JP5804459B2

JP5804459B2 - 癌疾患用細胞老化促進剤

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Description

本発明は、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２の発現量を指標とした老化マーカーおよび老化抑制物質の評価方法、さらにはｈｓａ−ｍｉＲ−２２の細胞老化作用を利用した癌抑制剤に関する。

マイクロＲＮＡ（以下、ｍｉＲＮＡ）は、広範囲にわたる種のゲノムにおいて同定されている短い非コードＲＮＡである。ｍｉＲＮＡは、最初、１９９３年にシノラディス・エレガンスにおいて発見され、その後多くの多細胞生物で発見された。ｍｉＲＮＡは、遺伝子発現の負の調節因子であり、タンパク質コードｍＲＮＡの３’非翻訳領域内の配列との塩基対の不完全な相互作用によって主に機能すると考えられている。現在までに公知となっている種々のｍｉＲＮＡは、ヒトのｍｉＲＮＡも含め、ｍｉＲＢａｓｅ（http://www.mirbase.org/参照）に登録されている。これらのｍｉＲＮＡの役割は、知られていないものもある。しかし、特定のｍｉＲＮＡは、脂肪細胞の分化、卵母細胞の成熟、多能性細胞状態の維持またはインスリン分泌の調節等の、多様な細胞過程の調節に関わっていることが解明されている。

例えば、特許文献１には、標的遺伝子から転写されたｍＲＮＡと二本鎖を形成するポリヌクレオチドを細胞に導入する段階を含む、細胞における標的遺伝子の発現を調節する方法が記載されている。当該方法では、二本鎖を形成する領域は、哺乳動物のｍｉＲＮＡ標的領域を含む。この方法に用いられるポリヌクレオチドとしては種々のｍｉＲＮＡもしくはその前駆体（Ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ）を挙げることができると記載されている。

また、特許文献２には、ｍｉＲＮＡが関与する種々の方法および組成物について記載されている。具体的には、例えば、ｍｉＲＮＡの発現分析等を行うことによってｍｉＲＮＡプロファイルを生成し、生成したｍｉＲＮＡプロファイルを利用する方法が記載されている。当該方法には、プロファイルを生成および利用し得る多くのｍｉＲＮＡが挙げられている。その多くのｍｉＲＮＡの中には、例えば、（ｈｓａ−）ｍｉＲ−２２が挙げられている。（ｈｓａ−）ｍｉＲ−２２は、前述したｍｉＲＢａｓｅにも登録された公知のｍｉＲＮＡである。特許文献２には、これらの多くのｍｉＲＮＡプロファイルが、特定の疾患、病態または障害の診断に利用され得るということも記載されている。特定の疾患には、例えば、癌等が挙げられている。

さらに、特許文献３は、より詳細なメカニズムを以て、ｍｉＲＮＡおよびｍｉＲＮＡ阻害分子に関する方法および組成物について記載している。具体的には、特定の合成ｍｉＲＮＡ分子の有効量を細胞に導入する段階を含む、細胞増殖を低下させるまたは阻害するための方法、細胞増殖を誘導するまたは増加させるための方法、細胞生存率を低下させるための方法、細胞生存率を増加させるための方法、細胞におけるアポトーシスを増加させるための方法および細胞におけるアポトーシスを阻害するための方法について記載されている。

特許文献３には、このようなｍｉＲＮＡのうち、前述した（ｈｓａ−）ｍｉＲ−２２の機能についても一部記載されている。具体的には、（ｈｓａ−）ｍｉＲ−２２は、Ａ５４９細胞（ヒト肺癌細胞）の生存細胞数を有意に低下させ、アポトーシス細胞のパーセンテージを有意に増加させるｍｉＲＮＡであることが記載されている。また、このような機能を利用することによる、（ｈｓａ−）ｍｉＲ−２２に対応する合成ｍｉＲＮＡ分子の有効量を被験体に投与する段階を含む、被験体における癌を処置するための方法についても記載されている。

一方、多くの動物細胞の前駆細胞は、決まった回数だけ分裂すると増殖を停止し、最終分化状態にとどまり続ける。停止機構の詳細については、完全には解明していない部分が多い。しかし、このような細胞内の細胞増殖抑制機構は、ヒト線維芽細胞において解明されている部分もある。具体的には、分裂期の終わりごろになると増殖速度が落ち、やがて停止し再び増殖することのない非分裂状態に入ることがわかっている。この現象は、複製に伴う細胞老化とよばれている（非特許文献１参照）。

特表２００６−５１９００８号公報特表２００８−５００８３７号公報特表２００８−５１９６０６号公報

Bruce Alberts, Alexander Johoson, Julian Lewis, Martin Raff, Keith Roberts, and Peter Walter.（著）中村桂子・松原謙一（監訳）MOLECULAR BIOLOGY OF THE CELL FORTH EDITION 細胞の分子生物学第４版、株式会社ニュートンプレス、２００４年１２月２０日、１０１７−１０１８

前述したような複製に伴う細胞老化の誘導のメカニズムまたはその意味について、個体老化との関連も含め、長らく論争の的になっている。これは、細胞老化がアポトーシスとならび重要な生体防御機構の一つであると考えられており、新しい癌治療への応用が期待されるためである。すなわち、細胞老化もアポトーシスと同様に、細胞増殖および異常な細胞に対する防御機構に関わるためである。そこで、細胞老化に関与している遺伝子の解明が求められている。細胞老化に関与している遺伝子を解明することで、新しい癌治療への応用だけでなく、老化マーカーまたは老化抑制物質の開発にも利用し得ることが期待される。

一方、前述したように、特許文献２には、多くのｍｉＲＮＡのプロファイルの一部として、（ｈｓａ−）ｍｉＲ−２２のプロファイルによる癌等の疾患での利用可能性が示唆されている。しかし、当該（ｈｓａ−）ｍｉＲ−２２が癌等の疾患に利用できるという確証は、実施例およびそのメカニズムを以て詳細には解明されていない。

特許文献３では、（ｈｓａ−）ｍｉＲ−２２を利用する癌を処置するための方法について、具体的なメカニズムを以て記載されている。詳細には、前述したように、当該癌を処置するための方法は、アポトーシス細胞を増加させ、癌細胞（Ａ５４９細胞；ヒト肺癌細胞）の生存細胞数を低下させることによると記載されている。しかし、本発明者が鋭意研究したところ、Ａ５４９細胞以外の癌細胞（ＳｉＨａ細胞およびＭＣＦ−７細胞）にｈｓａ−ｍｉＲ−２２を導入しても、顕著なアポトーシス細胞の増加は観察されなかった。

本発明は上記事情に鑑みてなされたものであり、細胞老化に関与しているｍｉＲＮＡを解明し、その利用方法を提供することを目的とする。詳しくは、検体の老化の程度を判断することができる老化マーカー、老化を抑制することができる物質を容易に評価することができる老化抑制物質の評価方法、ならびに、細胞を老化させ、癌の増殖、浸潤および／または転移を抑制する癌抑制剤を提供することを目的とする。

本発明の第１の態様に係る老化マーカーは、ｍｉＲ−２２の遺伝子転写物を含むことを特徴とする。

好ましくは、前記ｍｉＲ−２２の遺伝子転写物は、配列番号１に記載の塩基配列からなるＲＮＡ、配列番号２に記載の塩基配列からなるＲＮＡ、および／または、配列番号３に記載の塩基配列からなるＲＮＡを含むことを特徴とする。

