CN104293926B - 一种检测小鼠内耳祖细胞的标记分子及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种检测小鼠内耳祖细胞的标记分子，所述的标记分子为Npr3、Ucma和Ogn；本发明提供的细胞标记分子在小鼠内耳祖细胞中是特异性表达的，来自小鼠耳蜗基底膜，通过Phalanx小鼠基因表达谱的检测，表明Npr3、Ucma和Ogn三种基因具有显著的高水平表达，所述细胞标记分子可应用于小鼠内耳祖细胞的鉴定及小鼠内耳祖细胞的分选和纯化依据，可应用于内耳干细胞诱导产生的内耳祖细胞分选以及纯化研究。

Description

一种检测小鼠内耳祖细胞的标记分子及应用

(一)技术领域

本发明涉及一种内耳祖细胞鉴定，特别涉及一种组合式细胞标志分子鉴定小鼠内耳祖细胞的新型方法，该标记分子能特异性地鉴定分离和培养的内耳祖细胞。

(二)背景技术

哺乳动物内耳的前庭和耳蜗中存在内耳干细胞，内耳干细胞具有自我更新和多分化多潜能性，可以分化为感觉前体细胞、神经前体细胞以及非感觉前体细胞等三种不同类型的细胞。感觉前体细胞又称为内耳祖细胞。

内耳干细胞在特定的分化条件下可以分化为内耳祖细胞，内耳祖细胞可以在不同的诱导条件下进一步分化产生不同类型的细胞，包括毛细胞、支持细胞和神经元等。将内耳干细胞接种在多聚赖氨酸预先处理好的培养皿中，无血清贴壁培养7天之后，RT-PCR和免疫荧光检测表明分化之后的细胞表达内耳祖细胞相关基因和蛋白。将诱导分化7天之后的祖细胞进一步进行诱导分化。至第14天时，RT-PCR和免疫荧光检测表明诱导分化后有部分细胞表达毛细胞的特异性基因和蛋白。诱导产生的毛细胞可以特异性吸收小分子染料FM1-43，全细胞膜片钳检测发现其具有功能。内耳祖细胞是内耳毛细胞的前体细胞，在治疗感音性耳聋方面具有重要的应用价值。

但是到目前为止，对内耳祖细胞的研究依然非常稀少。这主要是由于内耳祖细胞的种子细胞即内耳干细胞的分离、培养以及纯化存在一定的困难；内耳干细胞体外诱导分化为祖细胞的成功率较低等原因造成的。目前用来鉴定内耳祖细胞的基因主要包括Pax-2及Pax-8，但是这两种基因在内耳干细胞和毛细胞的早期都有表达。同时这些基因还缺乏组织特异性，它们在其它的组织中也有表达。因此，到目前为止还缺乏针对内耳祖细胞的特异性分子标志。这对内耳祖细胞的分离、纯化以及鉴定造成了一定的困难。也是内耳祖细胞应用研究方面存在的一个技术瓶颈。

(三)发明内容

本发明目的是提供一种组合式细胞标记分子，并采用这种组合式细胞标记分子特异性地鉴定小鼠内耳祖细胞的方法。本发明是通过分离得到小鼠内耳耳蜗基底膜上的干细胞，在体外进行无血清悬浮培养获得克隆的小鼠内耳干细胞。将内耳干细胞无血清贴壁培养7天，诱导分化形成内耳祖细胞。提取小鼠内耳祖细胞的核糖核酸(RNA)进行小鼠基因表达谱芯片检测小鼠内耳祖细胞基因表达谱，然后筛选特异性候选基因。最后从新生P0天小鼠中提取出如大脑、肝脏、皮肤等10个不同组织的RNA，通过RT-PCR对候选的目的基因进行特异性检测，确定小鼠内耳祖细胞的特异性组合式细胞标记分子。

本发明采用的技术方案是：

本发明提供一种检测小鼠内耳祖细胞的标记分子，所述的标记分子为Npr3(核苷酸序列见序列7所示)、Ucma(核苷酸序列见序列8所示)和Ogn(核苷酸序列见序列9所示)。

