CN104313131B

CN104313131B - 一种检测小鼠内耳毛细胞的标记分子及应用

Info

Publication number: CN104313131B
Application number: CN201410493237.8A
Authority: CN
Inventors: 王金福; 柳全文
Original assignee: Zhejiang University ZJU
Current assignee: Zhejiang University ZJU
Priority date: 2014-09-24
Filing date: 2014-09-24
Publication date: 2016-02-24
Anticipated expiration: 2034-09-24
Also published as: CN104313131A

Abstract

本发明公开了一种检测小鼠内耳毛细胞的标记分子及应用，所述的标记分子为Chrna9和Espnl；本发明筛选出小鼠内耳毛细胞特异性的细胞标记分子可以区分小鼠内耳毛细胞与其他组织来源的细胞，也可为其他物种内耳毛细胞特异性标记分子研究提供参考。

Description

一种检测小鼠内耳毛细胞的标记分子及应用

(一)技术领域

本发明涉及一种小鼠内耳毛细胞鉴定，特别涉及一种组合式细胞标记分子鉴定小鼠内耳毛细胞的新型方法，这种方法能特异性地鉴定分离和培养的小鼠内耳毛细胞。

(二)背景技术

哺乳动物内耳的前庭和耳蜗中存在内耳干细胞，内耳干细胞具有自我更新和多分化多潜能性，体外无血清贴壁培养可以形成内耳祖细胞。将内耳祖细胞与灭活的鸡胚椭圆囊间质细胞共培养，部分祖细胞可以分化成具有功能的成熟毛细胞，具有典型的毛细胞形态。

近年来的研究发现内耳干细胞具有多分化潜能，在特定的分化条件下可以发育成内耳毛细胞。首先，将内耳干细胞接种在经多聚赖氨酸预先处理好的培养皿中，无血清贴壁培养7天。RT-PCR和免疫荧光检测表明分化之后的细胞表达内耳发育相关基因和蛋白，形成内耳祖细胞。然后将内耳祖细胞接种在灭活的鸡胚椭圆囊间质细胞上。7天后，RT-PCR和免疫荧光检测表明诱导分化后有部分细胞表达毛细胞的特异性基因和蛋白。诱导产生的毛细胞可以吸收特异性分子染料FM1-43，全细胞膜片钳检测发现其具有功能。内耳毛细胞是机械刺激的受体，可以将声音刺激转化为电信号。功能敏感性毛细胞的丢失是导致感音性耳聋的主要原因。因此，毛细胞在治疗感音性耳聋方面具有重要的应用价值。

具有大量的纯度较高的细胞是分子和细胞生物学研究的基础。内耳毛细胞在内耳中数目较少；体外培养条件复杂；缺少特异性的表面蛋白，导致分离高纯度的毛细胞难度很大。因此，到目前为止，对毛细胞进行的相关研究还非常少。虽然目前有研究发现了一些不同物种内耳毛细胞表达的基因，但这些基因尚缺乏较强的组织特异性，例如成鼠分离的内耳毛细胞表达的MyosinVIIA，Espin以及Brn3c，在其他的组织中也有不同程度的表达。因此，到目前为止尚缺乏针对内耳毛细胞特异性的细胞标记分子，这对内耳毛细胞的分离和纯化以及鉴定造成了一定的困难，也是内耳毛细胞应用研究方面存在的一个技术瓶颈。

(三)发明内容

本发明目的是提供一种鉴定小鼠内耳毛细胞的标记分子，并采用这种细胞标记分子特异性地鉴定小鼠内耳毛细胞的方法。本发明是通过分离得到小鼠内耳耳蜗基底膜上的干细胞，在体外进行无血清悬浮培养获得克隆的小鼠内耳干细胞。将内耳干细胞无血清贴壁培养7天，诱导分化形成内耳祖细胞。再将内耳祖细胞接种在灭活的鸡胚椭圆囊间质细胞上共培养，7天后约有30-40％的内耳祖细胞分化成毛细胞。用小分子染料FM1-43特异性标志毛细胞，再通过流式细胞仪进行分选，得到纯度较高的毛细胞。提取小鼠内耳毛细胞的核糖核酸(RNA)进行小鼠基因表达谱芯片检测小鼠内耳毛细胞基因表达谱，然后筛选特异性候选基因。最后从新生小鼠中提取出如大脑、肝脏、皮肤等10个不同组织的RNA，通过RT-PCR对候选的目的基因进行特异性检测，确定小鼠内耳祖细胞的特异性组合式细胞标记分子。

