CN100545260C - 人羊膜间充质干细胞的分离及培养方法及医用组合物 - Google Patents
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Abstract
本发明为一种人羊膜间充质干细胞的分离及培养方法及医用组合物，分离及培养方法是将人羊膜用胰蛋白酶、胶原酶、脱氧核糖核酸酶相继消化，然后过滤制成单细胞悬液，再采用加有体积百分含量为10%-20%的胎牛血清和终浓度为10-20ng/ml的碱性成纤维生长因子的VDMEM∶VF12＝1∶1的DMEM/F12培养基，置于37℃、饱和湿度、体积分数为5%的CO2培养箱中进行培养，通过换液和传代，使人羊膜间充质干细胞逐渐得到扩增和纯化。本发明方法具有来源广泛，不受伦理限制等优越性，具有广阔的应用前景，本发明的医用组合物可用于神经替代治疗、用于心肌梗塞的治疗、用于糖尿病的治疗、用于骨组织工程、应用于整形外科等。
Description
技术领域
本发明属于间充质干细胞的分离及培养方法，具体涉及的是一种人羊膜间充质干细胞的分离及体外培养方法，以及含有人羊膜间充质干细胞作为有效成分的医用组合物。
背景技术
近几年来，干细胞的研究取得了重大突破.1999和2000年，世界最权威的美国《Science》杂志连续2年将干细胞和人类基因组计划列为当年的10大科学突破，尤其是在1999年甚至将干细胞研究列为第一位。干细胞很可能在医学领域引发革命性进步，因而具有不可估量的医学价值而引起全世界的广泛关注和研究，美国《时代》周刊认为干细胞和人类基因组计划将同时成为新世纪最具有发展和应用前景的领域。
间充质干细胞(mesenchymal stem cells，简称MSCs)是来源于成熟组织中的多能干细胞，具有高度自我更新能力和多向分化潜能，是细胞移植和组织工程的新型种子细胞，具有广阔的应用前景。其中，研究最为广泛的MSCs是来源于骨髓的间充质干细胞，尽管其伦理问题与胚胎干细胞相比大为减少，但骨髓细胞必须通过侵入的途径获得，及其随着年龄的增长，干细胞数量显著减少。许多研究机构已经在其它组织中寻找到多能干细胞，包括动员的外周血、脐血、乳牙、脐带间充质细胞，然而，从这些组织中得到的细胞数量十分有限。
发明内容
本发明的第一个目的在于针对现有干细胞来源或者受伦理限制或者数量有限的问题，提供一种不受伦理限制且来源广泛的人羊膜间充质干细胞的分离及培养方法。
本发明的第二个目的在于利用本发明的方法制得的人羊膜间充质干细胞，提供一种医用组合物。
本发明的第一个目的是这样实现的：本发明包括如下顺序的步骤：
(1)取人羊膜先用胰蛋白酶消化，然后用胶原酶、脱氧核糖核酸酶消化，得到细胞悬液；
(2)将上一步所得的细胞悬液过滤，制成单细胞悬液；
(3)将第(2)步所得细胞接种于培养基中，置于37℃、饱和湿度、体积分数为5％的CO2培养箱中进行培养，并通过换液和传代，使人羊膜间充质干细胞逐渐得到扩增和纯化，所述培养基采用VDMEM∶VF12＝1∶1的DMEM/F12培养基，其中含有体积百分含量为10％-20％的胎牛血清和终浓度为10-20ng/ml的碱性成纤维生长因子。
在上述第(1)步中，优选采用重量百分含量为0.125-0.25％的胰蛋白酶，室温消化30-60分钟，共2-4次，然后用含体积百分含量为10％-20％胎牛血清的DMEM/F12培养液中止胰蛋白酶，采用含0.5-2.0g/L胶原酶和0.05-0.20g/L脱氧核糖核酸酶的VDMEM∶VF12＝1∶1的DMEM/F12培养液，37℃消化1-2小时。
在上述第(3)步中，优选将第(2)步所得细胞以1×105-1×106/ml密度接种于培养基中培养。
将细胞扩增和纯化的过程优选如下：在本发明的第(3)步开始细胞培养后，培养48～72小时，更换培养液，弃去未贴壁的细胞，根据细胞生长情况，每3～4天全量换液一次，待细胞达到80％～90％融合时，用重量百分含量为0.25％的胰蛋白酶消化，然后按1∶2的比例或1∶3的比例进行传代接种培养，并记为P1代，传代培养过程中每3天全量换液，直至贴壁细胞彼此融合，铺满瓶底，重复上述操作进行传代培养，并记为P2代，继续上述传代培养过程。
