CN112567020A - 可注射的即用的软骨、肌腱和韧带修复组合物及其使用方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了包含凝集的间充质细胞体和水凝胶的组合物。该组合物可以进一步包含药物或生长因子。凝集的间充质细胞体可包括结缔组织细胞，或甚至能够产生结缔组织细胞外基质如胶原蛋白和糖胺聚糖的祖细胞。还提供了治疗结缔组织缺陷、软骨损伤和软骨退变的方法。

Description

可注射的即用的软骨、肌腱和韧带修复组合物及其使用方法

相关申请的交叉引用

本申请要求于2018年3月6日提交的美国临时申请号62/639,322的优先权，其全部公开内容通过引用合并于此。

背景技术

软骨损伤每年影响大约一百万美国人，导致超过500K(50万台)的软骨相关手术[1]。当前治疗软骨损伤的方法包括清创术和微骨折术[2]、骨髓刺激、自体软骨细胞植入(ACI)[3]、基质诱导的自体软骨细胞植入(MACI)[4]、镶嵌成形术[5]，骨软骨自体移植和骨软骨异体移植[6-8]。每年至少进行350,000例膝关节置换术，其中>60％的病例存在软骨病灶[9]。由于人口的增长、寿命的延长和诊断工具的进步，预计此类手术的数量将会增加。

软骨病灶经常与其他关节损伤相关，并且可以发展为关节退化和骨关节炎(OA)[10]。OA影响了约20％的美国人，其中10％的OA患者活动受限。估计每年来自OA的费用超过1300亿美元。世界卫生组织将OA排名为影响无病生存年限和残疾方面的第四位病况，而疾病控制和预防中心确定关节炎在美国是残疾的首要原因[11]。骨关节炎甚至作为创伤后骨关节炎(PTOA)影响年轻人[12]。估计PTOA导致12％的髋部和膝盖的症状性关节炎，每年相关费用超过30亿美元。PTOA和其他常见的软骨损伤尤其影响现役军人，其所有常见软骨损伤的发生率约为平民的十倍。例如，每1000名士兵中，每年ACL和半月板损伤分别影响3.65名和约6.5名。平民的相应比率是1000中约0.34名和约0.45名[13]。迫切需要治疗军人和年轻人的PTOA和软骨损伤。

治疗骨软骨缺陷的最常见手术是微骨折术、镶嵌成形术、骨软骨异体移植或骨软骨自体移植、ACI以及近年来的MACI。所有技术均具有受尺寸限制、患者年龄和周围软骨质量影响的若干缺点。缺点包括生物力学性能降低、恢复时间长、两次手术以及对供体组织的需求。成功率往往很低，手术后1-5年失败的风险很高。

自体移植物移植和同种异体移植物移植已被用于治疗软骨损伤。自体移植已被证明可有效治疗直径达3cm的病灶，甚至在运动员中也有良好至极佳的结果[14]。同种异体骨软骨移植以前曾被用于战斗士兵中，使其能够返回军事岗位[15]。然而，与平民相比，同种异体骨软骨移植已被证明在现役军人中不太成功。回顾性分析了同种异体骨软骨移植在现役人群膝盖中的有效性，关注患者在手术后恢复至其状态的能力[16]。尽管这种针对膝部大病灶的手术方法在平民患者中获得了良好的成功率，但是它无法确保使受伤的士兵保持现役，特别是其占据体力要求很高的军事岗位时。许多接受同种异体骨软骨移植治疗的患者无法继续在他们的原有岗位保持现役。有必要为军队中那些原本在军队中几乎没有替代选项的人提供改进的移植疗法。那些具有体力上较为活跃的生活方式的人们，例如专业和业余运动员、消防员和警察也需要改进的移植疗法。

在制备用于移植的软骨时仍需要改进。长期以来，由于强烈的临床需要、该组织的无血管性质和低细胞密度，软骨已成为组织工程学领域的主要关注点。软骨组织工程学的发展主要是通过利用从天然软骨中提取的初代(primary)软骨细胞来进行的。这些高活性，但表型稳定且成熟的细胞可以产生软骨基质。即使是简单的培养系统，也可以从几毫米厚的初代软骨细胞中改造出可行的软骨组织构建体。同样，在具有动态流动环境的生物反应器中培养产生的软骨具有与母体软骨相似的生化组成和机械刚度。在软骨组织工程中，幼年的牛软骨细胞已与支架材料结合使用，对软骨进行工程改造，使其机械性能接近天然组织[17，18]。然而，这些方法的可用性有限并且从成体软骨细胞产生功能性软骨的能力有限。

除软骨损伤之外，结缔组织损伤也是持续的临床挑战。在美国，受损的肌腱、韧带和关节囊每年占所报道的3200万例肌肉骨骼损伤中的45％。此外，由于运动参与增加和人口老龄化，这些发病率正在上升。众所周知，结缔组织很难修复。当前的治疗策略通常包括用骨骼-肌腱-骨骼自体移植物(例如膝盖骨肌腱)进行外科手术重建。这种多组织组合物改善了对宿主组织的固定和整合。但是，这些自体移植物不能充分模仿原始组织，并且不能恢复损伤前的组织功能、复杂的生化特性和著骨点(enthesis)结构。因此，自体移植手术的失败率高，需要翻修手术，从而损害了患者的生活品质。

祖细胞干细胞具有形成软骨和结缔组织的潜力。已经研究了工程化来自干细胞的软骨和结缔组织的许多尝试，其目的是完全再生具有天然形式和功能的软骨。软骨样组织可以由间充质干细胞[19]或软骨细胞(例如Neocart和MACI)开始体外生长。然而，使用这些产品需要进行侵入性手术。尚未有一种成功的产品旨在通过微创手术(如关节镜手术)来再生软骨和结缔组织，或即用(off-the-shelf)的现成产品。

鉴于上述情况，需要提供改进的产品组合物，以通过再生天然样组织来治疗软骨和/或骨软骨缺陷。

发明内容

本文描述了用于使骨骼和结缔组织(例如软骨、肌腱和韧带)再生的改进的组合物和方法，该组合物和方法用作针对由于各种原因(如创伤、组织退化、创伤后骨关节炎、关节炎等)而发生的多种范围的缺陷(软骨/骨软骨缺陷，软骨、半月板组织、韧带、肌腱和肌肉的撕裂或断裂)的治疗方式。

本文所述的组合物和方法包括用于治疗结缔组织缺陷(例如关节或非关节软骨缺陷、肌腱缺陷和韧带缺陷)的新颖且改善的方法。优点包括：(1)允许植入各种缺陷尺寸和几何形状中的可注射平台；(2)易用性和精确填充缺陷；(3)可以经历软骨形成、肌腱生成、组织生成且形成天然组织样结构的祖细胞，其对于持久功能很重要；(4)细胞发育成具有生物力学特性(压缩模量、摩擦系数、拉伸强度和剪切强度)的天然组织的能力；(5)从细胞产生的凝集的(condensed)间充质体的体内成熟，以允许与宿主组织形成无缝的机械性能良好的界面；和(6)一种即用的基于细胞的组织产品，其可现成地用于按需治疗创伤性软骨和结缔组织损伤。细胞在整个培养过程中以及注射或植入之前和之后均具有活力。促进了组织向宿主的整合。可以避免重复手术和组织发病，并且改善了临床结果和减少了恢复时间。

在一方面，提供了一种组合物，其包含凝集的间充质细胞体(CMB)和水凝胶。CMB可由可经历软骨形成的细胞产生。或者，CMB可以从形成结缔组织的细胞产生。结缔组织可包含胶原蛋白、蛋白聚糖、透明质酸或弹性蛋白。胶原蛋白可以包括I、II、III、IV、V，VI、VII、VIII、IX、X或XI型胶原蛋白。蛋白聚糖可以包括糖胺聚糖、硫酸乙酰肝素或硫酸软骨素。CMB可以发育成包含各种类型的细胞外基质(ECM)的组织。ECM可包含例如胶原蛋白、糖胺聚糖、弹性蛋白、纤连蛋白和/或层粘连蛋白。可选地，该组合物可包含一种以上药物或生长因子，这取决于所产生的结缔组织类型。

在一些实施方案中，组合物还包含聚合物微球，其中一种以上生长因子被包封在聚合物微球中。在一些实施方案中，聚合物微球包含聚(乳酸-共-乙醇酸)(PLGA)、聚(乳酸)(PLA)，或PLGA和PLA的组合。在一些实施方案中，CMB包含选自结缔组织细胞和祖细胞的细胞，该祖细胞能够形成软骨细胞、肌腱细胞、韧带细胞或半月板细胞。在一些实施方案中，CMB包含从软骨、肌腱、韧带细胞或半月板分离的细胞。在一些实施方案中，细胞是肌腱细胞、成腱细胞，纤维细胞或成纤维细胞。在一些实施方案中，CMB是软骨细胞、祖细胞(选自间充质干细胞(MSC)、胚胎干细胞(ESC)、诱导多能干细胞(iPS))或从天然组织(例如软骨、肌腱、韧带和半月板)中提取的细胞，包括但不限于肌腱细胞、成腱细胞(tenoblast)、纤维细胞、成纤维细胞。在一些实施方案中，CMB包含干细胞。在一些实施方案中，干细胞选自间充质干细胞(MSC)、脂肪来源的干细胞(ADSC)、骨髓来源的干细胞(BMSC)、脐带血干细胞(UB-MSC)、神经脊干细胞、诱导多能干细胞、胚胎干细胞、初代软骨细胞和神经脊干细胞。

在一些实施方案中，细胞或干细胞(例如，MSC、ADSC、BMSC或UB-MSC)来自异体来源或自体来源。在一些实施方案中，细胞或干细胞(例如，MSC、ADSC、BMSC或UB-MSC)是抗免疫原性的和/或免疫抑制的(参见，例如，Gimble，JM等人，"Adipose-Derived Stromal/StemCells:A Primer”Organogenesis，2013，9(1)：3-10。)在一些实施方案中，将CMB和/或细胞在约-80℃或低于约-80℃的温度下冷冻保存或储存至少约1天。在一些实施方案中，将CMB和/或细胞在约-196℃或低于约-196℃的温度下冷冻保存或储存至少约1天、约2天、约3天、约4天、约5天、约6天或约1周。在一些实施方案中，CMB和/或细胞在-1℃至-25℃之间或低于约-1℃的零下温度下冷冻保存或储存至少约1天、约2天、约3天、约4天、约5天、约6天或约1周。在一些实施方案中，CMB在约-20℃、在-20℃或低于约-20℃的温度下储存至少1天、约2天、约3天、约4天、约5天、约6天或约1周。在一些实施方案中，CMB在约-10℃，-10℃或低于约-10℃下储存至少1天、约2天、约3天、约4天、约5天、约6天或约1周。在一些实施方案中，CMB和/或细胞在1℃至30℃之间或低于约30℃的零下温度下低温保存或储存至少约1天、约2天、约3天、约4天、约5天、约6天或约1周。在一些实施方案中，CMB在约4℃，4℃或低于约4℃下储存至少1天、约2天、约3天、约4天、约5天、约6天或约1周。在一些实施方案中，CMB在约25℃，25℃或小于约25℃下储存至少1天、约2天、约3天、约4天、约5天、约6天或约1周。

在一些实施方案中，CMB中的细胞在细胞表面上不表达大量或可检测量的人类白血球抗原(HLA)II类、CD40、CD80或CD86。在一些实施方案中，根据免疫分析，例如包括流式细胞术、ELISPOT、定量PCR和混合淋巴细胞反应测定中的一种以上的测定，CMB中的细胞在细胞表面上不表达大量或可检测量的人类白细胞抗原(HLA)II类，CD40，CD80或CD86。

在一些实施方案中，CMB中的细胞在细胞表面上表达大量的CD73、CD90、CD105或CD146。在一些实施方案中，CMB中的细胞在细胞表面上表达可检测量的CD73、CD90、CD105或CD146。在一些实施方案中，根据免疫分析，例如包括流式细胞术、ELISPOT、定量PCR和混合淋巴细胞反应测定中的一种以上的测定，CMB中的细胞在细胞表面上不表达大量的CD73，CD90，CD105或CD146。在一些实施方案中，根据免疫分析，例如包括流式细胞术、ELISPOT、定量PCR和混合淋巴细胞反应测定中的一种以上的测定，CMB中的细胞在细胞表面上不表达可检测量的CD73、CD90、CD105或CD146。

