CN111454901B - 一种脂肪干细胞诱导分化成软骨细胞的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种脂肪干细胞诱导分化成软骨细胞的方法，所述方法，包括制备脂肪干细胞‑海藻酸钠悬液、制备脂肪干细胞‑海藻酸钙微珠、诱导培养。本发明所述脂肪干细胞诱导分化成软骨细胞的方法，利用含有PRP和转化生长因子‑β超家族成员(TGF‑β1、IGF‑1、BMP‑6)的不完全成软骨诱导培养液，联合使用PRP、转化生长因子‑β超家族成员，具有协同作用，能够上调Sox‑9基因表达，抑制诱导后脂肪干细胞向肥大表型分化，促进细胞增殖及提高诱导分化效率。采用本发明所述方法诱导分化13‑15天得到的软骨细胞的增殖活力是对照组A的3.4倍，是实验组B的2.2倍，是实验组C的1.95倍。

Description

一种脂肪干细胞诱导分化成软骨细胞的方法
技术领域
本发明涉及一种脂肪干细胞诱导分化成软骨细胞的方法，属于干细胞技术领域。
背景技术
关节软骨缺损引起的病变在临床上较为常见，软骨创伤极难修复，因为软骨组织中没有血管和神经，其特点决定软骨不可再生。传统的治疗方法如关节冲洗、微裂缝、镶嵌成形术等，短期内可改善患者的临床症状，长期疗效不理想；关节假体置换可消除关节疼痛并恢复功能，但价格昂贵且并发症多；自体或异体软骨细胞提取困难，细胞数量少，增殖能力有限，限制了其临床应用，而软骨组织工程的发展为解决这些难题提供了新的方法。
软骨组织工程是将种子细胞接种到合适的生物支架材料形成复合物，在体外诱导后或者直接植入关节软骨缺损处，实现组织结构和功能的再生。种子细胞选择是修复或替换受损组织的关键。至今研究较多的是间充质干细胞，特别是骨髓间充质干细胞(BMSCs)是常用的种子细胞，但BMSCs需要从骨腔中取材，提取难度大，细胞来源有限，向成骨细胞分化效率低，其广泛应用受到一定的限制。Zuk（2001年）等从吸脂术获取的人类脂肪组织中首次分离得到了脂肪源干细胞(adipose derived mesenchymal cells，ASCs)。相比较于BMSCs，ASCs具有不受伦理限制、取材方便、来源充足、免疫原性低且增殖修复能力强等诸多优势，不同条件下可诱导分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、表皮细胞等。因此，ASCs有望成为软骨组织工程最理想的种子细胞来源。
随着对ASCs研究的不断深入，人们一直在寻找ASCs诱导分化成软骨细胞的生物支架材料。目前常用的支架材料包括人工合成高分子聚合物和天然材料两大类，研究表明采用高分子合成材料构建的纤维网状骨架，具有促进ASCs向软骨细胞方向分化的作用，但是这些高分子材料生物相容性差，降解较慢，植入关节处会引起炎症反应。近期，有学者提出采用天然纤维胶水材料或海藻酸钙凝胶等一些天然材料作为支架材料，生物相容性好、安全性高、可塑性强、体内可降解，研究表明这种材料可以促进ASCs吸附于骨架表面，并且诱导ASCs分化成软骨细胞。亦有研究表明，不使用支架材料，直接往关节腔内注射ASCs，但细胞体外扩增培养以及将修复组织整合存在一定的难度。
脂肪干细胞成软骨分化多采用高密度三维培养方法，包括微球法、微滴法和支架法。微球法即利用ADSCs在特定培养条件自发形成小聚集体的特点，将ADSCs离心于离心管管底，形成细胞微球，加入诱导培养基成软骨细胞诱导，可以形成一定的软骨组织，但数量很少。微滴法即在培养基中调整细胞在较高密度，以高密度细胞滴的形式培养在孔板中，使其在37 ℃下黏附2 h，待细胞贴壁微滴较为稳固时加入软骨诱导培养基诱导培养，此种方法可以将脂肪干细胞诱导成为软骨细胞。支架法即将细胞高密度混悬于天然提取或人工合成的生物材料支架中，置于软骨诱导培养基中进行体外三维培养，将脂肪干细胞诱导成为软骨细胞，生物材料的选择是关键。
