CN106421920B - 一种脂肪填充物及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

一种自体脂肪填充物及其制备方法，通过模拟组织工程的方法，构建自体脂肪填充物，由以下成分组成：细胞支架、细胞成分、生长因子和抗疤痕因子；其体积用量比例为109‑115：15‑30：4：0.5。通过各有效成分的组合，细胞支架部分提供移植物细胞成分的支架，可注射凝胶有利于细胞的粘附，洗涤脂肪占据了填充的大部分体积，干细胞和SVF组分可以分化为脂肪细胞及血管内皮细胞，其分泌的各类因子对于移植微环境的维持，血管的生成等均有益处。本发明提供的自体脂肪填充物及其制备方法，可有效提高移植脂肪的稳定性，减轻脂肪移植后的吸收，减少移植物纤维化不良反应的发生，利于自体脂肪面部填充技术的发展。

Description

一种脂肪填充物及其制备方法
技术领域
本发明属于生物医学领域，尤其涉及一种脂肪填充物及其制备方法。
背景技术
各种先天性的和外伤继发的软组织缺损一直是困扰整形外科医生的难题之一，引起软组织缺损的原因有严重烧伤、感染、各种外伤及先天性疾病等；对于软组织缺失，常用的治疗方法包括皮瓣移植、假体植入、软组织填充等。其中软组织填充具有创伤小，效果佳，可塑性强的优点，临床常用的填充物有硅胶、胶原蛋白和玻璃酸钠等，但是存在排异反应或术后疗效不能持久的缺点。
脂肪组织为软组织填充物的选择开辟了新方向。脂肪具有生物相容性好、获取方便、来源丰富、填充效果好和创伤小等优势，可以达到调配脂肪、雕塑体型的目的。然而，移植后的脂肪易被吸收，存活率较低，一般为30%-60%，甚至发生脂肪组织液化、坏死、钙化和纤维化等问题，限制了脂肪移植的临床应用，极大影响了脂肪移植的远期疗效。研究表明，脂肪组织是一种高度血管化的组织，血液供应和毛细血管的密度是骨骼肌的2-3倍，血管生成与脂肪形成密切相关，导致移植脂肪组织高吸收率的关键原因之一是移植区的血供不足，尤其是移植组织中央区不能获得充足的氧和营养，从而影响移植长期的存活率。因此，如何恢复和重建移植体内部的血供，提高移植体存活率，是脂肪移植研究中的热点。
种子细胞、生物材料、细胞与生物材料的整合是组织工程的三个关键因素。考虑到细胞成分在组织工程中的重要作用。近几年，单纯脂肪移植的改进方法-细胞辅助的脂肪移植（cell-assisted lipotransfer，CAL）技术得以发展。它是将新抽取的脂肪分为两份：一份用来提取基质血管组分（stromal vascular fraction cells, SVF），包括间质细胞、血管内皮细胞和血管壁细胞等；另一份作为细胞外基质，两部分联合作为移植物注射于移植区。专利（CN104548204A）中将脂肪前体细胞和脂肪进行混合，由于SVF细胞只是进行了提取，并没有经过扩增，而且细胞成分没有经过固定，不能停留在移植局部，导致移植物内细胞数量成分的不足，从而造成移植效果不佳；专利（CN103961743A）中干性脂肪颗粒和油性脂肪颗粒加入胰岛素后混合，并没有解决移植脂肪血管化的问题，其脂肪存活率并不会得到改善。脂肪移植早期，细胞处于缺氧状态，可诱导细胞分泌VEGF细胞因子，VEGF家族是一大类具有重要血管生长调节作用的生长因子。但是脂肪移植中生长因子含量有限，而外源性添加的VEGF因子在体内正常生理条件下，半衰期较短，不足1 小时。有人曾考虑使用VEGF基因转染及加用缓释系统的方法，但转染的方法可控性较差，缓释系统容易带入杂质；前述这两种方法临床可操作性较差。
综上所述，研究一种稳定性好，存活率高的脂肪填充物，对于修复软组织缺损显得尤为重要。