在一些实施方案中，水凝胶选自纤维蛋白胶、富血小板血浆(PRP)、I型胶原蛋白，II型胶原蛋白、壳聚糖、明胶、聚乙二醇二丙烯酸酯、透明质酸，以及纤维蛋白胶、PRP、I型胶原蛋白、II型胶原蛋白、壳聚糖、明胶、聚乙二醇二丙烯酸酯和透明质酸的任何组合。在一些实施方案中，生长因子选自TGF-β超家族成员，其包括TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、TGF-β4、BMP-1、BMP-2、BMP-3、BMP-4、BMP-5、BMP-6、BMP-7、BMP-8。在一些实施方案中，生长因子选自TGF-β超家族成员，其包括TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、TGF-β4、BMP-1、BMP-2，BMP-3、BMP-4、BMP-5、BMP-6、BMP-7、BMP-8和任何已显示协同作用的组合(Choi，S等人，Int.J.Oral.Sci.，2013，5(1)：7-13，以及Hildner,F.等人，J.Biomed.Mater.Res.A，2010，94(3)：978-87。)

在一些实施方案中，生长因子是TGF-β超家族成员。在一些实施方案中，生长因子是选自如下的形态发生蛋白：OP-1、OP-2、OP-3、TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、TGF-β4、BMP-1、BMP-2、BMP-3、BMP-4、BMP-5、BMP-6、BMP-8、BMP-9、BMP-10、BMP-11、BMP-12、BMP-13、BMP-15、BMP-16、BMP-17、BMP-18、DPP、CTGF、Vg1、Vgr-1、60A蛋白、GDF-1、GDF-2、GDF-3、GDF-5、GDF-6、GDF-7、GDF-8、GDF-9、GDF-10、GDF-11、GDF-12、CDMP-1、CDMP-2、CDMP-3、NODAL、UNIVIN、SCREW、ADMP、NEURAL。在一些实施方案中，所述组合物还包含胰岛素、转铁蛋白、人血清白蛋白、脯氨酸、牛血清白蛋白、硒酸、亚油酸、地塞米松和抗坏血酸中的一种以上。

在一些实施方案中，CMB中的细胞处于悬浮状态。

在一些实施方案中，CMB由至少1,000个细胞形成。在一些实施方案中，CMB由至少5,000个细胞、至少10,000个细胞、至少15,000个细胞、至少20,000个细胞、至少25,000个细胞、至少30,000个细胞、至少40,000个细胞、至少50,000个细胞、至少60,000个细胞、至少70,000个细胞、至少80,000个细胞、至少90,000个细胞、至少100,000个细胞、至少125,000个细胞、至少150,000个细胞、至少175,000个细胞、至少200,000个细胞、至少225,000个细胞、至少250,000个细胞、至少300,000个细胞、至少400,000个细胞或至少500,000个细胞产生。

在一些实施方案中，CMB的尺寸是均匀的。例如，CMB的直径可为约200μm、约300μm、约400μm、约500μm、约600μm、约800μm、约1mm、约1.2mm、约1.4mm、约1.6mm、约1.8mm、约2.0mm、约2.2mm、约2.4mm、约2.6mm、约2.8mm或约3mm。

在一些实施方案中，CMB的尺寸不同。CMB可以具有200μm至3.0mm的直径。CMB可以具有200μm至800μm的直径。CMB可以具有400μm到1.0mm的直径。CMB可以具有600μm到1.2mm的直径。CMB可以具有800μm到1.6mm的直径。CMB的直径可以为1.0mm至1.8mm。CMB的直径可以为1.2mm至2.0mm。CMB的直径可以为1.4mm至2.4mm。CMB的直径可以为2.0mm至3.0mm。

在一些实施方案中，该组合物是可注射的。

另一方面，提供了一种治疗患者软骨缺陷的方法，该方法包括将上述的和在此所述的任何组合物施用于软骨或软骨周围区域。

另一方面，提供了一种在患者中预防软骨退变或治疗软骨损伤、软骨退行性疾病或软骨病症的方法，该方法包括将上述的和在此所述的任何组合物施用于软骨或软骨周围区域。

在以上方法的一些实施方案中，软骨是关节软骨。在上述方法的一些实施方案中，软骨是非关节软骨。在一些实施方案中，非关节软骨选自：鼻软骨、耳软骨、气管支气管软骨、肋软骨、半月板和椎间盘。在一些实施方案中，该方法有效地在软骨缺陷、软骨退变、软骨损伤、软骨退行性疾病或软骨病症的部位形成包含1-20％(w/w)糖胺聚糖(GAG)的软骨组织。在一些实施方案中，该方法有效地形成包含0.5-20％(w/w)胶原蛋白的软骨组织。在一些实施方案中，该方法有效地在软骨缺陷、软骨退变、软骨损伤、软骨退行性疾病或软骨病症的部位形成包含至少1.2％(w/w)、1.3％(w/w)、1.4％(w/w)、1.5％(w/w)或1.6％(w/w)胶原蛋白的软骨组织。在一些实施方案中，该方法有效地在软骨缺陷、软骨退变、软骨损伤、软骨退行性疾病或软骨病症的部位形成具有至少100kPa的杨氏模量和至多0.8的摩擦系数的软骨。

在一些实施方案中，该方法有效地在软骨缺陷、软骨退变、软骨损伤、软骨退行性疾病或软骨病症的部位形成软骨，并且其中该软骨在该部位处或该部位周围与任何邻近软骨和软骨下骨组织整合。

在一些实施方案中，该方法有效地将组织撕裂或断裂、组织退化、损伤或退行性病症部位的天然组织连接在一起。在各种实施方案中，组织(如肌腱、韧带、半月板、肌肉)与任何邻近组织整合(如软骨、骨骼、肌肉，其他结缔组织或相同类型的组织)。

另一方面，提供了使用本文所述的任何组合物在体外或体内形成软骨组织的方法。

另一方面，提供了一种治疗患者的撕裂或断裂的结缔组织的方法，该方法包括将上述组合物中的任何一种施用于撕裂或断裂的结缔组织或撕裂或断裂的结缔组织周围区域。在一些实施方案中，结缔组织是韧带、肌腱或半月板。

附图说明

图1展示了用于测试低温贮藏对ADSC介导的软骨形成的影响的方案。左边在“细胞(2-D)”下方是显示形成CMB之前如何处理ADSC的示意图。“新鲜”ADSC不经历任何低温贮藏，而“SVF低温”和“p1低温”ADSC在低温贮藏并在液氮中保存至少一个月。在低温贮藏之前，“p1低温”ADSC经过单次传代，而“SVF低温”ADSC在低温贮藏之前没有传代。右边“团块(Pellet)3-D”下方是在多孔板中形成CMB，随后在测试样品中进行另一轮低温贮藏的描述。为了形成CMB，当采集ADSC并以250,000个细胞/mL的浓度重新悬浮在软骨形成培养基中时，将从新鲜的人类脂肪抽吸物中采集的基质体积分数(SVF)铺板并传代到P0至P10。随后，在96孔深孔板中，1mL细胞悬液被分配到每个孔，且在300g下离心5分钟。离心后，将CMB保留在软骨形成培养基中。

图2展示了在未冷冻保存的样品(新鲜)中、采集后立即冷冻保存随后解冻并传代1-4次的样品(SVF低温)中以及经过1次传代、冷冻保存、解冻并传代1至4次的ADSC(P1低温)中，细胞群体倍增时间相对于脂肪细胞衍生的干细胞(ADSC)传代次数的关系图。

图3展示用于测试冷冻保存对ADSC的影响的方案。该方案与图1的方案相似，不同之处在于CMB未冷冻保存。

图4A-4F展示了以对新鲜、SVF低温和P1低温ADSC群体的各种参数的测试结果。测试结果展示为直径(图4A)、湿重(图4B)、DNA与湿重的质量比(图4C)、GAG与湿重的质量比(图4D)、胶原蛋白与湿重的质量比(图4E)，以及培养物中每个新鲜、SVF低温和P1低温群体的外观(图4F)。图4F中的比例尺为0.5mm。

图5展示了用于测试冷冻保存对由ADSC制备的凝集的间充质细胞体(CMB)的团块的影响的方案。

图6A-6F展示了新鲜、SVF低温和P1低温ADSC群体的各种参数的测试结果。测试结果展示为直径(图6A)、湿重(图6B)、DNA与湿重的质量比(图6C)、GAG与湿重的质量比(图6D)、胶原蛋白与湿重的质量比(图6E)、以及培养物中每个新鲜、SVF低温和P1低温群体的外观(图6F)。

图7A展示了通过流式细胞术测定软骨形成CMB上的各种抗原的结果。在ISO抗体用作阴性对照的情况下可观察到阴性表达，而在CD59和CD90用作阳性对照的情况下可观察到阳性表达。测试的免疫原性标记物HLA II类、CD40、CD80和CD86的表达为阴性。

图7B展示了在活的ADSC上各种抗原的表达水平。

图8展示在硅胶外植体缺陷模型中测试水凝胶和CMB的组合的实验方案。

图9A是显示骨软骨缺陷模型中的空缺陷的照片。图9B是显示胶原蛋白凝胶-CMB填充的缺陷的照片。图9C是显示胶原蛋白凝胶-CMB填充的缺陷的半截面图，其中填充组分保留在缺陷中。

图10A展示了用于检查药物随时间释放的实验方案。图10B展示了生长因子随时间的可观察到的释放。

图11A显示载荷和未载荷的对照软骨填充物的GAG含量类似。

图11B展示了与胶原蛋白含量为约5湿重％的未载荷的对照相比，载荷将胶原蛋白含量提高至10湿重％。

图12示出了软骨填充物产品的示意性制造和输送过程。制备各个细胞、水凝胶和生长因子组分，储存直至需要，随后在注射器中合并以注射到缺陷部位。

图13显示了纤维蛋白和各种透明质酸/胶原蛋白水凝胶制剂向牛软骨外植体缺陷的递送。组合物的不透明度和保留率不同。

图14展示了一种具有CMB的水凝胶组合物向外植体缺陷的递送。离体培养后，新形成的组织整合到天然软骨中，并表现出与天然软骨相当的糖胺聚糖和胶原蛋白含量。

图15A展示了用多种CMB、水凝胶和生长因子制备的软骨构建体。该组织可以由具有不同细胞数量的多种CMB制成，范围为50,000-250,000个细胞/CMB。

图15B展示了用各种CMB尺寸制造的软骨构建体的组织学染色。结果揭示在实验组之间具有相当的糖胺聚糖和胶原蛋白含量。

图15C展示了用各种CMB尺寸制造的软骨构建体的定量表征。结果揭示实验组之间相当的湿重和DNA、GAG和胶原蛋白含量。

具体实施方式

为了促进对本发明各个实施方案的原理和特征的理解，下面对各种说明性的实施方案进行说明。尽管详细说明了本发明的示例性实施方案，但是应当理解，涵盖了其他实施方案。因此，不意图将本发明的范围限于在以下描述或实施例中阐述的构造和组分配置的细节。本发明能够具有其他实施方案并且能够以各种方式被实施或执行。另外，在描述示例性实施方案时，为了清楚起见，将采用特定术语。

定义

必须注意，如本文所用，除非上下文另外明确指出，单数形式的“一个(a/an)”和“该(the)”包括复数形式。例如，提到一个组分也意图包括多个组分的组合物。提及包括“一种”成分的组合物意在包括除所提及的成分外的其他成分。换句话说，术语“一个(a/an)”和“该(the)”不表示数量限制，而是表示存在所提及项的“至少一种”。旨在使每个术语涵盖本领域技术人员所理解的最广泛的含义，并且包括以类似方式操作以实现类似目的的所有技术等效物。

范围可以在本文中表示为从“约”、“大约”或“实质上”一个特定值和/或至“约”或“大约”或“实质上”另一特定值。当表示这样的范围时，其他示例性实施方案包括从一个特定值和/或至另一特定值。此外，术语“约”是指在特定值的可接受误差范围内，如本领域普通技术人员所确定的那样，这将部分取决于如何测量或确定该值，即测量系统的局限性。例如，根据本领域的实践，“约”可以表示在可接受的标准偏差内。或者，“约”可以意指在给定值的至多±20％，优选地至多±10％，更优选地至多±5％，并且还更优选地至多±1％的范围内。或者，特别是关于生物系统或方法，该术语可以表示在数值的数量级内，优选在数值的两倍内。除非另有说明，否则在本申请和权利要求书中描述了特定值的情况下，术语“约”是隐含的，并且在此上下文中意味着该特定值的可接受误差范围内。

“包含”、“含有”或“包括”是指在组合物或制品或方法中至少存在指定的化合物、元素、颗粒或方法步骤，但不排除其他化合物、材料、粒子、方法步骤的存在，即使其他此类化合物、材料、粒子、方法步骤具有与指定的功能相同的功能。