微球法和微滴法培养脂肪干细胞诱导分化成软骨，虽然简单方便，不需要特定的生物材料，但在培养过程中细胞聚集生长，易出现营养不足的缺陷，导致细胞增殖慢和向成骨细胞分化效率低，得到的软骨细胞数量很少，无法大规模应用于临床治疗；其次，软骨诱导培养基的选择是能否成功诱导成软骨的关键，现有的微球法、微滴法及支架法，多采用单一因子成软骨诱导培养基培养脂肪干细胞，在上调软骨特异性细胞外基质表达的同时，也上调了Runx2等软骨肥大标志物的表达，使形成的新生软骨被成骨细胞取代，软骨细胞的标记性基因的表达降低，且细胞增殖能力弱。
综上所述，有必要寻求最合适的种子细胞和生物支架材料诱导ASCs分化成软骨细胞，从而推动软骨组织工程技术应用于临床治疗中。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明提供一种脂肪干细胞诱导分化成软骨细胞的方法，实现以下发明目的：
（1）上调软骨细胞的标记性基因的表达量，提高分化效率。
（2）提高脂肪干细胞的增殖能力。
为解决上述技术问题，本发明采取以下技术方案：
一种脂肪干细胞诱导分化成软骨细胞的方法，所述方法，包括制备脂肪干细胞-海藻酸钠悬液、制备脂肪干细胞-海藻酸钙微珠、诱导培养。
所述诱导培养，将脂肪干细胞-海藻酸钙微珠加入培养液中进行诱导培养，脂肪干细胞-海藻酸钙微珠的浓度为8×105-1×106个/ml，诱导培养时间为13-15d。
所述培养液为含PRP 、BMP-6、TGF-β1、IGF-1的不完全成软骨诱导培养液。
所述培养液中，PRP的体积浓度为9-11%；所述BMP-6的终浓度为480-520μg/L，所述TGF-β1的终浓度为9-11μg/L，所述IGF-1的终浓度为95-105μg/L。
所述不完全成软骨诱导培养液为含6-6.5μg/L胰岛素、48-52nM L-抗坏血酸、95-105nM地塞米松、青霉素98-102U/mL，链霉素为98-102μg/mL、9-11%FBS的高糖DMEM培养基。
所述制备脂肪干细胞-海藻酸钠悬液，将P3-P4代的脂肪干细胞，贴壁培养至瓶底的80-90%，加入胰蛋白酶消化液制备ADSCs悬液，细胞浓度为4.2-4.8×106个/ml，然后加入1-1.4 %的海藻酸钠溶液，混合均匀，制备细胞浓度为5.6-6.4×106个/ml的脂肪干细胞-海藻酸钠悬液。
所述制备脂肪干细胞-海藻酸钙微珠，脂肪干细胞-海藻酸钠悬液滴入预热到36.5-37.5℃的过量的无菌CaCl2 溶液中，形成直径4-5mm脂肪干细胞-海藻酸钙微珠，每个微珠约含有274800-275200个细胞；所述CaCl2 溶液的浓度为100-105mM。
所述海藻酸钠溶液的温度为36.5-37.5℃。
所述胰蛋白酶消化液的质量浓度为0.23-0.27%。
所述PRP的制备方法为：采集自体静脉血于采血管内，翻转10-20次，使抗凝剂与血液充分混匀，移到离心管中，离心，收集上层和中层部分，即富血小板血浆PRP；
所述离心，为1100-1300rpm，9-11min；
本发明提供的脂肪干细胞来源于自体吸脂废物，取材方便，来源丰富，可避免免疫排斥反应。
