CN109750000A - 利用XistTale抑制性转录因子R6制备新型动物细胞系R6-MEFs方法及用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种利用Xist Tale抑制性转录因子R6制备新型动物细胞系R6‑MEFs的方法及新型动物细胞系R6‑MEFs的用途。R6‑MEFs是介于野生型MEFs和小鼠多能性干细胞系之间的、可传50代次以上的一种具有自我更新能力的新型动物细胞系；这种利用Xist Tale抑制性转录因子R6制备新型细胞系的方法可推广到人、大鼠和其他实验动物。新型动物细胞系R6‑MEFs的细胞特性为癌症研究及治疗、干细胞诱导研究和动物育种模型的建立提供了新材料和新思路。

Description

利用Xist Tale抑制性转录因子R6制备新型动物细胞系R6- MEFs方法及用途

技术领域

本发明属生物技术领域，涉及一种利用结合Xist第一内含子区的Tale抑制性转录因子制备新型动物细胞系(R6-MEFs)的方法及新型动物细胞系R6-

MEFs的用途。

背景技术

Xist(X-inactivation-specific transcript)是真哺乳亚纲动物雌性细胞中X染色体失活所必需的一种长链非编码RNA(lncRNA)。在X染色体失活的过程中，Xist扮演了一个重要的角色，它连同另外两个RNA基因(Jpx和

Ftx)和两个蛋白质基因(Tsx和Cnbp2)组成了X染色体失活中心(XIC的英文全称Xchromosome inactivation centre，XIC)。在雌性哺乳类细胞中，Xist 在失活X染色体上表达量上调，在失活染色体上起到较为关键的作用，对于调控X染色体失活起到了巨大的作用。X染色体失活发生在雌性哺乳动物中的早期胚胎发育阶段，其转录沉默一对X染色体中的一个，从而提供雄性和雌性之间的剂量等价，即剂量补偿效应。Xist在细胞重编程中发挥作用主要是通过转录成的Xist RNA缠绕将要失活的X染色体并使其沉默。被包裹的X染色体启动一系列的失活路径，包括启动DNA甲基化、组蛋白修饰等生物学反应，实现X 染色体的失活。同时，一旦失活的X染色体需要进行重活化时，Xist RNA的转录水平则会受到抑制，以便于失活X染色体的重活化。

Xist在多能干细胞中的表达沉默，与多能性因子OCT4，SOX2和NANOG有着重要的关系。在胚胎干细胞中，多能性调控因子OCT4、SOX2和NANOG等结合到Xist第一内含子区，以调控和维持Xist RNA的低水平状态。最近研究发现，在Xist第一内含子区结合的因子还包括多能性调控因子TCF3和PRDM14，以及早期胚胎发育调控因子CDX2等。此外，多能性因子出现直接与Xist调节相关，在Nanog缺失或Oct4的诱导阻遏时，Xist被上调，并且多能性因子对第一内含子的结合功能丧失。

类转录激活效应物(Transcriptional-activator-like effectors, TALEs)蛋白家族是来自于植物病原体-黄单胞杆菌的天然细菌效应蛋白。它与真核生物的转录因子相似，通过识别特异DNA序列来调节宿主基因转录，并促进细菌定植。人工体外合成的TALEs蛋白已经运用到基因工程的多个方面，包含具有基因组剪辑作用的类转录激活因子效应物核酸酶(TALEN)和起基因转录修饰和调控作用的Tale-dTFs等，其中Tale-dTFs包含抑制性效应因子(TALE based designer transcription Repressors,Tale R-dTF)和激活性效应因子 (TALE based designer transcription activators,Tale A-dTF)，它们的TALE 蛋白分别与抑制结构域(如KRAB等)和激活结构域(如VP64)相连接，最终通过在结合位点募集各种不同的转录调控因子而达到改变结合位点的表观遗传修饰状态并调控靶基因开关的目的。而且，Tale-dTFs已成功地应用于MEF细胞的重编程及干细胞的分化、转分化实验中。