本发明还提供一种所述检测小鼠内耳祖细胞的标记分子的应用，所述的应用为：从内耳干细胞体外诱导7天产生的细胞群体中分离单细胞，提取单细胞总RNA，反转录成cDNA，以cDNA为模板，分别以Npr3正向引物和Npr3反向引物，Ucma正向引物和Ucma反向引物，Ogn正向引物和Ogn反向引物作为三对引物进行PCR扩增，若Npr3正向引物和Npr3反向扩增产物708bp，Ucma正向引物和Ucma反向引物扩增产物181bp，且Ogn正向引物和Ogn反向引物扩增产物257bp，则单细胞为小鼠内耳祖细胞；

Npr3正向引物：5’-GGACGACATAGTGCGCTACA-3’；

Npr3反向引物：5’-TCTTCTAGGCCACATGATTTGC-3’；

Ucma正向引物：5’-TATGCTACAGGAGGGGACCA-3’；

Ucma反向引物：5’-CCTCTGTCTGTTTTCCGCATT-3’；

Ogn正向引物：5’-CCTGCTACTCTTCGTGCCTC-3’；

Ogn反向引物：5’-GGCATGTGGGCATTTCATCA-3’。

本发明所述内耳祖细胞按如下步骤获得：

(1)内耳干细胞分离和成球培养

解剖小鼠获得小鼠耳蜗基底膜后，将基底膜胰酶消化，用移液枪吹打散后，获得单细胞，然后将单细胞悬浮在内耳干细胞培养基中，在37℃、5％CO₂孵育箱中悬浮培养5-6天，形成内耳干细胞球。

本发明分离培养的小鼠内耳干细胞阳性表达Nestin、Abcg2、BMP-4及BMP-7等基因。

(2)内耳干细胞诱导分化为内耳祖细胞

用0.1mg/ml的多聚赖氨酸室温孵育培养皿5分钟，完全吸除多聚赖氨酸。用PBS彻底清洗培养皿3次，每次5分钟。将培养皿放入37℃孵育箱中过夜干燥。将P3代内耳干细胞接种在经多聚赖氨酸预先处理好的培养皿中，用内耳祖细胞培养基贴壁培养7天之后，形成内耳祖细胞。

本发明分离培养的小鼠内耳祖细胞阳性表达Pax-2、Pax8、BMP-4及BMP-7等基因。

(3)基因表达谱芯片检测基因表达谱与特异性候选基因筛选

对分离的内耳祖细胞RNA进行Phalanx小鼠基因表达谱检测(检测单位：上海仪方生物科技有限公司)。经对比内耳干细胞以及内耳毛细胞后，对内耳祖细胞差异表达性基因进行进一步分析，从内耳祖细胞中筛选出38个特异表达的基因。

(4)特异性组合式细胞标记分子验证

根据内耳祖细胞筛选的38种特异表达的基因，结合比较内耳干细胞及毛细胞中特异表达的基因，候选Npr3、Ucma和Ogn共3种基因，对小鼠大脑、肝脏、皮肤、肺、肠、胃、肾脏、肌肉、心脏及眼睛共10个不同的组织及器官进行RNA提取后，聚合酶链反应(PCR)检测这3种基因在不同组织细胞内的表达水平，验证出Npr3、Ucma和Ogn三种分子组合为小鼠内耳祖细胞最佳组合式细胞标记分子。通过小鼠不同组织3种候选基因的分子检测，只有在小鼠内耳祖细胞中Npr3、Ucma和Ogn这三种基因都是阳性表达的。因此这三种基因的组合阳性表达可作为小鼠内耳干细胞的分子标记。

