CN110129428B - miR-26a调节生殖细胞凋亡的应用 - Google Patents

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Abstract

研究指出miR‑26b参与了动物的繁殖调控，miR‑26b可通过靶向Smad4基因调控猪卵巢颗粒细胞凋亡，miR‑26a也可能有类似功能，但miR‑26a在生殖细胞中的研究还未见相关报道。本发明公开了miR‑26a调节生殖细胞凋亡的应用。本发明公开了DHCR24和Smad4是miR‑26a的靶基因，在猪卵巢颗粒细胞中，miR‑26a在转录水平和翻译水平负调控DHCR24和Smad4的表达；miR‑26a通过干扰DHCR24和Smad4表达从而促进卵巢颗粒细胞凋亡，同时再通过调节类固醇合成通路影响激素分泌控制雌二醇、孕酮分泌。

Description

miR-26a调节生殖细胞凋亡的应用
技术领域
本发明涉及细胞工程和基因工程技术领域，尤其涉及一种miR-26a调节生殖细胞凋亡的应用。
背景技术
在哺乳动物卵巢中，卵泡发生和闭锁过程受到复杂的基因网络的严格调控。因此，可以同时来源于细胞和细胞外来源的miRNA通过广泛参与转录后的mRNA调节而起到介导这些过程的作用。已有研究表明，卵巢miRNA在卵泡和黄体发育、卵巢功能和卵巢疾病和内分泌紊乱方面起着重要作用，miRNA通过促进颗粒细胞凋亡和抑制凋亡来发挥调控作用。
据报道，miR-26b参与了动物繁殖的调控，miR-26b通过靶向Smad4基因调控猪卵泡颗粒细胞凋亡，miR-26a与miR-26b具有相同的种子序列，因此，miR-26a可能在卵巢颗粒细胞中也发挥相似作用。有学者通过分析miRNA在卵泡发育过程中表达模式，筛选和鉴定相关miRNA、mRNA和通路，发现Smad2是调节牛卵泡发育的中枢因子，并且进一步研究发现miR-26a/b调控Smad2基因发挥作用。
这些研究结果表明，miR-26a在卵泡发育过程中可能起着重要的调控作用，但目前miR-26a在猪卵巢颗粒细胞中的研究还未见相关报道。
发明内容
本发明提出一种miR-26a调节生殖细胞凋亡的应用。
优选地，miR-26a的核酸序列如SEQ.NO.1所示。
优选地，生殖细胞为哺乳动物的生殖细胞；优选地，生殖细胞为猪的生殖细胞；优选地，生殖细胞为卵巢颗粒细胞。
优选地，miR-26a调控Seladin-1基因的表达来调节生殖细胞凋亡；优选地，miR-26a调控2,4-脱氢胆固醇还原酶来调节生殖细胞凋亡。
优选地，miR-26a调控Smad4基因的表达来调节生殖细胞凋亡。
Seladin-1基因与编码DHCR24酶的基因是一样的，后统一命名为2,4-脱氢胆固醇还原酶(DHCR24，又称Seladin-1)。DHCR24蛋白的抗凋亡作用与抑制Caspase-3的激活有关，如神经细胞和其他细胞模型所示。进一步的研究表明，DHCR24具有清除剂活性，从而保护细胞免受氧化应激诱导的细胞凋亡，即DHCR24具有活性氧清除活性。这些研究表明，DHCR24对许多细胞类型具有抗凋亡活性。因此，DHCR24是一种同时具有胆固醇合成和抗凋亡活性的多功能蛋白。
虽然已有研究表明，DHCR24在卵巢中有表达，但在卵泡发育及颗粒细胞功能调控方面研究还尚不清楚。而刘吉英(刘吉英.miR-26b调控猪卵泡颗粒细胞凋亡机制[D].南京农业大学,2016)揭露了miR-26b通过靶向Smad4基因调控猪卵泡颗粒细胞凋亡，而miR-26a与miR-26b具有相同的种子序列，即miR-26a可能在卵巢颗粒细胞中也发挥相似作用，但相关研究还较少，目前miR-26a在猪卵巢颗粒细胞中的研究还未见相关报道。
本发明公开了DHCR24和Smad4是miR-26a的靶基因，在猪卵巢颗粒细胞中，miR-26a在转录水平和翻译水平负调控DHCR24和Smad的表达；miR-26a通过干扰DHCR24和Smad4表达从而促进卵巢颗粒细胞凋亡，同时再通过调节类固醇合成通路影响激素分泌控制雌二醇、孕酮分泌。
附图说明
图1为双荧光素酶报告检测中GP-miRGLO质粒图谱信息。图2为miR-26a与DHCR24的3’UTR区域结合图。图3为miR-26a与Smad4的3’UTR区域结合图。图4为qPCR检测miR-26a小片段转染效率图。图5为miR-26a促进猪卵巢颗粒细胞凋亡。图6为miR-26a对雌二醇、孕酮分泌的影响图。图7为Smad4-WT比对结果图。图8为Smad4-MUT比对结果图。图9为DHCR24-WT比对结果图。图10为DHCR24-MUT比对结果图。图11为实施例6的双荧光素酶活性检测图。图12为qPCR验证miR-26a转录水平调控靶基因表达图。图13为Western Blot验证miR-26a对靶基因蛋白水平的影响图。图14为qPCR检测si-DHCR24、si-Smad4干扰效率图。图15为干扰DHCR24对颗粒细胞凋亡的影响图。图16为干扰Smad4对颗粒细胞凋亡的影响图。图17为干扰靶基因对雌二醇、孕酮的影响图。