而结合于Xist第一内含子区的基于类转录激活效应物的抑制性体外转录因子(Transcriptional-activator-like effectors based designer TranscriptionFactors,Tale-dTFs)Repressor 6(以下称R6)显著提高了小鼠胚胎成纤维细胞(mouseembryonic fibroblast,MEF)向iPSC的诱导效率。

因此，利用结合于Xist第一内含子的Tale抑制性转录因子R6建立新型动物细胞系成为可能。

发明内容

本发明提供一种利用Xist Tale抑制性转录因子制备了新型动物细胞系R6- MEFs的方法，利用R6成功制备了具有自我更新能力、可传代至50次以上的新型动物细胞系R6-MEFs，该细胞的潜在特性为癌症的研究及治疗、干细胞诱导研究和动物育种模型的建立提供了新材料和新思路。

本发明采用的技术方案是：一种利用Xist Tale抑制性转录因子R6制备新型动物细胞系R6-MEFs的方法，其特征在于：包括以下步骤：

1)载体制备及细胞建系：

利用小鼠Oct4Tale R-dTF载体改造为特异性识别和结合Xist第一内含子区的Tale R-dTF(R6)，最终形成的R6为PB载体携带的由Doxycycline (Dox)依赖型启动子TRE驱动的表达载体；

在体外条件下，获取携带Oct4-GFP基因的胎鼠成纤维细胞MEFs；

2)获得新型动物细胞系R6-MEFs：

A、Oct4-GFP MEFs的脂质体转染：

将携带Oct4-GFP基因的胎鼠成纤维细胞MEFs使用M10培养液培养于六孔板中，转染30min前更换为新鲜的M15培养液2mL，放入培养箱中等待转染；携带Oct4-GFP基因的胎鼠成纤维细胞MEFs达到40％-60％汇合度时，将500μL 转染体系加入M15培养液中，置于37℃、5％CO2培养箱中培养，进行脂质体转染；

B、脂质体转染后R6-MEFs的诱导及建系：

a、脂质体转染后第二天将M15培养液更换为M15+Dox培养液培养，放入 37℃，5％CO₂培养箱中培养；

b、脂质体转染后第三天荧光显微镜检测转染效率：转染成功的细胞表达红色荧光蛋白，更换新的M15+Dox+puro培养液，筛选具有转基因的细胞，培养细胞三天后，绝大多数非转基因细胞凋亡；

c、第六天更换为M15+Dox培养液培养，直至汇合度达到80％时，按照1： 40进行传代培养；隔天进行细胞生长情况的观察，并在液体发黄时更换 M15+Dox培养液；

d、细胞生长速度较快并且形成明显克隆的细胞，将其单克隆传入6孔板进行建系，建系成功后按比例1：40传代和冻存；

所述M10培养液的配制如下：

含有10％胎牛血清、1×谷氨酰胺、1×非必需氨基酸、1×青链霉素的 KnockoutDMEM。

所述M15培养液的配制如下：

含有15％胎牛血清、1×谷氨酰胺、1×非必需氨基酸、1×青链霉素、 0.1mMβ-巯基乙醇和106U/ml LIF的Knockout DMEM。

所述M15+Dox培养液为添加2μg/mL Doxcycline的M15培养液；

所述M15+Dox+puro培养液为添加2μg/mL Doxcycline和2μg/mL puromycin的M15培养液。

所述步骤A中转染体系由250μL A液和250μL B液组成：A液组成成分包含245μL的OPTI-MEM和5μL的脂质体转染试剂Lipofectamine 2000；B 液组成成分包含250μL的OPTI-MEM和转染载体，A液和B液配好后分别充分混匀，于室温孵育5min；然后将A、B液混匀静置，室温孵育30min。