本发明的医用组合物，包括通过本发明所述的方法制得的人羊膜间充质干细胞，优选包括人羊膜间充质干细胞和纤维蛋白胶的医用组合物。本发明的医用组合物可用于神经替代治疗、用于心肌梗塞的治疗、用于糖尿病的治疗、用于骨组织工程、应用于整形外科。
本发明的优点在于：人羊膜是胎儿出生以后的废弃物，本发明从羊膜分离、体外培养人羊膜间充质干细胞(Human Amniotic-derivedmesenchymal stem cells，简称HADMSCs)，具有来源广泛，不受伦理限制等优越性；本发明的医用组合物含有能够分化为中胚层及其它胚层的成熟组织的人羊膜间充质干细胞，应用广泛。
附图说明
图1是实施例一中培养不同时间的HADMSCs的放大100倍的显微照片。
图2是实施例一中流式细胞分析结果图。
图3是实施例二中HADMSCs经诱导向神经细胞分化的细胞照片，其中A为诱导4天的放大100倍的照片；B为诱导7天的照片；C为诱导前细胞表达nestin的照片，放大200倍；D为诱导7天细胞表达NSE的照片，放大200倍。
图4是实施例三中移植后神经细胞表达特异性标志物的照片，其中A、B、C、D为HADMSCs移植组，放大400倍，A、B为移植后2周、4周移植细胞表达GFAP的照片，C、D为移植后2周、4周移植细胞表达NSE的照片；E、F、G、H为纤维蛋白胶和HADMSCs混合移植组，放大400倍，E、F为移植后2周、4周移植细胞表达GFAP的照片，G、H为移植后2周、4周移植细胞表达NSE的照片。
具体实施方式
实施例一：人羊膜间充质干细胞的分离、培养、扩增及纯化
1、人羊膜间充质细胞的分离：
在无菌条件下取正常足月剖腹产胎儿的人胎盘，钝性分离胎盘脐带面的羊膜，用磷酸缓冲液(PBS)充分冲洗，将羊膜剪成1.0cm×1.0cm大小的片状，按每克组织加入重量百分含量为0.25％的胰蛋白酶2ml，室温消化30分钟，共3次，然后用含体积百分含量为10％胎牛血清(FBS)的DMEM/F12培养液中止胰蛋白酶，以尽可能除去上皮细胞。然后将羊膜尽可能剪碎，以每克组织加入含1.0g/L胶原酶和0.10g/L脱氧核糖核酸酶的VDMEM∶VF12＝1∶1的DMEM/F12培养液2ml，37℃消化1小时后得细胞悬液。然后用不锈钢网过滤将消化下来的细胞制成单细胞悬液，1000r/m离心10分钟，用PBS洗2次，用台盘兰染色，计数活细胞，以2×105/ml的密度将所得细胞接种于75ml培养瓶内。本发明在接种时的细胞密度可采用1×105-1×106/ml。
2、人羊膜间充质干细胞的培养、纯化及扩增：
培养基采用VDMEM∶VF12＝1∶1的DMEM/F12培养基，其中加了体积百分含量为10％的胎牛血清(FBS)和终浓度为20ng/ml的碱性成纤维生长因子(bFGF)，将上一过程所得的人羊膜间充质细胞分装于75ml培养瓶中，置于37℃、饱和湿度、体积分数为5％的CO2培养箱中培养48-72小时后，更换培养液，弃去未贴壁的细胞，根据细胞生长情况，每3-4天全量换液一次。待细胞达到80％-90％融合时，用重量百分含量为0.25％的胰蛋白酶消化，然后按1∶2或1∶3的比例的比例进行传代接种培养，并记为P1代。传代培养过程中每3天全量换液，直至贴壁细胞彼此融合，铺满瓶底，再重复上述操作进行传代，此传代培养记为P2代，然后继续上述传代培养过程。细胞于24小时内开始贴壁，72小时观察，见细胞呈圆形、梭形、星形、多角形等多种形态，通过全量换液逐渐去除未贴壁细胞，此时贴壁细胞呈单个分散或几个细胞的克隆，10天以后细胞形态逐渐均匀，呈长梭形，有伪足，14天左右可见两种细胞克隆：上皮样细胞克隆和成纤维样细胞克隆，前者是杂细胞，后者是人羊膜间充质干细胞HADMSCs，每个克隆约含200～300个细胞，培养至14～18天细胞达80％～90％融合，见成纤维样细胞呈放射状或漩涡状分布，上皮样细胞呈铺路石样排列。传代后细胞24小时内完全贴壁，7～10天达到完全融合，传至3代，细胞形态很均匀，上皮样细胞克隆消失。随着传代的进行，HADMSCs的胞体逐渐增大，出现部分宽大扁平的细胞，失去增殖和分化能力，而大部分细胞仍然维持细长的梭形，保持增生和分化能力。体外培养10代以后，细胞的增殖速度明显减慢，细胞出现老化现象。