本发明提供了一种具有PRP和转化生长因子-β超家族成员(TGF-β1、IGF-1、BMP-6)的新型培养组合物，该组合物中各成分间具有协同作用，能够上调Sox-9表达（使细胞保持软骨形态），抑制诱导后脂肪干细胞向肥大表型分化，促进软骨细胞增殖及增强分化效率。
本发明提供了一种利用藻酸盐凝胶载体进行三维培养和包装细胞的方法，藻酸盐凝胶载体为脂肪干细胞提供立体生长的环境，生物相容性好，可降解，有利于细胞附着、增殖和分化，解决细胞生长过程中营养不足、细胞形态改变的问题。
与现有技术相比，本发明取得以下有益效果：
（1）本发明所述脂肪干细胞诱导分化成软骨细胞的方法，利用含有PRP和转化生长因子-β超家族成员(TGF-β1、IGF-1、BMP-6)的不完全成软骨诱导培养液，联合使用PRP、转化生长因子-β超家族成员，具有协同作用，能够上调Sox-9基因表达，抑制诱导后脂肪干细胞向肥大表型分化，促进细胞增殖及提高诱导分化效率。
（2）采用本发明所述方法诱导分化13-15天得到的软骨细胞的增殖活力是对照组A的 3.4倍，是实验组B的2.2倍，是实验组C的1.95倍。
（3）本发明诱导分化成软骨的SOX9、COL2A1、COL10A1和 ACAN基因表达均上调，诱导第14天，本发明方法诱导分化的软骨细胞的标记基因ACAN基因的相对表达量是实验组B的2.7倍，是实验组C的2.4倍；本发明方法诱导分化的软骨细胞的标记基因SOX9基因的相对表达量是实验组B的3.2倍，是实验组C的2.8倍；本发明方法诱导分化的软骨细胞的标记基因COL2A1基因的相对表达量是实验组B的1.9倍，是实验组C的1.8倍；本发明方法诱导分化的软骨细胞的标记基因COL10A1基因的相对表达量是实验组B的1.75倍，是实验组C的1.6倍；
采用本发明所述方法诱导分化13-15天的软骨细胞的软骨标志基因SOX9、COL2A1、COL10A1和 ACAN的表达量是对照组的4-10倍。
（4）本发明所述方法诱导分化13-15天的软骨细胞，纯度为92%以上。
（5）本发明提供了一种利用藻酸盐凝胶载体进行三维培养和包装细胞的方法，相比较于微球法和微滴法，藻酸盐凝胶载体为脂肪干细胞提供三维生长的环境，可使细胞获得充足的营养，有利于细胞增殖和分化，生物相容性好，可降解，延长细胞存活时间，维持细胞形态。本发明提供的脂肪干细胞诱导成软骨细胞来源于自体吸脂废物，可避免免疫排斥反应。
附图说明
图1 倒置显微镜下观察脂肪干细胞图；
图2流式细胞术检测脂肪干细胞标志物CD29表达率的流式图；
图3为流式细胞术检测脂肪干细胞标志物CD4表达率的流式图；
图4为流式细胞术检测脂肪干细胞标志物CD105表达率的流式图；
图5为流式细胞术检测脂肪干细胞标志物CD90表达率的流式图；
图6为流式细胞术检测脂肪干细胞标志物CD34表达率的流式图；
图7为流式细胞术检测脂肪干细胞标志物HLA-DR表达率的流式图；
图8 为MTT检测OD值图；
图9 成软骨诱导分化过程中ACAN的相对表达量柱状图；
图10 成软骨诱导分化过程SOX9的相对表达量柱状图；
图11 成软骨诱导分化过程COL2A1的相对表达量柱状图；
图12成软骨诱导分化过程COL10A1的相对表达量柱状图。
具体实施方式
实施例1：脂肪干细胞的培养及传代
1)从志愿者腹部抽取脂肪组织，无菌条件下用PBS液清洗3遍，洗去红细胞，手术刀剪碎至细小颗粒；
2)加入2倍于脂肪组织体积的0.1% 的胶原酶溶液，于 37 ℃条件下振荡2-3h，进行消化；
3)振荡消化后收集液体，1500rpm/10min，弃上清，沉淀用含10% FBS的低糖DMEM培养基重悬；
