CN114292850B - 一种与山羊成肌细胞增殖和分化相关的circRNA及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种与山羊成肌细胞增殖和分化相关的circRNA及其应用，该circRNA具如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列；本发明进行circRNA测序筛选出circUBE3A并对其进行一系列鉴定试验，设计siRNA转染至山羊成肌细胞干扰circUBE3A的表达，探究si‑circUBE3A对山羊成肌细胞增殖和分化的影响，发现circUBE3A在分化和增殖方面对山羊成肌细胞均起到促进作用。这不仅对于深入研究山羊肌肉形成与发育的分子调控机制具有重要的意义，而且为肉羊育种和生长调控等提供强有力的理论支持。
Description
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种与山羊成肌细胞增殖和分化相关的circRNA及其应用。
背景技术
我国山羊种质资源丰富，存栏量约1.45亿只，是世界第一山羊养殖大国和羊肉的重要来源之一。然而，我国山羊均为地方品种，普遍存在着生长速度慢、出栏体重轻、屠宰率低等产肉性能不高的问题，是规模化舍饲养羊提质增效面临的重要瓶颈。因此，提高产肉性能是当前山羊生产中要解决的重大课题之一。
肌肉组织是动物机体的重要组成部分，骨骼肌则是三大肌肉组织中最主要的一种，不仅在动物运动、器官的形态、产热、保护等方面起着重要作用，而且与肉畜的肉产量与品质紧密相关。骨骼肌的生长发育是成肌细胞增殖、融合并分化成肌纤维的过程，这些过程除了受基因、信号通路、转录因子及miRNA等调控，还受到circRNA的复杂调控。circRNA功能的发挥依赖于其细胞定位，位于细胞液中的circRNA主要发挥竞争性内源RNA的作用，通过竞争性抑制miRNA与靶基因mRNA 3’UTR的结合，发挥其对miRNA和靶基因的调控作用。有研究发现circRBFOX2.2-3或circRBFOX2.2-4可结合miR206抑制成肌细胞增殖和分化；circLM07的过表达会抑制原代牛成肌细胞的分化，circLM07能吸附miR378a-3p而解除其对靶基因的抑制作用，进而调控成肌细胞的增殖与分化并能使其免于细胞凋亡。提示circRNA作为竞争性内源RNA在调控肌肉发育过程中发挥了重要的作用，但是目前在畜禽肌肉生长发育方面的相关研究还处于起步阶段，仍有待进一步研究。
为此，本研究以海门山羊背最长肌为对象，首先，利用RNA-seq技术，研究胎龄75d和初生羔羊背最长肌circRNA表达特征，并筛选出差异表达的候选基因circUBE3A；然后经过Sanger测序、RNase R消化试验和Fish等鉴定circUBE3A及其在成肌细胞中定位；最后构建circRNA的抑制表达si-circUBE3A转染山羊成肌细胞，通过CCK-8、免疫荧光染色、Western blot和qRT-PCR等方法检测circUBE3A对山羊成肌细胞增殖和分化的作用，这不仅对于深入研究山羊肌肉形成与发育的分子调控机制具有重要的意义，而且为肉羊育种和生长调控等提供强有力的理论支持。
发明内容
本发明的目的在于提供一种与山羊成肌细胞增殖和分化相关的circRNA及其应用。
本发明的目的可以通过以下技术方案实现：
一种与山羊成肌细胞增殖和分化相关的circRNA，该circRNA具有如(1)～(3)中任一所示的核苷酸序列：
(1)如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列；
(2)如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个核苷酸且具有相同功能的核苷酸序列；
(3)与(1)或(2)的核苷酸序列具有90％以上同源性且具有相同功能的核苷酸序列。
上述circRNA编码的蛋白质。
