CN115976021A - lncRNA MSTRG.5970.28及其应用、调控卵巢发育的产品和方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种长链非编码RNAMSTRG.5970.28及其应用、鹅卵巢发育的产品和方法，涉及生物技术领域，本发明提供了一种新的长链非编码RNAMSTRG.5970.28，该lncRNAMSTRG.5970.28与鹅卵泡颗粒细胞的增殖与凋亡相关，通过调控lncRNAMSTRG.5970.28的表达还可以对卵泡颗粒细胞的增殖与凋亡的相关miRNA、基因起到相应的调控作用。通过应用本发明提供的lncRNAMSTRG.5970.28及相应的产品，能够为卵泡颗粒细胞的增殖与凋亡以及生理生化功能的研究提供有力的保障。此外，还可以通过lncRNAMSTRG.5970.28对卵泡颗粒细胞的增殖与凋亡的调控作用，在保持鹅种质资源的优良特性的同时，提高群体繁殖力，从而促进鹅产业化发展，提高经济效益。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，涉及一种lncRNA MSTRG.5970.28及其应用、调控卵泡发育的产品和方法的技术领域。
背景技术
鹅属于季节性繁殖的动物，较强的就巢性和个体产蛋量低的特性严重影响了鹅养殖业的规模化发展。在实际生产中，鹅年平均产蛋数多为30-60个/只，个体差异较大。产蛋性能的提高是当前鹅育种中的主要选育目标之一，由于产蛋性能属于数量性状，遗传力低，运用传统数量遗传学育种方法己很难取得显著的遗传进展。
卵泡发育是决定母禽产蛋性能的关键因素。卵泡发育是极为复杂的生物学过程，众多基因和通路参与其增殖和分化。卵泡颗粒细胞可为卵泡发育提供营养物质，颗粒细胞的增殖和凋亡是卵泡成熟或闭锁的重要因素和必要条件，颗粒细胞的增殖可以促进卵泡发育成熟，而颗粒细胞凋亡则引发卵泡的闭锁。由此可见，颗粒细胞在卵泡发育过程中起决定作用。颗粒细胞的增殖和凋亡受多种影响因素调控，包括遗传、营养和激素等。随着分子生物学技术的不断发展，揭示颗粒细胞增殖或凋亡的分子机制，以提高母禽的产蛋性能已成为重要的研究手段。
长链非编码RNA(long noncoding RNA，lncRNA)是大于200nt的一种非编码RNA，可通过海绵吸附微小RNA(microRNA，miRNA)或其他分子，在转录和转录后水平起到调控作用。研究显示，lncRNA在多种等生物过程中发挥正向或反向的调控作用。
然而，目前关于鹅lncRNA的研究尤其是鹅卵巢lncRNA及其调控机制的研究仍十分匮乏。因此，迫切需要发现能够调控鹅卵巢细胞增殖和凋亡的lncRNA，有助于一步阐明鹅产蛋量的分子机制奠定理论基础，大大加快了高产蛋鹅的育种进程。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的研究空白，提供了一种lncRNA MSTRG.5970.28及其应用、调控卵巢发育的产品和方法。
为实现上述目的，本发明通过以下方案实现：
本发明的第一个目的在于提供一种新的lncRNA MSTRG.5970.28，以至少缓解现有技术中存在的技术问题之一。
本发明的第二个目的在于提供上述lncRNA MSTRG.5970.28在制备调控卵泡发育的产品中的应用。
本发明的第三个目的在于提供一种调控卵巢发育的方法。
本发明的第四个目的在于提供一种调控卵巢发育的产品。
为解决上述技术问题，本发明特采用如下技术方案：
本发明提供的lncRNA MSTRG.5970.28，具有：如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。
本发明还提供了上述的lncRNA MSTRG.5970.28在制备调控卵巢发育的产品中的应用。
进一步地，通过如下(1)-(4)中的任一种调控卵巢发育：
(1)调控卵巢颗粒细胞的增殖；
(2)调控卵巢颗粒细胞的凋亡；
(3)调控卵泡颗粒细胞的增殖或凋亡的相关miRNA，所述miRNA包括miR-133a-3p；
(4)调控卵泡颗粒细胞的增殖或凋亡相关基因，所述卵泡颗粒细胞的增殖或凋亡相关基因包括ANOS1。
进一步地，
(1)过表达lncRNA MSTRG.5970.28以促进卵巢颗粒细胞凋亡；