本发明提供的细胞标记分子在小鼠内耳祖细胞中是特异性表达的，由内耳干细胞诱导产生，通过Phalanx小鼠基因表达谱的检测，表明Npr3、Ucma和Ogn三种基因具有显著的高水平表达，所述细胞标记分子可应用于小鼠内耳祖细胞的鉴定及小鼠内耳祖细胞的分选和纯化依据，亦可应用于内耳干细胞诱导产生的内耳祖细胞分选以及纯化研究。

本发明的有益效果是：

(1)本发明筛选出小鼠内耳祖细胞特异性的组合式细胞标记分子Npr3、Ucma和Ogn。

(2)以本发明提供的组合式细胞标记分子可以区分小鼠内耳祖细胞与其他组织来源的细胞。

(3)使用本发明提供的组合式细胞标记分子阳性表达可鉴定小鼠内耳祖细胞，为发展新的分离纯化技术提供依据。

(4)本发明提供的组合式细胞标记分子也可为其他物种内耳祖细胞特异性标记分子研究提供参考。

(四)附图说明

图1小鼠内耳干细胞球显微图，A行为100×放大倍数下，内耳干细胞在培养1、3、5天的形态，B行为250×放大倍数下，内耳干细胞在培养1、3、5天的形态；C行为用DAPI对培养1、3、5天的内耳干细胞球染色后，250×放大倍数下显微图。

图2小鼠内耳祖细胞显微图。

图3小鼠内耳祖细胞基因表达电泳图，泳道1为Marker，泳道2为GAPDH，泳道3为Pax-2，泳道4为BMP-4，泳道5为BMP-7，泳道6为Pax-8。

图4小鼠内耳祖细胞Pax-2与Pax-8双标激光共聚焦显微图，A为Pax-2抗体标志显微图，B为Pax-8抗体标志显微图，C为A与B的合并图。

图5候选基因在不同组织中的表达电泳图，泳道1为大脑，泳道2为肝脏，泳道3为皮肤，泳道4为肺，泳道5为肠，泳道6为胃，泳道7为肾脏，泳道8为肌肉，泳道9为心脏，泳道10为眼睛，泳道11为内耳祖细胞。

图6标志分子Npr3+Ucma+Ogn在不同类型细胞中的表达电泳图，泳道1为内耳干细胞体外诱导7天产生的细胞检测Npr3，泳道2为内耳干细胞体外诱导7天产生的细胞检测Ucma，泳道3为内耳干细胞体外诱导7天产生的细胞检测Ogn，泳道4为皮肤组织检测Npr3，泳道5皮肤组织检测Ucma，泳道6为皮肤组织检测Ogn，泳道7为肺组织检测Npr3，泳道8为肺组织检测Ucma，泳道9为肺组织检测Ogn。

(五)具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例1小鼠内耳干细胞的分离及培养

1)将ICR小鼠(浙江省医学科学院)在-20℃冰箱中麻醉5分钟，浸入75％酒精中杀菌。用手术剪将小鼠直接断头，去除皮毛。然后在无菌状态下中分头颅，去除大脑及脑干，充分暴露位于颅底的颞骨。仔细的用剪刀和镊子分离出颞骨，将其转移到装有4℃预冷PBS(pH值为7.4)的3.5cm培养皿中。显微镜下用镊子在耳蜗底部钻一个小孔，从下至上剖开螺壳，暴露完整的蜗轴和蜗管。用镊子夹住耳蜗管的最底部，将耳蜗管与蜗轴分离。由此得到的耳蜗管包括螺旋韧带、前庭膜、以及基底膜(包含Corti器)。将分离得到的耳蜗管转移到新鲜预冷的PBS中，进一步将包含Corti器的基底膜与前庭膜及螺旋韧带分离开。将基底膜转移到100μL0.05％(w/v)的胰酶(购自Gbico)中，37℃消化7分钟，加入100μl1mg/ml的大豆胰酶抑制剂(PBS缓冲液配制，购自Gbico，pH＝7.4)终止胰酶反应。