一种生物材料，该生物材料为包含上述circRNA的生物材料或用于干扰、抑制、沉默或敲除权利要求1所述circRNA的生物材料，所述生物材料为重组DNA、siRNA、表达盒、转座子、质粒载体、噬菌体载体、病毒载体、工程菌或转基因细胞系。
上述的circRNA或生物材料在调控肉羊成肌细胞增殖或/和分化中的应用。所述的circRNA正调控肉羊成肌细胞增殖或/和分化。所述的正调控为促进肉羊成肌细胞增殖或/和分化。
上述的circRNA或上述的生物材料在肉羊育种和生长调控中的应用。
作为一种优选技术方案：所述肉羊为山羊。
一种促进山羊成肌细胞分化的方法：提高上述的circRNA的表达水平能够促进山羊成肌细胞分化或/和增殖。
本发明通过分析75d胎羊和初生海门山羊背最长肌circRNA测序结果，筛选出差异表达的候选基因circUBE3A，序列为：
GTTAAAAATCTGTAAGAGCCTGATTTTAGAATTCACCAGCTCCTCAGAAGTTTGGCGAAATATGAGTTATTAAACCTACGCTCAGATCAAGTTAGCAGCTAGACTGGTGTGACAACCTGTTTTTAATCAGTGACTCAAAGCTGTGATCACCCTGATGTCACCGAATGGCCACAGCTTGTAAAAGATCATCAGGAGAACCTCAATCTGACGACATTGAAGCTAGCCGAAT(SEQ ID No.1)。
鉴于此，以海门山羊成肌细胞为对象，首先通过Sanger测序、RNase R消化试验和Fish等鉴定circUBE3A及其在成肌细胞中定位。其次，将si-circUBE3A转染至山羊成肌细胞中，通过CCK-8、免疫荧光染色、Western blot和RT-PCR等方法检测circUBE3A对山羊成肌细胞增殖和分化的作用。结果发现，circUBE3A由UBE3A的外显子环化而成，可抵抗核酸外切酶的消化，具有一定的稳定性，且在细胞质和细胞核皆有表达；干扰circUBE3A抑制山羊成肌细胞分化和增殖，说明circUBE3A在增殖和分化方面对山羊成肌细胞有促进作用。本试验在山羊肌肉形成的分子调控层面做出讨论，为研究山羊肌肉发育的相关工作提供参考。
本发明的有益效果：
本发明进行circRNA测序筛选出circUBE3A并对其进行一系列鉴定试验，设计siRNA转染至山羊成肌细胞干扰circUBE3A的表达，探究si-circUBE3A对山羊成肌细胞增殖和分化的影响，发现circUBE3A在增殖和分化方面对山羊成肌细胞有促进作用。这不仅对于深入研究山羊肌肉形成与发育的分子调控机制具有重要的意义，而且为肉羊育种和生长调控等提供强有力的理论支持。
附图说明
图1为胎羊和羔羊肌肉组织前100个差异表达circ RNA的聚类热图。
图2为山羊两个关键肌肉发育阶段候选circ RNA的表达分析及验证；
其中，A.RNA-seq结果中10个差异表达circRNAs的表达水平。B.qRT-PCR检测这10个circ RNAs的相对表达水平。
图3为circUBE3A的鉴定结果；
其中，A.环状RNAcircUBE3A结构；B.Sanger测序结果，红色箭头表示“头对尾”circUBE3A剪接位点；C.RNase R酶处理及对照组中circUBE3A和ACTB的表达变化；D.荧光原位杂交(FISH)结果，荧光显示circUBE3A在细胞核质中均有表达。
图4为circUBE3A的表达特征；
其中，A.circUBE3A在山羊不同组织中的表达；B.circUBE3A在山羊成肌细胞分化不同时期的表达。
图5为干扰circUBE3A对细胞增殖的影响；
其中，A.干扰circUBE3A后，circUBE3A和亲本基因UBE3A表达水平变化；B.CCK-8检测细胞活力；C.EdU检测细胞增殖情况，标尺＝50μm；D.EdU阳性细胞统计；E.Western blot检测细胞增殖相关蛋白PCNA表达；F.Western blot条带灰度分析。
图6为干扰circUBE3A对细胞分化的影响；