本发明采用的技术方案是：

本发明提供一种检测小鼠内耳毛细胞的标记分子，所述的标记分子为Chrna9(核苷酸序列为序列5所示)和Espnl(核苷酸序列为序列6所示)。

本发明还提供一种所述的检测小鼠内耳毛细胞的标记分子在检测小鼠内耳毛细胞中的应用，所述的应用为：从小鼠耳蜗基底膜分离单细胞，提取单细胞总RNA，反转录成cDNA，以cDNA为模板，分别以Chrna9正向引物和Chrna9反向引物，Espnl正向引物和Espnl反向引物作为两对引物进行PCR扩增，若Chrna9正向引物和Chrna9反向引物扩增产物355bp，Espnl正向引物和Espnl反向引物扩增产物759bp，则单细胞为小鼠内耳毛细胞；

Chrna9正向引物：5’-AGCTGCGTCTCCAGTCATTC-3’；

Chrna9反向引物：5’-TGCTGTCTCTACGGCTTTGA-3；

Espnl正向引物：5’-GGTGGAGTGGTTACTCCGTG-3’；

Espnl反向引物：5’-GGCATGTGGGCATTTCATCA-3’。

本发明所述检测小鼠内耳毛细胞的标记分子按如下步骤筛选：

(1)内耳干细胞分离和成球培养

解剖小鼠获得小鼠耳蜗基底膜后，将基底膜胰酶消化，用移液枪吹打散后，获得单细胞，然后将单细胞悬浮在内耳干细胞培养基中，在37℃、5％CO₂孵育箱中悬浮培养5-6天，形成内耳干细胞球。

本发明分离培养的小鼠内耳干细胞阳性表达Nestin、Abcg2、Pax-2、BMP-4及BMP-7等基因。

(2)内耳干细胞诱导分化为内耳祖细胞

用0.1mg/ml的多聚赖氨酸室温孵育培养皿5分钟，完全吸除多聚赖氨酸。用PBS彻底清洗培养皿3次，每次5分钟。将培养皿放入37℃孵育箱中过夜干燥。将P3代内耳干细胞接种在经多聚赖氨酸预先处理好的培养皿中，用内耳祖细胞培养基贴壁培养7天之后，形成内耳祖细胞。

本发明分离培养的小鼠内耳祖细胞阳性表达Pax-2、BMP-4及BMP-7等基因。

(3)内耳祖细胞诱导分化为内耳毛细胞

将P3代鸡胚椭圆囊间质细胞接种在用明胶处理好的培养皿上。待基质细胞增长到整个玻片的90％的时候，用丝裂霉素(Sigma，2μg/mL)孵育箱中处理3小时。完全吸出丝裂霉素，用PBS漂洗处理后的细胞3次，然后作为饲养层细胞用于内耳干细胞的分化。将内耳祖细胞接种在灭活的鸡胚椭圆囊间质细胞上，用内耳毛细胞培养基诱导分化7天之后，部分内耳祖细胞诱导分化为内耳毛细胞。

小鼠内耳毛细胞阳性表达Math1、MyosinVIIA、Espin及Brn3c等基因。

(4)内耳毛细胞的流式分选

用DMEM/F12培养基稀释FM1-43(5μM，Sigma)染料，将诱导分化之后的样品放入染料中染色10秒钟。快速的吸出FM1-43，加入PBS快速清洗三遍，每遍5分钟。使用成分为50％Accutase(Invitrogen公司)+50％胰酶(0.05％)的混合消化液对样品进行消化。消化完成之后加入等体积的大豆来源胰酶抑制剂终止消化，用1mlEppendorf移液枪将样品吹打成单细胞悬液。

将经FM1-43染色的细胞悬液转移至15mL管中，1000rpm离心5分钟。离心完成之后，完全弃上清，加入1mLPBS重悬细胞。用40μm的滤器对细胞悬液进行过滤，除去较大的细胞团。过滤之后的细胞悬液进行二次离心，1000rpm离心5分钟之后完全去除上清。用含20％FBS的DMEM/F12培养基重悬细胞，将细胞悬液转移到无菌流式管中，在流式细胞分选仪中进行毛细胞分选。