(2)过表达lncRNA MSTRG.5970.28以抑制卵巢颗粒细胞增殖；
(3)过表达lncRNA MSTRG.5970.28引起的颗粒细胞的增殖与凋亡作用，被miR-133a-3p减弱；
(4)过表达lncRNA MSTRG.5970.28以促进ANOS1基因的表达。
进一步地，通过lncRNA MSTRG.5970.28的重组载体实现过表达lncRNAMSTRG.5970.28。
进一步地，通过lncRNA MSTRG.5970.28作为miR-133a-3p的ceRNA，影响ANOS1的表达，实现影响颗粒细胞发育；
进一步地，所述卵巢发育为鹅的卵巢发育。
本发明还提供了一种调控卵巢发育的方法，所述方法包括调控lncRNAMSTRG.5970.28的表达。
进一步地，
(1)过表达lncRNA MSTRG.5970.28以促进卵巢颗粒细胞凋亡；
(2)过表达lncRNA MSTRG.5970.28以抑制卵巢颗粒细胞增殖；
(3)过表达lncRNA MSTRG.5970.28引起的颗粒细胞的增殖与凋亡作用，被miR-133a-3p减弱；
(4)过表达lncRNA MSTRG.5970.28以促进ANOS1基因的表达。
进一步地，通过lncRNA MSTRG.5970.28的重组载体实现过表达lncRNAMSTRG.5970.28。
优选地，所述卵泡发育为鹅的卵泡发育。
另外，本发明还提供了一种调控卵泡发育的产品，包括用于过表达lncRNAMSTRG.5970.28的物质和/或用于沉默lncRNA MSTRG.5970.28的物质。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明提供了一种新的lncRNA MSTRG.5970.28，该MSTRG.5970.28被发现在产蛋前后各期鹅卵巢中差异表达。并且，本发明的发明人通过试验发现，lncRNA MSTRG.5970.28与颗粒细胞的增殖或凋亡相关，通过调控lncRNA MSTRG.5970.28的表达还可以对卵巢发育的相关通路、基因起到相应的调控作用。因此，应用本发明提供的lncRNA MSTRG.5970.28及相应的产品，能够从不同角度对卵巢发育进行有效的体内外调控，为卵巢的发育以及生理生化功能的研究提供了有力的保障。此外，还可以通过lncRNA MSTRG.5970.28对卵巢发育的调控作用，进一步开展高产品种选育等工作，以期在保持鹅种质资源的优良特性的同时，提高群体繁殖力，从而促进鹅产业化发展，提高经济效益。
附图说明
图1所示为卵巢颗粒细胞的鉴定、核质分离及激素处理结果图。
其中图A所示为贴壁生长的鹅卵巢颗粒细胞；图B所示为细胞免疫组化鉴定鹅卵巢颗粒细胞；图C所示为lncRNA MSTRG.5970.28的核质比；图D所示为FSH或hCG对lncRNAMSTRG.5970.28表达的影响。
图中*P＜0.05，**P＜0.01。下属所有附图均采用同种标注。
图2所示为lncRNA MSTRG.5970.28与miR-133a-3p靶向性验证结果图。
其中图A所示为MSTRG.5970.28与miR-133a-3p的预测结合信息；图B所示为MSTRG.5970.28与miR-133a-3p结合位点预测及载体构建；图C所示为MSTRG.5970.28与miR-133a-3p靶向关系的双荧光素酶活性检测；图D所示为miR-133a-3p过表达和干扰效率检测；图E所示为过表达/抑制表达miR-133a-3p后MSTRG.5970.28的表达变化。
图3所示为lncRNA MSTRG.5970.28通过miR-133a-3p调节鹅卵泡颗粒细胞的增殖、凋亡情况图。
其中图A所示为lncRNA MSTRG.5970.28过表达和干扰效率检测；图B所示为过表达/抑制表达MSTRG.5970.28对颗粒细胞增殖的影响；图C所示为过表达/抑制表达MSTRG.5970.28对颗粒细胞凋亡的影响；图D所示为过表达/抑制表达miR-133a-3p对颗粒细胞增殖的影响；图E所示为过表达/抑制表达miR-133a-3p对颗粒细胞凋亡的影响；图F所示为过表达/抑制表达MSTRG.5970.28及miR-133a-3p对颗粒细胞增殖的影响；图G所示为过表达/抑制表达MSTRG.5970.28及miR-133a-3p对颗粒细胞凋亡的影响。