其中，A.qRT-PCR检测干扰circUBE3A对成肌细胞分化标志基因MyoD、MyoG和MyHC的影响；B.免疫荧光染色检测干扰circUBE3A对成肌细胞肌管形成的影响。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明，凡在本发明的精神和原则之内所做的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
实施例1 circUBE3A的筛选与验证
1材料与方法
1.1试验材料
本试验项目所用细胞为实验室分离、鉴定的山羊成肌细胞。
1.2主要试验仪器及试剂
1.2.1仪器设备
高通量测序仪(Illumina,NovaseqTM 6000)、微量移液枪(德国Eppendorf)、琼脂糖凝胶电泳仪和电泳槽(北京六一，DYY-6C和DYCP-32A)、数码凝胶成像系统(Tanon，Tanon-4100)、紫外分光光度计(Thermo,NanoDrop1000)、荧光酶标仪(FLx800TM)、PCR仪(AppliedBiosystems)，QuantStudio 5实时荧光定量PCR仪(Applied Biosystems)、离心机(Centrifuge5417R)、BIO-RAD电泳仪、Mini Gel Tank小型胶电泳槽(ThermoFisherScientific，A25977)、BIO-RAD全能型蛋白快速转膜仪(BIO-RAD,170-4155)。
1.2.2主要试剂
Trizol试剂(Invitrogen，15596026)、反转录试剂盒(TaKaRa，RR047A)、荧光定量试剂(挪唯赞，Q711-02)、RIPA裂解液(Thermo Fisher Scientific，78501)、蛋白酶抑制剂(碧云天，P1005-1)、增强型BCA蛋白浓度测定试剂盒(碧云天，P0009)、ECL化学发光底物试剂(迈博，BL520B)、LDS Sample Buffer(4x)(Invitrogen，2201446)、Sample ReducingAgent(10x)(Invitrogen，2190252)、胎牛血清(Gibco，10099141)、马血清(Gibco，26050088)、DMEM/F12(Gibco，10565-018)、双抗(Gibco，15140-122)、I型胶原酶(Sigma，V900891)、0.25％Trypsin(Gibco，15050-057)、DPBS(Gibco，C14190500BT)、DAPI(碧云天，P1005)、细胞凋亡检测试剂盒(碧云天，C1048)。
1.3试验方法及步骤
1.3.1 RNA-Seq文库构建与测序
使用Trizol试剂按照说明书从山羊背最长肌样品中分离总RNA。采用NanoDropND-1000和Agilent 2100对RNA浓度和质量进行测定，保证RNA质量合格，随后构建去除核糖体RNA的链特异性文库，具体步骤为：使用Ribo-ZeroTM试剂盒去除总RNA(约5μg)中的核糖体RNA；然后用RNase R去除线性RNA富集circRNA；随后，在高温下用二价阳离子将富集的circRNA进行片段化处理；用反转录试剂盒对剪切后的RNA进行反转录合成第一链cDNA，接着加入大肠杆菌DNA聚合酶I、RNase H和dUTP合成U标记的cDNA的第二链；为连接到适配器做准备，在每条链的钝端加入一个A碱基；然后将含T碱基的适配器连接到DNA片段上；使用AMPure XP beads对合成的双链cDNA进行纯化后，用尿嘧啶DNA糖化酶处理，去除含有U的第二链cDNA，使得最终的测序信息都来自于第一链cDNA，从而保留了RNA的链方向性；通过PCR扩增富集文库中第一链cDNA，条件为：95℃变性3min；98℃变性15s，60℃退火15s，72℃拉伸30s共8个循环。
6个测序文库构建完成后，先使用Qubit进行初步定量，稀释文库至1ng/μL，随后使用Agilent 2100Bioanalyzer对测序文库的插入片段进行检测，使用qPCR方法对文库的有效浓度进行准确定量(有效浓度>2nM)，以保证文库质量。测序文库质检合格后，采用Illumina NovaseqTM 6000进行双末端高通量测序(2×150bp)。
1.3.2 circRNA的鉴定