(5)基因表达谱芯片检测基因表达谱与特异性候选基因筛选

将分选得到的内耳毛细胞RNA进行Phalanx小鼠基因表达谱检测(检测单位：上海仪方生物科技有限公司)。经对比内耳干细胞祖细胞以及内耳毛细胞后，对内耳毛细胞差异表达性基因进行进一步分析，从内耳毛细胞中筛选出31个特异表达的基因。

(6)特异性组合式细胞标记分子验证

根据内耳毛细胞筛选的31种特异表达的基因，结合比较内耳干细胞、祖细胞中特异表达的基因，候选Chrna9和Espnl共2种基因，对小鼠大脑、肝脏、皮肤、肺、肠、胃、肾脏、肌肉、心脏及眼睛共10个不同的组织及器官进行RNA提取后，聚合酶链反应(PCR)检测这2种基因在不同组织细胞内的表达水平，验证出Chrna9和Espnl两种分子组合为小鼠内耳毛细胞最佳组合式细胞标记分子。

本发明提供的Chrna9和Espnl两种细胞标记分子在小鼠内耳毛细胞中是特异性表达的，通过Phalanx小鼠基因表达谱的检测，表明Chrna9和Espnl两种基因具有显著的高水平表达。本发明提供的新型组合式细胞标记分子可应用于小鼠内耳毛细胞的鉴定，通过小鼠不同组织2种候选基因的检测分子，只有在小鼠内耳毛细胞中Chrna9和Espnl这两种基因都是阳性表达的，因此这两种基因的组合阳性表达可作为小鼠内耳毛细胞的标记分子，用于小鼠内耳毛细胞的分选和纯化依据及用于小鼠分离或体外培养扩增的内耳毛细胞分选以及纯化研究。

本发明的有益效果是：

(1)本发明筛选出小鼠内耳毛细胞特异性的组合式细胞标记分子Chrna9和Espnl。

(2)以本发明提供的组合式细胞标记分子可以区分小鼠内耳毛细胞与其它组织来源的细胞。

(3)使用本发明提供的组合式细胞标记分子阳性表达可鉴定小鼠内耳毛细胞，为发展新的分离纯化技术提供依据。

(4)本发明提供的组合式细胞标记分子也可为其他物种内耳毛细胞特异性标记分子研究提供参考。

(四)附图说明

图1小鼠内耳干细胞球显微图，A行为100×放大倍数下，内耳干细胞在培养1、3、5天的形态，B行为250×放大倍数下，内耳干细胞在培养1、3、5天的形态；C行为用DAPI对培养1、3、5天的内耳干细胞球染色后，250×放大倍数下显微图。

图2小鼠内耳祖细胞显微图。

图3鸡胚椭圆囊基质细胞显微图；A为原代鸡胚椭圆囊间质细胞，B为P3代鸡胚椭圆囊间质细胞，密度为80-90％。

图4小鼠内耳毛细胞显微图。

图5小鼠内耳毛细胞检测电泳图，泳道1为Marker，泳道2为GAPDH，泳道3为Myosin7a，泳道4为Espin，泳道5为Brn3c，泳道6为P27^kip1。

图6小鼠内耳毛细胞标志蛋白Myosin7a、Espin和Brn3c激光共聚焦显微图，A为毛细胞特异性蛋白Myosin7a抗体标志显微图；B为毛细胞特异性蛋白Espin抗体标志显微图；C为毛细胞特异性蛋白Brn3c抗体标志显微图。

图7为内耳毛细胞流式分选图，(A)为通过门控去除细胞悬液中的死细胞及细胞碎片；(B)为通过门控去除细胞悬液中的细胞聚集；(C)为通过门控去除细胞悬液中的粘连体；(D)没有细胞碎片和粘连体的细胞悬液，FM1-43阳性细胞通过门分选收集；(E)通过分析没有染色的对照组，来说明没有FM1-43荧光的背景图；(F)对分选出来的FM1-43阳性细胞，进行重新分选。

图8候选基因在不同组织中的表达电泳图，泳道1为大脑，泳道2为肝脏，泳道3为皮肤，泳道4为肺，泳道5为肠，泳道6为胃，泳道7为肾脏，泳道8为肌肉，泳道9为心脏，泳道10为眼睛，泳道11为内耳毛细胞。