具体实施方式
miR-26a模拟物(miR-26a mimic)、模拟物阴性对照(mimic NC)、miR-26a抑制物(miR-26a inhibitor)、抑制物阴性对照(inhibitor NC)、Smad4干扰RNA(si-Smad4)、DHCR24干扰RNA(si-DHCR24)干扰RNA阴性对照(NC-siRNA)均由广州市锐博科技生物有限公司合成，核酸序列如下：
Figure BDA0002053901760000031
Figure BDA0002053901760000041
注：DHCR24-siRNA序列为靶序列；NC-siRNA由广州锐博科技生物有限公司合成，其序列保密。
实施例1生物信息学预测及保守性分析
在miRBase数据库(http://www.mirbase.org/)下载猪(Sus scrofa)、人(Homosapiens)、小鼠(Mus musculus)、牛(Bos taurus)、山羊(Capra hircus)、猴(Macacamulatta)、马(Equus caballus)、大鼠(Rattus norvegicus)、斑马鱼(Danio rerio)、鸡(Gallus gallus)10个物种的miR-26a成熟序列，使用MEGA6.0软件分析其保守性。不同物种中miR-26a成熟序列比对如下表所示(其下表中虚线框内为种子序列)：
Figure BDA0002053901760000042
由上表可知：miR-26a的成熟序列在哺乳动物及斑马鱼中序列完全一致，具有22个碱基，鸡仅仅5‘端少一个碱基U，表明miR-26a在脊椎动物中具有较高的保守性。
根据NCBI数据库查询猪DHCR24、Smad4 mRNA序列信息，其3’UTR长度分别为2649bp、1315bp。根据本申请人前期对猪卵泡期和黄体期卵巢进行转录组及miRNA测序分析(详见田密.约克夏猪卵巢黄体期到卵泡期转变的关键miRNA的筛选与功能分析[D].安徽农业大学,2018；张旭.猪卵巢卵泡期和黄体期的转录组特征及差异基因筛选[D].安徽农业大学,2018)，以及对猪高低产仔猪卵巢转录组及小RNA高通量测序分析(详见黄龙.基于卵巢RNA组学鉴定影响猪产仔数性状的候选基因及microRNA[D].安徽农业大学,2016.)，发现miR-26a可能与DHCR24、Smad4存在靶向关系。通过RNAhybird(bibiserv2.cebitec.uni-bielefeld.de/rnahybrid)预测可知，DHCR24和Smad4可能是miR-26a调控的基因，预测结果如图2和图3，图2为miR-26a与DHCR24的3’UTR区域结合图，图3为miR-26a与Smad4的3’UTR区域结合图。
实施例2引物设计与合成
从最新的miRBase22.1数据库(www.mirbase.org)中查询并下载ssc-miR-26a(序列号：MI0002429)的成熟序列。利用加尾法设计miRNA引物，下游引物为通用引物由
Figure BDA0002053901760000051
Tip GreenmiRNA Two-Step qRT-PCR SuperMix试剂盒提供。
从NCBI数据库，下载猪基因Smad4(Gene ID：397142)、DHCR24(Gene ID：100628197)、Caspase-3(Gene ID：397244)、BCL-2(Gene ID：100049703)的mRNA序列。使用Primer Premier6.0软件对这几个基因的mRNA进行引物设计，使用NCBI平台中Primer-BLAST(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/index.cgi？LINK_LOC＝BlastHom e)对设计的引物进行序列比对及特异性分析。
Smad4、DHCR24、Bcl-2、Caspase-3、miR-26a及内参基因β-Actin和U6引物均由通用生物系统(安徽)有限公司合成，具体引物信息见下表(注：F为上游引物；R为下游引物。miR-26a和U6为上游特异性引物，下游引物为通用引物，由试剂盒内提供)：
Figure BDA0002053901760000061
实施例3猪卵巢颗粒细胞分离培养、接种转染
原代培养：(1)将猪卵巢置于预热的37℃生理盐水(添加1％双抗)中，迅速运回实验室；(2)将卵巢用预热的PBS(含1％双抗)清洗3遍，用1mL无菌注射器抽取直径3～6mm中等大小卵泡中的卵泡液；(3)吸取的卵泡液置于5mL完全培养基的15mL离心管中，1000rpm，室温离心5min；(4)弃上清，用完全培养基重悬，1000rpm离心5min，重复2次；(5)弃上清，用适量完全培养基重悬，接种于10cm细胞培养皿中；(6)置于37℃，5％CO2培养箱中培养，48h后观察贴壁情况，去除培养基；(7)加入10mL预热PBS清洗；(8)更换完全培养基，继续培养至细胞汇合度达到90％左右，进行传代培养。