利用Primer-NCBI设计跨环化位点的circUBE3A引物，以山羊背最长肌cDNA为模板进行PCR扩增，并对其产物进行电泳检测，然后Sanger测序以确定是否扩增出circUBE3A的环化位点。RT-PCR的反应体系为：2×High-Fidelity Master Mix酶10μL，cDNA模板1μL，上下游引物各0.6μL，加灭菌ddH2O至20μL。反应条件为98℃，2min；98℃，10s；60℃，30s；72℃，60s，循环数35cycles；72℃，7min；4℃保存。
由于circRNA对核酸酶不敏感，所以比线性RNA更稳定。因此，利用RNase R处理山羊背最长肌总RNA，验证circUBE3A的分子稳定性。具体步骤如下：37℃孵育3h，反应体系如表1，处理后的RNA反转录成cDNA并通过qRT-PCR检测丰度变化。
表1 RNase R处理体系
Table 1 RNase R digestion Reaction
1.3.3山羊成肌细胞培养
(1)成肌细胞的分离。采用组织消化法分离成肌细胞，方法如下：在无菌的条件下，迅速剪取山羊胎儿后肢大腿部的肌肉组织，放入含5％(g/mL)双抗(青霉素-链霉素溶液(100x))的PBS中，再用75％酒精浸泡组织10s，用含有1％(g/mL)双抗的PBS冲洗3次；将肌组织置于无菌平皿中反复剪碎，剔除其中筋膜；然后将剪碎的组织样置于15mL离心管中，加入一定量PBS，吹匀后静静放置3min，弃去上层清液；加入适量的0.1％(mg/L)胶原酶Ⅰ，37℃水浴锅中消化1h，每隔5min振荡一次；1200rpm/min，离心5min，弃去上清，加入适量0.25％(g/mL)的胰蛋白酶，37℃，继续消化10-15min；加入等体积细胞完全培养液终止消化，过200目的细胞筛，滤液12000rpm/min，离心5min，弃去上层清液；加入20％(v/v)胎牛血清和10％(v/v)马血清的DMEM培养液重悬，然后根据细胞生长情况转移进培养皿内，37℃、5％CO2培养箱中培养1-2h。
(2)成肌细胞的纯化。采用差速贴壁法对成肌细胞进行纯化，方法如下：原代分离出的细胞在5％CO2培养箱中培养2h后，将培养液中处于游离状态的细胞转移至新的培养板记作P01。原培养板中已贴壁的细胞记作P0，更换新培养液进行培养，12h后收集培养液，12000rpm/min，离心5min，弃去上层清液，用新鲜培养液重悬细胞，转移至明胶包被的培养板，记作P02，即为分离纯化的肌卫星细胞，每隔一天更换一次培养液。
(3)成肌细胞的传代。当6孔板中细胞密度为80-90％时，弃去旧培养液，每孔加入500μL胰酶，在细胞培养箱中消化1min后进行显微观察，当细胞从梭形变成圆形、细胞间隙变大、细胞胞质紧缩时，去除胰酶，用手用力拍打6孔板底部。每孔加入2mL培养液吹打混匀细胞，按照密度传至新6孔板的3-4个孔中，放进细胞培养箱中继续培养，隔天换液。
(4)成肌细胞的分化培养。由于原代肌卫星细胞贴壁较为缓慢，可以事先将细胞培养板用0.1％明胶包裹，以促进细胞贴壁生长。向细胞培养板中加入适量的0.1％(g/mL)的明胶溶液，转移到细胞培养箱中放置2h；移除明胶溶液用DPBS清洗2遍，彻底除去残留的明胶，培养板即被明胶包裹好。用生长培养液将肌卫星细胞转移到明胶包裹的培养板，放到培养箱中培养。待细胞生长融合程度达到80％左右时，改用分化培养液(含2％(v/v)马血清的DMEM)培养，每两天换一次新鲜培养液观察肌卫星细胞诱导分化形成肌管。
1.3.4荧光原位杂交实验(FISH)
(1)试剂准备。根据说明书将试剂Buffer A、Buffer C、Buffer F和DAPI用PBS稀释，新鲜配制备用，其中DAPI避光保存；
(2)当细胞生长至50％-60％的密度时将贴壁细胞接种于48孔板中，在培养箱中培养过夜；
(3)弃去培养基后用PBS清洗两次，每次5min；
(4)弃去PBS，每孔加入100μL 4％多聚甲醛，室温固定15min；
(5)弃去4％多聚甲醛，每孔加入100μL 0.1％Buffer A室温处理细胞15min；