在上述培养传代过程中的细胞形态可参见图1：A是培养8天的图，细胞混杂，见圆形、星形、多角形、梭形等多种形态；B、C是培养13天的图，其中B是成纤维细胞样克隆，C是上皮细胞样克隆；D是第1代3天的图，E是第3代3天的图，F是第3代6天的图，G是第6代3天的图，H是第8代10天的图。
3、流式细胞检测：
培养4-6代的人羊膜间充质干细胞用重量百分含量为0.25％的胰蛋白酶消化后，用含体积百分含量为1％小牛血清白蛋白的PBS调整细胞至5×105/50ul。然后分别加入下列鼠抗人单克隆抗体：CD29-PE、CD34-FITC、CD45-FITC、CD44-FITC、HLA-ABC、HLA-DR，置4℃孵育30分钟，用PBS洗1次，直标单抗可直接上流式细胞仪检测，而间标单抗再加兔抗鼠FITC二抗，置4℃孵育30分钟，用PBS洗涤2次后，进行流式细胞仪分析。分析结果如图所示，显示CD29、CD44、HLA-ABC阳性，CD34、CD45、HLA-DR阴性。上述鼠抗人单克隆抗体CD29-PE、CD34-FITC、CD45-FITC、CD44-FITC、HLA-ABC、HLA-DR购自Santa Cruz Biontechnology Ins.公司。
在本实施例的第1步的分离步骤中，胰蛋白酶的重量百分含量可为0.125-0.25％，消化时间可为30-60分钟，次数为2-4次；中止胰蛋白酶的DMEM/F12培养液中胎牛血清的体积百分含量可为10％-20％；胶原酶、脱氧核糖核酸酶消化时，VDMEM∶VF12＝1∶1的DMEM/F12培养液中胶原酶的浓度可采用0.5-2.0g/L，脱氧核糖核酸酶可为0.05-0.20g/L，消化时间可为1-2小时。
实施例二：定向诱导HADMSCs向神经元样细胞分化
1、定向诱导：取传至第3代的HADMSCs按4×105/L密度接种于事先放置有消毒盖玻片的六孔板内制备细胞爬片，待细胞达80％融合时，以含30μmol/L全反式维甲酸(Retinic acid，购自sigma公司)、20ng/mlbFGF、10％FBS的DMEM/F12培养基诱导7天，对照组不加任何诱导剂。结果：培养的人羊膜间充质干细胞表达神经干细胞的标志物人神经巢蛋白(nestin)，经诱导后的细胞表达nestin和神经元的标志物人神经元特异性烯醇化酶(NSE)，不表达神经胶质细胞的标志物胶质纤维酸性蛋白(GFAP)。
2、倒置显微镜下观察：HADMSCs向神经细胞的诱导分化，在加入诱导液后2天，即有部分细胞发生形态变化，胞体回缩，凸起变细变长，逐渐呈现神经元样细胞形态，可观察到部分细胞脱壁死亡；诱导4天后，大部分细胞发生形态改变，较多的神经元样细胞聚集在一起，相邻的细胞间轴突联结成网状，诱导的神经元样细胞形态不一，有简单的双极细胞，也有复杂的多极细胞，少部分细胞始终未发生形态改变，仍保持宽大扁平状；7天后，大部分细胞呈神经元样形态。HADMSCs在上述诱导分化过程中的细胞形态参见图3。
3、免疫细胞化学检测：取生长有细胞的盖玻片，采用SP免疫组化方法进行免疫细胞化学染色，细胞盖玻片用80％的丙酮固定10分钟，3％H2O2封闭10分钟，山羊血清封闭15分钟，去除血清后分别加入兔抗人神经巢蛋白、小鼠抗人神经元特异性烯醇化酶和胶质纤维酸性蛋白单抗工作液，并设阴性对照，以PBS代替一抗，置于湿盒中4℃下过夜，PBS洗涤3遍，分别滴加羊抗兔及羊抗鼠的二抗工作液，室温30分钟，再加入辣根过氧化物酶标记链霉卵白素，室温孵育30分钟，用显色剂DAB显色，中性树胶封片。镜下随机取10个非重叠视野(放大100倍)，计算nestin和NSE和GFAP阳性细胞占总细胞的比例。结果显示，诱导分化前HADMSCs的nestin表达率为82.0±3.3；诱导4天NSE表达率为40.4±2.0，诱导7天后NSE表达率为78.1±3.4，诱导4天和7天相比NSE表达在统计学上有差异，t＝-30.52，P＜0.05，表达上调；不表达GFAP。
实施例三：含有HADMSCs的组合物在治疗神经系统疾病中的应用
HADMSCs能够分化为神经细胞，为神经移植开辟了新的细胞来源。可通过局部应用或、腰椎穿刺及静脉输注等途径将HADMSCs移植人体来治疗脑损伤、帕金森综合症、脑卒中、脊髓损伤及外周神经损伤等神经系统疾病。