图4所示为miR-133a-3p与ANOS1靶向性验证。
其中图A所示为miR-133a-3p与ANOS1的预测结合信息；图B所示为miR-133a-3p与ANOS1结合位点预测及载体构建；图C所示为miR-133a-3p与ANOS1靶向关系的双荧光素酶活性检测；图D所示为过表达表达miR-133a-3p后ANOS1的mRNA及蛋白表达变化；图E所示为抑制表达miR-133a-3p后ANOS1的mRNA及蛋白表达变化。
图5所示为lncRNA MSTRG.5970.28通过作为miR-133a-3的ceRNA调控ANOS1的表达。
其中图A所示共转染MSTRG.5970.28与miR-133a-3p过表达质粒后ANOS1的mRNA表达变化；图B所示为共转染MSTRG.5970.28与miR-133a-3p过表达质粒后ANOS1的蛋白表达变化。
具体实施方式
以下实施例用于进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作地修改或替换，均属于本发明的范围。
本申请所采用的的试剂：PBS缓冲液、Ⅱ型胶原酶、M199完全培养基(含10％血清)、M199完全培养基(含10％胎牛血清及1％双抗)、Cytoplasmic&Nuclear RNA PurificationKit(Norgen Biotek,Canada)、Trizol试剂(Life technogies)、LipofectamineTM2000(Thermo Fisher Scientific)、10IU/mL促卵泡激素FSH(Solaibao,Beijing,China)、5IU/mL人绒毛膜促性腺激素hCG(Solaibao,Beijing,China)、Lip3000试剂(Invitrogen)、双荧光素酶报告基因分析试剂盒(RG027,Beyotime Institute ofBiotechnology)、PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser试剂盒(TaKaRa)、2×SYBR Green qPCRMaster Mix(Servicebio,Wuhan,China)、CCK-8检测试剂盒(Servicebio,Wuhan,China)、Annexin V-FITC细胞凋亡(CA1020,Servicebio,China)检测试剂盒、RIPA细胞裂解液(内含1mM PMSF)(Biosharp,Hefei,China)、10％SD-PAGE凝胶、BCA试剂盒、5％脱脂奶粉、抗山羊抗小鼠IgG、山羊抗兔IgG、ANOS1(1:500)、β-actin(1:1000)、PBST洗涤液、辣根过氧化物酶(HRP)、ECL超敏发光试剂盒(Thermo Scientific)
本申请中所采用的仪器：恒温水浴锅、离心机、涡旋仪、手术刀、无菌培养皿、手术剪、离心管、移液枪、枪头、不锈钢筛、6孔培养皿、细胞种板、ABI StepOnePlus(ABI,FosterCity,CA,USA)仪器、酶联免疫检测仪、NovoCyte流式细胞仪(Agilent,Santa Clara,CA,USA)
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例一：
本发明提供的一种新的lncRNA MSTRG.5970.28，具有：如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。
本发明还提供了上述的lncRNA MSTRG.5970.28在制备调控卵巢发育的产品中的应用。
进一步地，通过如下(1)-(4)中的任一种调控卵巢发育：
(1)调控卵巢颗粒细胞的增殖；
(2)调控卵巢颗粒细胞的凋亡；
(3)调控卵泡颗粒细胞的增殖或凋亡的相关miRNA，所述miRNA包括miR-133a-3p；
(4)调控卵泡颗粒细胞的增殖或凋亡相关基因，所述卵泡颗粒细胞的增殖或凋亡相关基因包括ANOS1。
进一步地，
(1)过表达lncRNA MSTRG.5970.28以促进卵巢颗粒细胞凋亡；
(2)过表达lncRNA MSTRG.5970.28以抑制卵巢颗粒细胞增殖；
(3)过表达lncRNA MSTRG.5970.28引起的颗粒细胞的增殖与凋亡作用，被miR-133a-3p减弱；
