CN106244548A - 木犀草素在诱导间充质干细胞向神经细胞定向分化中的用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了木犀草素在诱导间充质干细胞定向分化为神经细胞中的用途。本发明还公开了诱导间充质干细胞向神经细胞定向分化的诱导液及诱导分化方法。本发明木犀草素可以诱导间充质干细胞定向分化为神经细胞，可以为治疗神经损伤提供了原材料，临床应用前景良好。
Description
技术领域
本发明涉及木犀草素在诱导间充质干细胞向神经细胞定向分化中的用途。
背景技术
对于神经元损伤和功能丧失等神经系统的疾病,目前尚无促进神经细胞再生的有效方法，所以细胞替代疗法是治疗神经功能缺失最有前途的治疗策略之一。人脐带间充质干细胞(human umbilical cord-mesenchymal stem cells,hUC MSCs)为存在于脐带华尔通氏胶和血管周围组织。脐带为分娩后废弃物，无道德及法律限制,免疫原性低，异体移植无免疫排斥反应或反应较弱，使hUC MSC s成为临床上最具应用前景的多能干细胞。
木犀草素(Luteolin)最初是从草本植物木犀草的叶、茎、枝中被分离出而得名，具有抗炎、抗氧化、抑制凋亡、抗过敏、抗肿瘤等多种生物学作用，富含木犀草素的药物，被广泛应用于高血压病和癌症等疾病的治疗。对于木犀草素具有诱导hUC MSCs向神经细胞分化的可能，目前尚未见报道。
发明内容
本发明的技术方案是提供了木犀草素的新用途。
本发明首先提供了木犀草素在诱导间充质干细胞向神经细胞定向分化中的用途。
其中，诱导间充质干细胞向神经细胞定向分化是指促使间充质干细胞出现神经细胞样改变(胞核增大，细胞呈分叉状改变，细胞伸出较多细长的突起)，同时神经细胞特异性基因nestin、GFAP、MAP2、NEFH的表达明显上调。
优选地，所述间充质干细胞为脐带间充质干细胞。
本发明还提供了木犀草素在制备诱导间充质干细胞向神经细胞定向分化的诱导液中的用途。
优选地，所述间充质干细胞为脐带间充质干细胞。
本发明还提供了诱导间充质干细胞定向分化为神经细胞的诱导液，它以常用细胞培养基为基础培养基，并添加有木犀草素。
常用细胞培养基，是指包含供给细胞营养和促使细胞增殖的基础物质的培养基，如，α-MEM培养基(又叫MEM培养基，Minimum Essential Medium)、DMEM-高糖培养基、DMEM-低糖培养基、RPMI-1640培养基、DMEM/F12培养基或M-199培养基。
优选地，所述常用细胞培养基为α-MEM培养基、DMEM-高糖培养基、DMEM-低糖培养基、RPMI-1640培养基、DMEM/F12培养基或M-199培养基。
优选地，所述木犀草素的终浓度为10ug/ml。
进一步优选地，所述诱导液是以DMEM/F12培养基为基础培养基，添加有DMEM/F12培养基1/9(v/v)的FBS和终浓度为10ug/ml的木犀草素。
本发明还提供了一种诱导间充质干细胞定向分化为神经细胞的方法，包括如下步骤：
a、取间充质干细胞；
b、置于前述的诱导液中培养，即可。
步骤a中，所述间充质干细胞为脐带间充质干细胞。
步骤b中，培养的时间为6天。
本发明还提供了前述方法得到的细胞
根据公知常识，干细胞分化需要经过标志基因表达模式改变、细胞形态变化、最终成形等阶段。若分化为神经细胞，标志基因表达模式改变的具体表现就是神经细胞标志基因的高表达，这个阶段是整个分化过程最为重要的阶段之一，此阶段相当于给干细胞的分化定下了轨迹，在后期只要给予合适的条件，就能最终分化得到神经细胞。
本发明木犀草素可以诱导间充质干细胞的神经细胞标志基因高表达，而且还可以诱导其形态特征向神经细胞转变，说明其可以诱导木犀草素向神经细胞方向分化，后期再经过一定的刺激，可以分化为神经细胞。