如本文所用，并且除非另有说明，否则术语“水凝胶”和“支架(scaffold)”可以表示但绝不限于本文所教导和描述的水凝胶组合物，其包含聚合物网络，该聚合物网络包含离子型水溶性多糖，例如纤维素(例如，NaCS或NaCP)。

如本文所用，术语“胶原蛋白”可以意指但绝不限于作为结缔组织的主要组分存在的赋予其强度和柔韧性的细胞外密切相关的蛋白质家族中的任一种。至少存在14种类型，各自由共用共同三螺旋形状但在各类型之间的组成略有不同的原胶蛋白单元构成，并且这些类型位于不同的组织、阶段或功能。在某些类型中，包括最常见的I型，原胶原蛋白棒(rod)缔合以形成原纤维或纤维。在其他类型中，这些棒不是原纤维的，但与原纤维胶原蛋白相关；而在其他类型中，它们形成非原纤维、非周期性但结构化的网络。软骨可以包括软骨细胞或类软骨细胞以及细胞内材料、蛋白聚糖和其他蛋白质。软骨包括关节软骨和非关节软骨。

“关节软骨”，也称为透明软骨，是指无血管的非矿化的结缔组织，其覆盖关节中的骨骼的关节表面并且充当两个相对的骨骼表面之间的减小摩擦的界面。关节软骨允许关节移动，而无需直接进行骨骼与骨骼的接触。宏观上，软骨表面看起来光滑且有珠光，在高倍放大下则呈细颗粒状。关节软骨与II型和IX型胶原蛋白以及各种已被良好表征的蛋白聚糖的存在有关，并且与X型胶原蛋白的缺乏有关，X型胶原蛋白与软骨内骨形成有关。

“非关节软骨”是指不覆盖关节表面的软骨并且包括纤维软骨(包括关节间纤维软骨、纤维软骨盘、连接纤维软骨和周围纤维软骨)和弹性软骨。在纤维软骨中，微多糖网络与突出的胶原纤维束交织，并且软骨细胞比在透明软骨或关节软骨中更分散。发现关节间纤维软骨在暴露于震荡并经常移动的关节中(例如，膝盖的半月板)。这种关节的实例包括但不限于颞下颌骨关节、胸锁骨关节、肩锁骨关节、腕关节和膝关节。次级(secondary)软骨关节由纤维软骨盘形成。

术语“细胞”可以意指但绝不限于其通常的生物学意义，并且不指整个多细胞生物。细胞可以例如在体内、体外或离体，例如在细胞培养物中，或存在于多细胞生物体中，包括例如鸟类、植物和哺乳动物，诸如人、牛、绵羊、猿、猴、猪、狗和猫。细胞可以是原核的细胞(例如，细菌细胞)或真核的细胞(例如，哺乳动物或植物细胞)。

术语“纤维素”可以表示但不限于其通常的生物学意义。纤维素是具有式(C₆H₁₀O₅)_n的有机化合物，是一种由例如几百至上万个β(1→4)连接的D-葡萄糖单元的直链组成的多糖。

术语“缺陷”或“缺陷部位”是指软骨、骨软骨组织、半月板、韧带或肌腱的破坏。缺陷可以假设为“空隙”的构型，其被理解为是指三维缺陷，例如间隙、空腔、孔或软骨和/或骨软骨组织、半月板、韧带或肌腱的结构完整性的其他实质性破坏。缺陷也可能是软骨从其与骨骼或韧带的连接点脱离。在某些实施方案中，该缺陷使得其不能进行内源性或自发性修复。缺陷可能是事故、疾病和/或手术操作的结果。例如，软骨缺陷可能是关节受伤的结果，例如半月板撕裂组织移入关节。软骨缺陷也可以由诸如关节炎的退行性关节疾病引起。

如本文所用，术语“生长因子”可以包括能够刺激细胞生长、增殖、修复和细胞分化的物质。生长因子可以是药物。药物可以包括合成物质和天然物质。生长因子包括但不限于骨形态发生蛋白、成纤维细胞生长因子和血管内皮生长因子。

如本文所用，术语“聚合物”可以表示但不限于由五个或更多个称为单体的相同结合单元的化学结合形成的大分子。在大多数情况下，单体的数目非常大，并且常常无法精确得知。在合成聚合物中，该数量可以控制在预定的程度。两个、三个或四个单体的组合分别称为二聚体、三聚体和四聚体，统称为低聚物。聚合物可以是无机的(例如，硅氧烷、硫链、黑磷、硼氮、硅酮)或有机的(意味着含碳)。

如本文所用，术语“均聚物”可以表示但绝不限于衍生自单一单体的天然聚合物或合成聚合物。

如本文所用，术语“多糖”可以表示但绝不限于长链天然或合成聚合物，其由连接的单糖(单糖类)，例如葡萄糖和/或相关分子(例如，葡萄糖醛酸、半乳糖、半乳糖胺、葡萄糖胺、乙酰基葡萄糖胺)构成。两个单糖分子可通过糖苷键连接形成双糖，例如，在葡萄糖和果糖的连接中形成蔗糖。更复杂的多糖，例如淀粉、糖原、纤维素或甲壳素由许多通过糖苷键连接的单糖单元组成。

术语“修复”是指新的组织形成，其足以至少部分填充缺陷部位的空隙或结构不连续性，并且足以使新形成的组织与缺陷周围的天然组织(如关节软骨、非关节软骨、韧带和肌腱)的任何整合。然而，修复并不意味着(或必须)完全治愈的过程或将缺陷恢复到其缺陷前的生理/结构/机械状态的100％有效的治疗方法。

术语“治疗有效量”是指有效修复、再生、促进、加速、预防退化或形成软骨组织的量。

术语“患者”是指包括哺乳动物(例如人类)的动物。

术语“药学上可接受的载剂”或“药学上可接受的佐剂”是指可以与本发明的可溶性形态发生蛋白复合物一起施用给患者的无毒载剂或佐剂，该载剂或佐剂不会破坏可溶性形态发生蛋白复合物的药理学活性，且基于熟练从业者的知识不会引起不被接受的免疫反应(例如，严重的过敏或过敏性休克)。实例包括但不限于任何标准药物载剂，例如羧甲基纤维素(CMC)、磷酸盐缓冲盐溶液、水、乳液(如油/水乳液)和各种类型的润湿剂。用于气溶胶或肠胃外给药的示例性稀释剂是磷酸盐缓冲盐水或生理盐水(0.9％)。

如本文所用，术语“干细胞”可以表示但不限于具有高增殖潜能且具有自我更新能力的未分化细胞，其可以迁移到损伤区域，并可以产生可能最终分化为超过一种的不同细胞表型的子代细胞。这些细胞可能能够分化成各种细胞类型，从而促进目标的患病或受损组织的再生或修复。术语“细胞分化”是指细胞借助其获得细胞类型的过程。如本文所用，术语“祖细胞”是指任何谱系的可分离细胞，其保持可塑性以分化成一种以上靶细胞类型，包括但不限于软骨细胞、骨细胞和脂肪细胞。祖细胞被称为集落形成单位(CFU)或集落形成细胞(CFC)。祖细胞的特定谱系由后缀表示，例如但不限于CFU-F(成纤维细胞)。祖细胞能够如干细胞分化成特定类型的细胞，但已经比干细胞更具特异性，并被推动或刺激以分化成其“靶”细胞。通常，干细胞可以无限复制，而祖细胞只能分裂有限的次数。

如本文所用，术语“骨祖细胞”、“软骨祖细胞”、“骨软骨祖细胞”、“间充质细胞”、“间充质干细胞(MSC)”或“骨髓基质细胞”可互换使用，以指代由CFU-F细胞分化的多能干细胞，CFU-F细胞能够沿一个或几个谱系途径分化为成骨细胞、软骨细胞、肌细胞、脂肪细胞和肌腱细胞。当提到骨骼或软骨时，MSC通常被称为成骨软骨细胞、成骨细胞、成软骨细胞或成骨祖细胞，因为单个MSC显示出根据培养基和周围环境分化为软骨细胞或成骨细胞的能力。

如本文所用，术语“软骨细胞”可以表示但绝不限于在软骨中发现的、产生并维持软骨基质的细胞。从最少到最终分化的软骨细胞谱系是：(i)集落形成单位成纤维细胞(CFU-F)；(ii)间充质干细胞/骨髓基质细胞(MSC)；或(iii)软骨细胞。术语“软骨形成”是指由软骨形成细胞或软骨感受态(chondrocompetent)细胞形成新的软骨。

术语“药学上可接受的”或“药理学上可接受的”可以表示但绝不限于在视需要施用于动物或人类时不产生不利、过敏或其他不良反应的实体和组合物。

术语“药学上可接受的载剂”或“药学上可接受的载剂”可以是但不限于与药物施用相容的任何和所有溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂，等渗剂和吸收延迟剂等。合适的载剂在最新版的《雷明顿药物科学》(Remington's Pharmaceutical Sciences)中进行了描述，其是本领域的标准参考文献，其通过引用并入本文。这种载剂或稀释剂的实例包括但不限于水、盐水、芬格氏溶液(finger's solutions)、右旋糖溶液和5％人血清白蛋白。补充的活性化合物也可以掺入组合物中。

在一方面，提供了一种组合物，其包括凝集的间充质细胞体(CMB)和水凝胶。可选地，该组合物可以包含一种以上生长因子。

在一些实施方案中，CMB包含间充质干细胞(MSC)，例如脂肪来源的干细胞(ADSC)、骨髓来源的干细胞(BMSC)、脐带血来源的间充质干细胞(UM-MSC)、滑膜来源的间充质干细胞(SMSC)。诸如ADSC等干细胞可从大量脂肪组织中获取并在不损害细胞的软骨形成分化能力的情况下大量扩增，因此它们可为组织工程提供临床相关的细胞来源。临床级别的同种异体BMSC可以从冷冻库获得并进行筛选以选择表现出最强软骨形成水平的细胞。这些MSC可能不是免疫原性的或可能具有低免疫原性。除了具有自我更新和长期生长的能力外，MSC还能分化为多种细胞类型，包括脂肪细胞、成骨细胞、软骨细胞、肝细胞、肌细胞、心肌细胞、神经元和上皮细胞。

MSC可以通过本领域技术人员已知的多种方法分离。参见，例如，美国专利第6,153,432号。用于制备ADSC的脂肪组织可以源自各种脂肪组织部位，例如网膜脂肪组织。可以通过抽脂获得或分离脂肪组织，示例性分离量为10至300mL。用于制备BMSC的骨髓组织可以源自各种骨髓组织部位，例如髂骨。骨髓组织可通过针抽吸获得，示例性分离量为每公斤供体体重约20mL。

MSC可经工程化以包含表达生长因子、激素和细胞因子的基因。例如，ADSC可经工程化以表达有益的基因、细胞因子或生长因子。例如，已经被基因修饰以表达抗炎细胞因子(例如，IL-2)的ADSC可以被移植到发生炎症的位置(例如，关节炎的关节)。然后，移植为受试者提供了双重益处，因为除了表达有益的抗炎细胞因子外，ADSC还可以变成软骨细胞。

包含MSC的组合物可用于治疗骨关节炎(OA)的患者。OA的特征是关节软骨退化、基质损失、原纤维形成和裂痕形成。OA可导致软骨表面完全丧失。软骨细胞是关节软骨的唯一细胞，通过分泌大分子成分(胶原蛋白、糖胺聚糖和透明质酸)以及调节细胞外基质更新来维持稳态合成和细胞外基质的降解。在OA中，相对于合成代谢性物质和修复性物质而言，破坏性和促炎性介质的产生过多，导致关节软骨的逐渐破坏。

MSC可以是抗免疫原性的。在一些实施方案中，MSC来自异体来源。

异体细胞可以提供几个优点。由于异体细胞可以从容易获得的供体组织中分离，因此可以生产即用的组合物。测试和比较跨多个供体细胞批次的软骨形成潜力可以改善任何最终产品的品质。通用供体的细胞会减少成本和可变性，因为可以从一个批次中生产大量细胞和若干产物[20]。

扩增的未分化MSC可能不表达MHC II类分子。软骨诱导的MSC(例如通过应用生长因子TGF-β3和BMP-6)也可能不表达MHC II类分子。可以将来自异体来源的MSC(例如不表达MHC II类分子的那些)移植到供体中，而不会诱导免疫反应。可以进行各种动物研究以确认植入的ADSC不会诱导免疫反应。