所述转染载体为转座酶HyBase 1μg，CAG-rtTA 1μg，PGK-Puro 1μg 和携带mCherry的R6载体2μg。

所述步骤A的R6载体的结合位点如下：TTAAGTGTTATGGACAAGGA， GeneBank中参考基因序列号：NC_000086.7；

所述步骤B中利用R6建立R6-MEFs，需以低密度接种转基因细胞进行传代和诱导。

一种利用Xist Tale抑制性转录因子R6制备新型动物细胞系R6-MEFs的方法得到的R6-MEFs细胞系用于癌症治疗、干细胞诱导和动物育种模型。

本发明的有益效果是：该新型动物细胞系R6-MEFs生长速率明显高于WT- MEFs，且具有自我更新的能力，该特性与干细胞或癌细胞相似，且多能性基因具有不同程度的上调。因此，该新型动物细胞系R6-MEFs为癌症研究及治疗、干细胞诱导研究和动物育种模型的建立提供了新材料和新思路。这种利用Xist Tale抑制性转录因子R6制备新型动物细胞系的方法可试图推广到人、大鼠和其他实验动物。

附图说明

图1是本发明具体技术流程；

图2是本发明中Xist Tale抑制性效应因子R6的结构示意图；

图3是本发明中所使用载体在Xist基因上的结合位点；

图4是本发明获得新型动物细胞系R6-MEFs的部分过程，比例尺均为200 μm；

图5是R6-MEFs的生长曲线图；

图6是本发明中获得的R6-MEFs的细胞特性图；

图7是本发明中获得的R6-MEFs细胞系的核型检测分析结果。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细说明：

本发明利用Xist Tale抑制性转录因子R6制备新型动物细胞系R6-MEFs。实验中所需0.05％Trypsin-EDTA(1X)的生产厂家为gibco，货号是25300-054； RNA提取试剂盒为Cat.No.LS1040，生产厂家是：Promega；制备cDNA的试剂盒为Cat.No.A5000生产厂家是：Promega。

利用结合于Xist第一内含子区的Tale抑制性转录因子R6脂质体转染WT- MEFs，R6具体的结合位点如下：TTAAGTGTTATGGACAAGGA SEQ ID NO.1， GeneBank中参考基因序列号：NC_000086.7。

本发明中使用了2种培养基，具体配制方法如下：

1、小鼠胎儿成纤维细胞用液体培养基M10的配制：

含有10％胎牛血清、1×谷氨酰胺、1×非必需氨基酸、1×青链霉素的 KnockoutDMEM；

2、R6-MEFs培养基M15的配制：

含有15％胎牛血清、1×谷氨酰胺、1×非必需氨基酸、1×青链霉素、 0.1mMβ-巯基乙醇和106U/ml LIF的Knockout DMEM。

利用Xist Tale抑制性转录因子R6制备新型动物细胞系R6-MEFs的方法，包括以下步骤：

1.载体的制备和细胞建系：

利用小鼠Oct4Tale R-dTF载体改造为特异性识别和结合Xist第一内含子区的Tale R-dTF(R6)，最终形成的R6为PB载体携带的由Doxycycline (Dox)依赖型启动子TRE驱动的表达载体；

获取Oct4-GFP MEFs，选择生长状态良好的Oct4-GFP MEFs，作为制备R6- MEFs的材料；

2.制备新型动物细胞系R6-MEFs的方法

利用Xist Tale抑制性转录因子转染Oct4-GFP MEFs，添加结合于Xist第一内含子区的Tale抑制性转录因子R6为实验组，含有无特异性结合位点的 ConR作为对照组；

