CN111849876A - 诱导培养基及用于治疗关节炎的成软骨细胞的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种诱导培养基及用于治疗关节炎的成软骨细胞的制备方法，包括5‑6.25ug/ml人胰岛素、8‑10ng/ml转化生长因子‑β、40‑50nM维生素C磷酸酯、1‑2％的抗菌素，上述的百分数为质量百分数；用于治疗关节炎的成软骨细胞的制备方法，包括如下步骤：S1，将自体脂肪干细胞培养至3‑5代；S2，将S1中的自体脂肪干细胞采用权利要求1所述的诱导培养基诱导培养7‑14天，获得成软骨前体细胞，将成软骨前体细胞消化、制备成细胞悬液，细胞悬液注入自体关节腔内，获得成软骨细胞。本发明的制备方法在体外将自体脂肪干细胞分化为成软骨细胞，之后注入关节腔，避免直接将脂肪干细胞注入关节腔，带来脂肪干细胞分化的不明确性，同时保证了治疗用细胞的活力。

Description

诱导培养基及用于治疗关节炎的成软骨细胞的制备方法
技术领域
本发明涉及细胞生物学技术领域，特别是涉及一种诱导培养基及采用该诱导培养基将脂肪干细胞诱导分化为用于治疗关节炎的成软骨细胞的制备方法。
背景技术
关节炎(OA)是一种涉及软骨退行性变和继发性骨质增生为特征的慢性疾病。根据发病机理不同可分为骨性关节炎和风湿性关节炎两种。关节炎临床症状主要表现为关节疼痛、肿胀、僵硬和关节活动范围变小，情况严重还会导致抑郁、无助等心理性疾病。目前，对骨性关节炎的治疗主要通过康复训练、药物治疗、手术治疗等，来减轻疼痛、矫正畸形、恢复关节功能。康复训练包括有氧锻炼、肌肉训练、体重控制、辅助支具等，对于早期的关节炎患者，可通过康复训练来阻滞关节炎的加重；药物治疗包括对乙酰氨基酚、美洛昔康、塞来西部药物，药物治疗可以缓解关节炎患者的疼痛，但长期用药，对人体的其他器官副作用较大，造成严重损害；手术治疗包括全膝关节置换手术和关节清创术，手术治疗可以缓解患者的疼痛，但持续时间较短，部分患者还要进行二次手术。
骨髓间充质干细胞(bone mesenchymal stem cells，BMSC)可以有效地治疗关节炎，但是骨髓组织会随着年龄的增长而逐渐减少，可获取的间充质干细胞随之减少，更糟糕的是细胞的分化能力也会下降。为解决这一问题，科学家尝试将滑膜间充质干细胞(Synovial mesenchymal stem cells，SMSC)用于骨性关节炎的治疗，滑膜间充质干细胞相比于骨髓干细胞有更高的成软骨特性且不受年龄的限制，但是滑膜间充质干细胞在组织中的数量较少，无法大量获得。
脂肪间充质干细胞(ADSCs)，具有抗氧化和免疫调节耐受等作用。通过体内和体外实验，证明ADSCs能作用于T细胞、B细胞等免疫细胞，从而抑制TNF-α等炎症因子的表达。ADSCs还具有强大的多向分化的能力，给与不同的处理条件，其可以分化为软骨细胞、成骨细胞、脂肪细胞、神经元细胞、心肌细胞等。Kuroda K用脂肪间充质干细胞(ADSCs)治疗骨性关节炎取得较好的治疗效果。
透明质酸钠是关节腔液的主要成分，Chen等将透明质酸钠加入到ADSCs培养液中发现其不仅能够促进细胞增殖还可以提高ADSCs向软骨细胞分化的能力。但关节腔液是个动态、多因子的环境，多种因素均会影响到脂肪干细胞向软骨细胞的分化，注入关节腔的ADSCs能否分化为软骨细胞还是个科学问题。