(4)过表达lncRNA MSTRG.5970.28以促进ANOS1基因的表达。
进一步地，通过lncRNA MSTRG.5970.28的重组载体实现过表达lncRNAMSTRG.5970.28。
进一步地，通过lncRNA MSTRG.5970.28作为miR-133a-3p的ceRNA，影响ANOS1的表达，实现影响颗粒细胞发育；
进一步地，所述卵巢发育为鹅的卵巢发育。
本发明还提供了一种调控卵巢发育的方法，所述方法包括调控lncRNAMSTRG.5970.28的表达。
进一步地，
(1)过表达lncRNA MSTRG.5970.28以促进卵巢颗粒细胞凋亡；
(2)过表达lncRNA MSTRG.5970.28以抑制卵巢颗粒细胞增殖；
(3)过表达lncRNA MSTRG.5970.28引起的颗粒细胞的增殖与凋亡作用，被miR-133a-3p减弱；
(4)过表达lncRNA MSTRG.5970.28以促进ANOS1基因的表达。
进一步地，通过lncRNA MSTRG.5970.28的重组载体实现过表达lncRNAMSTRG.5970.28。
优选地，所述卵泡发育为鹅的卵泡发育。
另外，本发明还提供了一种调控卵泡发育的产品，包括用于过表达lncRNAMSTRG.5970.28的物质和/或用于沉默lncRNA MSTRG.5970.28的物质。
实施例二：
1材料与方法
1.1鹅卵泡颗粒细胞培养、鉴定及核质分离
所有动物实验操作程序均按照中华人民共和国农业部制定的相关指南和规定进行，并经新疆农业大学动物伦理委员会的审定批准(批准号2019004)。选择处于产蛋期的种鹅，经颈静脉放血处死后取整个卵巢组织，用加有双抗的PBS清洗数次。将漂洗干净的卵泡移入装有预冷PBS缓冲液的无菌培养皿中，剥净卵泡外膜、结缔组织及血管网，划破卵泡后释放卵黄，将漂洗干净的卵泡膜尽量剪碎，置于15mL离心管中，加4mL培养基反复吹打1min，自然沉降5min后弃上清液；加入4mL 0.2％Ⅱ型胶原酶，重悬沉淀，置于37℃恒温水浴锅消化30min，加入4mL M199完全培养基(含10％血清)终止消化；用200目不锈钢筛过滤，收集滤液，12000r/min离心5min收集细胞，加入M199完全培养基(含10％胎牛血清及1％双抗)重悬后，测定细胞密度后接种于6孔培养皿，置于37℃、5％CO2培养箱内静置培养24h后用于后续试验。采用FSHR免疫荧光方法鉴定分离的颗粒细胞。根据Cytoplasmic&Nuclear RNAPurification Kit(Norgen Biotek,Canada)试剂盒说明书进行卵泡颗粒细胞的核质分离，并使用Trizol试剂(Life technogies)从细胞核和细胞质中提取总RNA。
1.2细胞转染
试验所需mimics-miR-133a-3p、inhibitor-miR-133a-3p、OE-MSTRG.5970.28、Si-MSTRG.5970.28以及空载体均由上海吉玛制药技术有限公司合成(GenePharm，Shanghai,China)。所有构建物均通过测序技术进行验证。序列信息如表1所示。使用转染试剂LipofectamineTM2000(Thermo Fisher Scientific)按照说明书对细胞进行转染，转染24h后收集细胞。
表1：相关引物序列信息表
1.3FSH和hCG激素处理
细胞种板后第二天换液培养48小时后，用10IU/mL促卵泡激素FSH(Solaibao,Beijing,China)或5IU/mL人绒毛膜促性腺激素hCG(Solaibao,Beijing,China)处理颗粒细胞，对照组加入等体积的PBS，作用24h后收集细胞，提取总RNA，测定lncRNA MSTRG.5970.28的表达。
1.4双荧光素酶报告实验
由合肥源恩生物技术有限公司构建psiCheck2-MSTRG.5970.28-WT、psiCheck2-MSTRG.5970.28-MUT、psiCheck2-ANOS1-WT、psiCheck2-ANOS1-MUT载体后，将293T细胞种于24孔板中(5×105细胞/孔)，使用Lip3000试剂(Invitrogen)将上述载体与NC mimics或miR-133a-3p mimics共同转染到细胞中，48小时后，按照制造商的说明使用双荧光素酶报告基因分析试剂盒(RG027,Beyotime Institute ofBiotechnology)，测量相对荧光素酶活性，通过比较Firefly/Renilla luciferase活性的比值来计算相对荧光素酶活性。