脂质体转染：利用脂质体转染法将Xist Tale抑制性因子R6(对照组为 ConR)转染生长良好的Oct4-GFP MEFs；

诱导及建系：脂质体转染后第二天将培养液更换为添加2μg/mL Doxcycline的M15培养液(简称M15+Dox培养液)培养；第三天培养液更换为添加2μg/mL Doxcycline和2μg/mLpuromycin的M15培养液(简称 M15+Dox+puro培养液)，以筛选转基因细胞，M15+Dox+puro培养细胞三天后，绝大多数非转基因细胞凋亡，并换为M15+Dox培养液继续培养，直至汇合度达到80％时，按照1：40重新接种细胞并培养；隔天进行细胞生长情况的观察，并及时更换M15+Dox培养液；M15+Dox培养20-25天左右，显微镜观察，当出现短梭形的细胞克隆时，进行单克隆传代和建系，代次记为P1，P1之后按照 1：40的比例进行传代、培养和冻存；

3.R6-MEFs生物学特性分析

虽然R6-MEFs形态上与MEFs相似,但二者又有所差别：

首先，R6-MEFs呈短梭状，而且生长速率明显高于野生型MEFs；

其次，R6-MEFs像干细胞和癌细胞一样具有自我更新能力，实验室已传至 50代以上；为进一步分析该新型动物细胞系的特性，进行以下方面的生物学特性分析，以下实验均以WT-MEFs为对照组。

RT-qPCR检测显示，R6-MEFs中的多能性相关基因Oct4、Rex1、Sox2、 Nanog、Cdx2及生殖相关基因Prdm14与WT-MEFs的表达有所差异；流式细胞荧光分选检测显示，WT-MEFs的GOF-GFP表达呈阴性，而R6-MEFs细胞系的GOF- GFP呈阳性。

核型的检测分析结果表明：R6-MEFs与WT-MEFs相似，染色体均无明显异常。

实施例1：载体的制备

利用小鼠Oct4Tale R-dTF载体(Reprogramming to pluripotency usingdesigner TALE transcription factors targeting enhancers(Gao et al., 2013))改造为特异性识别和结合Xist第一内含子区的Tale R-dTF(R6)，最终形成的R6为PB载体携带的由Doxycycline(Dox)依赖型启动子TRE驱动的表达载体(Xist Tale抑制性效应因子R6的结构及其结合位点，见图2和图3)；具体识别的DNA序列为TTAAGTGTTATGGACAAGGA(GeneBank中参考基因序列号：NC_000086.7)；

实施例2：Oct4-GFP MEFs的建系

性成熟的C57BL/6J母鼠与携带Oct4-GFP的MF1，129/sv公鼠按1 (♂)：2(♀)比例合笼，将见栓13.5d的孕鼠剖腹获取胎鼠，洗净后除去头部、四肢和尾部，洗净剪碎后用3ml的0.05％Trypsin-EDTA(1X)于37℃水浴中消化20min，期间混匀几次；继续加入3ml的0.05％Trypsin-EDTA(1X)消化液，于37℃水浴中消化20min，吹打混匀后加入6ml的M10培养液终止消化， 1000rpm离心10min，弃掉上清，加适量M10培养液，反复吹打约10次，置于 T25培养瓶中，于37℃、5％CO2培养箱中培养，Oct4-GFP MEFs生长状态见图4A，达到80％汇合度后，进行1：3-1：5传代和培养，其它细胞进行原代冻存。

实施例3：获得新型动物细胞系R6-MEFs的方法

1、Oct4-GFP MEFs的脂质体转染：当培养于六孔板的Oct4-GFP MEFs达到 40％-60％汇合度时，进行脂质体转染，转染30min前更换为新鲜的M15培养基2 mL，放入培养箱中等待转染，超净台内配制转染体系500μL，转染体系由250 μL A液和250μL B液组成：A液组成成分包含245μL的OPTI-MEM和5μL 的脂质体转染试剂Lipofectamine 2000；B液组成成分包含250μL的OPTI- MEM和1μg转座酶HyBase、1μg CAG-rtTA、1μg PGK-Puro和2μg携带mCherry的R6载体；A液和B液配好后分别充分混匀，于室温孵育5min；然后将A、B液混匀静置，室温孵育30min；最后将上述500μL混合物加入M15培养基中，置于37℃、5％CO2培养箱中培养；