传代培养：(1)弃去培养皿中的培养基，用预热过的PBS清洗2遍；(2)加入3mL含0.25％EDTA的胰蛋白酶，轻晃使其与贴壁细胞充分接触；(3)置于培养箱中孵育2～3min，显微镜下观察至大部分细胞漂起即可；(4)立即加入6mL完全培养基终止消化，轻吹打数次；(5)转移至15mL离心管中，1000rpm，离心5min；(6)弃上清，加入5mL完全培养基重悬细胞，1000rpm，离心5min，重复2次；(7)加入适量完全培养基重悬细胞，接种于10cm培养皿；(8)放置37℃，5％CO2培养箱中培养，24h后观察细胞生长状况。
接种转染：(1)待10cm培养皿中细胞汇合度达到80～90％时，细胞接种前处理方法中传代培养方法；(2)使用完全培养基重悬细胞，均匀分配到每个孔中，加入完全培养基至合适体积，轻轻摇匀，置于培养箱中培养；(3)24h后，观察细胞状况，汇合度70～80％左右准备进行转染；(4)按照德国QIAGEN公司HiPerFect Transfection Reagent转染试剂说明书进行；每组设置3个重复；(5)转染后置于37℃，5％CO2培养箱中；(6)转染后48h及72h，收取细胞，进行检测。
实施例4总RNA提取
参照Omega Bio-Tek公司总RNA提取试剂盒操作说明书，提取组织或者细胞RNA，具体操作步骤如下：(1)样品处理：a.从组织中提取总RNA：取适量-80℃冻存的组织样品，液氮研磨至粉末状后加入装有1mL裂解液的无RNA酶离心管中，旋涡振荡，静置孵育2～3min；b.提取培养细胞(贴壁)总RNA：去除上清，使用预冷的PBS清洗2遍，直接加入适量裂解液后，室温静置孵育5min，转移至无RNA酶离心管中；(2)加入200μL氯仿，旋涡振荡后，置于冰上孵育10min；(3)4℃，12000×g离心15min；(4)吸取分层后的上层水相500μL转移至新的EP管中，加入等体积的70％乙醇，旋涡振荡；(5)将步骤(4)中的样品转移至吸附柱中，10000×g离心1min，弃滤液；(6)加入500μL RNA Wash BufferⅠ，室温下以10000×g离心1min，弃滤液和收集管；(7)将吸附柱转移至新收集管中，加入500μL RNA Wash BufferⅡ，室温下以10000×g离心1min，弃滤液；(8)重复步骤(7)，将收集管放空，16000×g离心2min；(9)将吸附柱转移至新的无RNA酶离心管中，加入30～45μL DEPC水，孵育3min，12000×g离心2min，洗脱液即为总RNA，置于-80℃冰箱保存。
总RNA提取完成后，取1μL待测RNA溶液，使用超微量核酸蛋白分析仪检测其吸光值OD260/OD280为1.8～2.0之间，则可用于后续试验。OD260/OD280值低于1.8表明样品有蛋白质污染，高于2.0则为有其他核酸污染。
实施例5miRNA反转录与qPCR，及mRNA反转录与qPCR
miRNA反转录按照全式金公司(北京，中国)所生产的反转录试剂盒TransScriptGreen miRNA First-Strand cDNA Synthesis SuperMix说明书操作。RT-PCR反应体系：
Figure BDA0002053901760000081
miRNA RT Enzyme Mix 1μL，2×TS miRNA Reaction Mix 10μL，RNA≤5μg，计算样品添加量并加样，加水(Rnase-free Water)至总体积为20μL。反应程序：37℃孵育1h，85℃5s，4℃保存。反转录完成后反应产物置于-20℃保存。
采用qPCR技术，使用TransStart Tip Green qPCR SuperMix(AQ202-01，北京全式金生物技术有限公司)试剂盒，检测miRNA表达水平。对于miRNA，反应体系：cDNA模板1μL，特异性引物0.4μL(0.2μM)，通用引物0.4μL(0.2μM)，
Figure BDA0002053901760000092
Top/Tip Green qPCRSuperMix 10μL，ddH2O 8.2μL，总反应体系为20μL。反应程序使用两步法：(1)94℃30s；(2)94℃5s，60℃30s(进行40个循环)。每个样品均检测3次。实验结果采用比较Ct值法，即2-ΔΔct方法计算样品miRNA相对表达量水平。
mRNA反转录按照全式金公司(北京，中国)TransScriptI One-Step gDNA Removaland cDNA Synthesis SuperMix的说明书操作。RT-PCR反应体系：Random Primer(0.1μg/μL)1μL，2×ES Reaction Mix 10μL，
Figure BDA0002053901760000091
RT/RI Enzyme Mix 1μL，gDNA Remover1μL，RNA≤5μg，计算RNA添加量再加样，加水(Rnase-free Water)至总体积为20μL。反应程序：42℃15min，85℃5s，4℃保存。