4)200目细筛过滤，过滤掉悬浮细胞液的残余的组织杂质，滤液置于离心管；
5)1500rpm/10min，弃上清，沉淀用含10% FBS的低糖DMEM培养基重悬，置于37℃、5% CO2培养箱中培养，此为原代细胞，5天后，首次换液；
6)当原代细胞融合度为80%时，消化传代，之后，3天换一次液，传至P3代用于后续试验，光学显微镜下观察细胞生长及形态（见图1）；
7)将P3代人脂肪干细胞计数后，置于流式管中，分别加入抗小鼠抗人单克隆抗体：CD29、CD34、CD44、 CD105、CD105和HLA⁃DR，4℃避光孵育30min。PBS洗涤两遍，1000 rpm/3min，使用流式细胞仪进行检测分析，当CD29、、CD44、 CD105和CD90表达率高达98%以上，CD34和HLA⁃DR表达率不足1%时，即鉴定为脂肪干细胞。
实施例2：脂肪干细胞向软骨细胞诱导分化
（1）预热
将1.2%的海藻酸钠溶液（用0.9% NaCl制备的海藻酸盐悬液）及氯化钙溶液预热至37℃。
（2）制备脂肪干细胞-海藻酸钠悬液
T175的瓶子中培养至P3代的脂肪干细胞（ADSCs），长满瓶底约90%，用PBS溶液冲洗细胞3遍，加入2-3ml 0.25％胰蛋白酶消化液制备ADSCs悬液，细胞浓度为4.5×106个/ml；
将ADSCs悬液按3:1体积比与1.2%的海藻酸钠溶液充分混匀，制成细胞浓度为6.0×106个/ml的脂肪干细胞-海藻酸钠悬液，用移液器轻轻吹打，防止产生气泡。
（3）制备脂肪干细胞-海藻酸钙微珠
用移液器将脂肪干细胞-海藻酸钠悬液滴入预热到37℃的过量的无菌CaCl2 溶液中，形成直径4-5mm脂肪干细胞-海藻酸钙微珠，每个微珠约含有275000个细胞。
所述CaCl2 溶液的浓度为102mM。
（4）加入诱导培养液
用不完全成软骨诱导培养液洗涤脂肪干细胞-海藻酸钙微珠2次，加到24孔细胞培养板中，将脂肪干细胞-海藻酸钙微珠分为4组，分别加入适量培养液（每8×105-1×106个细胞约需要lml培养液），置于37℃、5% CO2的培养箱中培养，每2天换液，连续培养2周进行检测。
培养液的添加如下：
对照组A：不完全成软骨诱导培养液（未加诱导剂）；
实验组B：不完全成软骨诱导培养液+PRP；
实验组C：不完全成软骨诱导培养液+BMP-6+TGF-β1+IGF-1；
实验组D：不完全成软骨诱导培养液+PRP + BMP-6+TGF-β1+IGF-1。
不完全成软骨诱导培养液配制：6.25μg/L胰岛素、50nM L-抗坏血酸、100nM地塞米松、青霉素100U/mL，链霉素为100μg/mL、10%FBS的高糖DMEM培养基。
上述10%的FBS是指FBS的体积百分比为10%；
上述诱导剂的终浓度分别为：BMP-6(500μg/L)、TGF-β1(10μg/L)、IGF-1(100μg/L)；富血小板血浆（PRP）体积浓度为：10%（采集10 ml的自体静脉血于采血管内，翻转10-20次，使抗凝剂与血液充分混匀，1200 rpm/10min，移到离心管中，收集上层和中层部分，即富血小板血浆）。
将上述对照组A、实验组B、实验组C、实验组D诱导的细胞，进行如下检测试验：
实施例3：MTT法检测细胞增殖活力
分别取上述四组第3d、7d、14d的脂肪干细胞-海藻酸钙微珠接种至96孔板，每孔加入100μl细胞悬液，细胞密度为5×104 个/m。每组3孔，同时设置空白对照组。