在一些实施方案中，根据流式细胞术和混合淋巴细胞反应测定，组合物、CMB和MSC在细胞表面上不表达大量或可检测量的人类白细胞抗原(HLA)II类、CD40、CD80或CD86。缺乏HLA II类、CD40、CD80和CD86表达的细胞可被认为具有免疫特权的(immunoprivileged)。

为了检测这些标记物，可以通过在I型胶原蛋白中在37℃下孵育1小时，将解冻的CMBs解离为单细胞悬液[21]。消化物随后用约等体积的软骨形成培养基和细胞悬液中和，并通过20G针重悬来进一步解离。可以按照制造商的流式细胞仪操作规程，使用表面标记物特异性抗体和钙黄绿素(Calcein)AM染色单细胞。然后可以使用流式细胞仪进行流式细胞术。

在一些实施方案中，CMB被低温保存。在一些实施方案中，将CMB在室温或0℃至10℃的温度下低温保存。在一些实施方案中，CMB被冷冻保存，例如，在约-20℃的温度，约-80℃的温度或低于约-80℃的温度。在各种实施方案中，将CMB低温保存或冷冻保存至少约一周。低温保存或冷冻保存的CMB可能表现出与未低温保存或冷冻保存的“新鲜CMB”类似的性能特征。低温保存或冷冻保存的CMB可以表现出与新鲜CMB或非低温保存或冷冻保存的CMB相当的细胞活力(可以使用例如ORFLO MoxiFlo和Moxi GO II通过LIVE/DEAD分析进行测试)。可以通过将CMB引入包含稳定剂如DMSO(例如，来自Gibco的Synth-a-

)的培养基中进行低温保存或低温保存。可对CMB以及包含CMB的组合物的低温保存或冷冻保存进行优化以改善长期储存和即用的特性。

可以对低温保存或冷冻保存的CMB进行各种测试。低温保存或冷冻保存的CMB可以在补充有抗坏血酸、地塞米松、ITS+Premix(Corning)、MSC补充剂、TGF-β3(R&D Systems)和BMP6(R&D Systems))的软骨培养基(例如，StemPro SFM培养基(Life Technologies)中培养，以评估软骨形成品质的维持。随后将培养的CMB固定在10％(体积/体积)的福尔马林中进行组织学和免疫组化学分析，或储存在TRI试剂中进行基因表达分析。固定后，将样品包埋在石蜡中，切成5μm的切片，并用苏木精和伊红(H&E)、阿尔新蓝用于GAC、三色染色法、I、II、X型胶原蛋白和lubricin(Abcam)染色。可以根据制造商的说明，使用TRI试剂法(LifeTechnologies)，将RNA从样品中纯化。

可以评估以下一个或多个基因的表达：聚集蛋白聚糖(ACAN)、I型胶原蛋白(COL1A1)、II型胶原蛋白(COL2A1)、X型胶原蛋白(COL10A1)、性别决定区域Y(SRY)-盒9(SOX9)和同源盒A2(HOXA2)间充质凝集转录因子、细胞粘附钙粘蛋白2(CDH2)、凝集细胞外基质纤连蛋白(FN1)、腱生蛋白C(TNC)、多配体聚糖3(SDC3)、基质金属蛋白酶13(MMP13)、具有血小板反应蛋白基序-5的去整合素和金属蛋白酶(ADAMTS5)、转化生长因子β(TGF-β1和TGF-β3)和骨形态发生蛋白6(BMP6)。可以使用TaqMan引物(Life Technologies)进行实时PCR进行基因表达分析。可以比较新鲜和低温保存的CMB之间的任何上述基因的表达，管家基因包括但不限于甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)、S18、L37、EF1、EF2和肌动蛋白。

CMB是用于软骨形成的前驱体细胞结构。可以通过培养人类MSC(例如ADSC)并使其形成聚集体来制备CMB。可以例如在培养一天、两天、三天、四天、五天、六天、七天、八天或甚至九天后形成CMB。培养至少六天的CMB可能会形成边缘或边界，因此是“成熟的CMB”。CMB可以表达一种以上的以下标记物，表明它们是“成熟的CMB”或特定于软骨(cartilage-specific)的CMB：聚集蛋白聚糖(ACAN)、I型胶原蛋白(COL1A1)、II型胶原蛋白(COL2A1)、X型胶原蛋白(COL10A1)、间充质凝集转录因子性别决定区域Y(SRY)-盒9(SOX9)、同源盒A2(HOXA2)、细胞粘附钙粘蛋白2(CDH2)、凝集细胞外基质纤连蛋白(FN1)、腱生蛋白C(TNC)，多配体聚糖3(SDC3)、基质金属蛋白酶13(MMP13)、具有血小板反应蛋白基序-5的去整合素和金属蛋白酶(ADAMTS5)、转化生长因子β(TGF-β1和TGF-β3)和骨形态发生蛋白6(BMP6)。不成熟的CMB的融合可有效修复现有的软骨，例如当存在于包含CMB、水凝胶和一种以上生长因子的组合物中时。

水凝胶可以由可模仿细胞外基质的天然凝胶状培养基的聚合物网络或支架组成。在某些实施方案中，天然凝胶状培养基是胶原蛋白或碎片化的胶原蛋白或明胶。在某些实施方案中，天然凝胶状培养基是透明质酸或改性的透明质酸。水凝胶可包括聚合物或微纤维的网络，所述聚合物或微纤维包括亲水或水溶性多糖化合物。在某些实施方案中，可溶性多糖化合物是水溶性纤维素化合物。在某些实施方案中，水溶性纤维素化合物是阴离子型水溶性纤维素。

水凝胶或支架可以进一步包括基本上不溶性纤维或长丝的基质或网状物。(术语“水凝胶”和“支架”在本文可互换使用。)在某些实施方案中，水凝胶包括足以在水凝胶内形成纤维或丝状网或基质的量的离子、水溶性纤维素化合物和聚离子多糖(例如聚阳离子多糖(例如壳聚糖))的聚合物网络。在某些实施方案中，聚阳离子多糖是壳聚糖。在另外的实施方案中，相对于水凝胶的重量，所包括的壳聚糖的有效量为约0.01％至约20％(w/w)。

水凝胶或支架可以进一步包括络合剂或稳定剂，例如抗衡离子(阴离子或阳离子)或化学交联剂。络合剂或稳定剂例如通过疏水、共价键、离子键、氢键、范德华力或其他化学键与纤维素聚合物相互作用或络合，从而赋予水凝胶额外的生物化学和/或生物力学稳定性或两者。在某些实施方案中，水凝胶或支架包括阴离子纤维素化合物和阳离子。在某些实施方案中，阳离子包括二价阳离子，例如钙离子、镁离子、锰离子或铁离子(II)。如在2017年9月8日公开的国际申请PCT/US2017/019956(公开号为WO2017/151619)中所述，可以使用各种生物可吸收的聚合物、支架及其组分。

在另外的实施方案中，水凝胶或支架包括离子、水溶性纤维素化合物和化学交联剂。多种合适的化学交联剂是本领域已知的。例如，用于本文所述的水凝胶的合适的交联剂包括与例如胺、硫酸基、羟基、硫醇基、二丙烯酸酯、糖苷键反应的交联剂，例如聚二甲基二烯丙基氯化铵(PDADMAC)和双环氧化物。在某些实施方案中，交联剂是二缩水甘油醚，例如二异山梨醇双环氧化物。

在一些实施方案中，水凝胶包括糖胺聚糖(GAG)。在体内，成体干细胞通常位于特定的化学和拓扑复杂的微环境或生态位中。模仿软骨发育过程中的微环境的特征可能是一种可行的方法。在软骨发育过程中，最早的事件之一是由于细胞与细胞之间的相互作用而导致的软骨前间充质细胞的聚集和凝集，该细胞与细胞之间的相互作用由细胞与细胞和细胞与基质的粘附介导。GAG在软骨发育期间存在，尤其是4-硫酸软骨素、6-硫酸软骨素和硫酸肝素。生长因子可以结合这些GAG。

在各种实施方案中，水凝胶可占组合物质量的约1.0％至约95％。在一些实施方案中，组合物包含1.0至3.0％的水凝胶、2.0至4.0％的水凝胶、3.0至6.0％的水凝胶、4.0至8.0％的水凝胶、5.0至10.0％的水凝胶、7.0至12.0％的水凝胶、10.0至15.0％水凝胶、15至25％水凝胶、20至30％水凝胶、25至40％水凝胶、30至45％水凝胶、35至50％水凝胶、40至55％水凝胶或50至70％水凝胶。

水凝胶可以由由蛋白质细丝组成的纳米纤维网络或框架支撑，细胞可以附着于蛋白质细丝。可溶性营养素可通过水凝胶扩散。在天然ECM中，水凝胶介导压缩应力。水被GAG强烈吸收，这使GAG可以为软骨提供抗压性。由GAG组成的蛋白聚糖可保持水凝胶的稠度。此外，GAG隔离了生长因子。GAG所包含的己糖胺、己糖或己糖醛酸单元(例如，葡萄糖醛酸、艾杜糖醛酸、半乳糖、半乳糖胺、葡糖胺)的类型有所不同。具有生理学意义的特定GAG是透明质酸、硫酸皮肤素、硫酸软骨素、肝素、硫酸乙酰肝素和硫酸角质素。

水凝胶或支架可以包括至少两种材料。在某些实施方案中，材料是多糖，例如两种水溶性纤维素化合物。在某些实施方案中，材料是胶原蛋白或基于胶原蛋白的基质。在某些实施方案中，材料包括胶原蛋白和透明质酸。在某些实施方案中，化合物如本文所述例如通过离子或化学相互作用而交联。

生长因子包括能够刺激细胞生长、增殖、修复和细胞分化的天然存在的物质。通常，生长因子是蛋白质或小分子，例如类固醇激素，其与靶细胞内/靶细胞上的特定受体结合。生长因子对于调节多种细胞过程很重要，通常充当细胞之间的信号传导分子。生长因子包括例如骨形态发生蛋白，而成纤维细胞生长因子和血管内皮生长因子刺激血管分化(血管生成)。

可用于本文所教导和描述的任一实施方案中的示例性生长因子包括但不限于：自分泌运动因子、骨形态发生蛋白(BMP)、表皮生长因子(EGF)、促红细胞生成素(EPO)、成纤维细胞生长因子(FGF)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、生长分化因子9(GDF9)、肝细胞生长因子(HGF)、肝癌衍生生长因子(HDGF)、胰岛素样生长因子(IGF)、促移行(migration-stimulating)因子、肌生长抑制素(GDF-8)、神经生长因子(NGF)、脑源性神经营养因子(BDNF)和其他神经营养因子、血小板源性生长因子(PDGF)、血小板生成素(TPO)、转化生长因子α(TGF-α)、转化生长因子β(TGF-β)、血管内皮生长因子(VEGF)、胎盘生长因子(PLGF)和/或胎牛生长激素(FBS)。

在一些实施方案中，生长因子是形态发生蛋白。形态发生蛋白包括骨形态发生蛋白(BMP)家族的成员，特别是BMP-6。该家族的成员是蛋白质TGF-β超家族的子类别。可用作生长因子的示例性形态发生蛋白包括：OP-1、OP-2、OP-3、BMP-2、BMP-3、BMP-4、BMP-5、BMP-6、BMP-8、BMP-9、BMP-10、BMP-11、BMP-12、BMP-13、BMP-15、BMP-16、BMP-17、BMP-18、DPP、Vg1、Vgr-1、60A蛋白、GDF-1、GDF-2、GDF-3、GDF-5、GDF-6、GDF-7、GDF-8、GDF-9、GDF-10、GDF-11、GDF-12、CDMP-1、CDMP-2、CDMP-3、NODAL、UNIVIN、SCREW、ADMP和NEURAL。

生长因子(或药物)可以诱导ADSC在CMB中原位分化为软骨细胞。在一些实施方案中，生长因子是TGF-β3、BMP-6或TGF-β3和BMP-6的组合。如果将TGF-β3和BMP-6组合，它们的质量比(TGF-β3比BMP-6)为1：5、1：4、1：3、1：2.5、1：2、1：1.5、1：1.25、1：1、1.25：1、1.5：1、2：1、2.5：1、3：1、4：1、5：1，或1：5至1：3、1：4至1：2.5、1：3至1：2、1：2.5至1：1.5、1：2至1：1.25、1：1.5至1：1、1：1.25至1.25：1、1：1至1.5：1、1.25：1至2：1、1.5：1至2.5：1、2：1至3：1、2.5：1至4：1或3：1至5：1。如果组合物中存在微球，并且TGF-β3和BMP-6组合，则它们的质量比(TGF-β3比BMP-6)为1：5、1：4、1：3、1：2.5、1：2、1：1.5、1：1.25、1：1、1.25：1、1.5：1、2：1、2.5：1、3：1、4：1、5：1，或1：5至1：3、1：4至1：2.5、1：3至1：2、1：2.5至1：1.5、1：2至1：1.25、1：1.5至1：1、1：1.25至1.25：1、1：1至1.5：1、1.25：1至2：1、1.5：1至2.5：1、2：1至3：1、2.5：1至4：1或3：1至5：1。