发明内容
针对上述问题，本发明提供一种脂肪填充物及其制备方法，该填充物可以有效提高移植脂肪的稳定性，有利于脂肪填充技术的发展。
为实现上述目的，本发明提供的脂肪填充物，由以下成分组成：细胞支架、细胞成分、生长因子、和抗疤痕因子，其体积用量比例为109-115：15-30：4：0.5。
所述细胞支架为洗涤脂肪、可注射水凝胶、玻尿酸、纤连蛋白或层粘连蛋白中的一个或组合。
所述细胞成分为自体或异体的脂肪干细胞、SVF组分、脐带干细胞、脐血干细胞、胎盘干细胞或骨髓干细胞中的一个或组合。
所述生长因子为VEGF、HGF、EGF、TGF-α、富含血小板的血浆（PRP）、肝素、前列腺素E1或前列腺素E2中的一个或组合。
所述抗疤痕因子为CD26的抑制剂、CD26的阻断剂或CD26的单克隆抗体中的一个或组合。
优选为，所述细胞支架为洗涤脂肪和可注射水凝胶；所述细胞成分为脐带干细胞、脂肪干细胞及SVF组分；所述生长因子为VEGF、HGF和富含血小板的血浆（PRP）；所述抗疤痕因子为CD26单克隆抗体。
为了实现上述目的，本发明还提供上述脂肪填充物的制备方法，具体包括以下步骤。
步骤1、细胞成分的提取、培养和制备。
步骤2、将细胞支架和步骤1制备的细胞成分充分混合，再加入生长因子和抗疤痕因子，混合均匀，即得脂肪填充物。
优选地，所述的脂肪填充物的制备方法，具体包括以下步骤。
步骤1、初次提取SVF组分。
步骤2、对SVF组分中的脂肪干细胞进行低氧培养、冷冻保存。
步骤3、脐带干细胞的制备、低氧培养和冷冻保存。
步骤4、采集脂肪，提取SVF和制备洗涤脂肪，备用。
步骤5、复苏步骤2中的脂肪干细胞和步骤3中的脐带间充质干细胞备用。
步骤6、提取PRP。
步骤7、将洗涤脂肪100ml、可注射水凝胶9-15ml、SVF5-10ml、脂肪干细胞5-10ml和脐带间充质干细胞5-10ml,充分混合，再加入VEGF0.5ml、HGF0.5ml、PRP3ml和CD26单克隆抗体0.5ml，混合均匀，即得脂肪填充物。
所述的干细胞低氧培养的条件为氧气10%、二氧化碳5%、氮气85%。
所述步骤2和步骤3的干细胞培养时使用无血清培养体系，并添加5%的无血清添加剂。
所述步骤4中提取SVF在提取时使用注射用水对红细胞进行裂解。
所述步骤7洗涤脂肪、可注射水凝胶、SVF、脂肪干细胞和脐带间充质干细胞的优选体积比例为10：1：1：1：1.脐带间充质干细胞和脂肪干细胞的数量为1:1,数量为1×106-1×107/ml，优选1×106/ml；SVF的细胞数量为1×105-106/ml，优选1×105/ml。
所述PRP的加入量为109-1010/ml，优选109/ml。
所述VEGF和HGF加入的量分别为1000-10000pg/ml，优选1000pg/ml。
本发明的有益效果。
本发明中，通过模拟组织工程的方法构建脂肪填充物，各有效成分的组合，细胞支架部分提供移植物细胞成分的支架，可注射凝胶有利于细胞的粘附，减少移植细胞的损失；此外移植的脂肪干细胞、脐带间充质干细胞及SVF细胞组分的额外补充，这些细胞成分不仅可以分化为脂肪细胞，同时可以分化为血管内皮细胞，其分泌的各类因子对于移植微环境的维持，血管的生成等均有益处；脐带间充质干细胞的使用更方便脂肪移植，不再需要事先对脂肪干细胞进行培养，尤其在紧急情况下，例如外伤，可立即复苏脐带干细胞与脂肪合并移植。脐带间充质干细胞的加入可增加细胞成分，添加的生长因子可提供细胞移植后，短时间内细胞因子的需要，待作用消失后，通过干细胞和PRP持续不断分泌的细胞因子，可满足移植脂肪组织修复、血管生成、炎症趋化等功能活动的需要。在脂肪移植过程中，无论是抽脂区还是填充区，都有可能造成伤疤。伤疤主要由胶原蛋白组成，这是一种由皮肤成纤维细胞分泌的纤维蛋白。研究发现底层皮肤的成纤维细胞表达一种称为CD26的蛋白，参与了伤口愈合的最初修复步骤，阻断CD26的活性，可以减少疤痕数量。CD26单抗的加入，极大减弱了移植脂肪纤维化的发展，保证了移植物的弹性和功能。