1.5实时荧光定量PCR
使用Trizol试剂(Life technogies)提取颗粒细胞的总RNA，PrimeScriptTMRTreagentKitwith gDNA Eraser试剂盒(TaKaRa)进行反转录。qPCR反应采用2×SYBR GreenqPCR MasterMix(Servicebio,Wuhan,China)在ABI StepOnePlus(ABI,Foster City,CA,USA)仪器进行。PCR反应体系20μL：cDNA模板3μL，2×SYBR Green qPCR MasterMix 10μL，上、游引物各0.4μL，RNase Free water补齐20μL。利用PrimerPremier(V5.0)设计特异性引物，mRNA、lncRNA表达量计算以β-actin为内参基因，miRNA表达量计算以U6为内参基因，引物序列信息见表2，引物均由通用生物(安徽)股份有限公司合成，目的基因相对表达水平采用2-ΔΔCT值方法计算。
表2：内参基因引物序列信息表
1.6CCK-8检测
将分离的鹅卵泡颗粒细胞接种到96孔板(1×104个·孔-1)，转染48小时。按照CCK-8检测试剂盒(Servicebio,Wuhan,China)说明进行细胞活性检测。随后在酶联免疫检测仪OD 450nm处测量各孔的吸光值，同时设置空白孔，计算细胞增殖活力。
1.7细胞凋亡检测
取细胞接种于6孔板，当细胞汇合度达到80％左右，进行转染，培养24h后消化并收集细胞。按照Annexin V-FITC细胞凋亡(CA1020,Servicebio,China)检测试剂盒说明书进行颗粒细胞凋亡检测，最后用NovoCyte流式细胞仪(Agilent,Santa Clara,CA,USA)检测分析，每个试验组设3个重复。
1.8Westernblot检测蛋白水平
收集细胞沉淀，每6孔板加入100μL RIPA细胞裂解液(内含1mM PMSF)(Biosharp,Hefei,China)，冰上裂解30min。12000rpm离心15min，收集上清液，即为总蛋白。使用BCA试剂盒测定蛋白浓度。总蛋白提取液在10％SD-PAGE凝胶上分离，并在硝化纤维素膜上印迹。室温下用5％脱脂奶粉封闭2h，结束后将膜与一抗山羊抗小鼠IgG、山羊抗兔IgG、ANOS1(1:500)、β-actin(1:1000)，4℃孵育过夜，加入PBST洗涤。随后按照1:10000用二抗稀释液稀释辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗(1:10000)，室温孵育2h，加入PBST洗涤。使用ECL超敏发光试剂盒(Thermo Scientific)观察蛋白条带，ImageJ软件分析蛋白灰度。
1.9统计分析
利用SPSS 19.0软件(IBM Corp,Armonk,NY,USA)进行统计分析，利用GraphPadPrism 8.0进行作图。多个数据的比较用单因素方差(One-Way ANOVA)分析，两组数据比较用独立t检验，试验重复3次以上，数据结果采用“平均值±标准误(Mean±SEM)”表示，P<0.05表示差异显著，P>0.05表示差异不显著。
2结果与分析
2.1鹅卵巢颗粒细胞的鉴定、核质分离及激素处理
鹅卵巢颗粒细胞培养24h后贴壁生长，呈现梭形、不规则三角形，如附图1A所示。通过利用颗粒细胞中特异性表达的FSHR来鉴定颗粒细胞纯度，如附图1B所示，染色后可观察到颗粒细胞胞浆呈红色荧光，细胞核被染成蓝色。通过荧光定量PCR检测lncRNAMSTRG.5970.28在颗粒细胞的细胞核与细胞质中的表达，发现MSTRG.5970.28在细胞核与细胞质中均有表达，且在细胞质中高表达，如附图1C所示。经hCG(5IU/mL)或FSH(10IU/mL)处理鹅颗粒细胞后，发现颗粒细胞中MSTRG.5970.28的表达均极显著降低(P<0.01)，如附图1D所示。
2.2lncRNA MSTRG.5970.28与miR-133a-3p靶向性验证