1、动物分组及模型制作：
Wistar大鼠80只，雌雄不限，随机分为4组：A组为损伤组(Sham)，20只，只开颅钻孔不打击脑组织不移植细胞，作为阴性对照组。B组为假移植组(TBI+NS)，20只，开颅钻孔打击脑组织1天后注射生理盐水10μl，作为干预对照。C组为移植组(TBI+HADMSCs)，20只，开颅钻孔打击脑组织1天后注射含HADMSCs的生理盐水10μl，作为HADMSCs移植组。D组为纤维蛋白胶移植组(TBI+FG+HADMSCs)，20只，开颅钻孔打击脑组织1天后将HADMSCs以1×106/ml密度与纤维蛋白胶的组分主体胶和催化剂混合，于损伤区用纤维蛋白胶专用注射器单点注射混合液100μl，作为纤维蛋白胶细胞移植组。纤维蛋白胶由广州倍秀生物技术有限公司生产。
B、C、D组三组采用自由落体硬膜外撞击法制作大鼠脑创伤模型，损伤装置有底板，固定支架，垂直导杆，20g砝码，聚乙烯撞击圆锥组成。撞击圆锥头端直径4mm，高2.5mm。10％水合氯醛腹腔内注射麻醉大鼠，注射量为3ml/kg体重，将大鼠头部固定于手术台上，减去顶部皮毛，消毒，沿中线切开皮肤及骨膜，左侧前卤后3mm，左旁开2mm，钻一直径为5mm的圆形窗，将撞击圆锥头端放入骨窗中，砝码自30cm高处垂直落下，撞击置于硬膜上的圆锥，致中度脑损伤，缝合骨膜及皮肤，放回复苏。
2、免疫组化：
创伤后2周、4周用10％水合氯醛腹腔内过量注射麻醉处死大鼠，每组各5只，立即开胸经心脏主动脉插管，1分钟内用1％肝素生理盐水100ml快速灌注，然后用4％多聚甲醛溶液滴灌2小时，灌注后取出脑组织，放入4℃、4％多聚甲醛溶液中固定过夜。梯度酒精脱水、二甲苯透明、浸蜡并制成蜡块，以损伤区为中心切片10张，将切片贴附于多聚赖氨酸处理的玻片上以备免疫组化染色。
免疫组化SP法：将石蜡切片脱蜡和水化；用PH7.4的PBS冲洗，冲洗3次，每次5分钟，3％H2O2室温孵育5-10分钟，以消除内源性过氧化物酶的活性；PBS冲洗3次，每次5分钟；加热抗原修复：将切片放入抗原修复液中，电炉加热至96～100℃，持续20分钟；室温冷却后用PBS冲洗5分钟×3次；10％正常山羊血清封闭，室温孵育20分钟，倾去血清，勿洗；滴加鼠抗人GFAP工作液，鼠抗人NSE工作液，4℃湿盒过夜；PBS冲洗3分钟×3次；滴加二抗即生物素标记山羊抗鼠IgG工作液，室温下孵育30分钟；PBS冲洗3分钟×3次；滴加三抗即辣根酶标记链霉卵白素-过氧化物酶溶液，37℃孵育30分钟；PBS冲洗3分钟×3次；加新鲜配制的DAB溶液，显微镜下观察5～10分钟；自来水充分冲洗；苏木素复染；酸酒精分化；梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。结果显示：动物脑内移植2周、4周均表达NSE和GFAP，参见图4。表明HADMSCs在体内分化为神经元和神经胶质细胞，HADMSCs能够在纤维蛋白胶内存活和分化。
实施例四：纤维蛋白胶作为HADMSCs的支架材料在组织工程中的应用
纤维蛋白胶是从血液中提取相关成分如纤维蛋白原、XIII因子、凝血酶等制成的医用生物材料，可作为粘合剂粘合修复组织损伤，其组织相容性和生物降解性良好，可被组织完全吸收。我们将纤维蛋白胶和HADMSCs混合，并移植于大鼠的损伤脑组织内，2周和4周均发现其分化为神经元和神经胶质细胞，表明移植的HADMSCs在纤维蛋白胶内能够很好的生存，且在局部微环境的影响下，能够分化为神经细胞。移植区未见炎细胞浸润，表明其和脑组织的良好相容性。2周的组织HE切片中未发现纤维蛋白胶团块，说明纤维蛋白胶已经完全溶解，其降解性能良好。且用纤维蛋白胶作为细胞移植的支架，不仅能够起到局部止血的作用，还能防止细胞的流动，使局部保持更大的细胞浓度，更有利于损伤的修复。同时，纤维蛋白胶作为HADMSCs的支架材料，还可用于骨组织工程等其它组织工程。
从以上实施例可见：本发明方法可成功地从羊膜分离、培养出人羊膜间充质干细胞，该细胞可在体外成功地扩增和纯化，经流式细胞检测，该细胞表达CD29、CD44、HLA-ABC，不表达CD34、CD45、HLA-DR阴性；人羊膜间充质干细胞表达神经干细胞的标志物nestin，经体外诱导该细胞可分化为神经元，在损伤脑区可分化为神经元和神经胶质细胞。
