CN102146359A

CN102146359A - 从胎盘中提取原始间充质干细胞及无血清扩增的方法

Info

Publication number: CN102146359A
Application number: CN 201110005964
Authority: CN
Inventors: 王泰华; 李荣荣; 陈立才; 孙涛
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2011-01-13
Filing date: 2011-01-13
Publication date: 2011-08-10

Abstract

本发明属于生物医学技术领域，特别公开了一种从胎盘中提取原始间充质干细胞及无血清扩增的方法。本发明利用早期流产胎儿胎盘组织提取更原始的人胎盘间充质干细胞，并建立了一种在胎盘间充质干细胞分离和体外扩增培养的体系。本发明使干细胞的遗传信息及表型更稳定，干细胞特性更原始，并且能有效地扩增细胞，提高产品质量，获得稳定均一的胎盘间充质干细胞，解决了干细胞治疗需要大批量干细胞的问题，可用于多种疾病的治疗。

Description

从胎盘中提取原始间充质干细胞及无血清扩增的方法

(一)技术领域

本发明属于生物医学技术领域，特别涉及一种从胎盘中提取原始间充质干细胞及无血清扩增的方法。

(二)背景技术

间充质干细胞最初在骨髓中发现，因其具有多向分化潜能、支持造血和促进干细胞植入、免疫调控和自我复制等特点而日益受到人们的关注。然而就目前已比较成熟的骨髓间充质干细胞而言，其含量非常低，仅占骨髓中单核细胞的1/10⁵～10⁶，并且采集骨髓给患者带来极大的痛苦，且随着年龄的增加，骨髓中间充质干细胞的数量、增殖和分化能力均显著下降，使其在研究和应用尤其是临床应用中受到限制。随着研究的发展已经从其它成体组织，包括脂肪、肌肉、神经、牙髓等提取出间充质干细胞，但取材和分离相对而言较为困难。并且这些细胞在取材的时候都会对患者造成创伤，因而不容易被患者接受；体外扩增条件也不容易控制、花费大。基于此，寻找一种采集无创伤、收获量大、免疫原性小、而又容易获得的干细胞来源更具有实际应用价值。

最新研究发现，胎盘组织中具有与骨髓间充质干细胞类似的贴壁细胞；同时目前用于胎盘间充质干细胞体外培养的体系主要采用的是含有一定比例(如10～20％等)胎牛血清的培养基(如低糖DMEM、高糖的DMEM、DMEM/F12，还有低血清培养基MesenPRO RS)进行贴壁培养扩增，但是这些培养体系由于添加了动物成分的胎牛血清，它含有补体成分，如果移植输注给患者时可能会导致患者的不良反应，并且存在短期内无法预见的危险。所以急待研究出一种无血清培养体系，既能有效地扩增细胞，又能提高产品质量，获得稳定均一的胎盘间充质干细胞。

(三)发明内容

本发明为了弥补现有技术的不足，提供了一种提高产品质量、有效扩增细胞的从胎盘中提取间充质干细胞及无血清扩增的方法。

本发明是通过如下技术方案实现的：

一种从胎盘中提取原始间充质干细胞的方法，以早期流产胎儿胎盘组织为原料，其特征在于：对新鲜流产胎盘立即进行放血，采用生理缓冲液清除胎盘组织和脐带外表的透明质粘液和母血污染；用生理缓冲液灌注，以去除血细胞和组织碎片；将胎盘小叶剪碎，用胶原酶消化，收集细胞成分，通过贴壁筛选法纯化间充质干细胞。

胎盘由羊膜、叶状绒毛膜和底蜕膜构成，是胎儿的附属物，为胎儿从母体获得养分及氧气并排出代谢废物，还有保护胎儿的作用。胎盘是一个暂时性器官，胚胎完成着床(妊娠第4周)后，羊膜腔形成，第9周胎盘开始出现，第10周胎盘雏形形成，并继续发育，一般在怀孕4～5个月就发育成熟了，随后渐渐进入它的生命后期，出现了生理性退行性改变，即老化现象，随着预产期的临近，老化现象日趋严重，表现为胎盘钙质沉着，成沙粒样改变，血管梗塞，纤维素沉着。当分娩结束以后，胎盘的作用也跟着结束了，在胎儿娩出后即完成了历史使命，通常都被遗弃处理。即胎盘也具有一个衰老的过程，其中的干细胞的数量和质量也随之降低，所以从早期流产胎儿的的胎盘组织更容易分离、扩增间充质干细胞，并且干细胞的遗传信息及表型将更稳定，干细胞特性更原始，为临床应用提供更好的保障。

本发明间充质干细胞的扩增方法为：采用流式细胞仪及体外诱导分化法鉴定所获得细胞群的表型和多能性，采用无血清培养体系扩增间充质干细胞。

鉴于间充质干细胞在细胞治疗及组织工程中的应用前景，其规模化、规范化培养、扩增及符合临床应用的安全性成为应用的关键。目前所报道的间充质干细胞体外培养条件及培养效率不尽相同，尚缺乏统一标准。因此建立人胎盘间充质干细胞简便、高效的培养体系十分必要。

本发明所述无血清培养体系为含有5ng/ml的碱性成纤维细胞生长因子、1mML一谷氨酰胺、0.1mMβ-琉基乙醇、1％非必需氨基酸和0.5μg/ml庆大霉素的无血清培养基；采用含有细胞生长因子的新培养体系能有效地提高胎盘间充质干细胞的扩增能力，并且不含血清的培养系统将有利于临床安全移植应用。

本发明使干细胞的遗传信息及表型更稳定，干细胞特性更原始，并且能有效地扩增细胞，提高产品质量，获得稳定均一的胎盘间充质干细胞，解决了干细胞治疗需要大批量干细胞的问题，可用于多种疾病的治疗。