qPCR检测使用TransStart Tip Green qPCR SuperMix(AQ202-01，北京全式金生物技术有限公司)试剂盒。对于mRNA，反应体系为20μL体系：cDNA模板1μL，上游引物0.4μL(0.2μM)，下游引物0.4μL(0.2μM)，
Figure BDA0002053901760000093
Top/Tip Green qPCR SuperMix 10μL，ddH2O 8.2μL。使用两步法程序：(1)94℃30s；(2)94℃5s，60℃30s(进行45个循环)。每个样品均检测3次。实验结果采用比较Ct值法，即2-ΔΔct方法计算样品mRNA相对表达量水平。
本发明采用合成的miR-26a mimic/NC和miR-26a inhibitor/NC进行体外细胞水平试验(过表达/对照和抑制/对照试验)，以研究ssc-miR-26a在猪卵巢颗粒细胞中功能。合成好所需oligo后，在猪卵巢颗粒细胞中进行转染，以检验其过表达和抑制效率。转染浓度为miR-26a mimic和mimic NC为100nM，miR-26a inhibitor和inhibitor NC为200nM，采用qPCR方法检测其效果，如图4所示，图4为qPCR检测miR-26a小片段转染效率图。
结果表明，转染miR-26a mimic组与NC mimic组相比，过表达约42倍，过表达效率较好；转染miR-26a inhibitor组与NC inhibitor相比，抑制效率约为3倍。下述实施例即采用此浓度。
实施例6细胞凋亡
细胞凋亡检测方法如下：猪卵巢颗粒细胞转染48h后，按照上海贝博生物的Annexin V-FITC/PI双染细胞凋亡检测试剂盒说明书检测细胞凋亡，具体步骤：(1)将细胞培养基转移至15mL离心管中，用2mLPBS轻轻润洗细胞，弃去PBS；(2)加入胰酶消化细胞后，用预冷的PBS洗涤细胞2遍，弃去PBS；(3)用400μL 1×Annexin Ⅴ结合液悬浮细胞，密度约为1×106细胞/mL；(4)在细胞悬液中加入5μL Annexin Ⅴ-FITC染色液，混匀，2～8℃避光孵育15min；(5)加入10μL PI染色液，混匀，2～8℃避光孵育5min；(6)立即使用流式细胞仪检测凋亡率。
本发明将miR-26a mimic/NC和miR-26a inhibitor/NC转染到培养的猪卵巢颗粒细胞中以确定miR-26a是否在调控卵巢颗粒细胞凋亡方面发挥作用。
采用annexin V FITC/PI染色，使用流式细胞仪分析检测卵巢颗粒细胞的凋亡率，其结果如图5所示，图5为miR-26a促进猪卵巢颗粒细胞凋亡。由图5可知：用miR-26a mimic转染的卵巢颗粒细胞凋亡率显著高于NC mimic组(P<0.01)；用miR-26a inhibitor转染的猪卵巢颗粒细胞凋亡率显著低于NC inhibitor组(P<0.05)。上述结果表明：miR-26a促进细胞凋亡，是猪卵巢颗粒细胞中的一个原凋亡因子。
实施例7类固醇激素分泌水平检测
类固醇激素分泌水平检测如下：培养的猪卵巢颗粒细胞转染48h后，收取细胞培养液上清，2000×g离心20min，取上清，-20℃保存。按照武汉基因美生物科技有限公司生产的ELISA检测试剂盒说明书操作，检测雌二醇和孕酮浓度。
由于颗粒细胞是卵巢的主要功能细胞，参与类固醇分泌和卵泡发育；而实施例6表明miR-26a能够促进猪卵巢颗粒细胞凋亡，而颗粒细胞的凋亡与雌激素含量密切相关。
本发明采用ELISA技术检测转染miR-26a mimic/NC和miR-26a inhibitor/NC后猪卵巢颗粒细胞培养液中雌二醇和孕酮的含量，来研究miR-26a对卵巢颗粒细胞雌激素(雌二醇、孕酮)的分泌是否有影响。结果见图6，图6为miR-26a对雌二醇、孕酮分泌的影响图。由图6可知：与NC组相比，转染miR-26a mimic能够极显著抑制雌二醇和孕酮的分泌(P<0.01)，转染miR-26a inhibitor极显著促进雌二醇和孕酮的分泌(P<0.01)。
实施例8双荧光素酶基因报告检测
1、获取目的基因序列片段：
根据NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/)查询的ssc-miR-26a(GeneID:100316605)基因序列信息，由上海吉玛制药技术有限公司合成ssc-miR-26a mimic和NCmimic。从NCBI查询猪Smad4(Gene ID:397142)和DHCR24(Gene ID：100628197)基因mRNA信息，根据RNAhybird(bibiserv2.cebitec.uni-bielefeld.de/rnahybrid)预测的ssc-miR-26a与靶基因DHCR24 3’UTR、Smad4 3’UTR的结合位点，采用全基因合成的方式合成野生型目的基因3’UTR区与ssc-miR-26a潜在结合位点的序列(命名为DHCR24-WT，Smad4-WT)，突变型目的基因包括与ssc-miR-26a的潜在结合位点的序列(命名为DHCR24-MUT，Smad4-MUT)。目的基因oligo由上海吉玛制药技术有限公司合成。具体如下所示：