实施例五：含有HADMSCs的医用组合物用于心肌梗塞的治疗
HADMSCs具有间充质干细胞的普遍特性，能够分化为中胚层及其它胚层的成熟组织。可通过介入手段或静脉输注等途径将其移植于心肌梗死部位，替代梗死心肌，恢复心脏功能。
实施例六：含有HADMSCs的医用组合物用于糖尿病的治疗
糖尿病主要是胰岛功能衰竭所致，将HADMSCs移植于胰岛，通过一定的分化调控，使其分化为功能性的胰岛细胞，替代胰岛功能，治疗糖尿病。
实施例七：含有HADMSCs的医用组合物用于骨组织工程
将HADMSCs在一定的诱导条件下分化为骨组织，可将HADMSCs移植于骨缺损处，修复骨缺损。
实施例八：含有HADMSCs的医用组合物在整形外科的应用
将HADMSCs通过适当的诱导体系诱导，分化为脂肪细胞，用于身体塑性。
Claims (3)
1.一种人羊膜间充质干细胞的分离及培养方法，其特征在于包括如下顺序的步骤：
(1)取人羊膜先采用重量百分含量为0.125-0.25％的胰蛋白酶，室温消化30-60分钟，共2-4次，然后采用含0.5-2.0g/L胶原酶和0.05-0.20g/L脱氧核糖核酸酶的VDMEM∶VF12＝1∶1的DMEM/F12培养液，37℃消化1-2小时，得到细胞悬液；
(2)将上一步所得的细胞悬液过滤，制成单细胞悬液；
(3)将第(2)步所得细胞接种于培养基中，置于37℃、饱和湿度、体积分数为5％的CO2培养箱中进行培养，并通过换液和传代，使人羊膜间充质干细胞逐渐得到扩增和纯化，所述培养基采用VDMEM∶VF12＝1∶1的DMEM/F12培养基，其中含有体积百分含量为10％-20％的胎牛血清和终浓度为10-20ng/ml的碱性成纤维生长因子。
2.根据权利要求1所述的人羊膜间充质干细胞的分离及培养方法，其特征在于：将第(2)步所得细胞以1×105-1×106/ml密度接种于培养基中培养。
3.根据权利要求1至2所述的任意一种人羊膜间充质干细胞的分离及培养方法，其特征在于：在第(3)步开始细胞培养后，培养48～72小时，更换培养液，弃去未贴壁的细胞，根据细胞生长情况，每3～4天全量换液一次，待细胞达到80％～90％融合时，用重量百分含量为0.25％的胰蛋白酶消化，然后按1∶2的比例或1∶3的比例进行传代接种培养，并记为P1代，传代培养过程中每3天全量换液，直至贴壁细胞彼此融合，铺满瓶底，重复上述操作进行传代培养，并记为P2代，继续上述传代培养过程。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
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| PB01 | Publication | ||
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Owner name: JIANGSU BEIKE BIOTECHNOLOGY CO., LTD. |
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| COR | Change of bibliographic data |
Free format text: CORRECT: ADDRESS; FROM: 518057 BLOCK W400, WEST TOWER, SHENZHEN-HONG KONG PRODUCTION + RESEARCH BASE BUILDING, SCIENCE AND TECHNOLOGY PARK, NANSHAN DISTRICT, SHENZHEN CITY, GUANGDONG PROVINCE TO: 518000 9/F, ZHONGKE BUILDING, BUILDING 3, CHINA SCIENCE AND TECHNOLOGY DEVELOPMENT INSTITUTE, HIGH-TECH SOUTH 1ST ROAD, HIGH-TECH INDUSTRIAL ZONE, SHENZHEN CITY, GUANGDONG PROVINCE |