2)用量程为200μL的移液枪吹打步骤1)反应物30-40次，使单细胞从基底膜中脱落。细胞脱落后经70μm的细胞筛过滤，去除较大的组织残骸与碎片，得到几乎没有大细胞聚集的单细胞悬液。然后用内耳干细胞培养基稀释，细胞密度为10⁵/ml，获得稀释后的单细胞悬液。内耳干细胞培养基组成为：1％(v/v)B27(血清替代物B27)、2％(v/v)N2(血清替代物N2)、20ng/mLEGF(表皮生长因子)、50ng/mLbFGF(碱性成纤维细胞生长因子)、10ng/mLIGF-1(类胰岛素生长因子1)、50μg/ml青霉素，溶剂为DMEM/F12(购自Gbico)，DMEM/F12组成为DMEM和Ham'sF-12，pH值为7.4。

3)稀释后的单细胞悬液经70μm的细胞筛过滤，获得单细胞悬液。

4)取步骤3)获得的200μL单细胞悬液，用2mL内耳干细胞培养基稀释后在37℃、5％CO₂孵育箱中悬浮培养1-5天，其中内耳干细胞会形成内耳干细胞球，其它非干细胞的细胞由于生长条件的限制而逐渐凋亡。分别取50μL培养1、3和5天的内耳干细胞培养基滴于玻片上，在显微镜下分别放大100倍(图1中的A行)和250倍(图1中的B行)观察内耳干细胞球。同时，分别取50μL培养1、3和5天的内耳干细胞培养基，让其中的内耳干细胞球在玻片上贴壁后，用200μLDAPI试剂(Roche公司)孵育细胞球1-3分钟，进行DAPI染色，并放大250倍观察内耳干细胞球如图1中C行所示，每一个细胞球里有几十至数百个细胞。

实施例2内耳干细胞诱导分化为内耳祖细胞

1)将实施例1中培养5天形成的内耳干细胞球用量程为200μL的移液枪吹打成单细胞，1000rpm离心5分钟后收集细胞，然后200μL细胞用2mL内耳干细胞培养液重悬后，37℃下培养5天形成P2代内耳干细胞球。将P2代内耳干细胞继续传代，获得P3代内耳干细胞球。

2)用200μL0.1mg/ml的多聚赖氨酸(Sigma公司)37℃孵育培养皿5分钟，然后完全吸除多聚赖氨酸。用PBS漂洗培养皿3次，每次5分钟。将培养皿放入37℃孵育箱中干燥过夜。

3)将P3代内耳干细胞球以500球/ml的密度悬浮在内耳祖细胞培养基中，然后接种于上述用多聚赖氨酸预处理的培养皿中，在37℃、5％CO₂孵育箱中贴壁培养7天，形成含内耳祖细胞的培养液，将培养液1000rpm离心5分钟，获得内耳祖细胞，如图2。内耳祖细胞培养基组成为：1％(v/v)B27、2％(v/v)N2、50ng/mLFGF3(成纤维生长因子3)、50ng/mLFGF10(成纤维生长因子10)，溶剂为DMEM/F12(购自Gbico)，DMEM/F12组成为DMEM和Ham'sF-12，pH值为7.4。

实施例3内耳祖细胞基因表达检测

1)内耳祖细胞总RNA提取：将实施例2中含内耳祖细胞的培养液收集在15ml离心管中，1000rpm离心5分钟弃上清；加入1mLTRIzol(TakaRa公司)，置漩涡振荡器上震荡至内耳祖细胞完全溶解后，转移至1.5mlEP管(Axgen公司)中；加入200μL氯仿(国药集团化学试剂有限公司)，剧烈振荡混匀，室温放置5min；4℃下12,000rpm离心15min，吸取上层水相约300μL入新的1.5mlEP管中；加入等体积的异丙醇(国药集团化学试剂有限公司)，颠倒混匀，室温静置10min；4℃下12,000rpm离心10min，弃上清；用体积浓度75％的乙醇水溶液洗涤沉淀，4℃下12,000rpm离心5min，弃上清；室温干燥2-5min后，加入适量DEPC水(Sigma公司)溶解，获得内耳祖细胞总RNA，用于下一步实验或保存于-80℃冰箱。