(6)弃去0.1％Buffer A，用PBS洗两次，每次5min；
(7)弃去PBS，每孔加入100μL 2×Buffer C，37℃培养箱放置30min；
(8)Buffer E提前在73℃水浴锅孵育30min，至澄清透亮；
(9)在避光条件下，将探针干粉剂中加入灭菌DEPC水摇晃均匀，得到探针浓度近100μM的溶液，避光储存在-20℃；
(10)移液器吸去每孔中的预杂交液，加入Buffer E，总体系100μL，73℃变性5min；
(11)吸去2×Buffer C，每孔加入100μL变性后的探针混合液，采取避光措施后置于37℃烘箱中杂交过夜；
(12)过夜后的第二天，将试剂从37℃培养箱中拿出，丢弃探针混合液，每孔加入100μL温度为42℃的0.1％Buffer F清洗5min；
(13)弃去0.1％Buffer F，每孔加入100μL 42℃预热的2×Buffer C洗涤5min；
(14)弃去2×Buffer C，每孔加入100μL 42℃预热的1×Buffer C洗涤5min，弃去洗涤液；
(15)每孔加100μL稀释后的DAPI工作液，黑暗环境下着色处理20min；
(16)弃去DAPI工作液，PBS洗两次，每次5min；
(17)在洁净的载玻片一滴滴加上甘油或抗淬灭剂，将细胞爬片的细胞面朝下盖在载玻片上，荧光显微观察，1周内完成拍摄。
1.3.5 circUBE3A的siRNA合成
circUBE3A的干扰序列(si-circUBE3A)：使用BLOCK-iTTM RNAi Designer tool在线设计二个siRNA，由中国上海吉玛制药技术有限公司合成，具体序列信息见表2。
表2 siRNA序列信息
Table 2 Detail for siRNA sequence
CircUBE3A的全长序列GTTAAAAATCTGTAAGAGCCTGATTTTAGAATTCACCAGCTCCTCAGAAGTTTGGCGAAATATGAGTTATTAAACCTACGCTCAGATCAAGTTAGCAGCTAGACTGGTGTGACAACCTGTTTTTAATCAGTGACTCAAAGCTGTGATCACCCTGATGTCACCGAATGGCCACAGCTTGTAAAAGATCATCAGGAGAACCTCAATCTGACGACATTGAAGCTAGCCGAAT
1.3.6细胞转染
将山羊成肌细胞接种至6孔板，使用生长培养液培养12h-18h后，待细胞生长汇合度约70％时，进行转染。质粒转染使用LIPOFECTAMINE LTX转染试剂，siRNA转染使用Lipofectamine TM 3000转染试剂。具体转染步骤参照LIPOFECTAMINE LTX和Lipofectamine TM 3000的说明书。转染6h后更换生长培养液。
1.3.7总RNA的提取，cDNA合成及qRT-PCR实验
总RNA的提取：
(1)利用Trizol法提取肌肉组织/细胞样品中的总RNA，实验步骤如下：取适量的肌肉组织，加入研磨珠和1mL Trizol在匀浆机上60s/次，匀浆两次；细胞样品直接加入1mLTrizol充分裂解；
(2)加入1/5体积的氯仿(约200μL)，剧烈摇晃15s，冰上静置5min，4℃，12 000rpm/min，离心15min；
(3)吸出离心完毕后的上层清液(约400μL)沿新的EP管的侧边转移，加入相同体积的异丙醇(约400μL)，翻转摇匀7、8次，在室温中静静放置10min，4℃，12 000rpm/min，离心10min；
(4)丢弃上清，加入1mL冷藏保存的75％酒精，在振荡器上混合均匀，至看不见沉淀为止，4℃，12 000rpm/min，离心5min；
(5)重复上一步，再次洗涤沉淀；
(6)去除多余水分，室温晾干，滤纸上静置10min，加入20μL RNAase-free ddH2O溶解，-80℃保存备用。
反转录及qPCR：