RNAhybrid分析显示，MSTRG.5970.28与miR-133a-3p存在预测结合位点，如附图2A所示。为验证MSTRG.5970.28与miR-133a-3p的靶向关系，通过构建了含有miR-133a-3p结合位点的MSTRG.5970.28-wt和MSTRG.5970.28-mut质粒，如附图2B所示。随后，将野生型或突变型质粒与NC mimics或miR-133a-3p mimics共转染到293T细胞中。双荧光素酶活性分析显示，miR-133a-3pmimics与MSTRG.5970.28-wt共转染组显著降低了野生型质粒的荧光活性(P＜0.05)，但对突变型质粒无显著影响(P＞0.05)，如附图2C所示。为进一步验证miR-133a-3p是否直接调节MSTRG.5970.28的表达，通过构建miR-133a-3p的过表达载体mimics-miR-133a-3p与抑制载体inhibitor-miR-133a-3p，并转染至颗粒细胞中。与NC组相比，mimics-miR-133a-3p组miR-133a-3p的表达极显著升高(P＜0.01)，inhibitor-miR-133a-3p组miR-133a-3p的表达极显著降低(P＜0.01)，说明miR-133a-3p过表达和干扰质粒构建成功，如附图2D所示。当过表达miR-133a-3p时，MSTRG.5970.28的表达极显著降低(P＜0.01)，抑制miR-133a-3p时，MSTRG.5970.28的表达极显著升高(P＜0.01)，如附图2E所示。
2.3lncRNA MSTRG.5970.28通过miR-133a-3p调节鹅卵泡颗粒细胞的增殖、凋亡
与NC组相比，OE-MSTRG.5970.28组MSTRG.5970.28表达极显著升高(P＜0.01)；Si-1、Si-2与Si-3组MSTRG.5970.28表达均极显著降低(P＜0.01)，其中以Si-3组MSTRG.5970.28表达降低最为显著，以上结果说明lncRNA MSTRG.5970.28过表达和干扰质粒构建成功，如附图3A所示。随后，我们分析了lncRNA MSTRG.5970.28对颗粒细胞增殖及凋亡的影响。结果表明，与NC组相比，OE-MSTRG.5970.28组细胞增殖活性极显著降低(P＜0.01)，细胞凋亡率极显著升高(P＜0.01)；Si-MSTRG.5970.28组细胞增殖活性极显著升高(P＜0.01)，细胞凋亡率极显著降低(P＜0.01)，如附图3B、附图3C所示。通过分析miR-133a-3p对颗粒细胞增殖及凋亡的影响，发现与NC相比，mimics-miR-133a-3p组细胞增殖活性极显著升高(P＜0.01)，细胞凋亡率极显著降低(P＜0.01)；inhibitor-miR-133a-3p组细胞增殖活性极显著降低(P＜0.01)，细胞凋亡率极显著升高(P＜0.01)，如附图3D、3E所示。为进一步分析lncRNA MSTRG.5970.28通过miR-133a-3p对鹅卵泡颗粒细胞功能的影响，通过将过表达MSTRG.5970.28与miR-133a-3p质粒转染至颗粒细胞中。结果表明，与NC组相比，mimics-miR-133a-3p+OE-NC组细胞增殖活性极显著升高(P＜0.01)，细胞凋亡率极显著降低(P＜0.01)，mimics-NC+OE-MSTRG.5970.28组细胞增殖活性极显著降低(P＜0.01)，细胞凋亡率极显著升高(P＜0.01)；而共转染mimics-miR-133a-3p+OE-MSTRG.5970.28组则降低了由lncRNA MSTRG.5970.28过表达引起的颗粒细胞增殖的抑制作用与细胞凋亡的促进作用，如附图3F、3G所示。
2.4miR-133a-3p与ANOS1靶向性验证
RNAhybrid分析显示，miR-133a-3p与ANOS1存在预测结合位点，如附图4A所示。为验证miR-133a-3p与ANOS1的靶向关系，通过构建了含有miR-133a-3p结合位点的ANOS1-wt和ANOS1-mut质粒，如附图4B所示。随后，将野生型或突变型质粒与NC mimics或miR-133a-3p mimics共转染到293T细胞中。双荧光素酶活性分析显示，miR-133a-3p mimics与ANOS1-wt共转染组极显著降低了野生型质粒的荧光活性(P＜0.01)，但对突变型质粒无显著影响(P＞0.05)，如附图4C所示。为进一步验证ANOS1是否为miR-133a-3p的功能靶点，通过将miR-133a-3p的过表达载体mimics-miR-133a-3p或抑制载体inhibitor-miR-133a-3p转染至颗粒细胞中。与NC组相比，mimics-miR-133a-3p组ANOS1的mRNA及蛋白表达均极显著降低(P＜0.01)，inhibitor-miR-133a-3p组ANOS1的mRNA及蛋白表达均极显著升高(P＜0.01)，如附图4D、4E所示。