在一个实施方案中，TGF-β3可包含在水凝胶或支架基质中。在体内发育过程中的软骨形成过程中可能检测到TGF-β3。可以使用先前报道的方案检测这种固定。例如，将BSA-PBS中的各种浓度的TGF-β3添加到交联的NaCS膜中在4℃下过夜。用BSA-PBS洗涤孔，并用小鼠抗人TGF-β3(Abeam，Inc.)进行免疫荧光染色，随后使用与FITC偶联的抗小鼠IgG二抗(BDBiosciences，Inc)。然后，使用荧光板读数器(FLX800，Biotek，Inc.)检测荧光强度，并将其与TGF-β3的量相关联。

在各种实施方案中，每cc组合物可以包括约10至约10000ng生长因子。在一些实施方案中，所述组合物包含每cc组合物1-15ng生长因子、10-100ng生长因子、20-200ng生长因子、50-500ng生长因子、100-1000ng生长因子、200-2000ng生长因子、500-3000ng生长因子、1000-4000ng生长因子、2000-5000ng生长因子、3000-6000ng生长因子、4000-7000ng生长因子或5000-8000ng生长因子、6000至10000ng生长因子。

存在于组合物中的生长因子可在注射组合物的关节或其他部位提供CMB分化成软骨细胞。组合物中存在的生长因子可以向CMB发出信号，以产生糖胺聚糖(GAG)或胶原蛋白或透明质酸。组合物中存在的生长因子以及水凝胶和CMB可以有利地提供间充质凝集的生理发育过程，间充质凝集在植入后可能形成软骨并与邻近组织整合。可以优化生长因子的量和释放速率以提供这种发育过程。使用材料螯合和缓慢释放生长因子可为CMB在发育过程中长时间暴露于生长因子提供条件。

在一些实施方案中，组合物还包含聚合物微球，其中一种以上生长因子被包封在聚合物微球中。在一些实施方案中，聚合物微球包含聚(乳酸-共-乙醇酸)(PLGA)。聚合物微球可以提供生长因子的受控释放，使得这种生长因子在数天或数周内有效地诱导MSC原位软骨分化。不希望受到理论的束缚，与单独的水凝胶相比，包含聚合物微球(例如PLGA)的水凝胶可提供更优异的长期生长因子释放。基于PLGA的微球可以持续控释生长因子(例如VEGF、BMP6和TGF-β3)长达90天。以基本上恒定的方式进行的这种控释可以允许形成用于骨软骨修复的致密和功能性细胞层。

此外，PLGA和其他聚合物微球是可冻干的和可储存的，这可以允许该组合物即用。

在一些实施方案中，组合物还包括稳定剂，例如纤维蛋白、层粘连蛋白、聚-D-赖氨酸和/或聚-L-赖氨酸。由于纤维蛋白是由凝血酶和纤维蛋白原形成的，因此这些成分可以分开存在，然后再合并使用。例如，可以在将组合物注射到需要软骨修复的关节或其他部位之前即刻合并凝血酶和纤维蛋白原。层粘连蛋白(LN)是一种高分子量的黏附性糖蛋白。聚-D-赖氨酸和聚-L-赖氨酸可能是有利的，因为它们可以从非生物来源制备。稳定剂的量可以变化，使得组合物具有适合于将CMB、水凝胶和生长因子保持在注射部位的凝胶状稠度。

在各种实施方案中，通过混合CMB和水凝胶来制备组合物。可以将一种以上药物添加到组合物中。可以将一种以上生长因子添加到组合物中。可以将包含CMB和水凝胶的组合物冷冻保存在液氮中至少5天、10天、15天、20天、25天、30天、2个月、3个月、4个月、6个月、1年、3年、5年、甚至10年。在制备过程中，组合物也可以在机械负荷下进行混合。例如，可以通过搅拌、通过动态载荷或通过静水压力来手动施加机械载荷。

在各种实施方案中，当施用于受试者或患者时，水凝胶或支架有效地支撑、促进和/或增强组织的生长、再生和/或修复。

本文所述的组合物可以与药学上可接受的载剂、赋形剂和/或佐剂一起给药。所述组合物可以与至少一种另外的生物活性剂和/或治疗剂，例如氨基酸、肽、多肽、化合物、药物、抗体等或它们的组合结合。例如，水凝胶或支架组合物可以包含至少一种另外的生物活性剂和/或治疗剂，例如氨基酸、肽、多肽、化学化合物、药物、抗体等，或它们的组合。

水性悬浮液可包括与适合于制备水性悬浮液的赋形剂混合的活性材料。这样的赋形剂包括悬浮剂，例如羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、藻酸钠、聚乙烯吡咯烷酮、黄蓍胶和阿拉伯胶。示例性的赋形剂还包括分散剂或湿润剂，例如卵磷脂，或环氧烷与脂肪酸的缩合产物，例如聚氧乙烯硬脂酸酯。示例性的赋形剂还包括环氧乙烷与长链脂族醇(例如，十七亚乙基氧基鲸蜡醇(heptadecaethyleneoxycetanol))的缩合产物，或环氧乙烷与衍生自脂肪酸和己糖醇的偏酯(例如，聚氧乙烯山梨醇单油酸酯)的缩合物，或环氧乙烷与衍生自脂肪酸和己糖醇酐的偏酯(例如聚乙烯失水山梨醇单油酸酯)的缩合物。

水性悬浮液还可包括一种以上防腐剂，例如对羟基苯甲酸乙酯或对羟基苯甲酸正丙酯；一种以上着色剂；一种以上调味剂以及一种以上甜味剂，例如蔗糖或糖精。

适用于注射用途的药物组合物可以包括无菌水溶液(在水溶性的情况下)或分散剂以及用于即时制备无菌注射溶液或分散剂的无菌粉末。注射用制剂可以单位剂型存在，例如在安瓿中或在多剂量容器中，并添加防腐剂。所述组合物可以形成为在油性或水性赋形剂中的悬浮液、溶液或乳液，并且可以含有悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。

对于静脉内施用，合适的载剂包括生理盐水、抑菌水，Cremophor^TM.(BASF，Parsippany，N.J.)或磷酸盐缓冲盐水(PBS)。该组合物可以是无菌的，并且是容易注射程度的流体。载剂可以是溶剂或分散介质，其含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)及它们的合适混合物。例如，可以通过涂层例如卵磷脂，在分散液的情况下通过维持所需的粒径，以及通过使用表面活性剂，来维持适当的流动性。可以通过各种抗细菌剂和抗真菌剂，例如对羟基苯甲酸酯、三氯叔丁醇、苯酚、抗坏血酸、硫柳汞等，来实现防止微生物的作用。等渗剂，例如糖、多元醇(如甘露醇、山梨糖醇)和氯化钠可包括在组合物中。通过在组合物中包含延迟吸收的试剂，例如单硬脂酸铝和明胶，可以实现可注射组合物的延长吸收。

生物反应器可用于制备组合物，示例性生物反应器如于2010年9月10日以WO2010/102059公开的国际申请号PCT/US10/026120和于2014年10月23日以WO 2014/172575公开的国际申请号PCT/US14/034559中所描述。在制造期间，同种异体供体细胞可用于产生CMB，然后将其在植入的最佳时间点进行低温保存或冷冻保存。类似地，可以生产并冻干注入生长因子的微粒，以使它们易于与由供体细胞的大型同种异体细胞池产生的CMB一起运输，以允许即用。

在各种实施方案中，可以在向患者给药之前或作为质量控制程序的一部分，在体外测试组合物或其任何组分。在测试之前，可以将组合物低温保存或冷冻保存。一种测试方式是测定组合物或其中的CMB的软骨形成特性。如果适用，可以将组合物的CMB解冻，然后在软骨形成培养基中培养。例如，解冻后，可将CMB在软骨分化培养基(CDM)中培养一天以上，然后在植入前与水凝胶组合。可以进行细胞活力、组织学和基因表达中一种以上的测定。具体的测定法描述于实施例1中。例如，可将培养的CMB固定并染色。各种染色剂可用于组织学分析，例如苏木精、伊红、阿尔新蓝和三色染色法。对于基因表达，可以进行即时PCR来评估聚集蛋白聚糖、胶原蛋白、SOX9、HOXA2、钙黏着蛋白2、纤连蛋白，腱生蛋白C、多配体聚糖3、基质金属蛋白酶(MMP)、具有血小板反应蛋白基序的去整合素和金属蛋白酶(ADAMTS)、转化生长因子β和骨形态发生蛋白。可以进行这种测试以优化或改进配制、低温保存或冷冻保存和/或存储组合物的方式。

可以测试组合物的免疫原性。可以例如通过流式细胞术测试存在于CMB中的MSC上的免疫原性标记物。示例性标记包括但不限于人类白细胞抗原(HLA)II类、CD40、CD80和CD86。实施例1中描述了这种测试的示例。

在一些实施方案中，可以测试组合物在体内修复软骨缺陷的效力。软骨缺陷可以在基于动物的软骨外植体中产生，也可以使用人造材料(例如硅橡胶环)进行模拟。或者，可以产生结缔组织缺陷。然后将组合物压入缺陷并在软骨形成培养基中培养。可选地，向组合物提供机械力以促进软骨细胞的发育或以其他方式模拟体内例如膝盖或肩部的状况。稍后可以测试组合物，以确定机械强度(通过测量压缩杨氏模量)。此外，如果提供了机械力，例如通过动态载荷，则可以进行上述的和实施例2中所述的组织学研究，以评估机械力对软骨细胞发育的影响。

另一方面，提供了一种治疗患者的软骨缺陷的方法，该方法包括将上述的和在此所述的任何组合物施用于软骨或软骨周围区域。可以将组合物注射到缺陷部位。例如，可以将组合物注射到膝盖的半月板中。或者，可以在膝盖的半月板附近的部位注射软骨。同样，可以将组合物注射到滑液中或与滑液接触。

另一方面，提供了一种在患者中预防软骨退变或治疗软骨损伤或退行性疾病或病症的方法，该方法包括将上述的和在此所述的任何组合物施用于软骨或软骨周围区域。该组合物可以被植入并固定在软骨病灶或缺陷中。因为软骨病灶和缺陷可以以各种形状、尺寸和位置发生，可以将组合物模制成足以适应待治疗患者的软骨中特定的软骨缺陷或病灶的形状和尺寸。例如，该组合物可以模制成薄片或基质。薄片或基质的厚度可以为0.5至10mm、1至1.5mm、1.5至3mm、2.5至4mm、3.5至5mm、4至6mm、5至7mm、6至8mm、或8至10mm。片材或基质中的厚度可以变化。可以根据需要使用其他基质、网状物和其他组分，以确保植入物位于软骨缺陷。

另一方面，提供了一种在患者中预防结缔组织退化或治疗结缔组织损伤或退行性疾病或病症的方法，该方法包括将上述的和在此所述的任何组合物施用于结缔组织或结缔组织周围区域。该组合物可以被植入并固定在结缔组织病灶或缺陷中。因为结缔组织病灶和缺陷可以以各种形状、尺寸和位置发生，可以将组合物模制成足以适应待治疗患者的结缔组织中特定结缔组织缺陷或病灶的形状和尺寸。例如，该组合物可以模制成薄片或基质。薄片或基质的厚度可以为0.5至10mm、1至1.5mm、1.5至3mm、2.5至4mm、3.5至5mm、4至6mm、5至7mm、6至8mm或8至10mm。片材或基质中的厚度可以变化。可以根据需要使用其他基质、网状物和其他组分，以确保植入物位于结缔组织缺陷。