また、好ましくは、前記ｍｉＲ−２２の遺伝子転写物は、Ｐｒｅ−ｈｓａ−ｍｉＲ−２２、および／または、二本鎖ｈｓａ−ｍｉＲ−２２を含むことを特徴とする。

本発明の第２の態様に係る老化抑制物質の評価方法は、被験化合物存在下および前記被験化合物非存在下での、検体における、ｍｉＲ−２２の遺伝子転写物の発現量を測定する工程と、
前記被験化合物非存在下での前記検体における前記ｍｉＲ−２２の遺伝子転写物の発現量に対する、前記被験化合物存在下での前記検体における前記ｍｉＲ−２２の遺伝子転写物の発現量を比較する工程と、
を含むことを特徴とする。

さらに好ましくは、前記検体は、哺乳動物個体に由来する検体であることを特徴とする。

より好ましくは、前記検体は、ヒト線維芽細胞であることを特徴とする。

本発明の第３の態様に係る癌抑制剤は、ｍｉＲ−２２の遺伝子転写物を有効成分として含有し、細胞老化を促進させ、癌の浸潤および／または転移を抑制することを特徴とする。

さらに好ましくは、前記癌抑制剤は、胃癌抑制剤、子宮癌抑制剤、咽頭癌抑制剤、乳癌抑制剤、子宮頸癌抑制剤および／または結腸癌抑制剤であることを特徴とする。

より好ましくは、前記癌抑制剤は、子宮頸癌抑制剤および／または乳癌抑制剤であることを特徴とする。

本発明の第１の態様に係る老化マーカーによれば、検体の老化の程度を判断することができる。本発明の第２の態様に係る老化抑制物質の評価方法によれば、老化を抑制することができる物質を容易に評価することができる。本発明の第３の態様に係る癌抑制剤によれば、細胞を老化させ、癌の増殖、浸潤および／または転移を抑制することができる。

本発明に係る、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２のStem-loop構造を示す模式図である。二本鎖ｈｓａ−ｍｉＲ−２２の構造を示す模式図である。実施例１に係る、ヒト線維芽細胞におけるｑＲＴ−ＰＣＲでのｈｓａ−ｍｉＲ−２２^＊の発現量のデータを示す図である。実施例２に係る、二本鎖ｈｓａ−ｍｉＲ−２２を導入したヒト線維芽細胞を蛍光顕微鏡および微分干渉顕微鏡によって観察した様子を示す図である。実施例２に係る、二本鎖ｈｓａ−ｍｉＲ−２２を導入したヒト線維芽細胞を老化細胞特異的なマーカーであるＳＡ−β−gal染色したものを顕微鏡によって観察した様子を示す図である。実施例２に係る、二本鎖ｈｓａ−ｍｉＲ−２２を導入したヒト線維芽細胞における老化細胞特異的ＳＡ−β−gal活性細胞の割合のデータを示す図である。実施例２に係る、二本鎖ｈｓａ−ｍｉＲ−２２を導入したヒト線維芽細胞における細胞数のデータを示す図である。実施例２に係る、二本鎖ｈｓａ−ｍｉＲ−２２を導入したヒト線維芽細胞におけるウェスタンブロッティングの様子を示す図である。実施例３に係る、Ｐｒｅ−ｈｓａ−ｍｉＲ−２２を導入したヒト線維芽細胞を老化細胞特異的なマーカーであるＳＡ−β−gal染色したものを顕微鏡によって観察した様子を示す図である。実施例３に係る、Ｐｒｅ−ｈｓａ−ｍｉＲ−２２を導入したヒト線維芽細胞における老化細胞特異的ＳＡ−β−gal活性細胞の割合のデータを示す図である。実施例３に係る、Ｐｒｅ−ｈｓａ−ｍｉＲ−２２を導入したヒト線維芽細胞における細胞数のデータを示す図である。実施例４に係る、癌細胞およびヒト正常線維芽細胞におけるｑＲＴ−ＰＣＲでのｈｓａ−ｍｉＲ−２２^＊の発現量のデータを示す図である。実施例５に係る、二本鎖ｈｓａ−ｍｉＲ−２２を導入した癌細胞を微分干渉顕微鏡によって観察した様子を示す図である。実施例５に係る、二本鎖ｈｓａ−ｍｉＲ−２２を導入した癌細胞を老化細胞特異的なマーカーであるＳＡ−β−gal染色したものを顕微鏡によって観察した様子を示す図である。実施例５に係る、二本鎖ｈｓａ−ｍｉＲ−２２を導入したＳｉＨａ細胞における老化細胞特異的ＳＡ−β−gal活性細胞の割合のデータを示す図である。実施例５に係る、二本鎖ｈｓａ−ｍｉＲ−２２を導入したＭＣＦ−７細胞における老化細胞特異的ＳＡ−β−gal活性細胞の割合のデータを示す図である。実施例５に係る、二本鎖ｈｓａ−ｍｉＲ−２２を導入したＳｉＨａ細胞における細胞数のデータを示す図である。実施例５に係る、二本鎖ｈｓａ−ｍｉＲ−２２を導入し、７日間培養したＳｉＨａ細胞を微分干渉顕微鏡によって観察した様子を示す図である。実施例５に係る、二本鎖ｈｓａ−ｍｉＲ−２２を導入したＭＣＦ−７細胞における細胞数のデータを示す図である。実施例５に係る、二本鎖ｈｓａ−ｍｉＲ−２２を導入し、７日間培養したＭＣＦ−７細胞を微分干渉顕微鏡によって観察した様子を示す図である。実施例６に係る、二本鎖ｈｓａ−ｍｉＲ−２２を導入したＳｉＨａ細胞の浸潤細胞数のデータを示す図である。実施例７に係る、二本鎖ｈｓａ−ｍｉＲ−２２を導入したＳｉＨａ細胞の創傷治癒アッセイの創傷閉鎖割合のデータを示す図である。実施例８に係る、二本鎖ｈｓａ−ｍｉＲ−２２を導入したＭＤＡ−ＭＢ−２３１−ｌｕｃ−Ｄ３Ｈ２ＬＮ乳癌細胞を観察した様子を示す図である。実施例９に係る、癌細胞移植後４６日目のマウスのin vivoにおける発光イメージングの様子を示す図である。実施例９に係る、癌細胞移植後４６日目のマウスにおけるフォトン値のデータを示す図である。実施例９に係る、解剖した癌細胞移植後４６日目のマウスの臓器における発光イメージングの様子を示す図である。実施例９に係る、解剖した癌細胞移植後４６日目のマウスの臓器におけるフォトン値のデータを示す図である。実施例１０に係る、腫瘍部位にin vivoにおいてＳＡ−β−gal染色およびＨＥ染色を行った様子を示す図である。実施例１１に係る、MultiTox assayによる二本鎖ｈｓａ−ｍｉＲ−２２を導入したＳｉＨａ細胞の生細胞の結果のデータを示す図である。実施例１１に係る、MultiTox assayによる二本鎖ｈｓａ−ｍｉＲ−２２を導入したＳｉＨａ細胞の死細胞の結果のデータを示す図である。実施例１２に係る、二本鎖ｈｓａ−ｍｉＲ−２２を導入したＳｉＨａ細胞にＴＵＮＥＬ染色法を行った様子を示す図である。

本発明者が鋭意研究した結果、（ｈｓａ−）ｍｉＲ−２２が細胞老化に関与しているｍｉＲＮＡであり、細胞老化を利用して癌細胞の増殖、浸潤および転移の抑制に利用できることを解明した（後述する実施例参照）。（ｈｓａ−）ｍｉＲ−２２は、前述したとおり公知のｍｉＲＮＡであり、詳細についてはｍｉＲＢａｓｅ（http://www.mirbase.org/）を参照されたい。例えば、ヒトのｍｉＲ−２２であるｈｓａ−ｍｉＲ−２２は、ｍｉＲＢａｓｅにおいて、そのStem-loop sequenceについてはAccession番号ＭＩ０００００７８に、そのMature sequenceについてはAccession番号ＭＩＭＡＴ０００００７７に、そのMinor miR^＊sequenceについてはAccession番号ＭＩＭＡＴ０００４４９５に登録されている。なお、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２のStem-loop sequenceについては配列番号１に示し、Mature sequenceについては配列番号２に示し、Minor miR^＊sequenceについては配列番号３に示す。