2)cDNA第一链合成：内耳祖细胞总RNA用DNA酶(Sigma公司)消化处理清除残余的基因组DNA污染，用紫外分光光度计测定(波长为260nm)RNA浓度。cDNA第一链合成采用反转录试剂盒(Fermentas公司)，每个样品取2μg总RNA(0.5-1μL)用于第一链合成。具体步骤如下：2μg总RNA(0.5-1μL)、1μLoligo(dT)18引物和1μL随机引物，ddH₂O补至总体积12μL，置65℃反应5min；加入5×buffer4μL、dNTP2μL、ribolockTMRNaseinhibitor1μL和RevertAidTMM-MulV反转录酶1μL，反应总体积为20μL，25℃5min→42℃60min→70℃5min。合成的cDNA第一链用于下一步PCR反应。

3)PCR反应：将上述制备的cDNA第一链作为模板，分别进行RT-PCR扩增，所用引物序列见表1。PCR反应采用PCRMix试剂盒(上海翊圣生物技术有限公司)，PCR反应体系为：cDNA2μL、2mMdNTP1μL、10μM的上下游引物各1μL、10×buffer(含Mg²⁺)5μL和TaqDNA聚合酶1μL，加H₂O补至总体积50μL。PCR程序为：94℃预变性5min，94℃变性30s，53℃～62℃退火30s，72℃延伸30s，35循环，72℃延伸7min，退火温度和循环数根据引物的具体情况进行选择。反应完成后取5μL扩增产物加1μL溴酚兰指示剂(Sigma公司)，用1.2％的琼脂糖(Biowest公司)进行凝胶电泳。电泳完毕后，用凝胶成像分析系统观测结果如图3表明内耳干细胞体外诱导产生了内耳祖细胞。

表1用于RT-PCR的引物序列

实施例4内耳祖细胞Pax-2与Pax-8蛋白双标检测

在100mlPBS(Gbico，pH＝7.4)中加入4g多聚甲醛，配制成4％(w/v)多聚甲醛固定液。将实施例2中制备的内耳祖细胞悬浮在4％多聚甲醛固定液中，室温下放置15分钟，然后1000rpm离心5分钟，用4℃预冷PBS清洗细胞两遍；再用含0.25％(v/v)Triton-X100的PBS于室温(25℃)下孵育10分钟对细胞进行破膜处理，PBS清洗3遍，每遍5分钟；再经含1％(w/v)BSA的0.1％(v/v)PBST(100mlPBS缓冲液(Gbico，pH＝7.4)中加入100μLTween-20(Sigma公司))淹没细胞，室温(25℃)下封闭30分钟；完全吸出封闭液之后，用200μL含1％BSA的0.1％(v/v)PBST稀释Pax-2一抗(兔源多抗，Abcam公司；Pax-2一抗与含1％BSA的0.1％(v/v)PBST的稀释体积比为1：100)和Pax-8一抗(鼠源单抗，Abcam公司；Pax-8一抗与含1％BSA的0.1％(v/v)PBST的稀释体积比为1：10)，4℃孵育细胞过夜。吸出含有一抗的PBST溶液，PBS清洗细胞3遍，每遍5分钟；用含1％BSA的PBS稀释Alexafluor488绑定驴抗鼠二抗(Jackson；AlexaFluor488绑定驴抗鼠二抗与含1％BSA的PBS稀释比体积为1:400)和Alexafluor594绑定驴抗兔二抗(Jackson；AlexaFluor594绑定驴抗兔二抗与含1％BSA的PBS稀释体积比为1:400)，室温下孵育细胞1小时，PBS清洗细胞3遍，每遍5分钟，尽量洗去背景颜色。加入200μLDAPI(Roche公司)复染1分钟，激光共聚焦显微镜下观察如图4。图4为内耳干细胞诱导分化7天之后，检测Pax-2和Pax-8抗体表达情况。a为Pax-2抗体标志显微图，b是Pax-8抗体标记显微图，c是a与b合并图。内耳干细胞球诱导分化7天之后，绝大部分细胞表达Pax-2和Pax-8，说明绝大部分细胞诱导生成内耳祖细胞。