本发明可有效提高移植脂肪的稳定性，减轻脂肪移植后的吸收，减少移植物纤维化不良反应的发生，细胞辅助的脂肪移植具有成本低、操作简单无免疫排斥反应，术后形体自然，无手术瘢痕等优点，临床效果良好且持久。
附图说明
图1为脐带间充质干细胞原代细胞的生长状态图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步的说明。
实施例1。
一种脂肪填充物，包括：细胞支架部分、细胞成分、生长因子、抗疤痕因子；所述细胞支架部分包括：洗涤脂肪和可注射水凝胶；所述细胞成分包括：培养的脐带间充质干细胞和脂肪干细胞及SVF组分；所述生长因子包括：VEGF、HGF和PRP；所述抗疤痕成分包括：CD26单克隆抗体。
上述脂肪填充物的制备方法，包括以下步骤。
步骤1、基质血管组分（SVF）的制备。
（1）洗涤脂肪：将100ml抽取的脂肪装入脂肪采集瓶中，取50ml脂肪分装到一个T175培养瓶中；用10ml移液管，去吸头，先吸取T175培养瓶上层黄色油脂弃掉，再吸取下层红色液体弃掉；向T175培养瓶中加入100ml氯化钠注射液，剧烈晃动3min，充分洗涤脂肪组织，静止3-5min，吸去下层水相；重复洗涤脂肪组织操作三次，直至下层水相液清澈，记录T175培养瓶中剩余洗涤脂肪组织的终体积。
（2）胶原酶I消化：在步骤（1）的T175培养瓶中加入与步骤（1）终体积等体积的胶原酶I溶液（浓度为0.05%），封口膜封口后，剧烈晃动培养瓶5-10s，置于气浴恒温震荡器中，在37℃、70rpm条件下，消化60min，消化过程中每隔15min剧烈晃动培养瓶5-10s，直到脂肪组织看起来较为平滑。
（3）分离基质血管组分（SVF）：将步骤（2）消化后的组织，用无菌输血器滤网过滤，将过滤后的液体分装到50ml的离心管中，400g离心10min；用移液管自上而下，除去细胞沉淀上层的油脂和胶原酶溶液；用10ml生理盐水重悬细胞沉淀，将细胞用移液管吹散，细胞过100目滤网，离心处理10min（室温，400g），吸去上清液，得到基质血管组分细胞（SVF）。
步骤2、对SVF组分中的脂肪干细胞进行培养、冻存。
（1）原代培养培养（P0）：使用10ml无血清培养体系（无血清培养液(Lonza，12-725F):无血清添加剂(PALL，15950-017)=50:1），重悬步骤1制备的基质血管组分细胞沉淀，细胞吹散后，补加8ml无血清培养体系；将细胞平均接种到3个T-75培养瓶中，每个培养瓶均补加无血清培养体系4ml；将培养瓶水平放入37℃，氧气10%、二氧化碳5%、氮气85%的培养箱中，进行低氧培养。
（2）细胞换液：原代培养24h后，进行全量换液；此后，每隔3天全量换液一次，放置在二氧化碳恒温恒湿（37℃，95%湿度）培养箱中，进行氧气10%、二氧化碳5%、氮气85%低氧培养。
（3）细胞收集：培养到第8天时，原代培养细胞融合度达到80%-90%时，消化收获细胞；将培养瓶中的无血清培养体系收集到50ml规格的离心管中，离心处理10min（室温，400g）；用20ml的生理盐水清洗T-75培养瓶1次，倒掉生理盐水，在T-75培养瓶中加入37℃预热的0.25%的胰酶2ml；在显微镜下观察，直至有80%的细胞变圆，并脱落漂浮，即用离心后的无血清培养体系终止消化，消化过程在37℃条件下，消化时间4min；将终止的细胞悬液收集到一个50ml离心管中，用10-20ml的生理盐水清洗一遍T-75培养瓶，洗液也倒入50ml离心管中，300g离心处理10min，弃上清，吹散离心后的细胞沉淀，加生理盐水稀释至40ml，300g离心10min，得到细胞沉淀。