2、脂质体转染后R6-MEFs的诱导及建系：脂质体转染后第二天，更换为添加2μg/mL强力霉素(Doxcycline)的M15培养液(以下称M15+Dox)培养，放入37℃，5％CO2培养箱中培养；脂质体转染第三天，荧光显微镜检测转染效率，转染成功的细胞表达红色荧光蛋白，并更换新的添加2μg/mL的强力霉素 (Doxcycline)和2μg/mL的嘌呤霉素(puromycin)的M15培养液(以下称 M15+Dox+puro)，以筛选具有转基因的细胞，M15+Dox+puro培养细胞三天后，绝大多数非转基因细胞凋亡，并换为M15+Dox培养液培养，之后培养液均为 M15+Dox；培养细胞直至汇合度达到80％时，按照1：40进行传代培养；隔天进行细胞生长情况的观察，并及时更换M15+Dox培养液；细胞生长速度较快并且形成明显克隆的细胞，将其传入6孔板，之后按1：40比例传代、建系和冻存，R6脂质体转染，D2，puro筛选前见图4B；R6脂质体转染，puro筛选完成见图4C；1：40传代后见图4D，6孔板中开始长出R6-MEFs克隆见图4E；

3、R6-MEFs的传代和培养：当细胞生长正常，且汇合度达到80％时，利用 DPBS清洗一遍，加入0.05％Trypsin-EDTA(1X)于37℃消化5min，吹匀后终止消化，1300rpm离心3min，弃上清，并用M10培养液分别重悬接种于6孔板中进行培养，克隆传代建立R6-MEFs的生长状态见图4F。

实施例4：获得的新型动物细胞系R6-MEFs的生物学特性分析

1、生长曲线制备

取生长状况良好的R6-MEFs和对照组WT-MEFs，采用胰蛋白酶法消化上述细胞，得到细胞悬液并进行细胞计数。每天取3孔细胞计数，连续进行8天 (见图5)。

2、利用RT-qPCR对多能性基因表达的检测

①总RNA提取：利用RNA提取试剂盒完成WT-MEFs和R6-MEFs的总RNA提取。将收集到的RNA混匀后进行浓度与纯度的测定。

②cDNA的制备：提前制冰，将试剂盒中的试剂在冰上融化。反转录反应体系为20μL，分为5μL和15μL两部分，5μL体系包括5μg的总RNA，1μL的引物，然后用无核酸的水配制成5μL体系，70℃加热5min，然后迅速冰浴至少5min，微型离心机中离心10s，冰上放置直至15μL体系加入；15μL体系包括 GoScriptTM5×缓冲液4.0μL，MgCl2(最终浓度1.5-5.0mM)2.5μL，dNTP 1.0μL，核糖核苷酸酶抑制剂0.5μL，GoScriptTM反转录酶1.0μL，无核酸酶的水6μL；将5μL体系与15μL体系混匀，于25℃孵育5min后，42℃孵育1h。

③实时定量PCR(Real-time quantitative PCR,RT-qPCR)反应：将试剂盒中的试剂于冰上融化，样品使用前混匀后离心富集。qPCR所用到的引物见表1.1；qPCR的反应体系为20μL(15μL Mix I+5μL Mix II，见表1.2)，反应条件见表1.3。将样品加入到96孔板中并记录加样信息，封好透明膜后离心，离心完成后将电脑连接RT-qPCR仪(Thermo，TCR0096)，更改电脑IP地址，打开软件PikoReal software，选择程序设定参数(参数设置见表1.3)，RT-qPCR反应完成后保存数据并进行分析(见图6A,RT-qPCR检测显示，R6-MEFs较WT-MEFs的Nanog和Prdm14基因表达上调)。

表1.1 RT-qPCR所需引物信息(SEQ ID NO.2-SEQ ID NO.15)

表1.2 RT-qPCR反应体系

Mix I：

Component	1×	26×
			SYBR(2×)	10μL	260μL
cDNA	1μL	26μL
			Nuclear-Free water	4μL	104μL
	15μL