图9标志分子Chrna9+Espnl在不同类型细胞中的表达电泳图，泳道1为内耳单细胞检测Chrna9，泳道2为内耳单细胞检测Espnl；泳道3为胃组织检测Chrna9，泳道4为胃组织检测Espnl；泳道5为肾脏组织检测Chrna9，泳道6为肾脏组织检测Espnl；泳道7为肌肉组织检测Chrna9，泳道8为肌肉组织检测Espnl。

(五)具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例1小鼠内耳干细胞的分离及培养

1)将ICR小鼠(浙江省医学科学院)在-20℃冰箱中麻醉5分钟，浸入75％酒精中杀菌。用手术剪将小鼠直接断头，去除皮毛。然后在无菌状态下中分头颅，去除大脑及脑干，充分暴露位于颅底的颞骨。仔细的用剪刀和镊子分离出颞骨，将其转移到装有4℃预冷PBS(pH值为7.4)的3.5cm培养皿中。显微镜下用镊子在耳蜗底部钻一个小孔，从下至上剖开螺壳，暴露完整的蜗轴和蜗管。用镊子夹住耳蜗管的最底部，将耳蜗管与蜗轴分离。由此得到的耳蜗管包括螺旋韧带、前庭膜、以及基底膜(包含Corti器)。将分离得到的耳蜗管转移到新鲜预冷的PBS中，进一步将包含Corti器的基底膜与前庭膜及螺旋韧带分离开。将基底膜转移到100μL0.05％(w/v)的胰酶(购自Gbico)中，37℃消化7分钟，加入100μl1mg/ml的大豆胰酶抑制剂(PBS缓冲液配制，购自Gbico，pH＝7.4)终止胰酶反应。

2)用量程为200μL的移液枪吹打步骤1)反应物30-40次，使单细胞从基底膜中脱落。细胞脱落后经70μm的细胞筛过滤，去除较大的组织残骸与碎片，得到几乎没有大细胞聚集的单细胞悬液。然后用内耳干细胞培养基稀释，细胞密度为10⁵/ml，获得稀释后的单细胞悬液。内耳干细胞培养基组成为：1％(v/v)B27(血清替代物B27)、2％(v/v)N2(血清替代物N2)、20ng/mLEGF(表皮生长因子)、50ng/mLbFGF(碱性成纤维细胞生长因子、10ng/mLIGF-1(类胰岛素生长因子1)、50μg/ml青霉素，溶剂为DMEM/F12(购自Gbico)，DMEM/F12组成为DMEM和Ham'sF-12，pH值为7.4。

3)稀释后的单细胞悬液经70μm的细胞筛过滤，获得单细胞悬液。

4)取步骤3)获得的200μL单细胞悬液，用2mL内耳干细胞培养基稀释后在37℃、5％CO₂孵育箱中悬浮培养1-5天，其中内耳干细胞会形成内耳干细胞球，其它非干细胞的细胞由于生长条件的限制而逐渐凋亡。分别取50μL培养1、3和5天的内耳干细胞培养基滴于玻片上，在显微镜下分别放大100倍(图1中的A行)和250倍(图1中的B行)观察内耳干细胞球。同时，分别取50μL培养1、3和5天的内耳干细胞培养基，让其中的内耳干细胞球在玻片上贴壁后，用200μLDAPI试剂(Roche公司)孵育细胞球1-3分钟，进行DAPI染色，并放大250倍观察内耳干细胞球如图1中C行所示，每一个细胞球里有几十至数百个细胞。

实施例2内耳干细胞诱导分化为内耳祖细胞

1)将实施例1中培养5天形成的内耳干细胞球用量程为200μL的移液枪吹打成单细胞，并1000rpm离心5分钟后收集细胞，然后细胞用2mL内耳干细胞培养液重悬后，37℃下培养5天形成P2代内耳干细胞球。将P2代内耳干细胞继续传代，获得P3代内耳干细胞球。

2)用200μL0.1mg/ml的多聚赖氨酸(Sigma公司)孵育培养皿5分钟，然后完全吸除多聚赖氨酸。用PBS漂洗培养皿3次，每次5分钟。将培养皿放入37℃孵育箱中干燥过夜。