（4）冻存：用1.5ml无血清培养体系稀释步骤（3）得到的细胞沉淀，混合均匀；缓慢加入在4℃条件下预冷30min的冻存液（体积：20% DMSO(Sigma,D5879)，80%无血清培养体系）1.5ml，混合均匀；将3ml混合均匀后细胞悬液加入到3个冻存管中，每管1ml；使用程序降温仪冷冻(降温至-80℃)细胞后(需90min），再放入液氮罐保存(-196℃)，备用。
步骤3、脐带间充质干细胞的制备、培养和冻存。
（1）脐带的采集：经产妇知情同意，采集新鲜无菌脐带，4℃保存，24h内进行处理，同时对脐带血进行传染病筛查。
（2）脐带的清洁和消毒：取筛查合格的脐带，先用0.9%的氯化钠注射液进行脐带表面清洗，然后浸泡在75%酒精内2min，用0.9%的氯化钠注射液再次清洗，去除残余酒精和血渍。
（3）脐带的原代制备：将脐带剪成2-3cm的小段后，剔除外侧羊膜和内部血管后，得到华通氏胶并剪成2mm3的组织小块；用0.9%的氯化钠注射液清洗2次，得到无血渍的华通氏胶组织小块并离心洗涤，加入10ml无血清培养体系，放置在CO2培养箱内37℃、5.0%CO2浓度下培养24h后，进行第一次全量换液，去除培养皿内的细胞碎片，在培养至第8天时，进行第二次全量换液。
不同氧浓度下脐带间充质干细胞扩增时间和流式检测结果，见表1。
表1：不同氧浓度下脐带充质干细胞扩增时间和流式检测结果。
由表1可知，不同氧浓度下脐带间充质干细胞在细胞表面标志物的流式检测上没有差别，在10%氧气的低氧条件下，原代培养时间最短，故本实施例使用10%氧气的低氧条件。
（4）脐带间充质干细胞的传代和收集：当细胞融合率达到70%以上时，使用0.125%胰酶10ml消化收集原代细胞，按照5000-6000个/cm2的细胞密度进行传代培养，待培养到细胞融合率达80%以上时，对细胞进行收集。脐带间充质干细胞生长状态如图1所示。
检测不同低氧条件分泌蛋白水平的不同情况，见表2。
表2：不同氧浓度下脐带间充质干细胞分泌因子含量测定（单位：pg/mL）。
由表2可知，对选取的5个细胞分泌因子进行含量测定，可知在10%氧气的低氧条件下，脐带间充质干细胞分泌细胞因子含量最高，且提高了2-4倍，故本实施例全程(包括原代和传代培养)使用10%氧气的低氧条件培养细胞，可大幅提高获取细胞因子的产量，尤其是血管内皮生长因子。
（5）冻存：用1.5ml无血清培养体系稀释步骤(4)得到的细胞沉淀，并混合均匀；往细胞悬液中加入1.5ml 4℃预冷30min冻存液（体积比：20%DMSO,80%无血清培养体系），并混合均匀；将3ml细胞悬液加入到3个冻存管中，每管1ml；使用程序降温仪冷冻(降温至-80℃)细胞90min后，置液氮罐（-196℃）保存，备用。
步骤4、基质血管组分（SVF）的纯化和洗涤脂肪的制备。
（1）基质血管组分（SVF）的纯化：重复操作步骤1，将得到的基质血管组分细胞沉淀加入10mL注射用水，裂解红细胞，用移液管快速吹打组织块及红细胞沉淀，裂解2min后，加入生理盐水至45mL，300g离心10min去除破碎的红细胞，将细胞沉淀收集，得到基质血管组分（SVF），备用。
采用传统方法(索莱宝，R1010)与本实施例注射用水裂解方法的红细胞残留情况，见表3。
表3：红细胞残留表。