利用TaKaRa反转录试剂盒，依照说明书将总RNA反转录为cDNA。使用诺唯赞定量酶在实时荧光定量PCR仪上进行定量PCR分析。采用20μL体系：SYBR Green Master Mix10μL；上下游引物(10μM)各0.6μL；cDNA 1μL；Nuclease-free H20 7.8μL。qRT-PCR条件为：95℃30s；95℃10s；60℃30s，40个循环；95℃15s；60℃30s；95℃1s.以18S rRNA为内参，用2-ΔΔCt法进行计算，所用引物的序列信息见表3。
表3 qRT-PCR的引物信息表
Table 3 The primer information of mRNA used for qRT-PCR
1.3.8蛋白的提取与Western Blot分析
(1)丢弃细胞旧培养液，用DPBS缓冲液清洗细胞；
(2)吸去DPBS缓冲液，每孔加入1000μL胰酶，在细胞培养箱中消化1min；
(3)显微观察，当细胞从梭形变成圆形、细胞间隙变大、胞质变得紧缩时，去除胰酶；
(4)每孔加入1mL细胞培养液，吹打混匀后将细胞悬浮液转移进新的EP管中，3000rpm/min，离心5min；
(5)吸取细胞培养液，加入1％蛋白酶抑制剂的RIPA缓冲液，吹散细胞呈黏稠状，在匀浆机中连续匀浆5次；
(6)取匀浆过后的EP管，3000rpm/min，离心10min后转移上层清液进新的EP管，得到蛋白原液；
(7)电泳。将变形好的蛋白样品加入到8％-12％SDS-PAGE泳道中，每孔约20μg，在样品左右两边泳道中加入蛋白Marker。在电泳槽中灌满1×电泳液，在200V电压下进行电泳，35min后停止；
(8)转膜。试验采用半干转膜法进行蛋白转膜，将目的蛋白的凝胶区域用钢尺小心裁断。剪取同样大小0.22孔径的NC膜在甲醇中激活后浸入去离子水待用，剪两块同样大小的厚滤纸浸入转膜液冷藏备用。在转膜仪上从下往上依次放置厚滤纸、NC膜、PAGE胶、厚滤纸，滴加适当转膜液防止气泡的产生，缓慢赶压气泡，0.2V转膜15min；
(9)封闭。转膜后用TBST简单润洗NC膜，将NC膜放置5％脱脂奶粉中，室温封闭2h；
(10)孵育抗体。将经奶粉封闭后的NC膜放入塑封袋，加入按照一定比例稀释的一抗,排出气泡后用塑封机封口。4℃过夜后，TBST洗涤后，与相应二抗室温孵育1h；
(11)显影曝光。用TBST洗涤膜上残余的二抗，利用ECL化学发光底物试剂在ImageQuant LAS4000上进行显影拍照，利用Image J软件完成对各泳道灰度值的量化统计。
试验所用基因抗体信息如下：
表4 Western Blot的抗体信息表
Table 4 Details of antibodies of proteins used for Western Blot
1.3.9 CCK-8检测细胞增殖试验
(1)按照1×103/孔的密度转移细胞进96孔板中，每孔中加入100μL细胞悬浮液，每板接种36(6×6)孔，并在周围的空白孔中加入100μL生长培养液，放入细胞培养箱培养；
(2)接种2h后取出，将此板作为增殖0h的细胞，弃去原培养液，在细胞孔及空白孔中加入含有10％CCK-8(v/v)试剂的生长培养液，加入培养液时小心不要带入气泡，以免影响吸光度的准确性；
(3)继续放入培养箱中培养2h后，取出培养板，用酶标仪测定450nm波长处细胞的吸光值即为增殖0h的细胞增殖活力；
(4)在0h、12h、24h和48h收集细胞，重复步骤(2)和(3)即可测得不同增殖阶段细胞的吸光度值；
(5)以培养时长为自变量，以校准后的OD值为应变量制作生长曲线。
1.3.10细胞免疫荧光
(1)取诱导分化后的山羊成肌细胞，使用4％多聚甲醛室温固定30min；
(2)置于0.25％TritonX-100室温通透15min后3％BSA室温封闭1h；
(3)分别用PAX7、Desmin、Myf5和MyHC等一抗4℃孵育过夜；
(4)DPBS漂洗后，用相应的荧光二抗进行室温避光孵育1h；
(5)用DAPI染核后，逐滴加入抗荧光猝灭剂并进行荧光显微观察、记录影像。
1.3.11数据分析
全部的试验结果用平均值±标准误差(SEM)展示。mRNA表达的统计学意义通过单因素方差分析进行分析，然后使用SPSS 23.0进行分析。P<0.05被认为具有统计学上的意义，用一个星号表示，P<0.01用两个星号表示。