本发明木犀草素可以诱导间充质干细胞向神经细胞方向定向分化，分化得到的细胞具有明显的神经细胞形态学特征，同时高表达nestin、GFAP、MAP2、NEFH等神经细胞特异性基因，可以作为治疗神经损伤的原材料，临床应用前景良好。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
图1 hUC MSCs原代培养细胞照片
图2木犀草素对hUC MSCs的形态学影响
图3诱导之后神经细胞标志物的表达情况，GFAP用绿色荧光标记，细胞核用蓝色荧光标记
图4诱导之后神经细胞标志物的表达情况，GFAP用绿色荧光标记，细胞核用蓝色荧光标记
具体实施方式
以下是通过药效实验及临床实验证明本发明的有益效果。
实验例1 本发明诱导液诱导脐带间充质干细胞分化为神经细胞
1材料
健康足月剖腹产的脐带1根,经产妇同意用于科学研究。胎牛血清(FBS)、DMEM/F12培养基(Gibcol),胰蛋白酶、木犀草素：成都中医药大学药学院制备(纯度99％),鼠抗nestin、GFAP多克隆抗体、FITC羊抗鼠二抗(Santacruz),Hoechst 33258(碧云天)。cDNA合成试剂盒(Fermentas公司，K1632)，qPCR试剂盒(Roche公司，04913850001)。hUC MSCs培养基组成:90％DMEM/F12+10％FBS
2.方法
2.1hUC MSCs的原代培养、传代及扩增:
无菌条件下取出剖宫产出生的健康足月新生儿脐带组织，将其置于含有1％双抗(青链霉素)无菌生理盐水中50ml离心管中。将脐带组织放入超净台中的无菌弯盘里，以无菌生理盐水反复冲洗脐带组织数次后，将其切成长约1cm的小段，剔除血管，放入培养皿，用灭菌剪刀快速将脐带组织剪碎，约lmm×lmm×lmm左右。将组织碎块摊开，使其均匀分布于培养皿的底部，向培养皿里轻轻加入含10％FBS的DMEM(F12)培养液，使其淹没组织小块，静置于37℃、5％CO2培养箱中进行培养。培养第3天，补加培养液，培养第七天，半换培养液。待培养皿里出现4-5个比较明显的克隆，去掉组织继续培养。待细胞铺满培养瓶80％-90％时，用0.25％胰蛋白酶EDTA消化，按1:2比例传代扩增。
2.2木犀草素诱导hUC MSCs向神经细胞方向分化，取对数生长期P3代细胞,0.05％胰蛋白酶EDTA消化,调整细胞密度1*104/cm2,接种于24孔板。待细胞达80％融合时,进行诱导分化(诱导分化的时间为6天)，实验组：90％DMEM/F12、10％FBS和木犀草素10ug/ml(0.5‰)，对照组：90％DMEM/F12、10％FBS和0.5‰DMSO。倒置显微镜下动态观察脐带MSC s诱导前后形态学变化。
2.3向神经细胞方向诱导分化鉴定：(1)用PBS洗涤培养板细胞2次；(2)加入4％多聚甲醛固定15min；(3)用1‰PBS Triton洗涤2次；(4)加入封闭液封闭1h；(5)分别滴加适当浓度的一抗(nestin、GFAP)，37℃孵育1h；(6)PBS Triton洗2次；(7)加FITC标记的山羊抗鼠(150:1)，室温孵育1h；(8)加入Hoechst 33258 5min；(9)PBS冲洗2次；加入抗淬灭剂；(8)荧光显微镜下观察，拍照。
2.3神经细胞分化相关标记基因的检测：
诱导结束后，用Trizol提取两组细胞的RNA，按cDNA合成说明书合成cDNA,qPCR试剂盒进行qPCR实验，检测与神经细胞分化相关的NSE、nestin、GFAP、MAP2、NEFH 5种基因的表达情况，选人Gapdh基因为内参基因。针对上述基因的引物信息如表1。