在上述方法的一些实施方案中，结缔组织是半月板、韧带或肌腱。在上述方法的一些实施方案中，软骨选自关节软骨和非关节软骨。在一些实施方案中，非关节软骨选自半月板和椎间盘。在一些实施方案中，该方法有效地在结缔组织缺陷、软骨缺陷、软骨退变、软骨损伤、软骨退行性疾病或软骨病症的部位形成包含1-20％(w/w)糖胺聚糖(GAG)的组织。该组织可以包含1.0至5.0％(w/w)的GAG、3.0至6.0％(w/w)的GAG、4.0至8.0％(w/w)的GAG、5.0至10.0％(w/w)的GAG、6.0至11.0％(w/w)的GAG、7.0至12.0％(w/w)的GAG、8.0至13.0％(w/w)的GAG、9.0至14.0％(w/w)的GAG、10.0至15.0％(w/w)的GAG、11.0％至16.0％(w/w)的GAG、13.0％至18.0％(w/w)的GAG、14.0％至19.0％(w/w)的GAG或15.0至20.0％(w/w)的GAG。在一些实施方案中，该方法有效地在结缔组织缺陷、软骨缺陷、软骨退变、软骨损伤、软骨退行性疾病或软骨病症的部位形成包含0.5-20％(w/w)胶原蛋白的组织。该组织可以包含0.5至5.0％(w/w)的胶原蛋白、1.0至5.0％(w/w)的胶原蛋白、2.0至7.0％(w/w)的胶原蛋白、3.0至8.0％(w/w)的胶原蛋白、4.0至9.0％(w/w)胶原蛋白、5.0至10.0％(w/w)的胶原蛋白、6.0至11.0％(w/w)的胶原蛋白、7.0至12.0％(w/w)的胶原蛋白、8.0至13.0％(w/w)的胶原蛋白、9.0至14.0％(w/w)的胶原蛋白、10.0至15.0％(w/w)的胶原蛋白、10.0至15.0％(w/w)的胶原蛋白、12.0至17.0％(w/w)的胶原蛋白、14.0至19.0％(w/w)的胶原蛋白或15.0至20.0％(w/w)的胶原蛋白。该组织可以包含至少1.2％(w/w)、1.3％(w/w)、1.4％(w/w)或1.6％(w/w)的胶原蛋白。在一些实施方案中，该方法有效地在软骨缺陷、软骨退变、软骨损伤、软骨退行性疾病或软骨病症的部位形成包含至少1％(w/w)GAG的组织。在一些实施方案中，该方法有效地在软骨缺陷、软骨退变、软骨损伤、软骨退行性疾病或软骨病症的部位形成具有至少100kPa的杨氏模量和至多0.8的摩擦系数的软骨。杨氏模量可以为至少20kPa、25kPa、30kPa、40kPa、50kPa、75kPa、100kPa、125kPa、150kPa、175kPa、200kPa、至少300kPa、至少400kPa、至少500kPa、至少600kPa、至少700kPa、至少800kPa、至少900kPa、至少950kPa、至少1000kPa、至少1100kPa、至少1200kPa或至少1300kPa。摩擦系数可以低于0.8、0.75、0.7、0.65、0.6、0.55、0.5、0.49、0.48、0.47、0.46、0.45、0.44、0.43、0.42、0.41、0.40、0.39、0.38、0.37、0.36、0.35、0.34、0.33、0.32、0.31、0.30、0.29、0.28、0.27、0.26、0.25、0.24或0.23。

在一些实施方案中，该方法有效地在软骨缺陷、软骨退变、软骨损伤、软骨退行性疾病或软骨病症的部位形成软骨。在一些实施方案中，软骨在该部位处或该部位周围与任何邻近软骨和软骨下骨组织整合。

实施例

还通过以下实施例描述和展示本发明。然而，在说明书中任何地方使用这些和其他实例仅是说明性的，绝不限制本发明或任何示例性术语的范围和含义。同样，本发明不限于这里描述的任何特定的优选实施例。实际上，在阅读本说明书之后，本发明的许多修改和变型对于本领域技术人员而言是显而易见的，并且在不脱离本发明的精神或范围的情况下，可以做出这种变型。因此，本发明仅由所附权利要求以及那些权利要求所赋予的等同物的全部范围来限制。

实施例1：证明冷冻保存的同种异体CMB的软骨形成特性

从LaCell LLC获得早期传代的，扩增的脂肪来源的干细胞(ADSC)，并进行了彻底的抗原性测试。使用GMP级组分扩增细胞并传代。第四次传代后，将ADSC引入软骨形成培养基中，形成CMB。

一旦形成CMB，通过以-1℃/分钟的速率降温至-80℃，立即将其冷冻保存在Synth-a-Freeze(Gibco)中，在-80℃下保存至少3天后，然后转移至液氮中。冷冻保存1至5周后，通过在37℃水浴中将冷冻的CMB快速加热至37℃解冻。使用LIVE/DEAD活力/细胞毒性测定试剂盒(Invitrogen)或台盼蓝排除法，测量细胞活力。通过将解冻的CMB与未冷冻保存的CMB所获得的结果进行比较，对解冻的CMB进行免疫组织化学和基因表达分析。

此外，将冷冻保存的CMB培养在软骨形成培养基中培养，以评估软骨形成品质的维持情况，该软骨形成培养基即添加了抗坏血酸、地塞米松、ITS+Premix(Corning)、MSC补充剂、TGFβ3(R&D Systems)和BMP6(R&D Systems)的StemPro SFM培养基(LifeTechnologies)。简而言之，将培养的CMB固定在10％(vol/vol)的福尔马林中以进行组织学和免疫组化分析，或保存在TRIzol中以进行基因表达分析。固定后，将样品石蜡包埋，切成5μm切片，并用苏木精和伊红(H&E)、阿尔新蓝(GAC)用于GAC、三色染色法、间充质凝集转录因子性别决定区域Y(SRY)-盒9(SOX9)、I、II、X型胶原蛋白和lubricin(Abcam)染色。使用制造商的说明，使用TRIzol方法(Life Technologies)，从样品中纯化RNA。使用TaqMan引物(Life Technologies)进行实时PCR以评估以下基因的表达：聚集蛋白聚糖(ACAN)、I型胶原蛋白(COL1A1)、II型胶原蛋白(COL2A1)、X型胶原蛋白(COL10A1)、间充质凝集转录因子性别决定区域Y(SRY)-盒9(SOX9)和同源盒A2(HOXA2)、细胞粘附钙黏着蛋白2(CDH2)、凝集细胞外基质纤连蛋白(FN1)、腱生蛋白C(TNC)、多配体聚糖3(SDC3)、基质金属蛋白酶13(MMP13)、具有血小板反应蛋白基序-5的去整合素和金属蛋白酶(ADAMTS5)、转化生长因子β(TGFβ1和TGFβ3)和骨形态发生蛋白6(BMP6)。甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)被用作管家基因。

为了更好地理解CMB形成后同种异体ADSC的抗原性，通过流式细胞术分析冷冻保存的样品，以检测人白细胞抗原(HLA)II类、CD40、CD80和CD86表面标记物水平。缺乏上述标志物表达的细胞被认为是免疫特权的[22]。简而言之，通过将CMB在I型胶原蛋白酶中在37℃下孵育1小时以打碎任何团块，将解冻的CMB解离成单细胞悬液。消化液用等体积的软骨形成培养基中和。通过用20G针重悬来进一步解离细胞悬液。按照制造商的晶载染色(On-Chip Staining)方案(安捷伦)，将单细胞用表面标记物特异性抗体和钙黄绿素AM染色。使用Agilent Bioanalyzer、

流式细胞仪或其他流式细胞仪进行流式细胞术。

根据需要优化生产CMB的方法，以实现(i)冷冻保存/解冻的CMB与新鲜产物相当的性能，(ii)ADSC均匀整合和融合到间质细胞体中(均一的糖胺聚糖结构，低的腱生蛋白沉积)，(iii)CMB形成后细胞上没有免疫原性表面标记物。

实施例2：施用水凝胶中同种异体CMB的体外模型

使用冷冻保存的和新鲜形成的CMB测试了CMB/水凝胶在填充体外软骨缺陷模型中的可行性和有效性。在非活的牛软骨外植体(直径5mm，高度5mm)中，形成3mm直径的全厚度软骨缺陷。使用各种水凝胶载体将CMB插入缺陷中。每种载体包括I型胶原蛋白、透明质酸和纤维蛋白中的一种以上，并进行了载体的比较分析以确定最佳的水凝胶组成。然后将水凝胶载体压入缺陷中(图4)。如上所述，将构建体在含有TGF-β3和BMP-6的软骨形成培养基中培养多达5周，并进行分析。进行组织学、生化和力学分析[19]。还测量了DNA、GAG和羟脯氨酸(胶原蛋白)的含量。

简而言之，软骨和软骨下区域沿着下面的骨的表面分离并且确定湿重。消化样品并使用PicoGreen分析(Molecular Probes)测定DNA含量。提取物中的硫酸化GAG(s-GAG)含量是使用1,9-二甲基亚甲基蓝染料量热测定法测定的，其中6-硫酸软骨素为标准品。按羟脯氨酸的含量计，使用1：7.64羟脯氨酸与胶原蛋白的质量比或总胶原蛋白含量的约13.5％，使用酸水解评估胶原蛋白的量。

然后通过无侧限压缩来测量软骨的压缩杨氏模量。通过压缩构建体(即每秒0.01％的应变，最大150μm的变形，多达3,000秒)来生成应力-应变曲线，并测量压缩载荷。杨氏模量是根据应力-应变曲线的线性斜率计算得出的。同样，在无侧限压缩结构中测量软骨与玻璃之间的法向力、摩擦力、轴向变形以及摩擦系数。然后，使用推出工具(push-out)测试融合的CMB和天然软骨基质之间的整合强度。

对植入物的承载能力进行量化，以确定载荷对与周围软骨和下层骨的整合的影响，并随时间检查“失败”参数。使用1Hz的10-15％的表面间变形进行动态载荷，每天最多4小时，每周5-7天。如上所述，评估了动态载荷对所得组织的细胞外基质组成和分布(通过生物化学和组织学)和功能特性(通过无侧限压缩测试)的影响。

根据需要优化制备和施用水凝胶中CMB的方法，以在机械刺激下显著改善所得组织的机械和生化特性，特别是(i)形成致密的软骨组织(含3％-6％w/w GAG和>5％w/w胶原蛋白)以填补缺陷，(ii)生理机械性能(杨氏模量>800kPa，摩擦系数<0.3)，和(iii)整合所开发的产品与相邻软骨和软骨下骨组织。

实施例3：使用PLGA微球作为递送平台的生长因子(TGFβ3和BMP6)的长期释放和CMB软骨形成

为了维持生长因子从骨软骨移植物的长期释放，结合并测试了控释技术。在测试样品中，微球用于传递生长因子以诱导和增强软骨形成。在对照样品中，不使用微球。

微球由基于PLGA的聚合物制成，基于其生物相容性、可注射性和可定制的释放特性，基于PLGA的聚合物已被用作可行的蛋白质递送载体。优化了生长因子(GF)的控释曲线，这种曲线取决于许多因素，包括所选GF的生化特性。

基于公开的方案，使用油包水(w/o/w)乳液方法制备了PLGA微球。简而言之，将PLGA(乳酸与乙醇酸的比例为50:50)和GF的水溶液在二氯甲烷中混合。将混合物均质化以形成油包水乳液，将其添加到聚乙烯醇(PVA)中以形成双重乳液。在长时间搅拌后，将内容物离心以除去上清液。随后将微球团块洗涤并冻干。

扫描电子显微镜用于通过基于不同微球组的尺寸分布和形态学特性对所产生的微球进行表征来评估其品质。为使均匀GF的释放最佳化，选择微球以显示最均匀的粒径和不同的球形形状。通过以下公开的方案分析不同微球的GF释放。简而言之，将10mg微球悬浮在微量离心管中的PBS中。为优化GF负荷，将制备好的微球装载BMP6和TGFβ3的不同组合(5mg：5mg，3mg：7mg和7mg：3mg)。在30分钟、1小时、5小时、1天、3天，7天以及此后每7天检查GF释放。对于每个时间点，收集上清液，并将等体积的新鲜PBS添加到微球中。重复该过程，直到样品中没有团块，表明微球完全降解并释放出生长因子。对收集的上清液进行ELISA，以确定随时间推移释放的生长因子浓度。选择能够在CMB软骨形成的最佳浓度(10ng/ml)下维持长期GF释放的微球。

优化条件以制备具有长储存寿命的聚合物微球。在4℃和25℃(室温)下测试生产的微球的保质期，并评估不同存储时间的GF释放曲线。将GF微球在4℃和25℃下保存1天、7天、14天和21天，并评估GF释放曲线，以确定在4℃和25℃下可接受的存储范围。