实施例5基因表达谱的检测

将3批内耳祖细胞RNA送上海仪方生物科技有限公司进行Phalanx小鼠基因表达谱的检测。

RNA样品的定量与纯度以NanoDropND-1000测定。纯度的吸光度质检标准为A260/A280≥1.8且A260/A230≥1.5。蛋白的吸收峰处于280nm，若比值过低表示样品中存在蛋白或酚类物质的影响；230nm吸收峰则是芳香基团、硫氰酸盐，或其他有机物质，A260/A230低于1.5则表示样本中可能存在一些污染。RIN值以安捷伦RNA6000nanoassay检测，检测RNA样本中18s与28s(真核生物)是否完整以判定RNA的完整性。RIN值在0-10之间，以10分为满分。RIN＞6表示样本的完整性良好可用于芯片实验。用于基因表达谱芯片检测的RNA质量检测如表2所示。

表2样品RNA质量检测

相对比较内耳干细胞以及内耳毛细胞，对内耳祖细胞差异表达性基因进行进一步分析，从内耳祖细胞中筛选出38个特异表达的基因如表3。表3说明了内耳祖细胞特异性标志基因在干细胞和毛细胞中的表达强度很低。

表3在内耳祖细胞中特异性表达基因的基本信息

注：参考序列号来自于NCBI，详情参照http://www.ncbi.nlm.nih.gov/。

实施例6特异性标志基因的验证

依据表3，筛选出在内耳祖细胞中表达的Npr3、Ucma和Ogn共3种基因。从小鼠分离大脑、肝脏、皮肤、肺、肠、胃、肾脏、肌肉、心脏及眼睛共10个不同的组织及器官。用液氮将组织研磨成粉状，加入1mlTrizol溶解。提取RNA后进行这3种基因的PCR检测，候选基因引物设计见表4。

表4候选特异性基因的引物设计

PCR结束之后进行琼脂糖凝胶电泳的检测，验证候选基因在不同组织中的表达情况如图5。根据候选基因验证结果，除了内耳祖细胞外，其它组织的细胞皆不能同时表达Npr3、Ucma和Ogn三种基因，由此确定Npr3、Ucma和Ogn三种基因的阳性表达为小鼠内耳祖细胞的组合式细胞标记分子。

实施例7内耳祖细胞的鉴定

1)将ICR小鼠(浙江省医学科学院)在-20℃冰箱中麻醉5分钟，浸入75％酒精中杀菌。用手术剪将小鼠直接断头，去除皮毛。然后在无菌状态下中分头颅，去除大脑及脑干，充分暴露位于颅底的颞骨。仔细的用剪刀和镊子分离出颞骨，将其转移到装有4℃预冷PBS(pH值为7.4)的3.5cm培养皿中。显微镜下用镊子在耳蜗底部钻一个小孔，从下至上剖开螺壳，暴露完整的蜗轴和蜗管。用镊子夹住耳蜗管的最底部，将耳蜗管与蜗轴分离。由此得到的耳蜗管包括螺旋韧带、前庭膜、以及基底膜(包含Corti器)。将分离得到的耳蜗管转移到新鲜预冷的PBS中，进一步将包含Corti器的基底膜与前庭膜及螺旋韧带分离开。将基底膜转移到100μL0.05％(w/v)的胰酶(购自Gbico)中，37℃消化7分钟，加入100μl1mg/ml的大豆胰酶抑制剂(PBS缓冲液配制，购自Gbico，pH＝7.4)终止胰酶反应。