2结果与分析
2.1胎羊和羔羊肌肉差异circRNA的筛选与验证
为了探索参与山羊肌肉发育的关键circRNA，我们筛选了前100个变化较大的circRNA(图1)，从中随机挑选了10个差异表达的circRNA进行qRT-PCR分析。结果显示它们的表达趋势与RNA-Seq结果一致(图2)，并筛选circ2233(命名为circUBE3A)作为后续靶基因。这些结果为测序数据提供了可靠的验证。
2.2 circUBE3A的鉴定
circUBE3A由UBE3A基因的2-4号外显子环化生成，全长229bp。根据RNA测序得到的序列信息，设计跨环化位点RT-PCR引物对circUBE3A进行扩增(图3A)，产物经Sanger测序发现circUBE3A是首尾相连的circRNA，红色箭头表示剪切位点(图3B)。circRNA对核酸外切酶耐受性很强。RNase R消化试验和RT-qPCR结果显示RNase R+组线性RNA ACTB的丰度明显降低，几乎无法检测其表达量，而circUBE3A丰度基本不变，表明RNase R可消化线性RNA，而环形RNA耐受RNase R的消化，几乎不受核酸酶消化的影响(图3C)。同时，细胞的荧光杂交(FISH)显示circUBE3A在细胞核和细胞质中均有表达(图3D)。
从circRNA测序结果中筛选到差异表达circ2233(命名为circUBE3A)，序列为：
GTTAAAAATCTGTAAGAGCCTGATTTTAGAATTCACCAGCTCCTCAGAAGTTTGGCGAAATATGAGTTATTAAACCTACGCTCAGATCAAGTTAGCAGCTAGACTGGTGTGACAACCTGTTTTTAATCAGTGACTCAAAGCTGTGATCACCCTGATGTCACCGAATGGCCACAGCTTGTAAAAGATCATCAGGAGAACCTCAATCTGACGACATTGAAGCTAGCCGAAT
2.3 circUBE3A的表达特征
为探究circUBE3A在山羊各组织内的表达模式，选取初生1d胎羊的背最长肌、心脏、肝脏、脾脏、肺脏和肾脏部分组织进行qRT-PCR检测，结果如图4A所示circUBE3A在肺脏和背最长肌中表达远高于其他组织；在脾脏和肾脏的表达相比于肺脏和背最长肌较低，但依然高于心脏和肝脏。此外，circUBE3A在山羊成肌细胞分化不同时期表达上调(图4B)。
2.4 circUBE3A对山羊成肌细胞增殖的影响
以跨circUBE3A back-splicing区域为靶向位点设计circUBE3A siRNA，并转染至山羊成肌细胞，qRT-PCR结果表明circUBE3A siRNA可以显著抑制circUBE3A表达而不影响UBE3A mRNA水平(图5A)，说明，circUBE3A siRNA的特异性很强。
为了探究circUBE3A对山羊成肌细胞增殖的影响，通过CCK-8和EdU法检测细胞增殖情况，结果显示，干扰circUBE3A显著抑制OD值(图5B；P<0.05)，以及EdU阳性细胞的数量(图5C-D)。进一步通过Western Blot对山羊成肌细胞中增殖标记基因PCNA的蛋白表达进行检测，表明干扰circUBE3A显著抑制PCNA蛋白表达(图5E-F；P<0.05)。上述结果表明，circUBE3A促进山羊成肌细胞增殖。
2.5 circUBE3A对山羊成肌细胞分化的影响
为了研究circUBE3A在山羊成肌细胞分化过程中发挥的作用，同样，将siNC和si-circUBE3A转染至进山羊成肌细胞后，检测对照组和处理组中分化相关基因MyoD、MyoG和MyHC的表达变化情况，并用MyHC抗体进行免疫染色观察成肌细胞内肌管的发育情况。
与对照组相比，干扰circUBE3A成肌细胞分化标志基因MyoD、MyoG和MyHC相对表达水平显著降低(P<0.05)(图5A)。细胞免疫荧光结果表明，与对照组相比，抑制circUBE3A表达后，肌管发育数量明显下降，肌管发育明显减弱(图5B)。上述结果表明，circUBE3A促进山羊成肌细胞分化。
3讨论