3)将P3代内耳干细胞球以500球/ml的密度悬浮在内耳祖细胞培养基中，然后接种于上述用多聚赖氨酸预处理的培养皿中，在37℃、5％CO₂孵育箱中贴壁培养7天，形成含内耳祖细胞的培养液，将培养液1000rpm离心5分钟，获得内耳祖细胞，如图2。内耳祖细胞培养基组成为：1％(v/v)B27、2％(v/v)N2(、50ng/mLFGF3(成纤维细胞生长因子3)、50ng/mLFGF10(成纤维细胞生长10)，溶剂为DMEM/F12(购自Gbico)，DMEM/F12组成为DMEM和Ham'sF-12，pH值为7.4。

实施例3鸡胚椭圆囊基质细胞的分离与培养

1)在显微镜下分离出20个胚胎期(E18)鸡胚的椭圆囊，用0.5mg/ml的嗜热菌蛋白酶(Sigma，DMEM/F12稀释)在37℃下处理40分钟。加入5％(v/v)的血清终止消化后去掉椭圆囊的感觉上皮。

2)用PBS(pH值为7.4)清洗20个剩余的椭圆囊基质部分，然后将其转移到200μLPBS中。加入200μL0.25％(w/v)的胰酶/EDTA(购自Gbico)，37℃消化7分钟。加入400μL含10％(v/v)FBS的DMEM/F12培养基终止消化。

3)用Eppendorf移液枪轻柔的吹打鸡胚椭圆囊基质组织，将基质细胞分离出来接种在10cm培养皿中，培养液为含10％(v/v)FBS的DMEM/F12，37℃培养至椭圆囊基质细胞长到整个培养皿的80-90％(图3)的时候进行传代。

4)传代时，先完全吸除培养基，然后加入2mL0.25％(w/v)的胰酶/EDTA(购自Gbico)，37℃消化7分钟。加入4mL含10％(v/v)FBS的DMEM/F12培养基终止消化。用Eppendorf移液枪轻柔的将细胞吹打成单细胞悬液。用70μm细胞筛过滤细胞悬液，除去较大的组织。将细胞接种10cm培养皿中，37℃培养至椭圆囊基质细胞长到整个培养皿的80-90％的时候进行下一次传代。细胞继续扩增两代，然后进行冻存，冻存液为90％(v/v)血清加10％(v/v)的DMSO，每毫升冻存液中冻存1×10⁶个细胞。

实施例4内耳祖细胞诱导分化为内耳毛细胞

1)将明胶加入到24孔培养板中，37℃孵育半小时。然后完全吸除明胶，将实施例3制备的P3代鸡胚椭圆囊间质细胞接种在用明胶处理好的培养板中。37℃培养至基质细胞增长到整个培养板面积的90％的时候，加入200μL含丝裂霉素(Sigma，2μg/mL)的培养基(含10％FBS的DMEM/F12)，37℃在孵育箱中孵育3小时。完全吸除培养基，然后用PBS(pH值7.4)漂洗细胞3次，每次5分钟，获得灭活的鸡胚椭圆囊间质细胞。

2)将实施例2制备的内耳祖细胞接种在灭活的鸡胚椭圆囊间质细胞上，用内耳毛细胞诱导培养基在37℃下诱导分化7天，部分细胞分化为内耳毛细胞，具有毛细胞的形态，如图4。内耳毛细胞培养基组成为：1％(v/v)B27、2％(v/v)N2、5μMDAPT(Sigma公司)，溶剂为DMEM/F12(购自Gbico)，DMEM/F12组成为DMEM和Ham'sF-12，pH值为7.4。

实施例5诱导分化的内耳毛细胞基因表达检测

1)分化后细胞总RNA提取：将实施例4中祖细胞分化7天之后形成的含毛细胞的细胞群体收集在15ml离心管中，1000rpm离心5分钟弃上清；加入1mLTRIzol(TakaRa公司)，置漩涡振荡器上震荡至细胞完全溶解后，转移至1.5mlEP管(Axgen公司)中；加入200μL氯仿(国药集团化学试剂有限公司)，剧烈振荡混匀，室温放置5min；4℃下12,000rpm离心15min，吸取上层水相约300μL入新的1.5mlEP管中；加入等体积的异丙醇(国药集团化学试剂有限公司)，颠倒混匀，室温静置10min；4℃下12,000rpm离心10min，弃上清；用体积浓度75％的乙醇水溶液洗涤沉淀，4℃下12,000rpm离心5min，弃上清；室温干燥2-5min后，加入适量DEPC水(Sigma公司)溶解，即为总RNA样品，用于下一步实验或保存于-80℃冰箱。