由表3可知，使用注射用水后可明显减少红细胞，平均红细胞残留达到103数量级，培养8天后单位面积获得的细胞数量是裂解前的三倍。本实施例使用注射用水对红细胞进行裂解，可以减少红细胞在原代培养过程中造成的干扰，加快组织贴壁，细胞游离加快，减少脂肪移植物的纤维化。此外，由于只使用注射用水，而不使用其他化学试剂，既降低了成本，也减少了对细胞的损伤，有效增加了临床应用的安全性。
（2）制备洗涤脂肪：取抽脂脂肪转移到一个T175培养瓶中，用10ml的移液管（去吸头），于脂肪采集瓶中先吸取脂肪层上层的油脂弃掉，再吸取脂肪层下层的红色液体弃掉。向T175培养瓶中加入100ml氯化钠注射液，剧烈晃动3min以充分洗涤脂肪组织，静止5min，吸去下层水相；重复洗涤脂肪组织操作三次，直到下层液较为清澈，得到洗涤脂肪，备用。
步骤5、干细胞的复苏：开启电热恒温水槽，使水温保持在40.0℃；将步骤2的脂肪干细胞和步骤3中脐带间充质干细胞放入电热恒温水槽3min，使细胞快速复温；将冻存管中细胞移入50ml离心管，加10ml的4℃预冷的氯化钠注射液到50ml离心管，吹打均匀；加氯化钠注射液定容到40ml，混合均匀，300g离心10min，弃上清，再次用氯化钠注射液洗涤一次,备用。
步骤6、富含血小板的血浆（PRP）的制备：取9ml静脉血置于装有1ml枸橼酸葡萄糖溶液抗凝剂的真空采血管中；2000rpm离心10min，将血液分为3层，最底层为红细胞，顶层为主要是纤维蛋白原等血浆成分的贫血小板血浆（PPP），中间层为血小板浓缩物（PC）；吸取全部上清直至顶层与中间层交界面以下3mm处，并将其移至另一离心管，2000rpm离心10min，离心管中液体分为2层，上层上清液为PPP，下层为PC，吸取约1/3上清液，弃之，剩余约3ml液体即为富含血小板的血浆。
步骤7、脂肪填充物的制备：将洗涤脂肪100ml、脂肪干细胞(10ml,106/ml)、脐带间充质干细胞(10ml,106/ml)、SVF(10ml, 105/ml )、可注射水凝胶（上海其胜生物制剂有限公司，992-803）10ml充分混合，加入VEGF(0.5ml,1000pg/ml)（美国PeproTech公司，AF-100-20）、HGF(0.5ml,1000pg/ml)（佰柯生物科技有限公司，BBOF-04343）、PRP(3ml,109/ml)、CD26单克隆抗体（ 美国进口Thermo Scientific，PA128302）(0.5ml, 50μg/ml)，再次充分混匀，即得。
为了进一步验证本发明的有益效果，本发明提供以下实验案例。
一、实验方法：移植区常规消毒铺巾，局部浸润麻醉或局部神经阻滞麻醉成功后，用10ml注射器针头于相对隐蔽部位作皮肤穿刺，用16号单孔针头沿穿刺点进行脂肪注射；回抽无血后，在标记范围内作多隧道、多层次、多点、少量的注射，避免路线重复，边退边注射脂肪填充物于乳房皮下；注射完成后进行局部按摩塑形，使填充物均匀分布于整个受区并与周围自然衔接；注射层次一般在皮下组织深层、SMAS筋膜浅层，注射量以填充部位稍高于周围组织为宜，应避免损伤局部神经和血管；术后仅包扎注射针孔处，嘱患者术后24h内间断性的冰敷；移植后减少或避免移植区周围肌肉的活动1周，防止移植脂肪中新生血管的损伤。
二、实验结果：术后定期随访、照相，与术前进行对比。
（1）大体观察：查体并参照术前术后照片，移植区外表无凹凸不平感，组织柔软度好，局部无硬块和囊肿。
（2）影像学评价结果：采用磁共振成像或是超声影像技术，作为评价术后填充物体积的一种量化方法。采用三维数字成像技术，精准定量地计算出患者自体脂肪填充中前后的效果。