図１は、本発明に係る、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２のStem-loop構造を示す模式図である。すなわち、図１は、プロセッシングされていないｈｓａ−ｍｉＲ−２２の遺伝子転写物であるｈｓａ−ｍｉＲ−２２前駆体（Ｐｒｅ−ｈｓａ−ｍｉＲ−２２）を示す。本明細書において、「ｈｓａ−ｍｉＲ−２２前駆体」または「Ｐｒｅ−ｈｓａ−ｍｉＲ−２２」といった場合、図１に示すStem-loop構造でのｍｉＲＮＡ、または、配列番号１に示すｍｉＲＮＡを示す。

図２は、二本鎖ｈｓａ−ｍｉＲ−２２の構造を示す模式図である。本明細書において、「二本鎖ｈｓａ−ｍｉＲ−２２」といった場合、図２に示すような構造の、二本鎖のｍｉＲＮＡを示す。また、本明細書において「成熟型ｈｓａ−ｍｉＲ−２２」といった場合、配列番号２または配列番号３に示す成熟型のｍｉＲＮＡを示す。配列番号２に示す「成熟型ｈｓａ−ｍｉＲ−２２」については、単に「ｈｓａ−ｍｉＲ−２２」としても用いられる。配列番号３に示す「成熟型ｈｓａ−ｍｉＲ−２２」については、用語「ｈｓａ−ｍｉＲ−２２^＊」と同意に用いられる。ｈｓａ−ｍｉＲ−２２およびｈｓａ−ｍｉＲ−２２^＊が二本鎖構造をとることによって、二本鎖ｈｓａ−ｍｉＲ−２２が構成される。

用語「ｈｓａ−ｍｉＲ−２２の遺伝子転写物」は、前述した図１、図２、配列番号１、配列番号２および配列番号３に示すような、「Ｐｒｅ−ｈｓａ−ｍｉＲ−２２」、「二本鎖ｈｓａ−ｍｉＲ−２２」、「ｈｓａ−ｍｉＲ−２２」および「ｈｓａ−ｍｉＲ−２２^＊」を含む意味として用いられる。また、単に「ｍｉＲ−２２の遺伝子転写物」といった場合は、「ｈｓａ−ｍｉＲ−２２の遺伝子転写物」だけでなく、ヒト以外の「ｍｉＲ−２２の遺伝子転写物」を含有する意味として用いられる。

以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。本発明は実施の形態に限定されることはなく、本発明の範囲内で種々の実施形態が可能である。本明細書において、「含む」または「含有する」といった表現は、「からなる」または「から構成される」という意も含むものとする。

（老化マーカー）
本発明の実施の形態１は、老化マーカーに関する。実施例において詳細に述べるが、本発明者が鋭意研究を行った結果、（ｈｓａ−）ｍｉＲ−２２の遺伝子転写物は老化したヒト線維芽細胞において高発現していることが確認された。また、老化するに従って、（ｈｓａ−）ｍｉＲ−２２の遺伝子転写物の発現量が増加するということもわかった。そこで、本実施の形態１に係る老化マーカーは、ｍｉＲ−２２の遺伝子転写物を含む。詳細には、ｍｉＲ−２２の遺伝子転写物は、配列番号１に記載の塩基配列からなるＲＮＡ、配列番号２に記載の塩基配列からなるＲＮＡ、および／または、配列番号３に記載の塩基配列からなるＲＮＡを含む。なお、このような配列番号１に記載の塩基配列からなるＲＮＡ、配列番号２に記載の塩基配列からなるＲＮＡ、および／または、配列番号３に記載の塩基配列からなるＲＮＡを含む本実施の形態１に係る老化マーカーには、Ｐｒｅ−ｈｓａ−ｍｉＲ−２２および二本鎖ｈｓａ−ｍｉＲ−２２も含有される。

本実施の形態１に係る老化マーカーの利用方法としては、例えば、検体におけるｍｉＲ−２２の遺伝子転写物の発現量と、検体に対応するｍｉＲ−２２の遺伝子転写物の発現量の基準値とを比較する工程を含む、老化の程度の判断方法が挙げられる。

本明細書において、用語「検体」とは、ｍｉＲ−２２の遺伝子転写物の発現量を測定し、老化の程度を判断し得る生物学的対象の任意の試料のことをいう。好ましくは、検体は哺乳動物個体に由来する検体である。最も好ましくは、検体はヒト（Homo sapiens）の線維芽細胞である。「検体に対応するｍｉＲ−２２の遺伝子転写物の発現量の基準値」とは、当該検体において測定したｍｉＲ−２２の遺伝子転写物の発現量の値と比較することができる、基準となる値をいう。例えば、基準値は、年代別（細胞における老若別も含む）の試料においてあらかじめ測定されたｍｉＲ−２２の遺伝子転写物の平均値である。年代別の試料におけるｍｉＲ−２２の遺伝子転写物の発現量は、例えば、何時間、何日または何年毎に測定しておいても構わない。また、平均値とは、どのような算出方法を用いた平均値でもよく、相加平均、相乗平均または調和平均等のいずれでも構わない。なお、このような基準値、および、年代別の平均値を、あらかじめ測定、算出しておくことは、後述するような当該分野の当業者において公知のｍｉＲＮＡの発現量の測定方法を用いることで容易に可能である。

例えば、検体がヒトまたはヒト由来の細胞である場合、検体と同年代の複数のヒトまたはヒト由来の細胞から、あらかじめｈｓａ−ｍｉＲ−２２の遺伝子転写物の発現量を測定しておく。これらの平均値を算出し、算出された平均値を基準値とする。前述したように、（ｈｓａ−）ｍｉＲ−２２の遺伝子転写物の発現量は老化するに従って増加する。そのため、検体における発現量と基準値とを比較し、検体における発現量の方が基準値よりも多かった場合、検体は老化していると言える。さらに、検体における発現量と基準値との差が大きければ大きい程、老化しているとも言える。

より厳密に老化を判断するには、例えば、ヒト線維芽細胞の老化の程度を判断する場合において、あらかじめ年代別（例えば５年毎）のヒト線維芽細胞におけるｈｓａ−ｍｉＲ−２２の遺伝子転写物の発現量を測定し、その平均値を算出しておく。次に、検体となるヒト線維芽細胞におけるｈｓａ−ｍｉＲ−２２の遺伝子転写物の発現量を測定する。検体において測定された発現量と、前述した年代別に測定された発現量の平均値とを比較し、検体において測定された発現量と最も近い発現量の平均値をもつ年代を求める。求めた年代と、検体の実際の年代とを比較することで、検体のヒト線維芽細胞の老化の程度を判断することができる。すなわち、求めた年代が検体の実際の年代よりも高ければ高い程、検体であるヒト線維芽細胞は老化（細胞老化）していると言える。

このような老化の判断方法は、検体におけるｍｉＲ−２２の遺伝子転写物の発現量を測定する工程を含む。ｍｉＲ−２２の遺伝子転写物の発現量の測定方法は、当該分野の当業者において公知のｍｉＲＮＡの発現量の測定方法なら何でもよいが、好ましくは、ノーザンブロット法、ＲＴ−ＰＣＲ（Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction）法、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ法、ＲＴ−ＬＡＭＰ（Reverse Transcription Loop-Mediated Isothermal Amplification）法、マイクロアレイ法、または、in situハイブリダイゼーション法のいずれかの方法を用いて測定する。最も好ましくは、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ法を用いて測定する。

