CN104623735A - 一种解剖状复合三维支架组织工程软骨及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种解剖状复合三维支架组织工程软骨及其制备方法。一种解剖状复合三维支架组织工程软骨，该组织工程软骨采用聚己内酯-羟基磷灰石复合材料为支架，支架上搭载IGF-1 PLGA微球，IGF-1 PLGA微球的添加量为支架重量的0.1%~2%。本发明制备的新型三维多孔支架具有良好的生物相容性和可降解性，无细胞毒性，植入生物体内后可随着正常软骨组织的再生而逐渐降解，最终为再生软骨代替，从而达到彻底治愈软骨损伤的目的。

Description

一种解剖状复合三维支架组织工程软骨及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种解剖状复合三维支架组织工程软骨及其制备方法。

背景技术

关节软骨损伤作为一个基本的病理过程，几乎参与了所有临床常见的关节疾病病理变化早期阶段，如创伤性关节炎，骨性关节炎，类风湿性关节炎，股骨头坏死等。这些关节疾病虽然有着完全不同的病因和各异的病理变化过程，但在其病变早期都表现出相同的病理过程，即关节软骨的病变。如何能够在关节疾病病变早期控制软骨的损伤程度，尽早终止软骨进一步损伤，甚至完全磨损，尽早干预并促进软骨组织的修复，是治疗此类关节疾病的关键所在。然而，由于软骨组织内缺乏血管和淋巴分布，软骨细胞含量少，缺乏细胞分化所必须的祖母细胞且包埋于稠厚的细胞外基质中，缺乏迁徙能力，无法移动到损伤部位参与修复，因此其自我修复能力非常差，即使是微小的软骨缺损也难以自然修复。

目前临床上对于关节软骨损伤主要以手术治疗为主，包括：关节镜修复术、微骨折术、软骨下骨钻孔术、自体软骨移植术和自体软骨细胞移植术等。但是这些治疗方法临床疗效不够理想，且存在许多不足之处。其中关节镜修复术短期疗效较明显，但仅能延缓软骨磨损进程，无法促进软骨缺损修复，无法最终阻止关节炎的发生。微骨折术和软骨下骨钻孔术旨在使软骨下骨骨髓腔内的干细胞渗透到软骨损伤部位，启动软骨修复机制。但是由于缺乏精确有效的定位和调控，且修复后形成的是以纤维软骨为主的混合组织，因此临床效果并不理想。自体软骨移植术和自体软骨细胞移植术目前临床较为常用，但存在着取材来源有限，供区感染、失血、伤口难愈合，患者需遭受额外痛苦且不易接受等诸多问题。由于对关节软骨损伤缺乏有效的临床治疗方法，许多患者最后都进一步发展成为骨性关节炎，而作为临床治疗骨性关节炎唯一有效的人工关节置换术，其费用高昂，创伤大，并发症多，使用寿命有限，患者需遭受极大的身心痛苦和沉重的经济负担。由于此类关节疾病发病率高，致残性高，严重损害了患者的身体健康，危害巨大，因此被世界卫生组织定义为“第一致残疾病”。

组织工程技术的出现，为关节软骨损伤的治疗提供了一种全新的思路和方法。美国国家科学基金会（NSF）于1987年首次提出了“组织工程”（tissue engineering）的概念，其基本原理是应用细胞生物学、生物材料和工程学的原理，研究开发用于修复或改善人体病损组织或器官的结构、功能的生物活性替代物。由于软骨组织中细胞成分单一，结构简单，只含有软骨细胞，因此组织工程技术非常适用于软骨缺损修复的研究。1977年，Green成功分离培养软骨细胞，并尝试与脱钙骨支架材料联合培养，为软骨组织工程研究的发展奠定了基础。1994年Vacanti等用分离的牛关节软骨细胞与可降解的生物材料在裸鼠皮下成功构建出透明软骨组织，此后软骨组织工程进入了快速发展阶段，我国科学家曹谊林等于1997年在裸鼠体内成功构建出具有皮肤覆盖的复杂三维空间结构的人耳廓形态软骨，标志着软骨组织工程研究迈向了一个新的台阶。此后，软骨组织工程技术迅速发展，成为了近十年来的研究热点。作为一门新兴的交叉学科，软骨组织工程的发展具有非常广阔的前景。