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Effective date of registration: 20100429 Address after: 518000 Guangdong city of Shenzhen province high tech Industrial Park South a Chinese Technology Development Institute Building No. 3, building nine floor Co-patentee after: Jiangsu Beike Bio-technology Co., Ltd. Patentee after: Shenzhen Beike Biotechnology Co., Ltd. Address before: 518057, Shenzhen, Nanshan District science and Technology Park, Guangdong, Shenzhen Hong Kong University research base building, west block, block W400 Patentee before: Shenzhen Beike Biotechnology Co., Ltd. |
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| ASS | Succession or assignment of patent right |
Owner name: JIANGSU BEIKE BIO-TECHNOLOGY CO., LTD. LIAONING BE Free format text: FORMER OWNER: JIANGSU BEIKE BIO-TECHNOLOGY CO., LTD. |
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| C41 | Transfer of patent application or patent right or utility model | ||
| TR01 | Transfer of patent right |
Effective date of registration: 20110901 Address after: 518000 Guangdong city of Shenzhen province high tech Industrial Park South a Chinese Technology Development Institute Building No. 3, building nine floor Co-patentee after: Jiangsu Beike Bio-technology Co., Ltd. Patentee after: Shenzhen Beike Biotechnology Co., Ltd. Co-patentee after: Liaoning Beike Biotechnology Co., Ltd. Co-patentee after: Anhui Beike Biotechnology Co. Ltd. Co-patentee after: Henan Beike Biotechnology Co. Ltd. Address before: 518000 Guangdong city of Shenzhen province high tech Industrial Park South a Chinese Technology Development Institute Building No. 3, building nine floor Co-patentee before: Jiangsu Beike Bio-technology Co., Ltd. Patentee before: Shenzhen Beike Biotechnology Co., Ltd. |