P3代MSCs(脐带间充质干细胞)，状态为生长至接近融合，用0.25％胰蛋白酶+0.02％EDTA消化，之后收集并调整MSCs细胞密度到6×10⁷/mL。

步骤二、接种和孵育：

取准备好的负载生长因子缓释微球和负载DMEM的两类支架，放置在12孔培养板内，吸取100ulMSCs细胞悬液，全部匀速滴加到支架材料上，每块支架上滴加100ulMSCs细胞悬液；之后将这些滴了细胞悬液的支架材料置于37℃、100％饱和湿度、5％C0₂的培养箱内孵育l小时，之后翻转这些支架材料，再按每块支架上滴加100ulMSCs细胞悬液的浓度操作一遍，之后放入37℃、100％饱和湿度、5％C0₂的培养箱内继续孵育2小时。

步骤三、成软骨诱导培养：

首先取已接种充分支架材料的培养板，向每个培养孔中缓慢小心地加入2ml的含15％PBS的含抗生素DMEM培养基(庆大霉素：1万单位/100ml，青霉素：5万单位/100ml)，再放置于37℃、100％饱和湿度、5％CO₂的培养箱中培养12小时。

之后改用高糖成软骨诱导培养基(含大霉素：1万单位/100ml，青霉素：5万单位/100ml10ug/ml，地塞米松：10-8mol/L)诱导培养，每周更换培养基3次，每2-3天一次，更换培养基时仔细观察细胞的粘附、增殖、分化及形态改变，直到第21天停止。

进一步，按以下步骤制备包裹TGF-β1壳聚糖缓释微球：

步骤一、制备TGF-β1溶液：

室温下，取10μgTGF-β1及与2mL浓度为4mmol/L的HCl液体，将两者充分混合制成TGF-β1溶液2ml。

步骤二、制备壳聚糖溶液：

室温下，取100mg壳聚糖溶解于浓度为2％的4ml乙酸溶液中，置入磁力搅拌器中充分搅拌，待完全溶解后得到壳聚糖溶液4ml。

步骤三、制备TGF-β1-壳聚糖混合溶液：

室温下，将2mlTGF-β溶液与4ml壳聚糖溶液充分混合制备成TGF-β1-壳聚糖混合溶液。

步骤四、乳化TGF-β1-壳聚糖混合溶液：

室温下，按1:20的比例制作聚山梨酯-80(Tween-80，聚氧乙烯脱水山梨醇单油酸酯)与正辛醇混合液，比例为聚山梨酯-80∶正辛醇＝5％，将TGF-β1-壳聚糖混合溶液缓慢地添加到10ml乳化剂-T80与正辛醇混合液中，再使用磁力搅拌器将其快速搅拌，使之成为TGF-β1-壳聚糖乳化液，静置20min备用。

步骤五、交联TGF-β1-壳聚糖乳化溶液：

室温下，向TGF-β-1壳聚糖乳化溶液中缓慢倒入浓度为100g/L的10mL多聚磷酸钠溶液，使TGF-β1-壳聚糖交联成微球，并逐渐沉淀在混合液中。

步骤六、缓释微球的提取：

室温下，将沉淀有TGF-β1壳聚糖微球的混合液离心(R＝3600rpm，RCF＝724.464g)，用大量的异丙醇和蒸馏水反复洗涤沉淀微球，将湿的微球团块取出经真空低温冷冻干燥10h后备用。

表1沃顿胶一体化梯度脱细胞软骨支架材料形态学观测结果总结表

沃顿胶可以经消化冻融冻干法制得一体化梯度脱细胞软骨支架材料，肉眼下呈白色多孔泡沫样海绵状的长方体，质地疏松有一定韧性，材料侧面观肉眼可见分层，均可见较多孔隙分布。

表2沃顿胶一体化梯度脱细胞软骨支架材料理化性能和成分分析结果

图2是材料内外侧层支架壁纳米显微硬度、支架壁纳米弹性模量、孔径大小、密度、GAGs含量和II型胶原含量的柱状统计图，图中可以看出，内侧层的支架壁纳米显微硬度、支架壁纳米弹性模量、孔径大小和密度大于外侧层，且具有统计学意义(P＜0.05)。