支架材料是软骨组织工程研究最为重要的一个因素，它为种子细胞提供获取营养、气体交换、废物排泄和生长代谢的场所，种子细胞附着于支架材料上不断更新、代谢，分化繁殖新的细胞，最终形成与体内软骨组织在形态和功能上完全一致且能正常代谢、增殖的软骨组织并植入到体内缺损部位，从而达到临床上完全治愈软骨缺损的目的。目前常用的人工软骨生物支架材料按其来源可分为三类：①天然生物材料，如藻酸盐、壳聚糖、纤维素、纤维蛋白凝胶、明胶、胶原、胶原海绵、硫酸软骨素、以及透明质酸等，天然生物材料的生物相容性和细胞黏附性较好，其组成成分和网状结构比较适合于种子细胞的增殖，分化及新陈代谢，但其可塑性差，机械强度不够，具有潜在的免疫原性和病原微生物污染可能，且难以大批量生产；②人工合成材料，如聚乙二醇、聚乙烯、多肽、聚乳酸（polylactic acid, PLA）、聚羟基乙酸(polyglycolic acid, PGA)、聚乳酸与聚羟基乙酸共聚体(polylactic-glycolic acid, PLGA)等，其中PLA，PGA及PLGA已被美国FDA批准用于人体。有学者将基于PGA和PLA的三维多孔聚合物结合自体软骨细胞移植修复软骨损伤，术后2年随防发现新生软骨和宿主软骨结合良好，关节功能显著改善。人工合成材料优势在于可大规模生产并且其理化特性可根据需要进行改变，但也存在着亲水性不够，对种子细胞的黏附性较差等问题；③复合材料，是将两种或两种以上的生物材料按一定的比例和流程制备而成，以消除单种材料的缺陷，提高支架的整体性能。较常见的有：明胶/硫酸软骨素/透明质酸钠、聚氧化乙烯/甲壳素/壳聚糖、壳聚糖/明胶、羟基磷灰石/胶原/透明质酸等。

关节软骨是一种非均质、具有粘弹性并充满液体的可渗透性物质，具有很好的生物机械性能，目前常用的支架材料均不能满足这一要求。如何从结构和性能上模拟天然软骨是目前支架材料开发的热门研究方向。结构决定功能，组织工程软骨的生物机械性能在很大程度上取决于生物支架材料的设计和制备技术。如何制备出接近天然关节软骨机械性能的生物支架将是软骨组织工程研究必需解决的技术难题。新型支架材料的开发研究是目前软骨组织工程研究的焦点。

细胞因子在ADSCs定向分化为软骨细胞的过程中起到了非常关键的作用。胰岛素样生长因子-1(Insulin-like growth factor-Ⅰ, IGF-Ⅰ)能够促进软骨细胞增殖、再分化，保持软骨细胞的特异表型并抑制程序性凋亡，同时促进软骨基质合成代谢，抑制软骨基质的降解，是体内调节软骨蛋白聚糖合成最重要的生长因子。在软骨细胞体外培养中，IFG-Ⅰ能够增加蛋白聚糖的合成，使软骨蛋白聚糖的合成量达到与体内相当的水平。Fortier等将IFG-Ⅰ和软骨细胞--纤维蛋白载体用于马的全层软骨缺损中，发现8个月后实验组 (含IFG-Ⅰ)新生软骨中DNA、Ⅱ型胶原和蛋白多糖的合成量明显高于对照组 (不含IFG-Ⅰ)，通过进一步对新生软骨组织形态学、胶原类型和生物学的分析，证实IFG-Ⅰ能够明显地提高全层软骨缺损的修复质量。有学者将IFG-Ⅰ用于软骨细胞的体外培养过程中，在不同的时间检测IFG-Ⅰ mRNA的含量，发现外源性的IFG-Ⅰ能够诱导软骨细胞的IFG-Ⅰ自分泌和旁分泌，这对于软骨缺损的体内修复有着积极的促进作用。但外源性IGF-Ⅰ价格昂贵，稳定性不好，体内半衰期短，生物膜透过性差，且在游离状态下极易失活，从而限制了其有效性的发挥。如何使细胞因子持续、高效释放以促进种子细胞定向分化和维持细胞表型是当前面临的关键性问题之一。