在本试验中，经过前期对背最长肌circRNA测序和筛选后，首先进行circRNA的鉴定工作，证实了circUBE3A为环状结构且在细胞核质中均存在，之后通过CCK-8和EdU分析细胞增殖生长情况，以及通过Western blot检测增殖相关蛋白PCNA的表达量，表明circUBE3A促进山羊成肌细胞增殖。通过qRT-PCR方法检测成肌细胞分化相关基因MyoD、MyoG和MyHC的表达，通过免疫荧光染色检测细胞肌管发育情况，发现circUBE3A促进山羊成肌细胞分化。结合前人的研究结论，circRNA发挥功能多作为miRNA的分子海绵，通过吸附miRNA对基因进行调控，推测circUBE3A促进成肌细胞增殖和分化的原因可能是其分子内部含有miRNA的吸附位点。miRNA与circRNA结合后缓解其对基因PCNA的抑制作用，使PCNA表达上调或者多次表达，达到促进细胞增殖的效果。circUBE3A促进分化则是与miRNA竞争性结合后降低了miRNA与MyoD、MyoG和MyHC等基因的结合程度，使得促分化基因表达升高，达到促进细胞分化的效果。
4结论
在调控骨骼肌生长发育方面，长链非编码RNA、miRNA和circRNA均发挥了调控作用。相比于长链非编码RNA和miRNA，circRNA数目更为庞大，在调控成肌细胞增殖分化中起到重要作用。
本研究在前期实验室进行circRNA测序筛选出circUBE3A的基础上，对其进行一系列鉴定试验，设计siRNA转染至山羊成肌细胞干扰circUBE3A的表达，探究si-circUBE3A对山羊成肌细胞增殖和分化的影响，主要结论为：circUBE3A在增殖和分化方面对山羊成肌细胞有促进作用。
序列表
<110> 南京农业大学
<120> 一种与山羊成肌细胞增殖和分化相关的circRNA及其应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 229
<212> DNA
<213> 海门山羊(Capra aegagrus hircus)
<400> 1
gttaaaaatc tgtaagagcc tgattttaga attcaccagc tcctcagaag tttggcgaaa 60
tatgagttat taaacctacg ctcagatcaa gttagcagct agactggtgt gacaacctgt 120
ttttaatcag tgactcaaag ctgtgatcac cctgatgtca ccgaatggcc acagcttgta 180
aaagatcatc aggagaacct caatctgacg acattgaagc tagccgaat 229
Claims (4)
1.circRNA或生物材料在促进山羊成肌细胞增殖或/和分化中的应用，其特征在于，
所述circRNA的核苷酸序列如SEQ ID No. 1所示；
所述的生物材料为包含所述circRNA的生物材料，所述生物材料为重组DNA、表达盒、转座子、质粒载体、噬菌体载体、病毒载体、工程菌或转基因细胞系。
2.用于抑制circRNA表达的生物材料在抑制山羊成肌细胞增殖或/和分化中的应用，其特征在于，
所述circRNA的核苷酸序列如SEQ ID No. 1所示；
所述的用于抑制所述circRNA表达的生物材料为siRNA。
3.circRNA或生物材料在山羊育种中的应用，其特征在于，
所述circRNA的核苷酸序列如SEQ ID No. 1所示；
所述的生物材料为包含所述circRNA的生物材料或用于抑制所述circRNA表达的生物材料；所述的包含所述circRNA的生物材料为重组DNA、表达盒、转座子、质粒载体、噬菌体载体、病毒载体、工程菌或转基因细胞系；所述的用于抑制所述circRNA表达的生物材料为siRNA。
4. 一种促进山羊成肌细胞分化的方法，其特征在于：提高核苷酸序列如SEQ ID No. 1所示circRNA的表达水平能够促进山羊成肌细胞增殖或/和分化。
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