图3是材料内外侧层孔隙率、2周降解率、4周降解率和吸水率的柱状统计图，图中可以看出，内侧层的孔隙率小于外侧层，且具有统计学意义(P＜0.05)。

沃顿胶一体化梯度脱细胞软骨支架材料内侧层的支架壁纳米显微硬度、支架壁纳米弹性模量、孔径大小、密度检测结果均大于外侧层，且结果均初步符合软骨组织工程支架的基本要求。

沃顿胶一体化梯度脱细胞软骨支架材料内侧层的孔隙率检测结果小于外侧层，且结果均初步符合软骨组织工程支架的基本要求。

沃顿胶一体化梯度脱细胞软骨支架材料内侧层的降解率、吸水率、GAGs含量、II型胶原含量与外侧层没有差别，且结果均初步符合软骨组织工程支架的基本要求。

这些结果和结论具有一定的价值：首先，它们得到了沃顿胶一体化梯度脱细胞软骨支架材料主要理化性能和成分组成的实验数据；其次，通过这些数据说明了该支架从理化性能和成分组成方面而言是初步符合软骨组织工程基本要求的；再次，它们明确了在本发明所述制作工艺前体下，材料内外侧层在理化性能和成分组成方面的不同，包括材料内侧层的孔径大小、密度检测结果均大于外侧层，以及材料内侧层的孔隙率检测结果小于外侧层。以上这些不但说明了从理化性能和成分组成方面而言，证明了沃顿胶一体化梯度脱细胞软骨支架材料是备选的软骨组织工程梯度化支架材料，而且还为分析今后体内外成软骨培养的结果提供线索和实验依据。

表3沃顿胶一体化梯度脱细胞软骨支架材料生物学性能检测结果总结表

沃顿胶一体化梯度脱细胞软骨支架材料的皮下肌肉埋植实验、急性全身毒性实验、热原实验、溶血实验、皮内刺激实验、支架浸提液的细胞毒性实验、支架复合干细胞的细胞毒性实验以及支架细胞粘附率实验结果的判定都是合格的。

沃顿胶一体化梯度脱细胞软骨支架材料内侧层的细胞粘附率与外侧层没有差别。

将沃顿胶一体化梯度脱细胞软骨支架材料复合干细胞后在体外进行成软骨诱导培养后，进行相关检测和分析，得到如下结果(见表4)：

1、沃顿胶一体化梯度脱细胞软骨支架材料能很好的负载缓释微球。

2、沃顿胶一体化梯度脱细胞软骨支架材料与干细胞复合在体进行成软骨外诱导培养21天，能初步得到分梯度的组织工程软骨复合体。

3、HE染色、甲苯胺蓝染色、II型胶原免疫组化染色、RT-qPCR检测成软骨相关mRNA、WesternBlot检测成软骨相关蛋白等检测提示该软骨支架的内外侧层都能促进软骨细胞的增殖和分化及软骨组织的形成，但外侧层比内侧层更适合细胞生物学行为的发挥。

4、原子力显微镜观察该组织工程软骨复合体内外侧层的表面形貌，内侧层粗糙、起伏大有大孔洞，外侧层较平整、起伏小含小孔洞。

5、该软骨复合体在形变约15％以下的范围内可产生弹性模量变化，将该软骨复合体的内侧层与外侧层的进行比较，随着培养时间的增加各组压缩弹性模量逐渐增大，但增大的幅度并不大，内侧层的压缩弹性模量比外侧层要大，但都远小于关节软骨的水平。