2)cDNA第一链合成：总RNA样品用DNA酶(Sigma公司)消化处理清除残余的基因组DNA污染，用紫外分光光度计测定(波长为260nm)RNA浓度。cDNA第一链合成采用反转录试剂盒(Fermentas公司)，每个样品取2μg总RNA(0.5-1μL)用于第一链合成。具体步骤如下：2μg总RNA(0.5-1μL)、1μLoligo(dT)18引物和1μL随机引物，ddH₂O补至总体积12μL，置65℃反应5min；加入5×buffer4uL、dNTP2μL、ribolockTMRNaseinhibitor1μL和RevertAidTMM-MulV反转录酶1μL，反应总体积为20uL，25℃5min→42℃60min→70℃5min。合成的cDNA第一链用于下一步PCR反应。

3)PCR反应：将上述制备的cDNA第一链作为模板进行RT-PCR扩增，所用引物序列见表1。PCR反应采用PCRMix试剂盒(上海翊圣生物技术有限公司)，PCR反应体系为：cDNA2μL、2mMdNTP1μL、10μM的上下游引物各1μL、10×buffer(含Mg²⁺)5μL和TaqDNA聚合酶1μL，加H₂O补至总体积50μL。PCR程序为：94℃预变性5min，94℃变性30s，53℃～62℃退火30s，72℃延伸30s，35循环，72℃延伸7min，退火温度和循环数根据引物的具体情况进行选择。反应完成后取5μL扩增产物加1μL溴酚兰指示剂(Sigma公司)，用1.2％的琼脂糖(Biowest公司)进行凝胶电泳。电泳完毕后，用凝胶成像分析系统观测结果如图5。表明实施例4中的内耳祖细胞经诱导分化之后，部分细胞分化为毛细胞。

表1用于RT-PCR的引物序列

实施例6内耳毛细胞蛋白表达检测

1)将实施例2制备的内耳祖细胞接种在灭活的鸡胚椭圆囊间质细胞上(24孔板中玻片上培养)(同实施例4)，加入与实施例4中相同的内耳毛细胞诱导培养基，在37℃诱导分化7天，将培养液1000rpm离心5分钟后，弃上清，获得内耳含毛细胞的细胞群体，做MyosinVIIA、Espin和Brn3c免疫细胞化学检测。

2)免疫细胞化学：在100mlPBS(Gbico，pH＝7.4)中加入4g多聚甲醛，配制成4％(w/v)多聚甲醛固定液。然后将200μL4％(w/v)多聚甲醛固定液加到步骤1)的24孔板中固定细胞15分钟，再用4℃预冷PBS(pH值为7.4)清洗细胞两遍，每遍5分钟；加入含0.25％(v/v)Triton-X100(GIBCO公司)的PBS，于室温(25℃)下孵育10分钟，对细胞进行破膜处理，PBS清洗3遍，每遍5分钟；再经含1％(w/v)BSA的0.1％(v/v)PBST(100mlPBS缓冲液(Gbico，pH＝7.4)中加入100μLTween-20(Sigma公司))淹没细胞，室温(25℃)下封闭30分钟。完全吸出封闭液之后，用200μL含1％BSA的0.1％(v/v)PBST分别稀释MyosinVIIA(兔源多抗，Abcam公司；MyosinVIIA一抗与含1％BSA的0.1％(v/v)PBST的稀释比为1：200)、Espin(兔源多抗，SantaCruz公司；Espin一抗与含1％BSA的0.1％(v/v)PBST的稀释比为1：200)和Brn3c(鼠源多抗，Abcam公司；1:32)一抗，用稀释后的一抗覆盖封闭后的细胞，4℃孵育细胞过夜。完全吸除含有一抗的PBST溶液，PBS清洗3遍，每遍5分钟。用含1％BSA的PBS稀释Alexafluor488绑定驴抗鼠(Jackson；AlexaFluor488绑定驴抗鼠二抗与含1％BSA的PBS稀释比为1:400)或Alexafluor594绑定驴抗兔(Jackson；AlexaFluor594绑定驴抗兔二抗与含1％BSA的PBS稀释比为1:400)的二抗，室温下孵育细胞1小时，PBS清洗3遍，每遍5分钟，尽量洗去背景颜色。加入200μLDAPI(Roche公司)复染1分钟，激光共聚焦显微镜下观察如图6。图6是内耳祖细胞在鸡胚椭圆囊基质细胞上诱导分化7天之后检测毛细胞标志蛋白MyosinVIIA、Espin和Brn3c抗体表达情况。A为MyosinVIIA抗体标志显微图，B为Espin抗体标志显微图，C为Brn3c抗体标志显微图。说明有部分内耳祖细胞诱导分化之后形成内耳毛细胞。