发明内容

为了解决上述的技术问题，本发明的一个目的是提供一种解剖状复合三维支架组织工程软骨，将IGF-1 PLGA微球搭载于解剖外形复合三维多孔支架内，以构建一种能在软骨组织损伤早期即植入生物体内恢复关节正常功能，并能快速、高效的自行再生软骨组织的新型复合支架系统。本发明第二个目的是提供一种上述的组织工程软骨的制备方法。

为了实现上述的第一个目的，本发明采用了以下的技术方案：

一种解剖状复合三维支架组织工程软骨，该组织工程软骨采用聚己内酯-羟基磷灰石复合材料为支架，支架上搭载IGF-1 PLGA微球，IGF-1 PLGA微球的添加量为支架重量的0.1%~2%。

作为优选，所述的IGF-1 PLGA微球的添加量为支架重量的0.5%~1%。

作为优选，所述的IGF-1 PLGA微球中rhIGF-1的含有量为0.01~0.5%。作为再优选，所述的IGF-1 PLGA微球中rhIGF-1的含有量为0.1~0.3%。

为了实现上述的第二个目的，本发明采用了以下的技术方案：

一种制备上述的解剖状复合三维支架组织工程软骨的方法，该方法包括以下的步骤：称取适量IGF-1 PLGA微球溶于含有PBS缓冲液的玻璃试管中，逐滴滴入复合支架上，-10~-30℃保存。

作为优选，所述的复合支架以液态，HA质量分数为10~30%的PCL-HA复合材料为原料，通过三维打印机逐层打印出三维解剖状的复合三维支架；将制备好的支架用去离子水清洗2~4次，每次10~25 min；丙酮清洗1次，10~25 min；真空40~50℃干燥20~30 h，100~120℃下定型20~30  h，消毒后真空包装，-2~-6℃冷藏。

作为优选，所述的IGF-1 PLGA微球的制备方法包括以下的步骤：

1）把1mg rhIGF-1冻干粉溶于100μl去离子水中，调配为浓度为10mg/ml的水溶液，作为内层水相，即W1相；

2）取500mg PLGA和140mg Span-80溶解于10ml二氯甲烷中，作为油相，即O相；

3）将W1相加入O相中，冰浴下用超声细胞粉碎机超声乳化1min后，形成初乳液W1/O；

4）持续搅拌下将 W1/O初乳液缓慢匀速加入到100ml含150mg tween-80的2% (w/v)的PVA水溶液中，PVA水溶液即外层水相W2，冰浴下3000rpm匀速磁力搅拌10min，形成 W1/O/W2双层复乳液；