表1针对5种标识基因及内参基因的引物信息
3数据分析：
所有数据均用x±s表示，统计分析软件SPSS19.0分析所有数据。P＜0.05认定为具有统计学意义。
4实验结果
4.1本实验形态学观察显示原代培养的脐带hUC MSCs呈成纤维样细胞,平行排列或旋涡状生长(图1)。
4.2诱导6天后：与对照组比较，终质浓度为10ug/ml的木犀草素诱导hESCs后，胞核增大，细胞呈分叉状改变，细胞伸出较多细长的突起，类似于神经细胞的树突和轴突，呈现出神经细胞样改变(图2)；细胞免疫荧光技术检测实验组大部分细胞神经标记物nestin、GFAP表达阳性，平均荧光分别强度为2.64、4.72，对照组有少量细胞nestin、GFAP表达阳性，平均荧光强度分别为0.24、0.46(图3和图4)。
4.3木犀草素对神经细胞标记物的影响
运用EXCEL软件计算出各组各基因2-△ct，经SPSS 19.0软件统计可得，所有数据均满足正态分布与方差齐性，故采用表示，两组比较选用配对T检验。
木犀草素对nestin、GFAP、MAP2、NEFH基因表达有明显影响(P＜0.05),对NSE的影响不明显。实验组nestin、GFAP、MAP2、NEFH mRNA为分别为对照组的2.08倍、1.64倍、1.93倍和6.76倍(表2)。
表2木犀草素对hUC MSCs的多个神经分化标识基因转录表达的影响(n＝4)
注：木犀草组组与对照组比较，其中“△”表示P＜0.05，“*”表示P＜0.01
5讨论
木犀草素诱导hUC MSCs后可以出现比较明显的神经细胞形态学改变。nestin为神经干细胞标志物，GFAP是神经胶质纤维酸性蛋白,是星形胶质细胞特异性抗原。诱导6天之后实验组大部分细胞神经标志蛋白nestin、GFAP表达阳性，nestin、GFAP、MAP2、NEFH等神经细胞特异性基因表达明显上调。
综上，木犀草素可以诱导hUC MSCs出现比较明显的神经细胞形态学改变，同时高表达nestin、GFAP、MAP2、NEFH等神经细胞特异性基因，说明木犀草素可以诱导hUC MSCs向神经细胞方向定向分化，诱导制备得到的细胞，可以做为治疗神经损伤的原材料，临床应用前景良好。
Claims (10)
1.木犀草素在诱导间充质干细胞向神经细胞定向分化中的用途。
2.木犀草素在制备诱导间充质干细胞向神经细胞定向分化的诱导液中的用途。
3.根据权利要求1或2所述的用途，其特征在于：所述间充质干细胞为脐带间充质干细胞。
4.诱导间充质干细胞向神经细胞定向分化的诱导液，其特征在于：它以常用细胞培养基为基础培养基，并添加有木犀草素。
5.根据权利要求4所述的诱导液，其特征在于：所述常用细胞培养基为α-MEM培养基、DMEM-高糖培养基、DMEM-低糖培养基、RPMI-1640培养基、DMEM/F12培养基或M-199培养基。
6.根据权利要求4或5所述的诱导液，其特征在于：所述木犀草素的浓度为10ug/ml。
7.根据权利要求4～6任意一项所述的诱导液，其特征在于：它是以DMEM/F12培养基为基础培养基，添加有DMEM/F12培养基1/9(v/v)的FBS和终浓度为10ug/ml的木犀草素。
8.一种诱导间充质干细胞向神经细胞定向分化的方法，其特征在于：包括如下步骤：
a、取间充质干细胞；
b、置于权利要求4～7任意一项所述的诱导液中培养，即可。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：步骤a中，所述间充质干细胞为脐带间充质干细胞；或者，步骤b中，培养的时间为6天。
10.权利要求8或9所述方法制备的细胞。
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