このように、本実施の形態１に係る老化マーカーによれば、検体（生物学的対象の試料）のｍｉＲ−２２の遺伝子転写物の発現量を測定し、検体に対応するｍｉＲ−２２の遺伝子転写物の発現量の基準値と比較することで、細胞老化の程度を判断することができる。また、あらかじめ年代別のｍｉＲ−２２の遺伝子転写物の発現量を測定し、平均値を算出しておくと、より細密に老化の判断を診断することができる。さらには、細胞老化の程度が判断できることにより、新規な医薬組成物の開発にも繋がり、病状等に対する進行具合の具体的な判断等へも繋がることが示唆される。

なお、本実施の形態１に係る老化マーカーが適応される細胞は、ヒト線維芽細胞の場合だけに限られない。ｍｉＲ−２２の遺伝子転写物は、種々の老化した細胞において高発現していると考えられる。例えば、老化した幹細胞においても高発現していると考えられる。さらに、老化が進行した細胞では免疫力等にも影響を与えるため、本実施の形態１に係る老化マーカー、例えば前述した老化の判断方法を利用することによって、検体の免疫力、細胞再生能力または生体肝移植後の予後等を判定できることが示唆される。この場合の「検体に対応するｍｉＲ−２２の遺伝子転写物の発現量の基準値」は、発現量を測定した細胞の種類、および、判定する内容を考慮して定めておくことが好ましい。

さらに、本実施の形態１に係る老化マーカーは、老化（細胞老化）の判断キットにも利用され得る。当該老化の判断キットは、ｍｉＲ−２２の遺伝子転写物に特異的にハイブリダイズするプライマーまたはプローブの少なくとも一つを含み得る。このようなプライマーまたはプローブは、当業者であれば、前述したデータベースの情報等を参考にして、ｍｉＲ−２２の遺伝子転写物の塩基配列に基づき適宜設計することが可能である。

プライマーまたはプローブの塩基配列は、鋳型との特異的な結合が可能となるような適当な塩基数であることが好ましい。例えば、数十ｂｐ、具体的には１５〜３０ｂｐ程度を有する。さらに、プライマー内でヘアピン構造をとったり、センス鎖とアンチセンス鎖とが互いにアニーリングしないような塩基配列とすることも重要である。例えば、OligoＴＭ（National Bioscience Inc.製）のような市販のプライマー設計用のソフトウェアを使用することも可能である。

このような老化（細胞老化）の判断キットは、ｍｉＲ−２２の遺伝子転写物の発現量を測定する器材を含み得る。「器材」とは、ｍｉＲＮＡの発現量を測定するために必要な、当該分野の当業者にとって公知である要素または成分等を指す。この器材の種類は、ｍｉＲ−２２の遺伝子転写物の発現量を測定する原理によって異なるが、例えば、各種試薬、酵素、緩衝液および／または反応プレート（容器）等が含まれ得る。

なお、ｍｉＲ−２２の遺伝子転写物の発現量を測定する原理には、前述した判断方法と同様、ノーザンブロット法、ＲＴ−ＰＣＲ法、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ法、ＲＴ−ＬＡＭＰ法、マイクロアレイ法、または、in situハイブリダイゼーション法等が挙げられる。最も好ましくは、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ法である。

さらに、当該老化（細胞老化）の判断キットは、検体におけるｍｉＲ−２２の遺伝子転写物の発現量を比較できる、前述したような基準値（例えば、年代別の試料におけるｍｉＲ−２２の遺伝子転写物の発現量の平均値）が記載された使用説明書等を含んでも構わない。

この場合、前述した器材等を用いて測定した検体（細胞等）のｍｉＲ−２２の遺伝子転写物の発現量を基準値と比較することにより、一回の発現量測定で老化（細胞老化）を判断することができる。このように、本実施の形態１に係る老化マーカーを利用した老化（細胞老化）の判断キットよれば、検体の老化の程度を容易に判断することができる。

（老化抑制物質の評価方法）
本発明の実施の形態２は、老化抑制物質の評価方法に関する。詳細には、本実施の形態２は、被験化合物存在下および被験化合物非存在下での、検体における、ｍｉＲ−２２の遺伝子転写物の発現量を測定する工程と、被験化合物非存在下での検体におけるｍｉＲ−２２の遺伝子転写物の発現量に対する、被験化合物存在下での検体におけるｍｉＲ−２２の遺伝子転写物の発現量を比較する工程と、を含む老化抑制物質の評価方法に関する。

なお、実施の形態１において前述したように、ｍｉＲ−２２の遺伝子転写物は、配列番号１に記載の塩基配列からなるＲＮＡ、配列番号２に記載の塩基配列からなるＲＮＡ、および／または、配列番号３に記載の塩基配列からなるＲＮＡを含有する。さらには、Ｐｒｅ−ｈｓａ−ｍｉＲ−２２および／または二本鎖ｈｓａ−ｍｉＲ−２２も含有し得る。「検体」は、好ましくは哺乳動物個体に由来する検体、最も好ましくはヒト線維芽細胞である。また、本明細書において、「評価方法」、「評価する」または「評価」等の用語には、スクリーニングの意味も含まれる。

前述したように、老化が進行すると、ｍｉＲ−２２の遺伝子転写物の発現量は増加する。従って、被験化合物の存在下および非存在下において、ｍｉＲ−２２の遺伝子転写物の発現量を測定し、その測定値を比較することにより、被験化合物が老化抑制物質であるか否かを評価、スクリーニングすることができる。

具体的には、被験化合物の存在下（例えば、検体に被験化合物を混合、添加した場合）におけるｍｉＲ−２２の遺伝子転写物の発現量が、被験化合物非存在下におけるｍｉＲ−２２の遺伝子転写物の発現量よりも少なかった場合、その被験化合物は老化抑制物質であると評価することができる。さらに、前述した実施の形態１と同様に、被験化合物存在下または被験化合物非存在下における両発現量の差が大きいまたは小さいほど、その被験化合物の老化抑制作用は大きいまたは小さいと言える。また、両発現量の差によって判断しなくとも、被験化合物存在下または被験化合物非存在下における両発現量から、年代を算出して、算出された年代を比較しても構わない。

検体におけるｍｉＲ−２２の遺伝子転写物の発現量を測定する方法は、当該分野の当業者において公知のｍｉＲＮＡの発現量の測定方法であれば任意である。好ましくは、実施の形態１と同様、ノーザンブロット法、ＲＴ−ＰＣＲ法、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ法、ＲＴ−ＬＡＭＰ法、マイクロアレイ法、または、in situハイブリダイゼーション法のいずれかの方法を用いて測定する。最も好ましくは、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ法を用いて測定する。

このように、本実施の形態２に係る老化抑制物質の評価方法よれば、老化を抑制することができる物質を容易に評価、選別することができる。選別した老化抑制物質は、例えば、化粧品または栄養剤等の成分に用いたり、様々な用途に用いることができる。また、本実施の形態２において老化抑制物質とは評価されず、逆に老化を促進する物質であると判断された場合は、例えば、化粧品または栄養剤等の成分に添加しないようにすることもできる。

（癌抑制剤）
本発明の実施の形態３は、ｍｉＲ−２２の遺伝子転写物を有効成分として含有する癌抑制剤に関する。具体的には、ｍｉＲ−２２の遺伝子転写物は、配列番号１に記載の塩基配列からなるＲＮＡ、配列番号２に記載の塩基配列からなるＲＮＡ、および／または、配列番号３に記載の塩基配列からなるＲＮＡを含有し、細胞老化を促進させ、癌の浸潤および／または転移を抑制する。なお、実施の形態１および実施の形態２で述べた通り、ｍｉＲ−２２の遺伝子転写物、または、配列番号１に記載の塩基配列からなるＲＮＡ、配列番号２に記載の塩基配列からなるＲＮＡおよび／もしくは配列番号３に記載の塩基配列からなるＲＮＡには、Ｐｒｅ−ｈｓａ−ｍｉＲ−２２および二本鎖ｈｓａ−ｍｉＲ−２２も含有される。