研究脂肪干细胞分化为软骨细胞的体外体内调控路径将有助于提高脂肪干细胞向软骨细胞的分化效率。目前，脂肪干细胞体外分化为软骨细胞的方法有外源性因子诱导液培养法、软骨细胞共培养法、外源基因修饰法及透明质酸法等。TGF-β信号通路在脂肪干细胞向软骨细胞分化中起着关键性的作用，其可以磷酸化激活素受体激酶5，进而激活Smad信号通路，最终诱导脂肪干细胞向软骨细胞分化。同时TGF-β还会能阻止软骨下骨的重建进而延缓关节的病变。Ruszymah等发现10ngTGF-β3联合10ngBMP-6相比于单个因子的作用，更能提高脂肪干细胞向软骨细胞的分化效果。Meretojia等在体外将ADSCs与软骨细胞共培养，发现软骨细胞可以通过向生体性效应诱导ADSCs向软骨细胞的分化。脂肪干细胞可以在多种因素下被诱导分化为软骨细胞，且与其他干细胞相比，脂肪干细胞具有更好的定向软骨细胞分化的潜能，成为治疗骨性关节炎的首选种子细胞。ADSCs在体外能够被特异性诱导成为软骨细胞，在体内是否能够借助关节腔微环境分化为功能性的软骨细胞仍然是个难题。将脂肪干细胞直接注入关节腔内，未有报道检测到细胞替代，其治疗效果仅显示旁分泌的作用，无法从根本上治愈关节炎。
发明内容
为了解决目前处理方法无法将脂肪干细胞分化的软骨细胞，替代退化软骨细胞的问题，本发明的目的是提供一种诱导培养基，另外，本发明还提供了采用该诱导培养基将脂肪干细胞分化为用于治疗关节炎的成软骨细胞的制备方法。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明的第一方面，提供一种诱导培养基，包括5-6.25ug/ml人胰岛素、8-10ng/ml转化生长因子-β、40-50nM维生素C磷酸酯、1-2％的抗菌素，上述的百分数为质量百分数。
本发明的第二方面，提供一种用于治疗关节炎的成软骨细胞的制备方法，包括如下步骤：
S1，将自体脂肪干细胞培养至3-5代；
S2，将S1中的自体脂肪干细胞采用权利要求1所述的诱导培养基诱导培养7-14天，获得成软骨前体细胞，将成软骨前体细胞消化、制备成细胞悬液，细胞悬液注入自体关节腔内，获得成软骨细胞。
其中，所述S2中注入关节腔的细胞悬液为200uL，细胞数量为107个。
本发明的第三方面，提供采用上述的制备方法获得的成软骨细胞。
与现有技术相比，本发明实现的有益效果：本发明的制备方法在体外将自体脂肪干细胞预分化成软骨前体细胞，之后注入关节腔内，在关节腔液的驱使下软骨前体细胞取代受损的软骨细胞，具有明显的关节炎治疗效果；本发明的制备方法在体外将自体脂肪干细胞分化为成软骨细胞，之后注入关节腔，避免直接将脂肪干细胞注入关节腔，带来脂肪干细胞分化的不确定性，同时保证了治疗用细胞的活力。
附图说明
以下结合附图和具体实施方式来进一步详细说明本发明：
图1为人脂肪干细胞分化成脂肪细胞、成骨细胞、成软骨细胞及神经元细胞的结果图；
图2为脂肪干细胞、脂肪干细胞分化的成软骨细胞治疗关节炎的效果图；
图3为脂肪干细胞、脂肪干细胞分化的成软骨细胞注入关节腔液的免疫因子；
图4为脂肪干细胞、脂肪干细胞分化的成软骨细胞对关节炎软骨的修复效果图。
具体实施方式
以下由特定的具体实施例说明本发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点及功效。
市面上售卖有诱导成人脂肪间充质干细胞分化为软骨细胞的培养基，包括地塞米松、抗坏血酸、ITS、丙酮酸钠、脯氨酸、TGF-β3。
市面上售卖有人滑膜间充质干细胞分化为软骨细胞的培养基，包括地塞米松、抗坏血酸、ITS、丙酮酸钠、脯氨酸、TGF-β3、阿利辛蓝染液。
上述的培养基成分较多，添加工序较复杂。研发人员经过反复地研究和实验发现，选用不同于市面上售卖的培养基成分，将人胰岛素、转化生长因子-β、维生素C磷酸酯、抗菌素配合使用，可以将脂肪干细胞诱导分化为成软骨细胞，相对于市面售卖的培养基，培养基成分种类减少，且诱导效率更高。