Figure BDA0002053901760000121
Figure BDA0002053901760000131
使用退火方法得到目的基因序列片段：将合成的Smad4-WT、Smad4-MUT、DHCR24-WT、DHCR24-MUT oligo溶解为100μM浓度。按照下表配置退火反应体系：
Figure BDA0002053901760000132
在PCR仪上按照如下程序进行退火处理：95℃5min；85℃5min；75℃5min；70℃5min；4℃保存。退火处理后得到浓度为10μM的dsDNA模板。将所得模板溶液稀释50倍，终浓度为200nM，用于连接反应。
2、目的基因序列片段克隆至载体中
(1)双荧光素酶报告基因质粒使用GP-miRGLO质粒，图谱信息如图1所示；(2)用SacⅠ和XhoⅠ对载体GP-miRGLO进行酶切，按照表1.5配置酶切反应体系，37℃酶切2h，体系如下：
Figure BDA0002053901760000141
(3)电泳，用DNA凝胶回收试剂盒回收双酶切的GP-miRGLO载体条带；
(4)用T4 DNA ligase连接酶切得到的GP-miRGLO载体条带和目的基因dsDNA模板，22℃连接2h，连接体系如下：
Figure BDA0002053901760000142
(5)得到载体：pmirGLO-Smad4-WT、pmirGLO-Smad4-MUT、pmirGLO-DHCR24-WT、pmirGLO-DHCR24-MUT。
载体构建完成后，对重组质粒进行测序，将测序结果与目的基因序列进行比对，比对无误后，方可进行后续实验，其比对结果如图7-10所示，图7为Smad4-WT比对结果图，图8为Smad4-MUT比对结果图，图9为DHCR24-WT比对结果图，图10为DHCR24-MUT比对结果图。由图7-10可知：Smad4-WT、Smad4-MUT、DHCR24-WT以及DHCR24-MUT成功连接到双荧光素酶报告基因检测载体中，测序结果与设计的序列比对完全一致，表明载体构建成功，可进行后续实验。
3、转化
(1)取感受态细胞置于冰上4min，待解冻后分装至无菌预冷离心管中，加入10μL连接产物，混匀，冰浴30min；(2)将离心管42℃水浴锅放置90s，立即转移至冰浴冷却3min；(3)在离心管中加入800μL LB培养基(不含抗生素)，混匀，置于37℃摇床，250rpm，培育45min以复苏菌体；(4)取200μL培育后的细胞，涂布于含50μg/mL氨苄青霉素的LB平板上；(5)待平板上液体被吸收后，置于37℃培养箱中，培养16h。
4、挑菌培养及测序验证
(1)从培养好的平板上挑选菌落，置于装有5mL(含50μg/mL氨苄青霉素)LB培养基的试管中，37℃，250rpm，培养16h；(2)将菌液用质粒小提取试剂盒(天根生化，DP104-02)抽提质粒，按照说明书操作；(3)取200μL阳性克隆对应的菌液送测序鉴定，剩余菌液甘油保存；(4)将测序结果与目的序列比对无误后，将保存菌液复苏培养并进行大量质粒抽提。
5、细胞转染和双荧光素酶活性检测
(1)转染前将293T细胞消化接种至12孔板，每孔细胞数量约为5×105，置于37℃5％CO2培养24h；
(2)溶解稀释合成的microRNA，终浓度为20μM；
(3)在1.5mL EP管中加入100μL opti-DMEM培养基，加入10μL microRNA，添加1.6μg对应的双荧光报告载体，混匀；在另一EP管中，加入100μL opti-DMEM培养基，添加4μLlipofectamine 2000转染试剂，混匀；室温孵育5min后将两管混合，室温孵育20min；
(4)试验分组：
Smad4验证分组为：A.mimic NC+SMAD4 WT；B.mimic NC+SMAD4 MUT；C.ssc-miR-26a+SMAD4 WT；D.ssc-miR-26a+SMAD4 MUT；
DHCR24验证分组为：A.mimic NC+DHCR24 WT；B.mimic NC+DHCR24MUT；C.ssc-miR-26a+DHCR24 WT；D.ssc-miR-26a+DHCR24 MUT；
(5)弃去12孔板中的培养基，将转染混合物逐滴加入孔中，混匀，培养箱培育5h；(6)吸弃转染液，加入500μL含10％FBS的DMEM培养液，37℃5％CO2培养48h；(7)收集细胞，使用Dual-Luciferase报告基因检测系统试剂盒进行荧光检测。
在猪卵巢颗粒细胞共转染miR-26a mimc/mimic NC和pmirGLO-Smad4-WT/pmirGLO-Smad4-MUT、pmirGLO-DHCR24-WT/pmirGLO-DHCR24-MUT，48h后，检验相对荧光强度，以确定miR-26a是否靶向结合到DHCR24和Smad4 3’UTR区。