なお、本明細書において、「癌抑制剤」とは、癌細胞の老化（細胞老化）を促進させ、その結果として、癌の増殖、浸潤および／または転移を抑制する組成物を示す。本発明の実施の形態３に係る癌抑制剤は特に限定されないが、好ましくは、胃癌抑制剤、子宮癌抑制剤、咽頭癌抑制剤、乳癌抑制剤、子宮頸癌抑制剤および／または結腸癌抑制剤である。このうち最も好ましくは、子宮頸癌抑制剤および／または乳癌抑制剤である。

一方、前述したようなｍｉＲ−２２の遺伝子転写物は、人工的に化学合成されたもの、生化学的に合成されたもの、または、生物体内で合成されたもののいずれでも構わない。

本実施の形態３に係る癌抑制剤は、有効成分であるｍｉＲ−２２の遺伝子転写物を、遺伝子治療剤に通常用いられる基剤と共に配合することによって製造することができる。また、ｍｉＲ−２２の遺伝子転写物をウイルスベクターに組み込んだ場合は、組換えベクターを含有するウイルス粒子を調製し、これを遺伝子治療剤に通常用いる基剤と共に配合することによって製造することができる。

有効成分であるｍｉＲ−２２の遺伝子転写物を配合するために使用する基剤としては、通常注射剤に用いる基剤を使用することができる。例えば、蒸留水、塩化ナトリウムもしくは塩化ナトリウムと無機塩との混合物等の塩溶液、マンニトール、ラクトース、デキストランもしくはグルコース等の溶液、グリシンもしくはアルギニン等のアミノ酸溶液、有機酸溶液、または、塩溶液とグルコース溶液との混合溶液等が挙げられる。あるいは、当業者にとって公知の常法に従い、これらの基剤に浸透圧調整剤、ｐＨ調整剤、植物油または界面活性剤等の助剤を用い、溶液、懸濁液または分散液として注射剤を調製することもできる。これらの注射剤は、粉末化または凍結乾燥等の操作により、用時溶解用製剤として調製することもできる。

本実施の形態３に係る癌抑制剤の投与形態としては、通常の静脈内または動脈内等の全身投与でもよいし、局所注射または経口投与等の局所投与を行っても構わない。さらに、カテーテル技術、遺伝子導入技術または外科的手術等と組み合わせた投与形態をとることもできる。すなわち、本実施の形態３に係る癌抑制剤の投与方法は、経口投与、非経口投与（例えば、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、皮内投与、粘膜投与、直腸内投与、膣内投与、患部への局所投与もしくは皮膚投与等）または患部への直接投与等が挙げられる。

本実施の形態３に係る癌抑制剤は、医薬組成物として使用する場合、必要に応じて薬学的に許容可能な添加剤を配合することができる。薬学的に許容可能な添加剤の具体例としては、抗酸化剤、保存剤、着色料、風味料、希釈剤、乳化剤、懸濁化剤、溶媒、フィラー、増量剤、緩衝剤、送達ビヒクル、希釈剤、キャリア、賦形剤および／または薬学的アジュバント等が挙げられるが、これらに限定されない。

本実施の形態３に係る癌抑制剤の製剤形態は特に限定されないが、例えば、液剤、注射剤または徐放剤等が挙げられる。このような製剤として処方するために使用される溶媒としては、水性または非水性のどちらでも構わない。

本実施の形態３に係る癌抑制剤の有効成分であるｍｉＲ−２２の遺伝子転写物の導入は、例えば、リポソームを用いて核酸分子を導入する方法（リポソーム法、ＨＶＪ−リポソーム法、カチオニックリポソーム法、リポフェクション法もしくはリポフェクトアミン法等）、マイクロインジェクション法、または、遺伝子銃（Gene Gun）でキャリア（金属粒子）とともに核酸分子を細胞に移入する方法等を利用することができる。また、組換えアデノウイルスまたはレトロウイルス等のウイルスベクターも利用することができる。具体的には、無毒化したレトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス、ポリオウイルス、シンドビスウイルス、センダイウイルスまたはＳＶ４０等のＤＮＡウイルスまたはＲＮＡウイルスに、ｍｉＲ−２２の遺伝子転写物を組込み、細胞または組織にこの組換えウイルスを感染させることにより、細胞または組織内に遺伝子を導入することができる。

本実施の形態３に係る癌抑制剤の投与量は、使用目的、疾患の重篤度、患者の年齢、体重、性別および／または既往歴等を考慮して、当業者が決定することができる。このように、本実施の形態３に係るｍｉＲ−２２の遺伝子転写物を有効成分とする癌抑制剤を使用することによって、癌細胞の老化を促進させ、その結果、癌の増殖を抑制し、さらには癌の浸潤および転移を抑制することができる。これは、本実施の形態３に係る癌抑制剤による正常な細胞への影響が、細胞を老化させるが、アポトーシスを起こさせることが少ないということを意味する（実施例参照）。つまり、特許文献２および特許文献３においてｍｉＲ−２２と同等に挙げられている他の多くのｍｉＲＮＡよりも、癌抑制剤として、より効果的かつ実用的な有効成分であることが示唆される。これにより、本実施の形態３に係る癌抑制剤の投与による副作用についても、従来の抗癌剤等に比べて、極めて軽減されることが示唆される。

以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説明するが、実施例は本発明を限定するものでない。

本発明者は、細胞老化および細胞増殖の抑制等に関与しているｍｉＲＮＡについて研究した。その結果、（ｈｓａ−）ｍｉＲ−２２の遺伝子転写物（ｍｉＲＢａｓｅ http://www.mirbase.org/参照）が、細胞老化および細胞増殖の抑制に関与していること、ならびに、当該細胞増殖の抑制を利用して癌の増殖、浸潤および転移を抑制できることを発見した。ｍｉＲ−２２の詳細については、前述したｍｉＲＢａｓｅにおけるAccession番号を参照されたい。

（実施例１）
本実施例１では、若い細胞および老化細胞におけるヒト線維芽細胞のｈｓａ−ｍｉＲ−２２^＊の発現量に係る実施例について説明する。本発明者は、若いヒト線維芽細胞および老化ヒト線維芽細胞（若い細胞と比較して、分裂回数を繰り返した細胞）における、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２^＊の発現量を、定量的リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ法によって調べた。以下、詳細に説明する。

ＴＩＧ−３細胞、ＴＩＧ−１細胞、ＴＩＧ−１１２細胞、ＴＩＧ−１１４細胞およびＭＲＣ−５細胞のヒト線維芽細胞についてのｈｓａ−ｍｉＲ−２２^＊の発現量を調べた。ＴＩＧ−３細胞、ＴＩＧ−１細胞、ＴＩＧ−１１２細胞およびＴＩＧ−１１４細胞については、１０％ＦＢＳ（Fetal Bovine Serum）と抗生物質とを含有するＤＭＥＭ（Dulbecco's Modified Eagle's Medium）を用いて培養した。ＭＲＣ−５細胞については、ＤＭＥＭ／Ｆ−１２培地（１：１、Ｖ/Ｖ）に、ＳＡＰ（０．２ｍＭ serine、０．１ｍＭ aspartic acid、１．０ｍＭ pyruvate）、１０％ＦＢＳおよび抗生物質を加えて培養した。これらの細胞は、全て加湿恒温インキュベーターを用い、３７℃、５％ＣＯ_２の条件において培養した。