每孔加入10μl MTT溶液（5mg/ml），在37℃、5% CO2培养箱内继续孵育4h，小心弃去孔内上清，加入二甲基亚砜（DMSO）150μl，振荡10min，在酶联免疫检测仪OD490nm处测量各孔的吸光值。
根据MTT检测，在诱导后第3d、7d、14d，实验组B、C、D的OD值均显著高于对照A组，第14d，对照组A的OD值为0.26，实验组B的OD值为0.37，实验组C的OD值为0.42，实验组D测得OD值最高，为0.82，实验组D的OD值是对照组A的3.4倍，是实验组B的2.2倍，是实验组C的1.95倍。表明PRP和转化生长因子-β超家族成员（BMP-6、TGF-β1、IGF-1）组合物共培养的脂肪干细胞增殖能力最强，PRP和转化生长因子-β超家族成员具有协同增效作用。
实施例4：甲苯胺染色鉴定
采用甲苯胺蓝染色法鉴定ADSC诱导成软骨分化情况。具体步骤如下：
1)将诱导培养14d后的4组脂肪干细胞-海藻酸钙微珠取出爬片，用40g/L多聚甲醛常温固定1h，再用蒸馏水冲洗15min；
2)加入1%甲苯胺蓝室温染色3min；
3)水洗；
4)用95%乙醇脱色，再用蒸馏水清洗至无色；
5)二甲苯进行透明和脱脂，中性树胶封固。倒置显微镜下观察。
结果表明，对照组A未诱导，甲苯胺染色呈阴性，细胞几乎失去染色。实验组B、C、D组，甲苯胺蓝染色均呈阳性，其中，B组和C组细胞染色较淡，染色细胞少；实验组D组，阳性程度较高，细胞数量较B组和C组多，细胞核呈深蓝色，胞质呈蓝紫色，细胞内及周围有异染颗粒出现。说明细胞分泌蛋白多糖，PRP和转化生长因子-β超家族成员各组分（BMP-6、TGF-β1、IGF-1）具有诱导脂肪干细胞分化为软骨细胞的能力，联合应用诱导脂肪干细胞向软骨细胞分化优于两类因子单独应用，PRP和转化生长因子-β超家族成员协同，具有促进软骨细胞分化的能力。
实施例5：细胞免疫组织化学染色
采用Ⅱ型胶原免疫组织化学法鉴定ADSC诱导成软骨细胞分化情况。具体操作步骤如下：
1)取诱导14d后的细胞爬片，10%福尔马林固定60min；
2)95%酒精固定15min，PBS冲洗5min后吹干；
3)加鼠抗兔Ⅱ型胶原一抗(1∶300)，37℃孵育2h；
4)PBS冲洗5min，加入二抗(1∶300)，37℃孵育50min；
5)PBS冲洗两次，加入DAB显色液进行染色；
6)加入苏木紫染色复染3s，中性树胶封片，观察Ⅱ型胶原表达。
立体培养诱导脂肪干细胞成软骨细胞14d后免疫组化染色显示：对照组A，未见阳性染色，实验组B和实验组C细胞质和细胞膜呈淡黄色，为弱阳性着色，实验组D呈棕黄色，为强阳性着色。结果表明，PRP联合转化生长因子-β超家族成员各组分（BMP-6、TGF-β1、IGF-1）诱导成软骨细胞能力更强。
实施例6：qRT-PCR检测诱导软骨细胞相关基因的相对表达量分析
诱导培养脂肪干细胞成软骨细胞第3d、7d、14d时，分别取对照组A、实验组B、实验组C、实验组D细胞各3孔，去培养基，PBS清洗2次，按照TRIZOL试剂说明书提取细胞的总RNA，分光光度计测RNA的浓度和纯度。以Oligo Dt为引物，按逆转录试剂盒说明书操作合成cDNA，以GADPH为内参，实时荧光定量PCR检测软骨标志基因ACAN、SOX9、COL2A1、COL10A1的表达水平，引物序列见表1。
实时荧光定量PCR反应条件为：95℃预变性3min；95℃变性20s，58℃退火30s，72℃延伸30s；重复40个循环。根据2–ΔΔCt法计算样品中检测基因相对于内参基因的相对表达量，具体算法为：相对表达量=2–(Ct检测基因–Ct内参基因)。诱导组相对于对照组表达量的倍数=诱导组相对表达量/对照组相对表达量。