结果如图11所示，图11为实施例6的双荧光素酶活性检测图。由图11A可知：共转染miR-26a mimic和pmirGLO-DHCR24-WT重组质粒后，与共转染mimic NC组相比，转染miR-26amimic能够显著抑制荧光素酶报告基因的活性(P<0.05)；共转染pmirGLO-DHCR24-MUT重组质粒，转染miR-26a mimic组与对照组mimic NC相比，对报告基因荧光活性无显著影响(P>0.05)，即当DHCR24 3’UTR区域与miR-26a结合区域发生突变后，miR-26a不能结合到DHCR243’UTR上，从而影响荧光素酶报告基因活性。而图11B可知：对于靶基因Smad4，其结果也如DHCR24一样。
双荧光素酶报告实验结果表明，miR-26a能够通过靶向结合DHCR24和Smad4的3’UTR区域从而抑制报告基因荧光活性。
实施例9qPCR检测miR-26a对DHCR24、Smad4转录水平的影响
本发明采用miR-26a mimic/NC和miR-26a inhibitor/NC转染培养猪卵巢颗粒细胞后检测其mRNA表达水平以进一步验证miR-26a与DHCR24和Smad4之间的靶向关系，其结果如图12所示，图12为qPCR验证miR-26a转录水平调控靶基因表达图。
如图12A所示，在猪卵巢颗粒细胞中转染miR-26a mimic后，与转染mimic NC组相比，极显著下调DHCR24 mRNA的表达(P<0.01)；转染miR-26a inhibitor与inhibitor NC相比，显著上调DHCR24 mRNA表达(P<0.05)。由图12B可知，对于靶基因Smad4，miR-26a mimic显著下调Smad4 mRNA表达(P<0.05)，miR-26a inhibitor极显著上调Smad4 mRNA的表达(P<0.01)。
qPCR检测结果表明：miR-26a在转录水平抑制DHCR24和Smad4表达。上述结果表明：miR-26a能够促进猪卵巢颗粒细胞凋亡，DHCR24和Smad4是miR-26a的靶基因。
实施例10 Western Blot检测
Western Blot检测方法如下：(1)细胞收集及蛋白提取：细胞消化后，收集细胞，2500rpm10min，加入1mL RIPA细胞裂解液(含1mM PMSF)，置于冰上裂解30min，收集上清液，即为细胞总蛋白；(2)SDS-PAGE电泳：在细胞总蛋白样品中，按照1：4加入5×SDS-PAGE缓冲液，沸水浴加热10min，充分变性蛋白；样品冷却后，将样品上样至SDS-PAGE胶加样孔，电泳至溴酚蓝刚出胶底部为止；(3)转膜：将PVDF膜剪裁至与胶条相同大小，甲醇浸泡3～5min，用转膜缓冲液浸润5min；转膜装置从下往上依次放置阴极板、3层滤纸、凝胶、PVDF膜、3层滤纸、阳极板，每一步均需去除气泡；300mA恒流转膜60min；(4)封闭：转膜结束，将PVDF膜在Western洗涤液中漂洗5min，加入封闭液(5％脱脂奶粉)，摇床室温封闭2h；(5)一抗孵育：参照说明书，加入DHCR24和Smad4一抗稀释液(DHCR24一抗：1：500，Smad4：1：1000)，4℃孵育过夜，PBST洗涤10min，洗涤3次；(6)二抗孵育：根据说明书，按1：2000用二抗稀释液稀释辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗室温孵育2h，PBST洗涤10min，3次；(7)蛋白检测：参照说明书，使用ECL超敏发光试剂盒来检测蛋白；使用Image J软件进行胶片条带分析。
本发明通过Western Blot技术从翻译水平进一步验证miR-26a对DHCR24和Smad4蛋白水平的影响。在猪卵巢颗粒细胞中转染miR-26a mimic/mimic NC或miR-26ainhibitor/inhibitor NC，72h后检测DHCR24和Smad4蛋白表达量，结果如图13所示，图13为Western Blot验证miR-26a对靶基因蛋白水平的影响图。如图13A所示，在猪卵巢颗粒细胞中转染miR-26a mimic组与mimic NC组相比，DHCR24蛋白表达量极显著下调(P<0.01)；转染miR-26a inhibitor组与转染inhibitor NC组相比，DHCR24蛋白表达量极显著上调(P<0.01)。如图13B所示，与DHCR24结果一致，转染miR-26a mimic能够极显著抑制Smad4蛋白表达(P<0.01)，转染miR-26a inhibitor极显著促进Smad4蛋白表达(P<0.01)。Western Blot结果表明：miR-26a在翻译水平负调控DHCR24和Smad4的表达。
实施例11si-DHCR24、si-Smad4干扰效率检测
实施例6结果表明：miR-26a能够促进猪卵巢颗粒细胞凋亡，DHCR24和Smad4是miR-26a的靶基因。
本发明合成了DHCR24、Smad4小干扰RNA片段，用于在细胞水平验证其功能，以研究miR-26a是否是通过调控其靶基因DHCR24和Smad4的表达发挥作用。