实施例7内耳毛细胞流式分选

1)用DMEM/F12培养基稀释FM1-43(5μM，Sigma)染料，对诱导分化后的样品(实施例4)染色10s。染色完成之后，快速的吸出FM1-43。加入PBS清洗3遍，每遍5分钟，去除残留的染料。

2)用成分为50％(v/v)Accutase+50％(v/v)胰酶(0.05％)的混合消化液对步骤1)染色后的样品进行消化。将混合消化液加入样品之后，放入37℃孵育箱消化7分钟。消化完成之后加入等体积的大豆来源胰酶抑制剂(购自Sigma，PBS缓冲液配制，pH＝7.4)终止消化，用1mlEppendorf移液枪将样品吹打成单细胞悬液。

3)用40μm的滤器对细胞悬液进行过滤，除去较大的细胞团。过滤之后的细胞悬液进行离心，1000rpm离心5分钟之后完全去除上清。用含20％(v/v)FBS(胎牛血清)的DMEM/F12培养基重悬细胞，将细胞悬液转移到无菌流式管中，在流式细胞分选仪(BDFACSArial，购自BDBiosciences公司)中进行毛细胞分选。图7为内耳祖细胞在鸡胚椭圆囊基质细胞上诱导分化7天之后，经流式细胞分选仪进行分选。A为通过门控去除细胞悬液中的死细胞和细胞碎片，B和C为通过门控去除细胞悬液中的粘连体，D为分选出荧光信号较强的毛细胞(HC)，E为没有进行FM1-43标志的对照组，E为对分选出来的毛细胞进行充分选，证明分选出来的毛细胞纯度达到96.4％。

实施例8基因表达谱的检测

将3批内耳毛细胞RNA送上海仪方生物科技有限公司进行Phalanx小鼠基因表达谱的检测。

RNA样品的定量与纯度以NanoDropND-1000测定。纯度的吸光度质检标准为A260/A280≥1.8且A260/A230≥1.5。蛋白的吸收峰处于280nm，若比值过低表示样品中存在蛋白或酚类物质的影响；230nm吸收峰则是芳香基团、硫氰酸盐，或其他有机物质，A260/A230低于1.5则表示样本中可能存在一些污染。RIN值以安捷伦RNA6000nanoassay检测，检测RNA样本中18s与28s(真核生物)是否完整以判定RNA的完整性。RIN值在0-10之间，以10分为满分。RIN＞6表示样本的完整性良好可用于芯片实验。用于基因表达谱芯片检测的RNA质量检测如表2所示。

表2样品RNA质量检测

相对比较内耳干细胞、祖细胞，对内耳毛细胞差异表达性基因进行进一步分析，从内耳干细胞中筛选出31个特异表达的基因如表3。

表3在内耳干细胞中特异性表达基因的基本信息

注：参考序列号来自于NCBI，详情参照http://www.ncbi.nlm.nih.gov/。

实施例9特异性标志基因的验证

依据表3筛选出在内耳毛细胞中表达的Chrna9和Espnl共2种基因。从小鼠分离大脑、肝脏、皮肤、肺、肠、胃、肾脏、肌肉、心脏及眼睛共10个不同的组织及器官。用液氮将组织研磨成粉状，加入1mlTrizol溶解。提取总RNA后进行这2种基因的PCR检测，RNA的提取、cDNA第一链合成以及PCR反应同实施例4。候选基因引物设计见表4。