Mix II：

Component	1×	7×
			Primer F+R(10μM)	0.8μL	5.6μL
Nuclear-Free water	4.2μL	29.4μL
				5μL

表1.3 RT-qPCR反应条件

3、R6-MEFs的GOF-GFP表达检测

利用流式细胞荧光分选仪检测了在M15+Dox的培养条件下的R6-MEFs的 GOF-GFP表达情况，对照组为WT-MEFs(见图6B,获得的R6-MEFs的GOF-GFP表达呈阳性)。

4、R6-MEFs的核型分析

核型分析所需试剂的配制如下：

I.0.075mol/L的KCl溶液：5.59g的KCl溶于1000mL的蒸馏水。

II.20μg/mL秋水仙素：5mL秋水仙素粉末溶于250mL生理盐水，用 0.22μm的滤器过滤除菌，4℃避光保存。

III.固定液：甲醇与冰醋酸比例为3：1配制，生物安全柜中进行。

Ⅳ.Giemsa染液：66mL甘油中加入1g的Giemsa粉末，于研钵中研磨细致，置于56℃恒温水浴锅中1.5h，之后加入66mL甲醇，充分搅拌，用滤纸过滤，除去未溶的颗粒杂质，即为制成的母液。将其收集在棕色细口瓶中保存备用，用时以Giemsa原液与PBS比例为1：9稀释使用。

将R6-MEFs接种于6孔板中M15培养液培养，次日显微镜观察其生长状态，汇合度达到50％～60％时，在3mL的M15培养液中加入30μL 20μg/mL的秋水仙素处理2h，之后弃掉培养液，用PBS清洗细胞一遍，加入0.5mL 0.05％Trypsin-EDTA(1X)消化5min，加入含有血清的M15培养液终止消化， 1300rpm离心3min，后弃去上清，得到细胞沉淀。在有细胞沉淀的离心管中滴入8mL 0.075mol/L的KCl，用胶头滴管吹打并重悬细胞沉淀，置于37℃的恒温水浴锅，或者干浴器40min，进行低渗处理。在低渗结束前1min加入1mL 固定液进行预固定(加入固定液的实验步骤均在生物安全柜内进行)，混匀后 1000rpm离心10min，弃去上清。在离心管中缓慢滴入固定液8mL，用胶头滴管轻轻吹打混匀细胞，置于37℃恒温水浴锅固定30min进行固定，之后1000 rpm离心10min，弃去上清，再加入固定液8mL，重复此步骤一次。取载玻片，清洗洁净后置于冰水中浸泡，待滴片使用。在离心管中加入新鲜配制的固定液0.5mL。胶头滴管吹匀，并将细胞悬液吸入，将其由高处滴至经冰水浸泡的洁净载玻片上，70℃烘箱烘烤1h，干燥处理后室温冷却，做好标记待染色。干燥后的染色体标本用Giemsa染液染色处理10min，之后用自来水在没有染色体标本的那一面冲洗，自然风干。使用细胞遗传工作站进行观察，并利用 Genus软件进行染色体标本的分析,见图7A：WT-MEFs；B：R6-MEFs。

以上所述的实施例仅用于说明本发明的技术思想及特点，其目的在于使本领域内的技术人员能够理解本发明的内容并据以实施，不能仅以本实施例来限定本发明的专利范围，即凡本发明所揭示的精神所作的同等变化或修饰，仍落在本发明的专利范围内。

Claims (8)

1.一种利用Xist Tale抑制性转录因子R6制备新型动物细胞系R6-MEFs的方法，其特征在于：包括以下步骤：

1)载体制备及细胞建系：

利用小鼠Oct4Tale R-dTF载体改造为特异性识别和结合Xist第一内含子区的Tale R-dTF(R6)，最终形成的R6为PB载体携带的由Doxycycline(Dox)依赖型启动子TRE驱动的表达载体；