表1 成软骨基因荧光定量PCR引物序列
Figure 101818DEST_PATH_IMAGE001
结果表明，SOX9、COL2A1和 COL10A1的相对表达量随着时间增加而增加，诱导分化第14时细胞基因表达水平方面均高于第3天的细胞；ACAN的相对表达量第7d时表达量达到最高，7d后表达量随之降低，差异具有统计学意义（P<0.05）。诱导分化成软骨的SOX9、COL2A1、COL10A1和 ACAN基因表达均上调，实验组D各基因的表达量均显著高于实验组B和实验组C，第14天，实验组D的ACAN基因的相对表达量是实验组B的2.7倍，是实验组C的2.4倍；实验组D的SOX9基因的相对表达量是实验组B的3.2倍，是实验组C的2.8倍；实验组D的COL2A1基因的相对表达量是实验组B的1.9倍，是实验组C的1.8倍；实验组D的COL10A1基因的相对表达量是实验组B的1.75倍，是实验组C的1.6倍，表明脂肪干细胞成功诱导分化成软骨细胞，且PRP联合BMP-6、TGF-β1、IGF-1诱导成软骨能力更强。本发明培养14天即可得到所需的软骨细胞。
本发明实验组B、实验组C、实验组D诱导的软骨细胞的纯度分别为：42%、45%、92%。
除非特殊说明，本发明采用的比例均为质量比例，采用的百分比均为质量百分比。

Claims (5)

1.一种脂肪干细胞诱导分化成软骨细胞的方法，其特征在于：所述方法，包括制备脂肪干细胞-海藻酸钠悬液、制备脂肪干细胞-海藻酸钙微珠、诱导培养；所述诱导培养，将脂肪干细胞-海藻酸钙微珠加入培养液中进行诱导培养，脂肪干细胞-海藻酸钙微珠的浓度为8×105-1×106个/ml，诱导培养时间为13-15d；
所述培养液为含PRP 、BMP-6、TGF-β1、IGF-1的不完全成软骨诱导培养液；
所述培养液中，PRP的体积浓度为9-11%；所述BMP-6的终浓度为480-520μg/L，所述TGF-β1的终浓度为9-11μg/L，所述IGF-1的终浓度为95-105μg/L。
2.根据权利要求1所述的一种脂肪干细胞诱导分化成软骨细胞的方法，其特征在于：所述不完全成软骨诱导培养液为含6-6.5μg/L胰岛素、48-52nM L-抗坏血酸、95-105nM地塞米松、青霉素98-102U/mL，链霉素为98-102μg/mL、9-11%FBS的高糖DMEM培养基。
3.根据权利要求1所述的一种脂肪干细胞诱导分化成软骨细胞的方法，其特征在于：所述制备脂肪干细胞-海藻酸钠悬液，将P3-P4代的脂肪干细胞，贴壁培养至瓶底的80-90%，加入胰蛋白酶消化液制备ADSCs悬液，细胞浓度为4.2-4.8×106个/ml，然后加入1-1.4 %的海藻酸钠溶液，混合均匀，制备细胞浓度为5.6-6.4×106个/ml的脂肪干细胞-海藻酸钠悬液。
4.根据权利要求1所述的一种脂肪干细胞诱导分化成软骨细胞的方法，其特征在于：所述制备脂肪干细胞-海藻酸钙微珠，脂肪干细胞-海藻酸钠悬液滴入预热到36.5-37.5℃的过量的无菌CaCl2 溶液中，形成直径4-5mm脂肪干细胞-海藻酸钙微珠，每个微珠含有274800-275200个细胞；所述CaCl2 溶液的浓度为100-105mM。
5.根据权利要求3所述的一种脂肪干细胞诱导分化成软骨细胞的方法，其特征在于：所述海藻酸钠溶液的温度为36.5-37.5℃。
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