4）然后常温下500rpm匀速磁力搅拌6h，除去有机溶剂后固化，然后冲洗过滤，10000rpm离心10min，得到IGF-1 PLGA微球，-20℃保存备用。

本发明由于采用了上述的技术方案，利用三维打印技术和计算机设计技术，构建的基于PLGA和PCL-HA复合材料的新型三维多孔支架，具有独特的各向异性排列结构，并具有与损伤软骨需修复部分完全精确一致解剖外形，且具有良好的生物力学性能。可直接植入体内以发挥其机械性能，并能为种子细胞提供良好的体内天然微环境。同时本发明采用W/O/W乳化-溶剂挥发法制备IGF-1 PLGA微球，将其搭载于解剖外形复合三维多孔支架内，以构建一种能在软骨组织损伤早期即植入生物体内恢复关节正常功能，并能快速、高效的自行再生软骨组织的新型复合支架系统。本发明制备的新型三维多孔支架具有良好的生物相容性和可降解性，无细胞毒性，植入生物体内后可随着正常软骨组织的再生而逐渐降解，最终为再生软骨代替，从而达到彻底治愈软骨损伤的目的。

附图说明

图1为支架复合材料的降解速率图。

图2、图3为三维兔股骨远端干骺端及关节面实体模型。

图4、图5为三维解剖状的复合三维支架。

图6为PLGA微球透射电镜图，PLGA微球呈圆球状，形态良好，直径大小为50-80μm，表面光滑。

图7为PLGA微球扫描电镜图，PLGA微球呈圆球状，形态良好，直径大小为50-80μm，表面光滑。

图8为搭载IGF-1 PLGA微球的复合支架扫描电镜图，支架孔洞丰富，孔径为150-300μm，微球分布较均匀，测得孔隙率为92%。

图9、图10为兔股骨髁搭载IGF-1 PLGA微球的复合支架植入手术图。

具体实施方式

1. 复合支架成品制备方法

本发明使用本课题组前期成功研制出的解剖外形复合三维支架。具体制备流程：使用CAD软件设计修改三维兔股骨远端干骺端及关节面实体模型（如图2、图3所示），修改后的数据以STL的格式储存。将修改后的STL格式的三维数据输入三维打印机，以液态，HA质量分数为20%的PCL-HA复合材料为原料，逐层打印出三维解剖状的复合三维支架（如图4、图5所示）。将制备好的支架用去离子水清洗3次，每次15 min；丙酮清洗1次(15 min)；真空45℃干燥24 h，105℃下定型24 h，环氧乙烷消毒后真空包装，-4℃冷藏备用。

2. 载IGF-1 PLGA微球的制备

采用W/O/W乳化-溶剂挥发法制备载IGF-1 PLGA微球，具体过程为：把1mg rhIGF-1冻干粉溶于100μl去离子水中，调配为浓度为10mg/ml的水溶液，作为内层水相(W1相)。取500mg PLGA和140mg Span-80溶解于10ml二氯甲烷中，作为油相(O相)。将W1相加入O相中，冰浴下用超声细胞粉碎机超声乳化1min后，形成初乳液W1/O。持续搅拌下将 W1/O初乳液缓慢匀速加入到100ml含150mg tween-80的2% (w/v)的PVA水溶液中（外层水相W2），冰浴下3000rpm匀速磁力搅拌10min，形成 W1/O/W2双层复乳液。然后常温下500rpm匀速磁力搅拌6h，除去有机溶剂后固化。然后冲洗过滤，10000rpm离心10min，得到IGF-1 PLGA微球，-20℃保存备用。

3. 搭载IGF-1 PLGA微球的复合支架的制备

称取0.2mg、0.8g 或1.5g IGF-1 PLGA微球溶于含有2ml PBS缓冲液(pH 7.4)的玻璃试管中，逐滴滴入100g复合支架上，-20℃保存备用。

4. 细胞增殖实验

取第三代兔脂肪干细胞，以1×10⁵/ml密度，接种细胞悬液于复合支架材料上，共培养 3d、7d、14d，电镜观察测定细胞增殖情况。

结果：支架材料与细胞共培养3d、7d、14d后，细胞计数显示增殖情况良好。共培养第3天细胞数：3.6±0.31×10⁴，第7天：8.5±0.45×10⁴，第14天：11.2±0.49×10⁴。结果显示复合支架对脂肪干细胞无毒性，促增殖作用良好。