次に、培養したこれらの細胞のＲＮＡの回収と定量的リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ分析を行った。まず、培養細胞のtotal ＲＮＡを、ｍｉＲＶａｎａｍｉＲＮＡ Isolation Kit（Ambion）のプロトコルに準じて抽出し、Nanodrop分光計で定量した。ｃＤＮＡはtotal ＲＮＡ１０ｎｇから合成した。ｍｉＲＮＡの発現量は、Taqman microＲＮＡ assays（Applied Biosystem）を用いて定量した。定量的リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ法は、ＡＢＩ Step One and Step One Plus real-time ＰＣＲ system（Applied Biosystem）と、LightCycle ４８０（Roche）とを用いて行った。ｍｉＲＮＡの発現量は、threshold cycleで決定し、Ｕ６ small nuclear ＲＮＡで標準化を行った後、若い細胞を１としたときの相対的な発現量を２^{−ΔΔＣｔ}法によって計算した。

図３は、実施例１に係る、ヒト線維芽細胞におけるｑＲＴ−ＰＣＲでのｈｓａ−ｍｉＲ−２２^＊の発現量のデータを示す図である。なお、老化細胞（Ｓ）については、それぞれの細胞の若い細胞（Ｙ）を１としたときの相対値（ＲＱ（relative quantitation））を示している。図３に示すように、いずれのヒト線維芽細胞株においても、老化細胞（Ｓ）は、若い細胞（Ｙ）と比較すると、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２^＊が高発現している。この結果から、細胞が老化する（分裂を何度も繰り返す）と、その老化の程度に伴い、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２^＊すなわちｍｉＲ−２２の遺伝子転写物の発現量が増加することが示唆される。

（実施例２）
本実施例２では、二本鎖ｈｓａ−ｍｉＲ−２２をヒト線維芽細胞に導入した場合に係る実施例について説明する。本発明者は、二本鎖ｈｓａ−ｍｉＲ−２２をヒト線維芽細胞（ＭＲＣ−５細胞）に導入した場合、老化細胞において見られるような現象等が見られるか否かを調べた。以下、詳細に説明する。

まず、本発明者は、二本鎖ｈｓａ−ｍｉＲ−２２をヒト線維芽細胞（ＭＲＣ−５細胞）に導入した場合、老化細胞のマーカーの一つであるSenescence-associated heterochromatic foci（以下、ＳＡＨＦ）の形成が観察されるか否かを調べた。Lipofectamine ＲＮＡｉ Max（Invitrogen）のプロトコルに準じて、１０ｎＭの二本鎖ｈｓａ−ｍｉＲ−２２（Ｂ-bridge、後述の実施例も同様）またはAllStars Negative Control ｓｉＲＮＡ（Qiagen）を、ＭＲＣ−５細胞に導入した。蛍光ラベル化された二本鎖short interference ＲＮＡを用いて計測した導入効率では、９０％以上と予測された。導入後、４８時間後、８−well culture chamberまたは３５ｍｍ dishに播種した。４日後、ＰＢＳ（phosphate buffer saline）を加え、細胞を二回洗浄した後、２％ホルムアルデヒド含有ＰＢＳを加えた。その後、５日間室温においてインキュベートして細胞を固定した。

固定した細胞を、微分干渉顕微鏡（ＤＩＣ、Differential interference contrast microscope）を用いて観察した。また、固定した細胞をＤＡＰＩ（４’，６-diamidino-２-phenylindole）（０．２５μｇ／ｍＬ）で染色し、蛍光顕微鏡（Axiovert ２００Ｍ、Carl Zeiss）を用いて観察した。図４は、実施例２において、二本鎖ｈｓａ−ｍｉＲ−２２を導入したヒト線維芽細胞を蛍光顕微鏡および微分干渉顕微鏡によって観察した様子を示す図である。図４において、ｍｉＲ−２２は二本鎖ｈｓａ−ｍｉＲ−２２をＭＲＣ−５細胞に導入したものであり、ＣｏｎｔｓｉＲはAllStars Negative Control ｓｉＲＮＡ（Qiagen）をＭＲＣ−５細胞に導入したものである。

図４に示すように、ヒト線維芽細胞に二本鎖ｈｓａ−ｍｉＲ−２２を導入すると、老化細胞のような大きく広がった形態となった。さらに、老化細胞において観察されるようなＳＡＨＦの形成も誘導していた。

また、本発明者は、二本鎖ｈｓａ−ｍｉＲ−２２をヒト線維芽細胞（ＭＲＣ−５細胞）に導入した場合、老化細胞において見られるSenescence-associated β−gal活性（以下、ＳＡ−β−gal活性）が見られるか否かも調べた。

ＰＢＳを加え細胞を二回洗浄するまでは前述したＳＡＨＦの検出と同様である。その後、４０ｍＭ citric acid（ｐＨ６．０）、５ｍＭ potassium ferrocyanide、５ｍＭ potassium ferricyanide、１５０ｍＭＮａＣｌ、２ｍＭＭｇＣｌ_２および０．５ｍＭ／ｍＬ５-bromo-４-chloro-３-indolyl-β-Ｄ-galactopyranoside（Ｘ-gal）を含むＳＡ−β−gal染色液を用事調整し、３７℃において、４８時間インキュベートした。これを、通常の顕微鏡下において観察し、細胞５００個中のＳＡ−β−gal活性細胞を計数し、評価した。

図５は、実施例２に係る、二本鎖ｈｓａ−ｍｉＲ−２２を導入したヒト線維芽細胞を老化細胞特異的なマーカーであるＳＡ−β−gal染色したものを顕微鏡によって観察した様子を示す図である。図６は、実施例２に係る、二本鎖ｈｓａ−ｍｉＲ−２２を導入したヒト線維芽細胞における老化細胞特異的ＳＡ−β−gal活性細胞の割合のデータを示す図である。図５および図６に示す、ＭＲＣ−５cellは、二本鎖ｈｓａ−ｍｉＲ−２２またはAllStars Negative control ｓｉＲＮＡ（Qiagen）のいずれも導入せずに観察した結果を示す。なお、ｍｉＲ−２２およびＣｏｎｔｓｉＲについては、図４と同様に、ｍｉＲ−２２は二本鎖ｈｓａ−ｍｉＲ−２２を、ＣｏｎｔｓｉＲはAllStars Negative Control ｓｉＲＮＡ（Qiagen）をＭＲＣ−５細胞に導入したものである。図６におけるＳＡ positive cell(%)は、ＳＡ−β−gal活性細胞の割合（％）を示す。図５および図６に示すように、ヒト線維芽細胞に二本鎖ｈｓａ−ｍｉＲ−２２（ｍｉＲ−２２）を導入すると、老化細胞において見られるＳＡ−β−gal活性を誘導することがわかった。

さらに、本発明者は、二本鎖ｈｓａ−ｍｉＲ−２２をヒト線維芽細胞（ＭＲＣ−５細胞）に導入した場合、細胞の増殖はどう変化するのかについて調べた。二本鎖ｈｓａ−ｍｉＲ−２２の導入までは前述と同様である。導入後４８時間後、３×１０^４個のＭＲＣ−５細胞を３５ｍｍ dishに播種し、５日間培養した。培養条件については、実施例１において述べた培地、条件と同様である。培養期間中、２４時間毎に細胞を回収して、細胞数を計測した。それぞれの実験はduplicateで行った。この結果をもとに細胞の増殖曲線を作成した。