在体外分析了注入生长因子(GF)的微球，以确定它们是否可以维持长期的GF释放并因此增强CMB的成熟和软骨形成。在该实验中，通过混合组分并将复合材料注入定制模具中来制备水凝胶+CMB±GF微球复合材料。在不添加GF的情况下，将复合构建体在优化的培养基中培养(根据实施例1和2)。进行组织学和生化测定以证实GF释放在复合构建体中的CMB成熟、软骨生成和骨软骨ECM沉积中的作用。在30分钟、1小时、5小时、1天、3天、5天、7天和每7天收集这些构建体的条件培养基，以通过ELISA检查5周内的GF释放。复合构建体(水凝胶+CMB+GF微球)可以表现出与水凝胶+CMB构建体相当的CMB成熟度和软骨形成程度，该水凝胶+CMB构建体在添加了BMP6和TGF-β3的培养基中培养。

实施例4：体外软骨缺陷模型中的产品施用和功效模型

一旦优化了实施例1-3的方案并选择了合适的条件和组分，就在体外软骨缺陷模型中测试由CMB、水凝胶和GF注入的微粒制成的所选材料。如实施例1和2中所述，将选择的材料注射入外植软骨缺陷模型中并在机械负荷下培养。将外植体在不添加外源GF的软骨形成培养基中生长长达五周。评估所得组织的功能，如实施例1和2中所述。此外，在每次培养基更换时评估向培养基中的GF释放，以进一步确定这些平台对PTOA的长期治疗的功效。还进行组织学、生化和力学分析，以评估复合结构的生物学和力学性能。成功标准取决于缺陷处软骨组织的形成以及组织与相邻软骨和软骨下骨的整合。

实施例5：测试冷冻保存对软骨形成的影响

如图1中概述的测试了冷冻保存对ADSC介导的软骨形成的影响。在图1中，在CMB培养的二维(2-D)或三维(3-D)阶段中冷冻保存细胞。对于2-D条件，将细胞(i)不进行冷冻保存传代至P4(新鲜)，(ii)在采集基质血管分数(SVF)后立即冷冻保存、解冻并传代至P4(SVF低温)，或(iii)传代至P1、冷冻保存、解冻，然后传代至P4(P1低温)。对于3-D条件，CMB在形成后保留且不冷冻保存(对照)，或在培养三天后冷冻保存并在冷冻保存1-5周后解冻。

通过离心脂肪组织样品以分离基质血管分数(SVF)来制备冷冻样品和对照“新鲜”样品。将SVF转移到烧瓶中，并用TrypLE-Select传代四次。然后将样品分成(i)未进行冷冻保存的对照样品和(ii)冷冻样品，如实施例1中所述地将冷冻样品冷冻保存并将其在液氮中储存1-5周。随后将冷冻保存的样品解冻以产生冷冻样品。然后将对照样品和测试样品都进行进一步测定。

通过离心脂肪组织样品以分离基质血管分数(SVF)来制备测试样品和对照“SVF低温”样品。如实施例1所述地将SVF冷冻保存，并在液氮中储存至少一个月。然后将SVF解冻，转移到烧瓶中并传代四次。然后，将样品分为对照样品和冷冻样品，其中冷冻样品如实施例1所述冷冻保存。然后，将样品分为(i)未进行冷冻保存的对照样品和(ii)冷冻样品，其中冷冻样品如实施例1所述冷冻保存，并在液氮中保存1-5周。然后将冷冻保存的样品解冻以产生测试样品。然后将对照样品和测试样品都进行进一步测定。

通过离心脂肪组织样品以分离基质血管分数(SVF)来制备测试样品和对照“p1低温”样品。将SVF转移到烧瓶中并传代一次。如实施例1所述将传代的SVF冷冻保存，并在液氮中储存至少一个月。然后将SVF解冻，转移至烧瓶中并传代四次。然后将样品分为对照和冷冻样品，冷冻样品如实施例1所述冷冻保存。随后将样品分为(i)未冷冻保存的对照样品和(ii)冷冻样品。冷冻样品如实施例1所述冷冻保存并在液氮中储存1-5周。然后将冷冻保存的样品解冻以产生测试样品。随后将对照样品和测试样品都进行进一步测定。

然后，测定了ADSC冷冻保存对群体倍增时间的影响。在以下ADSC中进行比较(i)无冷冻保存传代至P4的ADSC(新鲜)，(ii)采集基质血管分数(SVF)后立即冷冻保存、解冻并传代至P4的ADSC(SVF低温)，和(iii)传代至P1、冷冻保存、解冻并传至P4的ADSC(P1低温)。采集最后的冷冻保存步骤后进行的四次传代的每个样品，然后进行群体倍增时间的分析。结果显示在图2中，Y轴为群体倍增时间，X轴为进行的传代次数。

群体倍增时间(PDT)的分析显示，新鲜ADSC和P1低温ADSC表现出类似的趋势，其中PDT随着传代而增加。可替代地，对于SVF低温ADSC，PDT随着传代而减少。对于“新鲜”样品，群体倍增时间从约1.5天(传代一次)增加至传代4次时的大约2天。相对地，对于SVF冷冻保存并解冻的“SVF低温”样品，群体倍增时间从约2天(传代一次)降至传代四次时的1.5天。对于“p1低温”样品(其中SVF在冷冻保存和解冻之前经过了一次传代)，群体倍增时间为约2.5天，并且随着传代次数的增加而略有增加。

实施例6：测试ADSC冷冻保存对软骨生成的影响

进一步测定了冷冻保存对(烧瓶中的2D)细胞的影响。如图3所示，对照“新鲜”、“SVF低温”和“p1低温”CMB以上述方式制备。培养28天后，测量每个“新鲜”、“SVF低温”和“p1低温”样品中的CMB的直径，并显示在图4A中。新鲜CMB的直径约为1.9mm、SVF低温CMB的直径约为1.7mm，P1低温细胞的直径约为1.6mm。

在培养28天后，测量“新鲜”、“SVF低温”和“p1低温”样品中的CMB的湿重并显示在图4B中。新鲜的CMB的湿重约为4.0mg。SVF低温CMB的湿重约为2.5mg，P1低温CMB的湿重约为1.7mg。(*p<0.05，**p<0.005。)

在培养28天后，测量“新鲜”、“SVF低温”和“p1低温”样品中的DNA与湿重的质量比(ng DNA/mg湿重)，并显示在图4C中。新鲜CMB的质量比为约375ng DNA/mg湿重。SVF低温CMB的质量比为约85ng DNA/mg湿重。P1低温CMB的质量比为约105ng DNA/mg湿重。(*p<0.05，**p<0.005。)

在培养28天后，测量“新鲜”、“SVF低温”和“p1低温”样品中的每一个中GAG与湿重的质量比(w/w％)，并显示在图4D中。新鲜CMB的比例约为5.5w/w％。SVF低温CMB的比例约为2.0w/w％。P1低温CMB的比例约为4.8w/w％。(*p<0.05，**p<0.005。)

在培养28天后，测量“新鲜”、“SVF低温”和“p1低温”样品中的胶原蛋白与湿重的质量比(w/w％)，并显示在图4E中。CMB的比例约为3.5w/w％。SVF低温CMB的比例约为5.2w/w％。P1低温CMB的比例约为3.1w/w％。(*p<0.05，**p<0.005。)

培养28天后，“新鲜”、“SVF低温”和“p1低温”CMB的外观如图4F所示。比例尺为0.5mm。

当3组ADSC用于产生CMB且生长于软骨形成分化培养基(CDM)中4周时，冷冻保存显著降低所得样品(p<0.01)的直径、湿重和DNA。虽然在SVF低温CMB中，冷冻保存还显著降低GAG[(p<0.01)用于软骨形成的标记物]且显著增加胶原蛋白含量(p<0.05)，但P1低温CMB的性能与新鲜CMB相似。图4F显示了培养28天后典型CMB图像。

以上结果表明，在一次传代后冷冻保存的ADSC(“p1低温”)适用于即用的可注射产品。

实施例7：测试CMB冷冻保存对软骨生成的影响

进一步测定了冷冻保存对(孔中的3-D)CMB团块的影响。

如图5所示，制备对照“新鲜”和“p1低温”样品。将脂肪组织样品离心以分离基质血管分数(SVF)。在“p1低温”样品中，将SVF放入烧瓶中，传代一次，然后如实施例1所述的进行冷冻保存，并在液氮中储存1至5周。然后将冷冻保存的样品解冻并传代四次。在“新鲜”样品中，将SVF放入烧瓶中并传代四次。

然后将“新鲜”和“p1低温”样品中的每一个分成对照样品和冷冻样品。如实施例1所述将冷冻样品冷冻保存，并在液氮中储存至少一周。然后将冷冻样品解冻，转移至多孔板。然后将对照样品和冷冻样品都进行进一步测定。

在多孔板中培养(3-D培养)3天后和软骨分化28天后，测量“新鲜对照”、“p1低温对照”、“新鲜冷冻”和“p1低温冷冻”样品中细胞的直径，结果如图6A所示。新鲜对照CMB的直径约为1.87mm，新鲜冷冻CMB的直径约为1.20mm，p1低温对照CMB的直径约为1.82mm，p1低温冷冻CMB的直径约为1.43mm。

还测量了“新鲜对照”、“p1低温对照”、“新鲜冷冻”和“p1低温冷冻”样品中细胞的湿重，结果示于图6B中。新鲜对照CMB的湿重约为3.15mg，新鲜冷冻CMB的湿重约为1.70mg，p1低温对照CMB的湿重约为2.30mg，p1低温冷冻CMB的湿重为约1.20mg。

测量了“新鲜对照”、“p1低温对照”、“新鲜冷冻”和“p1低温冷冻”样品中DNA与湿重的质量比(ng DNA/mg湿重)，并显示在图6C中。在诱导长期软骨形成之前，CMB的DNA与湿重的质量比约为200至5000ng DNA/mg CMB。软骨形成诱导5周后，新鲜对照CMB的DNA与湿重的质量比约为360ng DNA/mg湿重，新鲜冷冻CMB的质量比约为230ng DNA/mg湿重，p1低温对照CMB的质量比约为345ng DNA/mg湿重，p1低温冷冻CMB的质量比约为550ng DNA/mg湿重。

测量了“新鲜对照”、“p1低温对照”、“新鲜冷冻”和“p1低温冷冻”样品中的每一个的GAG与湿重的质量比(w/w％)，并如图6D所示。新鲜对照CMB的质量比约为5.70(w/w％)，新鲜冷冻CMB的质量比约为6.55(w/w％)，p1低温对照CMB的质量比约为4.45(w/w％)，且p1低温冷冻CMB的质量比约为3.90(w/w％)。

测量了“新鲜对照”、“p1低温对照”、“新鲜冷冻”和“p1低温冷冻”样品中胶原蛋白与湿重的质量比(w/w％)，并如图6E所示。新鲜对照CMB的质量比约为3.65(w/w％)，新鲜冷冻CMB的质量比约为4.95(w/w％)，p1低温对照CMB的质量比约为4.00(w/w％)，且p1低温冷冻CMB的质量比约为2.40(w/w％)。

在多孔板中培养(3-D培养)3天后和软骨分化28天后，“新鲜对照”、“p1低温对照”、“新鲜冷冻”和“p1低温冷冻”CMB中各自的外观如图6F所示。

对照CMB的直径(图6A)是相似的，其中CMB低温保存的直径降低了25-30％。这些差异可以通过图6F中的目视检查数据观察到。图6B中的湿重数据显示了所有组之间的显著差异，ADSC和CMB低温保存均显示出显著降低。

DNA(图6C)、GAG(图6D)和胶原蛋白(图6E)含量的生化分析显示出取决于相关周边的不同响应。新鲜对照组、新鲜冷冻组和P1低温对照组之间，CMB的DNA含量没有显著差异。但是，在P1低温冷冻组中，与其他组相比，尤其是新鲜冷冻组，DNA含量有所增加。与新鲜CMB相比，P1低温CMB的GAG含量较低。如图6D所示，其中一些差异很明显。对照组之间的原纤维胶原蛋白含量相似，但是与各自的对照组相比，新鲜冷冻组的胶原蛋白含量增加，而P1低温冷冻组的胶原蛋白含量随之降低。

实施例8：软骨形成CMB的流式细胞术分析

通过流式细胞术进行了软骨形成CMB的细胞表面标记物的分析。针对ISO的抗体用作阴性对照，针对CD59和CD90的抗体用作阳性对照。测试了HLAII类，、CD40、CD80或CD86的表达。另外，测试了CD34、CD45、CD73、CD90和CD105的表达。在图7A中，流式细胞术结果通过HLA II类、CD40、CD80和CD86阴性表达显示了软骨形成CMB的抗原性。用ISO抗体作为阴性对照也可观察到阴性表达，而将CD59和CD90用作阳性对照可观察到阳性表达。