5. 压缩模量的测定

在MTS 810材料试验机上测定未降解试样加载单元最大量程200 N，加载速率0.1 mm/min，计算其压缩模量。

结果显示：复合支架压缩模量为3.589±0.125 Ec/Mpa，适合用于软骨组织工程。

6. 降解实验

将支架样品真空干燥至恒重后放入盛有人工降解液的试管中，在37℃下的人工降解液里密闭降解，分别在降解4、8、12、16、20、24周时将试样取出。蒸馏水清洗、干燥至恒重。测试降解速率。

结果：如图1所示，随着降解时间的延长，支架复合材料的降解速率增大。

7. PLGA微球及复合支架的形貌观察

取适量冻干的PLGA微球分散于无水乙醇中，滴入铜网，晾干后透射电镜观察微球形貌及粒径（如图6所示）。

取适量冻干的PLGA微球置于硅片上，表面喷金处理，扫描电镜观察微球表面形貌特征（如图7所示）。

称取适量IGF-1 PLGA微球溶于含有2ml PBS缓冲液(pH 7.4)的玻璃试管中，逐滴滴入复合支架上。表面喷金处理后扫描电镜观察各自表面形态（如图8所示）。

Claims (7)

1.一种解剖状复合三维支架组织工程软骨，其特征在于该组织工程软骨采用聚己内酯-羟基磷灰石复合材料为复合支架，复合支架上搭载IGF-1 PLGA微球，IGF-1 PLGA微球的添加量为复合支架重量的0.1%~2%。

2.根据权利要求1所述的一种解剖状复合三维支架组织工程软骨，其特征在于：IGF-1 PLGA微球的添加量为复合支架重量的0.5%~1%。

3.根据权利要求1或2所述的一种解剖状复合三维支架组织工程软骨，其特征在于：IGF-1 PLGA微球中rhIGF-1的含有量为0.01~0.5%。

4.根据权利要求3所述的一种解剖状复合三维支架组织工程软骨，其特征在于：IGF-1 PLGA微球中rhIGF-1的含有量为0.1~0.3%。

5.一种制备权利要求1~4任意一项权利要求所述的解剖状复合三维支架组织工程软骨的方法，其特征在于该方法包括以下的步骤：称取适量IGF-1 PLGA微球溶于含有PBS缓冲液的玻璃试管中，逐滴滴入复合支架上，-10~-30℃保存。

6.根据权利要求5所述的解剖状复合三维支架组织工程软骨的制备方法，其特征在于：复合支架以液态，HA质量分数为10~30%的PCL-HA复合材料为原料，通过三维打印机逐层打印出三维解剖状的复合三维支架；将制备好的支架用去离子水清洗2~4次，每次10~25 min；丙酮清洗1次，10~25 min；真空40~50℃干燥20~30 h，100~120℃下定型20~30  h，消毒后真空包装，-2~-6℃冷藏。

7.根据权利要求5所述的解剖状复合三维支架组织工程软骨的制备方法，其特征在于：IGF-1 PLGA微球的制备方法包括以下的步骤：

1）把1mg rhIGF-1冻干粉溶于100μl去离子水中，调配为浓度为10mg/ml的水溶液，作为内层水相，即W1相；

2）取500mg PLGA和140mg Span-80溶解于10ml二氯甲烷中，作为油相，即O相；

3）将W1相加入O相中，冰浴下用超声细胞粉碎机超声乳化1min后，形成初乳液W1/O；

4）持续搅拌下将 W1/O初乳液缓慢匀速加入到100ml含150mg tween-80的2% (w/v)的PVA水溶液中，PVA水溶液即外层水相W2，冰浴下3000rpm匀速磁力搅拌10min，形成 W1/O/W2双层复乳液；

5）然后常温下500rpm匀速磁力搅拌6h，除去有机溶剂后固化，然后冲洗过滤，10000rpm离心10min，得到IGF-1 PLGA微球，-20℃保存备用。