a.MRI测量乳房体积。
术前、术后6、12个月行双侧乳房平扫，由放射科3位专业技师对所得影像资料进行体积测量，反复3次，取平均值，按公式（移植后体积/(移植前体积＋移植物体积)）计算存留率，结果见表4。
表4：移植前后体积变化及存留率表。
由表4可知，在移植100ml的移植物后，单纯移植脂肪者6个月和12个月后的存留率均较本发明方法低，说明本发明能较好的保证移植物的存活，可以延长移植物的存活时间。
b、评价乳房MRI影像的变化。
6个月以后观察，并无结节、囊肿或钙化。
特别说明，出于人道主义角度考虑，脂肪填充物移植者更倾向于采集自体干细胞制备脂肪填充物，满足自身需求。但是，在实际临床中，有些移植者身体消瘦或者身体状况不佳，脂肪干细胞活性不理想，导致自体脂肪制备的填充物效果不理想，移植者会积极地选择来源于异体的备用的抽脂脂肪。
上述实施例仅为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让本技术领域的人员了解本发明的内容并局限于此，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明技术方案所作的等效变化，都应覆盖在本法的保护范围之内。

Claims (4)

1.一种脂肪填充物，其特征在于，由以下成分组成：细胞支架、细胞成分、生长因子和抗疤痕因子，其体积用量比例为109-115：15-30：4：0.5，所述细胞支架为洗涤脂肪和可注射水凝胶；所述细胞成分为脐带干细胞、脂肪干细胞、和SVF组分，脐带干细胞浓度为1×106-1×107/ml，脂肪干细胞浓度为1×106-1×107/ml，SVF组分浓度为1×105-106/ml；所述生长因子为VEGF、HGF 、富含血小板的血浆PRP，VEGF浓度为1000-10000pg/ml、HGF浓度为1000-10000pg/ml、PRP浓度为109-1010/ml；所述抗疤痕因子为CD26单克隆抗体，浓度为50ug/ml。
2.如权利要求1所述的脂肪填充物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1、初次提取SVF组分；
步骤2、对SVF组分中的脂肪干细胞进行低氧培养、冷冻保存；
步骤3、脐带干细胞的制备、低氧培养和冷冻保存；
步骤4、采集脂肪，提取SVF和制备洗涤脂肪，备用；
步骤5、复苏步骤2中的脂肪干细胞和步骤3中的脐带间充质干细胞备用；
步骤6、提取PRP；
步骤7、将洗涤脂肪100ml、可注射水凝胶9-15ml、SVF5-10ml、脂肪干细胞5-10ml和脐带间充质干细胞5-10ml,充分混合，再加入VEGF0.5ml、HGF0.5ml、PRP3ml和CD26单克隆抗体0.5ml，混合均匀，即得脂肪填充物。
3.如权利要求2所述的脂肪填充物的制备方法，其特征在于，所述低氧条件为氧气10%、二氧化碳5%、氮气85%；所述步骤2和步骤3的干细胞培养时使用无血清培养体系，并添加5%的无血清添加剂；所述步骤4中提取SVF在提取时使用注射用水对红细胞进行裂解。
4.如权利要求2所述的脂肪填充物的制备方法，其特征在于，所述步骤7洗涤脂肪、可注射水凝胶、SVF、脂肪干细胞和脐带间充质干细胞的体积比例为10：1：1：1；脐带间充质干细胞和脂肪干细胞的数量为1:1,数量为1×106/ml；SVF的细胞数量为1×105/ml；所述PRP的加入量为109/ml；所述VEGF和HGF加入的量分别为1000pg/ml。
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