図７は、実施例２に係る、二本鎖ｈｓａ−ｍｉＲ−２２を導入したヒト線維芽細胞における細胞数のデータを示す図である。すなわち、ＭＲＣ−５細胞の増殖曲線（ＭＲＣ−５ growth curve）を示す。図７における、ＭＲＣ−５cell、ｍｉＲ−２２およびＣｏｎｔｓｉＲは、前述した図５および図６と同様である。図７に示すように、二本鎖ｈｓａ−ｍｉＲ−２２を導入した細胞（ｍｉＲ−２２）は、あまり細胞数（Cell number）が変化していない。すなわち、二本鎖ｈｓａ−ｍｉＲ−２２（ｍｉＲ−２２）を導入すると、ヒト線維芽細胞（ＭＲＣ−５細胞）の増殖が阻害されることがわかった。

さらに、本発明者は、二本鎖ｈｓａ−ｍｉＲ−２２をヒト線維芽細胞（ＭＲＣ−５細胞）に導入した場合、細胞周期因子ｐ２１およびサイクリン依存性キナーゼＣＤＫ６（cyclin dependent kinase ６）等の発現にどのような影響を与えるのかを調べた。

前述と同様の方法において二本鎖ｈｓａ−ｍｉＲ−２２をヒト線維芽細胞（ＭＲＣ−５細胞）に導入し、導入後の細胞を遠心分離により回収し、可溶化した（５０ｍＭ Tris-ＨＣｌｐＨ８．０、１２０ｍＭＮａＣｌ、１％ＮＰ４０、１００ｍＭＮａＦ、０．２ｍＭＮａ_３ＶＯ_４、１×complete mini（Roche））。可溶化細胞中の全タンパク質（３０μｇ）を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ＳＤＳ-Poly-Acrylamide Gel Electrophoresis）で分離し、ＰＶＤＦ（PolyVinylidene DiFluoride）メンブレンに移した。一次抗体ｐ５３（clone ＢＰ５３−１２、upstate）、ｐ２１Ｗａｆ１／ｃｉｐ１（ＤＣＳ３６０、cell signaling）およびＣＤＫ６（Ｃ−２１、santa cruz）を加える前に、メンブレンは５％スキムミルクを含むＰＢＳ−Ｔ（０．０５％ Tween２０）でブロッキングした。抗体の結合は、ＨＲＰ（horseradish peroxidase）結合二次抗体を用いて可視化した。シグナルは、ＥＣＬ plus Kit（Amersham）を用いて可視化し、検出した。泳動コントロールとして、β−actin（clone ＡＣ−１５、Sigma）と特異的なモノクローナル抗体を用いて、β−actinを検出した。

図８は、実施例２に係る、二本鎖ｈｓａ−ｍｉＲ−２２を導入したヒト線維芽細胞におけるウェスタンブロッティングの様子を示す図である。図８において、ＣｏｎｔはＭＲＣ−５細胞におけるタンパク質（３０μｇ）を泳動したものを、ｍｉＲ−２２は二本鎖ｈｓａ−ｍｉＲ−２２を導入したＭＲＣ−５細胞におけるタンパク質（３０μｇ）を泳動したものを示す。図８に示すように、二本鎖ｈｓａ−ｍｉＲ−２２（ｍｉＲ−２２）を導入すると、ＴＰ５３遺伝子および細胞周期阻害因子ｐ２１の発現を誘導し、サイクリン依存性キナーゼＣＤＫ６の発現を抑制していることがわかった。

図４ないし図８において示した本実施例２の結果から、ｍｉＲ−２２は細胞老化に関与しているｍｉＲＮＡであり、二本鎖ｍｉＲ−２２を線維芽細胞に導入すると、細胞の老化が促進され、細胞が老化細胞と同様の特徴を持ち、その結果、細胞増殖が抑制される（細胞増殖が停止する）ということがわかった。

（実施例３）
本実施例３では、レンチウイルス感染によって、Ｐｒｅ−ｈｓａ−ｍｉＲ−２２（図１参照）をヒト線維芽細胞（ＭＲＣ−５細胞）に導入した場合に係る実施例について説明する。本発明者は、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２が成熟型（Mature）ｈｓａ−ｍｉＲ−２２となる前のＰｒｅ−ｈｓａ−ｍｉＲ−２２をヒト線維芽細胞に導入した場合でも、細胞老化に特異的な現象（ＳＡ−β−gal活性および細胞増殖の阻害）が見られるか否かを確認した。

まず、LipofectamineＬＴＸ Plus reagent（Invitrogen）を使用し、０．９μｇのＰｒｅ−ｈｓａ−ｍｉＲ−２２またはcontrol empty vectorのレンチウイルスベクター（いずれもSystem Biosciences）と、０．９μｇのパッケージングplasmid mix（ｐＰＡＣＫ−Ｈ１−ＧＡＧ、ｐＰＡＣＫ−Ｈ１−ＲｅｖおよびｐＶＳＶ−Ｇ）とをコトランスフェクションすることによって、２９３Ｔ細胞においてレンチウイルスを発生させた。トランスフェクションから４８時間後、０．４５μｍのフィルター膜を通し上清を回収し、直接ＭＲＣ−５細胞を感染させるために使用した。図には示していないが、ベクターの形質導入および転写については、定量リアルタイムＰＣＲ法および蛍光顕微鏡によって確認した。

なお、ＳＡ−β−gal活性の染色方法および活性細胞の計数・評価方法等は、実施例２において前述した二本鎖ｈｓａ−ｍｉＲ−２２を導入した場合と同様である。図９は、実施例３に係る、Ｐｒｅ−ｈｓａ−ｍｉＲ−２２を導入したヒト線維芽細胞を老化細胞特異的なマーカーであるＳＡ−β−gal染色したものを顕微鏡によって観察した様子を示す図である。さらに、図１０は、実施例３に係る、Ｐｒｅ−ｈｓａ−ｍｉＲ−２２を導入したヒト線維芽細胞における老化細胞特異的ＳＡ−β−gal活性細胞の割合のデータを示す図である。

図９および図１０に示すように、レンチウイルス感染によってＰｒｅ−ｈｓａ−ｍｉＲ−２２が導入されたＭＲＣ−５細胞（Ｌｅｎｔｉ−２２）は、control empty vectorが導入されたＭＲＣ−細胞（Ｌｅｎｔｉ−Ｃ）よりもＳＡ−β−gal活性細胞の割合が低かった。

同様にレンチウイルス感染によってＰｒｅ−ｈｓａ−ｍｉＲ−２２を導入したＭＲＣ−５細胞を使用し、細胞の増殖の変化について調べた。細胞の培養方法および細胞の増殖曲線の作成方法等は、実施例２において前述した方法と同様である。

図１１は、実施例３に係る、Ｐｒｅ−ｈｓａ−ｍｉＲ−２２を導入したヒト線維芽細胞における細胞数のデータを示す図である。図１１に示すように、やはり、二本鎖ｈｓａ−ｍｉＲ−２２を導入した場合と同様に、Ｐｒｅ−ｈｓａ−ｍｉＲ−２２を導入したＭＲＣ−５細胞（Ｌｅｎｔｉ−２２）でも、control empty vectorが導入されたＭＲＣ−細胞（Ｌｅｎｔｉ−Ｃ）と比較して、細胞増殖が抑制されていた。

図９ないし図１１の結果から、Ｐｒｅ−ｈｓａ−ｍｉＲ−２２をヒト線維芽細胞に導入した場合でも、二本鎖ｈｓａ−ｍｉＲ−２２をヒト線維芽細胞に導入した場合と同様に、細胞の老化が促進され、細胞が老化細胞と同様の特徴を持ち、その結果、細胞増殖が抑制される（細胞増殖が停止する）ということがわかった。