2)用量程为200μL的移液枪吹打步骤1)反应物30-40次，使单细胞从基底膜中脱落。细胞脱落后经70μm的细胞筛过滤，去除较大的组织残骸与碎片，得到几乎没有大细胞聚集的内耳单细胞悬液。去除较大的组织残骸与碎片，得到几乎没有大细胞聚集的单细胞悬液。然后用内耳干细胞培养基稀释，细胞密度为10⁵/ml，获得稀释后的单细胞悬液。内耳干细胞培养基组成为：1％(v/v)B27、2％(v/v)N2、20ng/mLEGF、50ng/mLbFGF、10ng/mLIGF-1、50μg/ml青霉素，溶剂为DMEM/F12(购自Gbico)，DMEM/F12组成为DMEM和Ham'sF-12，pH值为7.4

3)稀释后的单细胞悬液经20μm的细胞筛过滤，获得单细胞悬液。

4)取步骤3)获得的200μL单细胞悬液，用2mL内耳干细胞培养基稀释后在37℃、5％CO₂孵育箱中悬浮培养1-5天，其中内耳干细胞会形成内耳干细胞球，其它非干细胞的细胞由于生长条件的限制而逐渐凋亡。

5)对内耳干细胞进行传代，将P3代内耳干细胞球接种于上述用多聚赖氨酸预处理的培养皿上，培养基更换为祖细胞培养基，在37℃、5％CO₂孵育箱中无血清贴壁培养7天。将培养后的细胞消化之后，吹打成单细胞，获得单细胞悬液。祖细胞培养基组成为：1％(v/v)B27、2％(v/v)N2、50ng/mLFGF3、50ng/mLFGF10，溶剂为DMEM/F12(购自Gbico)，DMEM/F12组成为DMEM和Ham'sF-12，pH值为7.4。

6)提取步骤4)获得的单细胞的RNA，进行Npr3、Ucma和Ogn三种基因表达的PCR检测。RNA的提取、cDNA第一链合成以及PCR反应同实施例3，同时提取小鼠皮肤细胞和肺组织细胞RNA并进行PCR检测作为对照。凝胶电泳见图6所示，泳道1、2和3为内耳干细胞体外诱导7天产生的细胞，泳道4、5和6为皮肤组织细胞，泳道7、8和9为肺组织细胞，依次对Npr3、Ucma和Ogn三种基因的检测。Npr3扩增产物长度为708bp，Ucma扩增产物长度为281bp，Ogn扩增产物长度为257bp。从图6可以看出，泳道4、5和6只表达Ogn，但不表达Npr3和Ucma；泳道7、8和9仅表达Npr3和Ucma，但是不表达Ogn。泳道1、2和3同时表达表达Npr3、Ucma和Ogn这三种基因，表明所检测的内耳干细胞体外诱导7天产生的细胞为内耳祖细胞。

Claims (2)

1.一种检测小鼠内耳祖细胞的标记分子，所述的标记分子为Npr3、Ucma和Ogn。

2.一种权利要求1所述检测小鼠内耳祖细胞的标记分子的应用，其特征在于所述的应用为：从小鼠耳蜗基底膜分离单细胞，提取单细胞总RNA，反转录成cDNA，以cDNA为模板，分别以Npr3正向引物和Npr3反向引物，Ucma正向引物和Ucma反向引物，Ogn正向引物和Ogn反向引物作为三对引物进行PCR扩增，若Npr3正向引物和Npr3反向扩增产物708bp，Ucma正向引物和Ucma反向引物扩增产物181bp，且Ogn正向引物和Ogn反向引物扩增产物257bp，则单细胞为小鼠内耳祖细胞；

Npr3正向引物：5’-GGACGACATAGTGCGCTACA-3’；

Npr3反向引物：5’-TCTTCTAGGCCACATGATTTGC-3’；

Ucma正向引物：5’-TATGCTACAGGAGGGGACCA-3’；

Ucma反向引物：5’-CCTCTGTCTGTTTTCCGCATT-3’；

Ogn正向引物：5’-CCTGCTACTCTTCGTGCCTC-3’；

Ogn反向引物：5’-GGCATGTGGGCATTTCATCA-3’。