表4沃顿胶一体化梯度脱细胞软骨支架材料生物学性能检测结果总结表

沃顿胶一体化梯度脱细胞软骨支架材料与干细胞在体外复合诱导培养后能初步得到梯度组织工程软骨复合体，且该支架材料的外侧层比内测层更有助于软骨干细胞的生物学行为。

为比较本发明一体化梯度方法的优越性，特进行下述对比试验：

试验例1：

表5：本发明一体化梯度脱细胞软骨支架材料与非一体化梯度脱细胞软骨支架材料制备工艺差别：

试验例2：

表6：“沃顿胶梯度一体化软骨支架材料”相比“普通、无序的沃顿胶软骨支架材料”的优势：

本发明第一次证实了以沃顿胶制作一体化梯度天然脱细胞软骨支架材料的可行性，丰富了软骨组织工程的研究并为进一步更深入的研究提供了实验依据；该支架材料的内外层之间过渡自然、连接紧密；两层的理化性能有一定区别，但主要成分和生物学性能相同，检测结果符合软骨支架的要求；该支架材料与干细胞在体外复合诱导培养后能初步得到梯度组织工程软骨复合体，且该支架材料的外侧层比内测层更有助于软骨干细胞的生物学行为。

以上所述仅是对本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，凡是依据本发明的技术实质对以上实施例所做的任何简单修改，等同变化与修饰，均属于本发明技术方案的范围内。

Claims (6)

1.一种以脐带沃顿胶体外初步构建组织工程软骨的方法，其特征在于，所述的以脐带沃顿胶体外初步构建组织工程软骨的方法包括：

步骤一、将新鲜人类脐带里的沃顿胶组织制作成梯度沃顿胶组织块，再经过消化冻融并冻干制作成一体化梯度脱细胞软骨支架材料；

步骤二、将检测合格的转化生长因子-β1缓释微球负载在支架材料上，与第3代脐带间充质干细胞进行复合诱导培养成组织工程梯度软骨复合体。

2.如权利要求1所述的以脐带沃顿胶体外初步构建组织工程软骨的方法，其特征在于，步骤一所述的制作分梯度的沃顿胶组织块的具体方法为：

将经过预冻的脐带标本垂直其长轴切成高20mm的圆柱体，剥离脐带外膜后完整切除中心脐血管区域，剩下呈环柱体形状的沃顿胶组织块，将环柱体沃顿胶组织块沿环柱体高度线切开，将沃顿胶拉伸展开成一大块长方体，最后选取较平整无缺损的部位将沃顿胶加工成12mm×8mm×3mm大小长方体的组织块。

3.如权利要求1所述的以脐带沃顿胶体外初步构建组织工程软骨的方法，其特征在于，步骤一所述的制作一体化梯度脱细胞软骨支架材料的具体方法为：

步骤一、将沃顿胶组织块置入含抗生素PBS液中浸泡冲洗5min，重复3次；

步骤二、双蒸水浸泡沃顿胶组织块1min；

步骤三、胰蛋白酶消化组织块15min；

步骤四、双蒸水震荡漂洗组织块5min；

步骤五、将漂洗干净的组织块装入冻存管里，快速置入含液氮罐的液氮中冷冻15min，取出后将沃顿胶组织块立即经37℃水浴快速复温，重复上述急冻急复温过程3次；

步骤六、再次将组织块置入含抗生素PBS液中，浸泡冲洗10min次；

步骤七、双蒸水浸泡组织块5小时，每15min震荡1次；

步骤八、将组织块置入－80℃的低温冰箱预冻1h从而调节孔径大小；

步骤九、真空冷冻干燥机中将组织块真空冷冻干燥12h得到沃顿胶梯度脱细胞软骨支架材料；

步骤十、将得到的沃顿胶梯度脱细胞软骨支架材料使用环氧乙烷灭菌8h后放入冰箱密封保存备用。

4.如权利要求1所述的以脐带沃顿胶体外初步构建组织工程软骨的方法，其特征在于，步骤二所述的组织工程梯度软骨复合体的制作方法包括：

步骤一、负载生长因子缓释微球到支架材料：

取制备好的包裹TGF-β1壳聚糖缓释微球粉末100mg，在20ml含抗生素的无菌双蒸水中分散，充分分散后制成缓释微球悬浊液；将制备好的沃顿胶一体化梯度脱细胞软骨支架材料放入12孔无菌培养板里，往每个孔里缓慢滴加缓释微球悬浊液，直到使支架材料里充分吸满缓释微球悬浊液并完全浸泡在缓释微球悬浊液中，最后将支架材料进行真空低温冷冻干燥12h后环氧乙烷灭菌8h备用；