诱导培养基，包括5-6.25ug/ml人胰岛素、8-10ng/ml转化生长因子-β、40-50nM维生素C磷酸酯、1-2％的抗菌素，上述的百分数为质量百分数。
一种用于治疗关节炎的成软骨细胞的制备方法，包括如下步骤：
S1，将自体脂肪干细胞培养至3-5代；
S2，将S1中的自体脂肪干细胞采用上述的诱导培养基诱导培养7-14天，获得成软骨前体细胞，将成软骨前体细胞消化、制备成细胞悬液，细胞悬液注入自体关节腔内，获得成软骨细胞。
其中，所述S2中注入关节腔的细胞悬液为200uL，细胞数量为107个。
实施例1
诱导培养基，包括6.25ug/ml人胰岛素、10ng/ml转化生长因子-β、50nM维生素C磷酸酯、1％的抗菌素，上述的百分数为质量百分数。
脂肪干细胞预分化的成软骨细胞的制备方法，包括如下步骤：
S1，将自体脂肪干细胞培养至3-5代；
S2，将S1中的自体脂肪干细胞采用上述的诱导培养基诱导培养7天，获得成软骨前体细胞，将成软骨前体细胞消化、制备成细胞悬液，以备用。
实施例2
诱导培养基，包括5ug/ml人胰岛素、8ng/ml转化生长因子-β、40nM维生素C磷酸酯、2％的抗菌素，上述的百分数为质量百分数。
脂肪干细胞预分化的成软骨细胞的制备方法，包括如下步骤：
S1，将自体脂肪干细胞培养至3-5代；
S2，将S1中的自体脂肪干细胞采用上述的诱导培养基诱导培养12天，获得成软骨前体细胞，将成软骨前体细胞消化、制备成细胞悬液，以备用。
实施例3
诱导培养基，包括6ug/ml人胰岛素、9ng/ml转化生长因子-β、45nM维生素C磷酸酯、1.5％的抗菌素，上述的百分数为质量百分数。脂肪干细胞预分化的成软骨细胞的制备方法，包括如下步骤：
S1，将自体脂肪干细胞培养至3-5代；
S2，将S1中的自体脂肪干细胞采用上述的诱导培养基诱导培养14天，获得成软骨前体细胞，将成软骨前体细胞消化、制备成细胞悬液，以备用。
一、脂肪干细胞的分化性能
将分离培养过处在第三代至第五代(P3-P5)的脂肪干细胞，培养24h后，吸取原来的培养基，用PBS洗两次，分别换上成脂肪细胞、成骨细胞、成软骨细胞和成神经元细胞的诱导培养基，隔天换液，14天后固定并分别进行相应染色，结果如图1，其中成软骨细胞的诱导培养基为实施例1中的培养基。
如图1，hADSC-Oil Red O指人源脂肪干细胞油红染色，HE指苏木精染色，hADSC-Adipocytes指人源脂肪干细胞-成脂肪细胞，hADSC-Alizarin指人源脂肪干细胞茜素红染色，hADSC-Osteoblast指人源脂肪干细胞-成骨细胞，hADSC-Alcian指人源脂肪干细胞阿利辛蓝染色，hADSC-Chondrocytes指人源脂肪干细胞-成软骨细胞，hADSC-Tujl指人源脂肪干细胞Tuj1抗体染色，hADSC-Neuron指人源脂肪干细胞-成神经元细胞。
图1表明本发明的脂肪干细胞能够在一定的诱导条件下分别分化为脂肪细胞、成骨细胞、成软骨细胞及神经细胞，具有多向分化能力；而在成软骨细胞的诱导分化方面，85％以上的细胞都出现了聚集并形成软骨样的克隆，说明该诱导培养基具有较高的诱导效率。
二、大鼠骨关节炎模型(OA模型)的建立
用2％的水合氯醛将SD大鼠施行麻醉处理，然后用脱毛剂将大鼠右腿膝关节处的毛脱掉，以防感染并方便手术操作。切开皮，分离皮下组织，分离脂肪垫，注意止血。暴露关节面及内侧半月板，切掉内侧半月板并剪断前后交叉韧带。缝合皮下结缔组织及皮肤后静置大鼠待其苏醒。
三、治疗效果验证实验