图7B显示了在通过流式细胞术分析表面标记物特征之后，在活的ADSC上各种抗原的表达百分比。ADSC来自四个人类供体。观察到典型的间充质干细胞(MSC)分布，其中CD34和CD45低表达，伴随CD73、CD90和CD105高表达。此外，在冷冻保存的CMB中检查抗原标记物显示缺乏HLA II类、CD40、CD80或CD86表达，表明此类细胞不太可能引发免疫原性应答。

实施例9：硅树脂缺陷模型以测试水凝胶和CMB的组合

检查了I型胶原蛋白、透明质酸，以及I型胶原蛋白：透明质酸盐(以4：1、1：1和1：4的比例)作为CMB和生长因子-微粒的递送载体。为了优化我们的水凝胶递送载体以及CMB和微粒参数，使用了模拟外植体缺陷模型的硅橡胶环方法(内径5mm，厚度2mm)，如图8所示。水凝胶和CMB被添加到硅树脂缺陷中。湿重、DNA质量比、GAG质量比和胶原蛋白质量比参数显示在图8中的表中，所有凝胶制剂都是递送CMB的合适选择。在硅树脂缺陷模型中对每种水凝胶的凝胶化浓度和时间进行了优化。在填充CMB的硅树脂和软骨缺陷模型中均进行了额外的优化，CMB用(i)胶原蛋白和(ii)胶原蛋白：透明质酸盐(1：1、4：1和1：4)递送，以确定哪种情况可以提供软骨表型和与周围软骨融合的最佳组合。

在硅树脂缺陷模型中优化之后，使用骨软骨缺陷模型重复测试。图9A是骨软骨缺陷模型中的空缺陷的照片。图9B是显示胶原蛋白凝胶-CMB填充缺陷的照片。图9C是显示胶原蛋白凝胶-CMB填充的缺陷的半截面图，其中填充组分保留在缺陷中。在骨软骨缺陷模型中进行了上述参数的其他优化。

实施例10：硅树脂缺陷模型以测试水凝胶和CMB的组合

将药物掺入CMB-水凝胶组合中以测试其是否可以诱导hADSC软骨形成。药物释放制剂的设计等同于先前用于诱导hADSC软骨形成的药物补充方法，在该方法中，将药物直接添加到软骨形成分化培养基中。将平均尺寸为1-10μm的颗粒装载0.02％(w/w％)的药物。制备了80mg的载药微粒，并测试了其长期释药(长达35天)，以确定成功诱导hADSC软骨形成所需的最佳微粒浓度。使用图10A中描述的实验方案测定随时间的药物释放。

图10B显示了观察到的药物随时间的释放。10mg微粒在六天内提供约10pg/48小时或5pg/天的释放速率。

为了达到适于在5mm直径/1mm厚的移植物(20μL移植物体积)中维持10ng/ml生长因子浓度的20pg/天的释放速率，可将40mg微粒装载到每个移植物中。

实施例11：软骨外植体缺陷模型以测试从包含水凝胶、CMB和药物的组合物中软骨的再生

将两种药物，TGF-β3和BMP-6，添加到CMB-水凝胶组合中，以测试它们是否填充了离体模型中的软骨缺陷，以及动态变形载荷是否影响GAG和胶原蛋白的含量。使用动态变形载荷(1％皮重载荷，然后从表面到表面位移10％，1Hz，每天3小时，5-7天每周[Ng等人，CellMol.Bioeng.，2009年9月1日，2(3)：386-394])刺激ADSC分化为软骨细胞并增加软骨形成分化因子的产生，例如糖胺聚糖、软骨寡聚蛋白(COMP)、连接蛋白、透明质酸和胶原蛋白，特别是II型胶原蛋白、IX型胶原蛋白、XI型胶原蛋白。测定了经受动态变形载荷的软骨填充物和对照软骨填充物的GAG含量和胶原蛋白含量。结果显示在图11A和11B中。

图11A显示，载荷与未载荷的对照软骨填充物的GAG含量相似。

图11B显示了与胶原蛋白含量为约5％的未载荷的对照相比，载荷将胶原蛋白含量提高到10湿重％。

实施例12：软骨外植体缺陷模型以测试各种水凝胶组合物的递送。

在全厚度软骨外植体缺陷模型中测试了不同组成和浓度的水凝胶的保留和胶凝化时间。测试的凝胶成分仅包括纤维蛋白，以及胶原蛋白/透明质酸的各种组合。通过将各种水凝胶组合物递送至外植体缺陷中、固化，然后在37℃的PBS中搅拌至多5天，测试凝胶的保留能力。

结果显示在图13中。与高胶原蛋白组合物样品相比，仅血纤蛋白和高透明质酸水凝胶组合物表现出更好的保留。

另外，将具有由ADSC制备的含CMB的水凝胶组合物递送至外植体缺陷。从骨骼成熟的牛膝上收获直径为10mm，厚度为10mm(软骨厚度为1-2mm)的牛骨软骨外植体。活检打孔器用于产生直径5mm的全厚度(直至骨)缺陷。然后用1：1体积的CMB和胶原蛋白/透明质酸水凝胶的混合物填充这些缺陷，并在具有或不具有载荷的情况下在含有TGF-β3和BMP-6生长因子的培养基中培养至多多5周。离体培养后，新形成的组织整合到天然软骨中，并表现出与天然软骨相当的糖胺聚糖和胶原蛋白含量。数据如图14所示。

实施例13：CMB尺寸对软骨构建体质量的影响。

评估了CMB尺寸对软骨构建体质量的影响。从50K，100K和250K细胞生成CMB。构建体随后用每种CMB尺寸制造，培养4周，然后收集进行目视检查、组织学和定量评估。目视检查表明，在所有实验条件下的样品均表现出良好融合的CMB。数据示于图15A。此外，构建体是不透明的，这表明软骨样质量。H&E的组织学染色证实了视觉观察结果，揭示了所有组中融合的CMB，如图15B所示。软骨形成标记物GAG和胶原蛋白的组织学染色在实验条件之间显示出相当的分化。还比较了各组样品的湿重、DNA、GAG和胶原蛋白的定量，以确定CMB尺寸如何影响构建品质。数据示于图15C。对于所有参数，各组之间的值相对一致。这些结果表明，50K、100K和250K CMB尺寸均产生相当的软骨品质，可考虑用于软骨填充产品的制造。

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本发明不限于本文所述的具体实施方案的范围。实际上，根据前面的描述，除了本文描述的那些之外，本发明的各种修改对于本领域技术人员而言将变得显而易见。这样的修改旨在落入所附权利要求的范围内。

本文引用的所有专利、申请、出版物、测试方法、文献和其他材料均通过引用以其整体并入本文，如同其物理存在于本说明书中一样。

Claims (32)

1.一种组合物，其包含：

a)凝集的间充质细胞体(CMB)；和

b)水凝胶。

2.如权利要求1所述的组合物，其中，所述组合物还包含：

c)一种以上药物或生长因子。

3.如权利要求1或权利要求2所述的组合物，其中，所述组合物还包含：聚合物微球，其中一种以上药物或生长因子被包封在聚合物微球中。

4.如权利要求3所述的组合物，其中，所述聚合物微球包含聚(乳酸-乙醇酸共聚物)(PLGA)、聚(乳酸)(PLA)或PLGA和PLA的组合。

5.如权利要求1-4中任一项所述的组合物，其中，所述CMB包含选自结缔组织细胞和祖细胞的细胞，所述祖细胞能够形成软骨细胞、肌腱细胞、韧带细胞或半月板细胞。

6.如权利要求1-4中任一项所述的组合物，其中，所述CMB包含从软骨、肌腱、韧带或半月板分离的细胞。

7.如权利要求6所述的组合物，其中，所述细胞是软骨细胞、肌腱细胞、成腱细胞、纤维细胞或成纤维细胞。

8.如权利要求5所述的组合物，其中，所述CMB包含干细胞，所述干细胞选自间充质干细胞(MSC)、脂肪来源的干细胞(ADSC)、骨髓来源的干细胞(BMSC)、脐带血干细胞(UB-MSC)、神经脊干细胞、诱导多能干细胞、胚胎干细胞、初代软骨细胞和神经脊干细胞。

9.如权利要求5所述的组合物，其中，所述细胞来自异体来源或自体来源。

10.如权利要求5所述的组合物，其中，所述细胞是抗免疫原性的和/或免疫抑制的。

11.如权利要求5所述的组合物，其中，所述CMB在小于约-1℃的温度下冷冻保存至少一天。

12.如权利要求5所述的组合物，其中，所述CMB在0℃至30℃之间的温度下低温保存至少一天。

13.如权利要求1-12中任一项所述的组合物，其中，所述CMB中的细胞在细胞表面上不表达大量或可检测量的人类白细胞抗原(HLA)II类、CD40、CD80或CD86。

14.如权利要求1所述的组合物，其中，所述水凝胶选自纤维蛋白胶、富血小板血浆(PRP)、I型胶原蛋白、壳聚糖、明胶、聚乙二醇二丙烯酸酯、透明质酸，以及纤维蛋白胶、PRP，I型胶原蛋白、壳聚糖、明胶、聚乙二醇二丙烯酸酯和透明质酸的任何组合。

15.如权利要求2所述的组合物，其中，所述生长因子是TGF-β超家族成员。

16.如权利要求2所述的组合物，其中，所述生长因子是选自如下的形态发生蛋白：OP-1、OP-2、OP-3、TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、TGF-β4、BMP-1、BMP-2、BMP-3、BMP-4、BMP-5、BMP-6、BMP-8、BMP-9、BMP-10、BMP-11、BMP-12、BMP-13、BMP-15、BMP-16、BMP-17、BMP-18、DPP、Vg1、Vgr-1、60A蛋白、GDF-1、GDF-2、GDF-3、GDF-5、GDF-6、GDF-7、GDF-8、GDF-9、GDF-10、GDF-11、GDF-12、CDMP-1、CDMP-2、CDMP-3、NODAL、UNIVIN、SCREW、ADMP、NEURAL。

17.如权利要求1-16中任一项所述的组合物，其中，所述组合物还包含胰岛素、转铁蛋白，人血清白蛋白、脯氨酸、牛血清白蛋白、硒酸、亚油酸、地塞米松和抗坏血酸中的一种以上。

18.如权利要求1所述的组合物，其中，所述CMB以单细胞悬浮。

19.如权利要求1所述的组合物，其中，所述CMB的尺寸是均匀的或不均匀的。

20.如权利要求1所述的组合物，其中，所述组合物是可注射的。

21.一种治疗患者的结缔组织缺陷的方法，包括将权利要求1-20中任一项所述的组合物施用于所述结缔组织或所述结缔组织周围区域。

22.一种在患者中预防软骨退变或治疗软骨损伤、软骨退行性疾病或软骨病症的方法，包括将权利要求1-20中任一项所述的组合物施用于软骨或软骨周围区域。

23.如权利要求22所述的方法，其中，所述软骨是关节软骨。

24.如权利要求22所述的方法，其中，所述软骨是非关节软骨。

25.如权利要求24所述的方法，其中，所述软骨选自鼻软骨、耳软骨、气管支气管软骨、肋软骨、半月板和椎间盘。

26.如权利要求21-25中任一项所述的方法，其中，所述方法有效地在软骨缺陷、软骨退变、软骨损伤、软骨退行性疾病或软骨病症的部位形成包含1-20％(w/w)糖胺聚糖(GAG)的组织。

27.如权利要求21-25中任一项所述的方法，其中，所述方法有效地在软骨缺陷、软骨退变、软骨损伤、软骨退行性疾病或软骨病症的部位形成包含至少0.5％(w/w)胶原蛋白的组织。

28.如权利要求21-27中任一项所述的方法，其中，所述方法有效地在软骨缺陷、软骨退变、软骨损伤、软骨退行性疾病或软骨病症的部位形成具有至少100kPa的杨氏模量和至多0.8的摩擦系数的软骨。

29.如权利要求21-28中任一项所述的方法，其中，所述方法有效地在软骨缺陷、软骨退变、软骨损伤、软骨退行性疾病或软骨病症的部位形成软骨，并且所述软骨在所述部位处或所述部位周围与任何邻近软骨和软骨下骨组织整合。

30.一种使用权利要求1-20中任一项所述的组合物在体外或体内形成软骨组织的方法。

31.一种治疗患者的撕裂或断裂的结缔组织的方法，包括将权利要求1-20中任一项所述的组合物施用于撕裂或断裂的结缔组织或撕裂或断裂的结缔组织周围区域。

32.如权利要求31所述的方法，其中，所述结缔组织是韧带、肌腱或半月板。

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