对于靶基因DHCR24，设计合成了3个小干扰RNA片段(分别命名为si-DHCR24-1、si-DHCR24-2、si-DHCR24-3)以及对照(NC-siRNA)，在培养的猪卵巢颗粒细胞中转染小片段，检验其干扰效率，筛选出最佳的一条小干扰RNA用于后续试验。
qPCR检测结果如图14所示，图14为qPCR检测si-DHCR24、si-Smad4干扰效率图。由图14A可知：转染si-DHCR24-1/2/3后，与对照组siRNA-NC相比，均能够显著(P<0.05)或极显著(P<0.01)下调DHCR24表达，其中si-DHCR24-2组干扰效率最高，故选取此条小干扰RNA用于后续试验，在此命名为si-DHCR24。对于靶基因Smad4，在猪这一物种中已有相关研究报道(Li Q,Du X,Pan Z,et al.The transcription factor SMAD4 and miR-10b contributeto E2 release and cell apoptosis in ovarian granulosa cells by targetingCYP19A1[J].Mol Cell Endocrinol,2018,476:84-95.)，故使用已有序列进行合成，命名为si-Smad4。由图14B可知：在猪卵巢颗粒细胞中转染si-Smad4后，与对照组siRNA-NC相比，能够极显著下调Smad4表达(P<0.01)，故使用此条序列进行后续试验。
实施例12干扰DHCR24、干扰Smad4促进猪卵巢颗粒细胞凋亡
本发明采用转染RNA小干扰片段si-DHCR24、si-Smad4来研究靶基因DHCR24和Smad4在猪卵巢颗粒细胞中对细胞凋亡的影响，使用上述流式细胞术检测颗粒细胞凋亡，其结果如图15-16所示，图15为干扰DHCR24对颗粒细胞凋亡的影响图，图16为干扰Smad4对颗粒细胞凋亡的影响图。
图15A表明：转染si-DHCR24组细胞凋亡率极显著高于siRNA-NC组(P<0.01)，并且图15C也表明转染si-DHCR24组显著上调促凋亡基因Caspase-3的表达(P<0.05)，但通过图15B可知转染si-DHCR24组对BCL-2基因的表达无显著影响(P>0.05)。
通过图16A的结果表明：转染si-Smad4组猪卵巢颗粒细胞凋亡率极显著高于对照组siRNA-NC组(P<0.01)，并且图16B也表明转染si-Smad4组显著抑制抗凋亡基因BCL-2的表达(P<0.05)，图16C表明转染si-Smad4组显著促进促凋亡基因Caspase-3的表达(P<0.05)。
综合上述结果，干扰DHCR24和Smad4的表达能够促进猪卵巢颗粒细胞的凋亡。
实施例13干扰DHCR24、干扰Smad4对雌激素分泌的影响
本发明采用酶联免疫吸附实验(ELISA)检测干扰DHCR24和Smad4后细胞培养液中雌二醇、孕酮的浓度，以观测DHCR24和Smad4在猪卵巢颗粒细胞中对雌激素、孕酮分泌的影响。
结果如图17所示，图17为干扰靶基因对雌二醇、孕酮的影响图。由图17A可知，与转染siRNA-NC组相比，转染si-DHCR24极显著降低雌二醇的分泌(P<0.01)，但转染si-Smad4组极显著提高了雌二醇水平(P<0.01)。
图17B可知，对孕酮的影响，转染si-DHCR24组与对照组siRNA-NC组相比，孕酮浓度显著降低(P<0.05)，转染si-Smad4组孕酮浓度极显著升高(P<0.01)。
以上结果表明，在猪卵巢颗粒细胞中抑制DHCR24表达可抑制雌二醇和孕酮的分泌，抑制Smad4表达促进颗粒细胞分泌雌二醇和孕酮。
本发明首先通过分析miR-26a在不同物种中的保守性，确定miR-26a在不同物种间成熟序列高度保守，且种子序列完全保守，故推测其在猪卵巢颗粒细胞中可能也存在相似功能。因此为研究miR-26a在猪卵巢颗粒细胞中的功能，本发明通过合成miR-26a mimic/NC、miR-26inhibitor/NC，转染到猪卵巢颗粒细胞中，以研究其对卵巢颗粒细胞功能的影响。
本发明在培养的猪卵巢颗粒细胞过程中，过表达miR-26a能够促进卵巢颗粒细胞凋亡，抑制雌二醇和孕酮激素分泌；而抑制内源性miR-26a表达抑制颗粒细胞凋亡，促进雌二醇和孕酮激素分泌。根据已有研究表明，miRNA在调控颗粒细胞凋亡及雌激素分泌之间存在关联。这些研究结果与本发明结果一致，即miRNA可通过调控雌激素(雌二醇、孕酮)的合成，进而调控卵巢颗粒细胞凋亡。
本发明结果表明：miR-26a可调控卵巢颗粒细胞凋亡和类固醇合成。据本申请人所知，本发明首次表明/揭露miR-26a可调节猪卵巢颗粒细胞中的细胞凋亡和类固醇合成。
根据本申请人前期对高低产母猪卵巢mRNA及miRNA转录组分析，筛选出DHCR24和Smad4可能是miR-26a的靶基因。随后通过生物信息学分析，确定DHCR24和Smad4 mRNA 3’UTR区域存在miR-26a的结合位点。