1、脂肪干细胞治疗组、脂肪干细胞预分化的成软骨细胞治疗组、PBS阴性对照组的实验结果比较
随机挑选成功制备骨关节炎模型的大鼠9只，每3只为一组，分成3组，分别为A、B、C，A组注入脂肪干细胞用于治疗骨关节炎，B组注入实施例1制备的预分化的成软骨细胞用于治疗骨关节炎，C组注入相同量的PBS为阴性对照组，结果如图2，注入量均为200uL，细胞数量为107个。
如图2，右侧(Right)为患有骨关节炎的一侧，左侧(Left)为正常侧，图示为半月板。OA-hADSC组为脂肪干细胞治疗组，OA-hADSC-Chon为脂肪干细胞预分化的成软骨细胞治疗组，OA-PBS为注入PBS的阴性对照组。
细胞治疗两个月后进行小动物CT检测，检测结果如图2。由图2可知，脂肪干细胞治疗组和脂肪干细胞分化为成软骨细胞治疗组较PBS阴性组相比，骨关节面修复显著，光滑，骨赘明显减少；另外，比较脂肪干细胞分化的软骨细胞治疗组和脂肪干细胞治疗组，发现脂肪干细胞分化的软骨细胞治疗组骨赘明显减少，说明脂肪干细胞分化的软骨细胞治疗组具有更好的治疗效果。
2、免疫因子调节机制的验证实验
CT检测结束后，牺牲大鼠，分别剖开两个关节，并向内注射500uL PBS后，混匀腔液后吸出腔液，低温保存后送至公司采用高通量方法进行浓度检测。
结果如图3，Sham为正常组，Sham-L为正常组左侧，Sham-R为正常组右侧，OA-90D-PBS表示OA模型制备成功30天后，注射PBS 60天后的关节腔的免疫因子；OA-90D-hADSC-Chon表示OA模型制备成功30天后，注射脂肪干细胞分化的软骨细胞60天后的关节腔的免疫因子。由图3可知，脂肪干细胞及分化的成软骨细胞能够显著降低炎症因子IL-1β、IL-18、IL-α的表达、单核细胞趋化因子MCP-1的表达(OA-D90-hADSC-Chon与OA-D90-PBS-R组相比较)，改善了关节腔微环境，有助于关节软骨的修复。
3、考察脂肪干细胞、脂肪干细胞预分化的成软骨细胞对关节炎软骨修复的影响
将B组和C组分别进行冰冻切片，切片后用胶原I和胶原II抗体免疫组化染色后追踪脂肪干细胞和脂肪干细胞来源分化的成软骨细胞对关节炎软骨的修复，结果如图4所示，绿色荧光标记的脂肪干细胞及分化的成软骨细胞能够分化为表达II型胶原。
绿色荧光的细胞为外源注射的脂肪干细胞或脂肪干细胞分化的软骨细胞，这些绿色荧光的细胞同时表达II型胶原，表明这些外源注射的细胞在体内能够向软骨细胞分化进而修复软骨，从而对关节炎具有治疗作用。
上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。

Claims (4)

1.一种诱导培养基，其特征在于，包括5-6.25ug/ml人胰岛素、8-10ng/ml转化生长因子-β、40-50nM维生素C磷酸酯、1-2％的抗菌素，上述的百分数为质量百分数。
2.一种用于治疗关节炎的成软骨细胞的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1，将自体脂肪干细胞培养至3-5代；
S2，将S1中的自体脂肪干细胞采用权利要求1所述的诱导培养基诱导培养7-14天，获得成软骨前体细胞，将成软骨前体细胞消化、制备成细胞悬液，细胞悬液注入自体关节腔内，获得成软骨细胞。
3.如权利要求2所述的用于治疗关节炎的成软骨细胞的制备方法，其特征在于，所述S2中注入关节腔的细胞悬液为200uL，细胞数量为107个。
4.采用权利要求2或3所述的制备方法获得的成软骨细胞。
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