2.5lncRNA MSTRG.5970.28通过作为miR-133a-3的ceRNA调控ANOS1的表达
为进一步分析lncRNA MSTRG.5970.28通过作为miR-133a-3p的ceRNA调控ANOS1的表达，将MSTRG.5970.28与miR-133a-3p的过表达质粒共转染至颗粒细胞中。结果表明，与NC组相比，Control+mimics-miR-133a-3p+OE-NC组ANOS1的mRNA及蛋白表达均极显著降低(P＜0.01)，Control+mimics-NC+OE-MSTRG.5970.28组ANOS1的mRNA及蛋白表达均极显著升高(P＜0.01)。在共转染Control+mimics-miR-133a-3p+OE-MSTRG.5970.28组中发现ANOS1的mRNA及蛋白表达均极显著高于NC组(P＜0.01)，但极显著低于Control+mimics-NC+OE-MSTRG.5970.28组(P＜0.01)，如附图5A、5B所示。
如上所述，即可较好地实现本发明，上述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案作出的各种改变和改进，均应落入本发明确定的保护范围内。
Claims (9)
1.lncRNA MSTRG.5970.28，其特征在于，具有：如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。
2.如权利要求1所述的lncRNA MSTRG.5970.28在制备调控卵巢发育的产品中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，通过如下(1)-(4)中的任一种调控卵巢发育：
(1)调控卵巢颗粒细胞的增殖；
(2)调控卵巢颗粒细胞的凋亡；
(3)调控卵泡颗粒细胞的增殖或凋亡的相关miRNA，所述miRNA包括miR-133a-3p；
(4)调控卵泡颗粒细胞的增殖或凋亡相关基因，所述卵泡颗粒细胞的增殖或凋亡相关基因包括ANOS1。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，
(1)过表达lncRNA MSTRG.5970.28以促进卵巢颗粒细胞凋亡；
(2)过表达lncRNA MSTRG.5970.28以抑制卵巢颗粒细胞增殖；
(3)过表达lncRNA MSTRG.5970.28引起的颗粒细胞的增殖与凋亡作用，被miR-133a-3p减弱；
(4)过表达lncRNA MSTRG.5970.28以促进ANOS1基因的表达。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，通过lncRNA MSTRG.5970.28的重组载体实现过表达lncRNA MSTRG.5970.28。
6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，通过lncRNA MSTRG.5970.28的ceRNA实现lncRNA MSTRG.5970.28的调控。
7.根据权利要求2-6任一项所述的应用，其特征在于，所述卵泡颗粒细胞的增殖或凋亡为鹅的卵泡颗粒细胞的增殖或凋亡。
8.一种调控卵泡颗粒细胞的增殖或凋亡的方法，其特征在于，所述方法包括调控lncRNA MSTRG.5970.28的表达。
9.一种调控鹅卵泡颗粒细胞的增殖或凋亡的产品，其特征在于，包括用于过表达lncRNA MSTRG.5970.28的物质和/或用于沉默lncRNA MSTRG.5970.28的物质。
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