步骤二、负载DMEM到支架材料：

将经过环氧已烷灭菌的支架用无菌磷酸盐缓冲液浸泡20分钟，甩掉多余水分后将支架材料置于12孔培养板内，用含15％PBS的含抗生素DMEM培养基预湿8小时，干燥备用；

步骤三、细胞-支架复合物的构建。

5.如权利要求1所述的以脐带沃顿胶体外初步构建组织工程软骨的方法，其特征在于，所述细胞-支架复合物的构建方法为：

步骤一、获取及调整细胞密度：

将P3代MSCs，状态为生长至接近融合，用0.25％胰蛋白酶+0.02％EDTA消化，之后收集并调整MSCs细胞密度到6×10⁷/mL；

步骤二、接种和孵育：

取准备好的负载生长因子缓释微球和负载DMEM的两类支架，放置在12孔培养板内，吸取100ulMSCs细胞悬液，全部匀速滴加到支架材料上，每块支架上滴加100ulMSCs细胞悬液；之后将这些滴了细胞悬液的支架材料置于37℃、100％饱和湿度、5％C0₂的培养箱内孵育l小时，之后翻转这些支架材料，再按每块支架上滴加100ulMSCs细胞悬液的浓度操作一遍，之后放入37℃、100％饱和湿度、5％C0₂的培养箱内继续孵育2小时；

步骤三、成软骨诱导培养：

首先取已接种充分支架材料的培养板，向每个培养孔中缓慢小心地加入2ml的含15％PBS的含抗生素DMEM培养基，再放置于37℃、100％饱和湿度、5％CO₂的培养箱中培养12小时；

之后改用高糖成软骨诱导培养基诱导培养，每周更换培养基3次，每2-3天一次，更换培养基时仔细观察细胞的粘附、增殖、分化及形态改变，直到第21天停止。

6.如权利要求1所述的以脐带沃顿胶体外初步构建组织工程软骨的方法，其特征在于，按以下步骤制备包裹TGF-β1壳聚糖缓释微球：

步骤一、制备TGF-β1溶液：

室温下，取10μgTGF-β1及与2mL浓度为4mmol/L的HCl液体，将两者充分混合制成TGF-β1溶液2ml；

步骤二、制备壳聚糖溶液：

室温下，取100mg壳聚糖溶解于浓度为2％的4ml乙酸溶液中，置入磁力搅拌器中充分搅拌，待完全溶解后得到壳聚糖溶液4ml；

步骤三、制备TGF-β1-壳聚糖混合溶液：

室温下，将2mlTGF-β溶液与4ml壳聚糖溶液充分混合制备成TGF-β1-壳聚糖混合溶液；

步骤四、乳化TGF-β1-壳聚糖混合溶液：

室温下，按1:20的比例制作聚山梨酯-80与正辛醇混合液，比例为聚山梨酯-80∶正辛醇＝5％，将TGF-β1-壳聚糖混合溶液缓慢地添加到10ml乳化剂-T80与正辛醇混合液中，再使用磁力搅拌器将其快速搅拌，使之成为TGF-β1-壳聚糖乳化液，静置20min备用；

步骤五、交联TGF-β1-壳聚糖乳化溶液：

室温下，向TGF-β-1壳聚糖乳化溶液中缓慢倒入浓度为100g/L的10mL多聚磷酸钠溶液，使TGF-β1-壳聚糖交联成微球，并逐渐沉淀在混合液中；

步骤六、缓释微球的提取：

室温下，将沉淀有TGF-β1壳聚糖微球的混合液离心，用大量的异丙醇和蒸馏水反复洗涤沉淀微球，将湿的微球团块取出经真空低温冷冻干燥10h后备用。