表4候选特异性基因的引物设计

PCR结束之后进行琼脂糖凝胶电泳的检测，验证候选基因在不同组织中的表达情况如图8。根据候选基因验证结果，除了内耳毛细胞外，其他组织的细胞皆不能同时表达Chrna9和Espn这两种基因。确定Chrna9和Espnl两种基因的阳性表达为小鼠内耳毛细胞的组合式细胞标记分子。结合图说明结论。

实施例10内耳毛细胞的鉴定

1)将待测ICR小鼠(浙江省医学科学院)在-20℃冰箱中麻醉5分钟，浸入75％酒精中杀菌。用手术剪将小鼠直接断头，去除皮毛。然后在无菌状态下中分头颅，去除大脑及脑干，充分暴露位于颅底的颞骨。仔细的用剪刀和镊子分离出颞骨，将其转移到装有4℃预冷PBS(pH值为7.4)的3.5cm培养皿中。显微镜下用镊子在耳蜗底部钻一个小孔，从下至上剖开螺壳，暴露完整的蜗轴和蜗管。用镊子夹住耳蜗管的最底部，将耳蜗管与蜗轴分离。由此得到的耳蜗管包括螺旋韧带、前庭膜、以及基底膜(包含Corti器)。将分离得到的耳蜗管转移到新鲜预冷的PBS中，进一步将包含Corti器的基底膜与前庭膜及螺旋韧带分离开。将基底膜转移到100μL0.05％(w/v)的胰酶(购自Gbico)中，37℃消化7分钟，加入100μl1mg/ml的大豆胰酶抑制剂(PBS缓冲液配制，购自Gbico，pH＝7.4)终止胰酶反应。

2)用量程为200μL的移液枪吹打步骤1)反应物30-40次，使单细胞从基底膜中脱落。细胞脱落后经70μm的细胞筛过滤，去除较大的组织残骸与碎片，得到几乎没有大细胞聚集的内耳单细胞悬液。去除较大的组织残骸与碎片，得到几乎没有大细胞聚集的单细胞悬液。然后用内耳干细胞培养基稀释，细胞密度为10⁵/ml，获得稀释后的单细胞悬液。内耳干细胞培养基组成为：1％(v/v)B27、2％(v/v)N2、20ng/mLEGF、50ng/mLbFGF、10ng/mLIGF-1、50μg/ml青霉素，溶剂为DMEM/F12(购自Gbico)，DMEM/F12组成为DMEM和Ham'sF-12，pH值为7.4

3)提取步骤2)获得的内耳单细胞的RNA，进行Chrna9和Espnl两种基因表达的PCR检测。RNA的提取、cDNA第一链合成以及PCR反应同实施例4。同时提取小鼠胃组织、肾脏组织和肌肉组织RNA并进行PCR检测作为对照。凝胶电泳见图9所示，泳道1和2为内耳单细胞，泳道3和4为胃组织，泳道5和6为肾脏组织，泳道7和8为肌肉组织。依次对应Chrna9和Espnl两种基因的检测。Chrna9扩增产物长度为355bp，Espnl扩增产物长度为759bp。从图9中可以看出，泳道3和4不表达Chrna9和Espnl；泳道5和6只表达Espnl，不表达Chrna9；泳道7和8只表达Chrna9，不表达Espnl。泳道1和2同时表达Chrna9和Espnl这两种基因，表明检测的内耳单细胞为内耳毛细胞。

Claims

1.一种检测小鼠内耳毛细胞的标记分子，其特征在于所述的标记分子为Chrna9和Espnl。

2.一种权利要求1所述的检测小鼠内耳毛细胞的标记分子的应用，其特征在于所述的应用为：从小鼠耳蜗基底膜分离单细胞，提取单细胞总RNA，反转录成cDNA，以cDNA为模板，分别以Chrna9正向引物和Chrna9反向引物，Espnl正向引物和Espnl反向引物作为两对引物进行PCR扩增，若Chrna9正向引物和Chrna9反向引物扩增产物355bp，Espnl正向引物和Espnl反向引物扩增产物759bp，则单细胞为小鼠内耳毛细胞；

Chrna9正向引物：5’-AGCTGCGTCTCCAGTCATTC-3’；

Chrna9反向引物：5’-TGCTGTCTCTACGGCTTTGA-3；

Espnl正向引物：5’-GGTGGAGTGGTTACTCCGTG-3’；

Espnl反向引物：5’-GGCATGTGGGCATTTCATCA-3’。