(四)附图说明

下面结合附图对本发明作进一步的说明。

图1为本发明不同细胞标记的表达流式检测图；

图2为本发明胎盘间充质干细胞染色鉴定示意图；

图3为本发明不同培养体系中胎盘间充质干细胞的形态图。

(五)具体实施方式

实施例：

(1)人胎盘来源间充质干细胞的获得

获得新鲜胎盘后立即置于无菌托盘或容器中，采用生理缓冲液清除胎盘组织和脐带外表的透明质粘液和母血污染，经脐动脉注入含有肝素的抗凝剂和抗生素的平衡盐溶液，放血，并开始灌注。初步灌注后无菌剪取胎盘小叶，0.1％I型胶原酶(Gibco)37℃水浴30分钟消化胎盘组织，同时缓慢振荡。获得细胞悬液，再将细胞悬液过细胞筛，除去组织碎片，1500转/分，离心洗涤，获得的细胞用DMEM重悬后离心，获得的细胞接种到培养瓶中，在37℃、5％CO₂、饱和湿度条件下培养。24～48小时弃去未贴壁的细胞，并补充相同的培养液。以后每2～3d半换液，记为P0代；待细胞达到80～90％汇合时，胰蛋白酶消化，按1∶3或1∶4比例传代，并标记为P1。

(2)胎盘间充质干细胞的生物学特性的鉴定

a.流式细胞术鉴定胎盘间充质干细胞表面标志：收集第3代细胞，PBS洗一次，1500转/分，离心10min；弃上清，残留100～200μL，吹打混匀细胞；分别加入20μL藻红蛋白(PE)标记的CD44和异硫氰酸荧光素(FITC)标记的CD34；4℃，避光反应30min；PBS洗一次，1500转/分，离心10min；标记后进行流式检测，流式细胞仪为BD FACScan(Becton Dickinson)。结果表明细胞表达间充质干细胞的表面标志CD44，不表达造血干细胞的表面标志CD34(如附图1所示)。

b.胎盘间充质干细胞分化潜能的鉴定

成脂诱导：

细胞传至第3代时将其转入成脂诱导培养基中进行培养。诱导培养后不同时间段，对成脂诱导组进行油红O脂肪颗粒染色。成脂诱导培养基包含：基础培养基DMEM，10％胎牛血清、0.5mM IBMX(isobulyl-1-methylxanthione)、0.1mM消炎痛、1uM地塞米松。第12天和第16天分别进行油红O染色。结果显示：培养12天可见到折光度增加的液泡充满整个细胞；油红O染色发现培养中约90％细胞富含脂肪滴(如图2A所示)。说明干细胞亚群可在体外诱导分化成脂肪细胞。

成骨诱导

取第三代人间充质干细胞，培养在6孔板中，待细胞长到80％左右时换用成骨诱导液培养，诱导液的成分包含：基础培养基DMEM，10％胎牛血清、10mMβ-磷酸甘油、0.1mM抗坏血酸磷酸盐Vc、0.1uM地塞米松。每三天换液，培养3周，于2周、3周分别进行茜素红染色观察。结果显示：成骨诱导培养中细胞形态由原来的梭形变成了立方形；2周之后已有矿化结节形成了，3周后结节比较多，染色比较明显(如图2B所示)。说明干细胞亚群可在体外诱导分化为成骨细胞。

(3)采用无血清体系扩增间充质干细胞

培养的原代(P0代)细胞达到80～90％汇合时，胰蛋白酶消化，按1∶3比例传代，采用无血清培养体系(

MSC SFM无血清培养基，含有5ng/ml的碱性成纤维细胞生长因子、1mML一谷氨酰胺：0.1mMβ-琉基乙醇、1％非必需氨基酸、0.5μg/ml庆大霉素)进行扩增，一般细胞2～3天传代一次，通过连续传代细胞得以纯化，血细胞和内皮细胞随着传代培养而被剔除，经过2次传代培养其形态呈较为均一的梭形成纤维细胞样，漩涡样生长，同时细胞进入指数生长阶段。

与传统培养基(DMEM+10％FBS或MesenPRO RS)相比，扩增速度提高30％，并且我们发明的无血清体系中培养的胎盘间充质干细胞小得多的纺锤体形态，显示了更原始的形态(如附图3)。

附图3中，

A：DMEM+10％FBS培养体系中胎盘间充质干细胞呈胞体较扁，体积较大的成纤维细胞样；

B：无血清培养体系中胎盘间充质干细胞的细胞呈较小的纺锤体形态，显示了更原始的形态。

Claims

1.一种从胎盘中提取原始间充质干细胞的方法，以早期流产胎儿胎盘组织为原料，其特征在于：对新鲜流产胎盘立即进行放血，采用生理缓冲液清除胎盘组织和脐带外表的透明质粘液和母血污染；用生理缓冲液灌注，以去除血细胞和组织碎片；将胎盘小叶剪碎，用胶原酶消化，收集细胞成分，通过贴壁筛选法纯化间充质干细胞。

2.根据权利要求1所述的间充质干细胞的无血清扩增方法，其特征在于：采用流式细胞仪及体外诱导分化法鉴定所获得细胞群的表型和多能性，采用无血清培养体系扩增间充质干细胞。

3.根据权利要求2所述的间充质干细胞的无血清扩增方法，其特征在于：所述无血清培养体系为含有5ng/ml的碱性成纤维细胞生长因子、1mML一谷氨酰胺：0.1mMβ-琉基乙醇、1％非必需氨基酸和0.5μg/ml庆大霉素的无血清培养基。