但生物信息学方式预测只能提供参考，具体的验证还需生物实验技术方法。生物技术方法主要分为两类：一类以miRNA与靶基因mRNA直接作用为基础的方法，另一类为间接检测miRNA与靶基因mRNA的相互作用。这两种检测技术，第一类包括双荧光素酶报告基因或RNA与蛋白质免疫共沉淀技术等，其准确性较高；第二类准确性较低，主要是通过改变miRNA表达，检测靶基因mRNA及蛋白水平的变化，从而推测其相关关系。
本发明首先通过生物信息学方法确定DHCR24和Smad4是miR-26a的潜在靶基因，随后通过两种生物技术方法进行验证。双荧光素酶报告基因检测系统具有灵敏度高、准确性高等特性。为了验证miR-26a与潜在靶基因DHCR24、Smad4是否存在靶向结合调控关系，首先构建靶基因野生型WT质粒、突变型MUT质粒，随后将构建的重组质粒与miR-26a模拟物共转染至293T细胞，使用双荧光活性检测来进行验证靶基因3’UTR与miRNA靶向关系。本发明揭露转染miR-26a模拟物显著降低DHCR24和Smad4基因野生型载体荧光素酶活性，对突变型载体无显著影响；表明miR-26a通过靶向结合DHCR24和Smad4的3’UTR区域抑制报告基因荧光活性。双荧光素酶报告基因检测结果表明，miR-26a与DHCR24、Smad4存在靶向关系。
为了进一步验证它们之间的靶向关系，本发明使用qPCR技术和Western blot技术进行验证。qPCR检验表明：在猪卵巢颗粒细胞中过表达miR-26a能够在转录水平抑制DHCR24和Smad4基因表达，抑制miR-26a表达在转录水平促进DHCR24和Smad4表达。使用Westernblot检测发现，与qPCR结果一致，miR-26a在翻译水平调控DHCR24和Smad4蛋白表达。
本发明采用所合成的DHCR24小干扰RNA片段对颗粒细胞功能的影响，确定抑制猪卵巢颗粒细胞中DHCR24的表达可以显著增加Caspase-3的表达，促进细胞凋亡，抑制雌二醇和孕酮的分泌，提示DHCR24在猪卵巢颗粒细胞中具有抗凋亡功能。而已有研究表明在神经细胞和其他细胞模型所示中，DHCR24蛋白的抗凋亡作用与抑制Caspase-3的激活有关。同时本发明确定，抑制DHCR24能够促进Caspase-3表达，这与上述研究结果一致。并且本申请人还发现：可能由于DHCR24启动子区域存在雌激素反应因子，抑制DHCR24基因的表达也可以抑制猪颗粒细胞中雌激素和黄体酮的分泌，
由于卵巢体细胞(主要是颗粒细胞)和卵母细胞相互作用决定着卵泡的发生，排卵及黄体化。在卵泡发育的过程中，Smad蛋白广泛表达与卵巢发育的各个阶段，其表达水平随着卵巢功能的发育有周期性的变化。
已有研究发现用si-Smad4处理猪卵巢颗粒细胞后改变了许多的基因表达，这些基因参与了卵泡颗粒细胞的关键过程；Smad4的缺失时可以使卵巢颗粒细胞提前黄体化；在卵巢中特异性敲除Smad4基因会导致小鼠颗粒细胞过早黄体化，导致卵巢早衰，生育能力下降等；进一步研究发现沉默Smad4基因能够促进卵巢颗粒细胞凋亡。
本发明在猪卵巢颗粒细胞中抑制Smad4的表达，抑制抗凋亡基因BCL-2表达，上调促凋亡基因Caspase-3表达，促进颗粒细胞的凋亡，这与上述研究结果一致。在猪卵巢颗粒细胞中抑制Smad4表达后，极显著促进雌二醇和孕酮。
同时现有研究发现，在猪卵巢颗粒细胞中过表达Smad4能够上调CYP19A1表达，促进雌二醇分泌；在小鼠卵巢中特异性敲除Smad4基因，会破坏类固醇激素调节，促进孕酮分泌。这也与本发明结果一致。
综上所述，本发明表明：DHCR24和Smad4是miR-26a的靶基因，miR-26a通过靶向调控DHCR24和Smad4表达促进猪卵巢颗粒细胞凋亡；miR-26a能够抑制猪卵巢颗粒细胞雌二醇和孕酮分泌，抑制DHCR24表达能够降低雌二醇和孕酮分泌，但抑制Smad4表达却升高雌二醇和孕酮分泌，说明miR-26a抑制猪卵巢颗粒细胞激素分泌主要是通过调控DHCR24表达从而调节类固醇合成通路影响激素分泌。
上述M为mol/L，即mM为mmol/L，μM为μmol/L，nM为nmol/L。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (1)

1.miR-26a在制备猪卵巢颗粒细胞凋亡过程中抑制猪卵巢颗粒细胞雌二醇和孕酮分泌的药物中的应用；DHCR24是miR-26a的靶基因，miR-26a通过靶向调控DHCR24表达促进猪卵巢颗粒细胞凋亡；miR-26a通过调控DHCR24表达从而调节类固醇合成通路抑制猪卵巢颗粒细胞雌二醇和孕酮分泌；
其中猪miR-26a的核酸序列为UUCAAGUAAUCCAGGAUAGGCU；
DHCR24基因3’UTR区中与miR-26a结合位点的核酸序列如下：CTGAGCTGAATCCAGAGGACCTGGGCTCATGCTTGGCTCTCCACTCTCCATGCCTCTTGTCC。
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