在体外条件下，获取携带Oct4-GFP基因的胎鼠成纤维细胞MEFs；

2)获得新型动物细胞系R6-MEFs：

A、Oct4-GFP MEFs的脂质体转染：

将携带Oct4-GFP基因的胎鼠成纤维细胞MEFs使用M10培养液培养于六孔板中，转染30min前更换为新鲜的M15培养液2mL，放入培养箱中等待转染；携带Oct4-GFP基因的胎鼠成纤维细胞MEFs达到40％-60％汇合度时，将500μL转染体系加入M15培养液中，置于37℃、5％CO₂培养箱中培养，进行脂质体转染；

B、脂质体转染后R6-MEFs的诱导及建系：

a、脂质体转染后第二天将M15培养液更换为M15+Dox培养液培养，放入37℃，5％CO₂培养箱中培养；

b、脂质体转染后第三天荧光显微镜检测转染效率：转染成功的细胞表达红色荧光蛋白，更换新的M15+Dox+puro培养液，筛选具有转基因的细胞，培养细胞三天后，绝大多数非转基因细胞凋亡；

c、第六天更换为M15+Dox培养液培养，直至汇合度达到80％时，按照1：40进行传代培养；隔天进行细胞生长情况的观察，并在液体发黄时更换M15+Dox培养液；

d、细胞生长速度较快并且形成明显克隆的细胞，将其单克隆传入6孔板进行建系，建系成功后按比例1：40传代和冻存。

2.根据权利要求1所述的一种利用Xist Tale抑制性转录因子R6制备新型动物细胞系R6-MEFs的方法，其特征在于：所述M10培养液的配制如下：

含有10％胎牛血清、1×谷氨酰胺、1×非必需氨基酸、1×青链霉素的Knockout DMEM。

3.根据权利要求1所述的一种利用Xist Tale抑制性转录因子R6制备新型动物细胞系R6-MEFs的方法，其特征在于：所述M15培养液的配制如下：

含有15％胎牛血清、1×谷氨酰胺、1×非必需氨基酸、1×青链霉素、0.1mMβ-巯基乙醇和106U/ml LIF的Knockout DMEM。

所述M15+Dox培养液为添加2μg/mL Doxcycline的M15培养液；

所述M15+Dox+puro培养液为添加2μg/mL Doxcycline和2μg/mL puromycin的M15培养液。

4.根据权利要求1所述的一种利用Xist Tale抑制性转录因子R6制备新型动物细胞系R6-MEFs的方法，其特征在于：所述步骤A中转染体系由250μL A液和250μL B液组成：A液组成成分包含245μL的OPTI-MEM和5μL的脂质体转染试剂Lipofectamine 2000；B液组成成分包含250μL的OPTI-MEM和转染载体，A液和B液配好后分别充分混匀，于室温孵育5min；然后将A、B液混匀静置，室温孵育30min。

5.根据权利要求4所述的一种利用Xist Tale抑制性转录因子R6制备新型动物细胞系R6-MEFs的方法，其特征在于：所述转染载体为转座酶HyBase 1μg，CAG-rtTA 1μg，PGK-Puro1μg和携带mCherry的R6载体2μg。

6.根据权利要求1所述的一种利用Xist Tale抑制性转录因子R6制备新型动物细胞系R6-MEFs的方法，其特征在于：所述步骤A的R6载体的结合位点如下：TTAAGTGTTATGGACAAGGA，GeneBank中参考基因序列号：NC_000086.7。

7.根据权利要求1所述的一种利用Xist Tale抑制性转录因子R6制备新型动物细胞系R6-MEFs的方法，其特征在于：所述步骤B中利用R6建立R6-MEFs，需以低密度接种转基因细胞进行传代和诱导。

8.一种权利要求1所述的一种利用Xist Tale抑制性转录因子R6制备新型动物细胞系R6-MEFs的方法得到的R6-MEFs细胞系用于癌症治疗、干细胞诱导和动物育种模型。