（実施例４）
本実施例４では、癌細胞およびヒト正常線維芽細胞における、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２^＊の発現量に係る実施例について説明する。本発明者は、前述した実施例２および実施例３の結果であるｍｉＲ−２２の細胞老化および細胞増殖阻害という特徴は、癌細胞とも関与しているのではないかと考えた。そこで、癌細胞およびヒト正常線維芽細胞におけるｈｓａ−ｍｉＲ−２２^＊の発現量を定量的リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ分析によって調べ、比較した。以下、詳細に説明する。

ヒト癌細胞系列としては、胃癌細胞（扁平上皮型腺癌）（ＭＫＮ−１細胞）、胃癌細胞（ＭＫＮ−７４細胞）、胃癌細胞（ＴＭＫ−１細胞）、子宮癌細胞（ＭＥＳ−ＳＡ細胞）、咽頭癌細胞（ＫＢ細胞)、乳癌細胞（ＭＣＦ−７細胞）、子宮頸癌（ＨｅＬａ細胞）、結腸癌細胞（ＲＫＯ細胞）および子宮頸癌細胞（ＳｉＨａ細胞）を調べた。ヒト正常線維芽細胞としては、ＴＩＧ−３ｐ４２細胞を使用した。

各癌細胞およびＴＩＧ−３ｐ４２細胞の培養条件は、実施例１で述べたＴＩＧ−３細胞等の培養条件と同様である。培養したこれらの細胞のＲＮＡの回収と定量的リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ分析の方法についても実施例１と同様である。

図１２は、実施例４に係る、癌細胞およびヒト正常線維芽細胞におけるｑＲＴ−ＰＣＲでのｈｓａ−ｍｉＲ−２２^＊の発現量のデータを示す図である。図１２に示すように、ＴＩＧ−３ｐ４２細胞におけるｈｓａ−ｍｉＲ−２２^＊の発現量を１としたときの相対値（ＲＱ（relative quantitation））は、全ての癌細胞において０．５よりも低くなっていた。すなわち、癌細胞においてはｍｉＲ−２２の発現量が低く、ほとんど機能していないということが本実施例４からわかった。

（実施例５）
本実施例５では、二本鎖ｈｓａ−ｍｉＲ−２２を癌細胞に導入した場合に係る実施例について説明する。本発明者は、前述した実施例４の結果から、癌細胞における細胞増殖の現象は、ｍｉＲ−２２の低発現量と関与しているのではないかと考えた。そこで、二本鎖ｈｓａ−ｍｉＲ−２２を癌細胞に導入した場合、老化細胞において見られるような現象等が見られるか否かを調べた。以下、詳細に説明する。

癌細胞としては、ＳｉＨａ細胞およびＭＣＦ−７細胞を使用した。これらの癌細胞の細胞培養条件は実施例１で述べたＴＩＧ−３細胞等と同様である。二本鎖ｈｓａ−ｍｉＲ−２２の癌細胞への導入方法は、前述した実施例２と同様である。図１３は、実施例５に係る、二本鎖ｈｓａ−ｍｉＲ−２２を導入した癌細胞を微分干渉顕微鏡によって観察した様子を示す図である。図１３において、ｍｉＲ−２２は二本鎖ｈｓａ−ｍｉＲ−２２をＳｉＨａ細胞またはＭＣＦ−７細胞に導入したものである。ＣｏｎｔｓｉＲは、AllStars Negative Control ｓｉＲＮＡ（Qiagen）をＳｉＨａ細胞またはＭＣＦ−７細胞に導入したものである。図１３に示すように、癌細胞（ＳｉＨａ細胞およびＭＣＦ−７細胞）に二本鎖ｈｓａ−ｍｉＲ−２２（ｍｉＲ−２２細胞）を導入すると、老化細胞のような大きく広がった形態を誘導していた。

さらに、本発明者は、前述した実施例２と同様に、二本鎖ｈｓａ−ｍｉＲ−２２を癌細胞（ＳｉＨａ細胞およびＭＣＦ−７細胞）に導入した場合、老化細胞において見られるＳＡ−β−gal活性が見られるか否かも調べた。癌細胞の細胞培養条件は実施例１で述べたＴＩＧ−３細胞等の培養条件と同様であり、ＳＡ−β−gal活性の測定方法は実施例２において述べた方法と同様である。

図１４は、実施例５に係る、二本鎖ｈｓａ−ｍｉＲ−２２を導入した癌細胞を老化細胞特異的なマーカーであるＳＡ−β−gal染色したものを顕微鏡によって観察した様子を示す図である。図１５は、実施例５に係る、二本鎖ｈｓａ−ｍｉＲ−２２を導入したＳｉＨａ細胞における老化細胞特異的ＳＡ−β−gal活性細胞の割合のデータを示す図である。図１６は、実施例５に係る、二本鎖ｈｓａ−ｍｉＲ−２２を導入したＭＣＦ−７細胞における老化細胞特異的ＳＡ−β−gal活性細胞の割合のデータを示す図である。図１４ないし図１６において、ｍｉＲ−２２およびＣｏｎｔｓｉＲは、前述した図１３と同様である。図１５および図１６において、ＳｉＨａ cellまたはＭＣＦ−７ cellは、いずれも導入せずに観察した結果を示す。

図１４ないし図１６に示すように、癌細胞（ＳｉＨａ細胞およびＭＣＦ−７細胞）に二本鎖ｈｓａ−ｍｉＲ−２２（ｍｉＲ−２２）を導入すると、老化細胞において見られるＳＡ−β−gal活性を誘導することがわかった。

さらに、本発明者は、二本鎖ｈｓａ−ｍｉＲ−２２を癌細胞（ＳｉＨａ細胞およびＭＣＦ−７細胞）に導入した場合、癌細胞の増殖はどう変化するのかについて調べた。二本鎖ｈｓａ−ｍｉＲ−２２の導入までは前述と同様であり、培養方法については実施例２において述べた方法と同様に５日間培養した。この結果をもとに細胞の増殖曲線を作成し、さらに導入から７日間培養後、微分干渉顕微鏡によって癌細胞の様子を観察した。

図１７は、実施例５に係る、二本鎖ｈｓａ−ｍｉＲ−２２を導入したＳｉＨａ細胞における細胞数のデータを示す図である。すなわち、ＳｉＨａ細胞の増殖曲線（ＳｉＨａ growth curve）を示す。図１８は、実施例５に係る、二本鎖ｈｓａ−ｍｉＲ−２２を導入し、７日間培養したＳｉＨａ細胞を微分干渉顕微鏡によって観察した様子を示す図である。図１９は、実施例５に係る、二本鎖ｈｓａ−ｍｉＲ−２２を導入したＭＣＦ−７細胞における細胞数のデータを示す図である。すなわち、ＭＣＦ−７細胞の増殖曲線（ＭＣＦ−７ growth curve）を示す。図２０は、実施例５に係る、二本鎖ｈｓａ−ｍｉＲ−２２を導入し、７日間培養したＭＣＦ−７細胞を微分干渉顕微鏡によって観察した様子を示す図である。図１７ないし図２０における、ｍｉＲ−２２およびＣｏｎｔｓｉＲについてはそれぞれ図１３と同様であり、ＳｉＨａ cellまたはＭＣＦ−７ cellについては図１５または図１６と同様である。

図１７および図１９に示すように、二本鎖ｈｓａ−ｍｉＲ−２２を導入したＳｉＨａ細胞またはＭＣＦ−７細胞（ｍｉＲ−２２）は、ＣｏｎｔｓｉＲ、および、ＳｉＨａ cellまたはＭＣＦ−７ cellと比較すると細胞数（Cell number）の変化が少ないが、５日目であってもある程度の細胞数は維持されていた。また、図１８および図２０に示すように、二本鎖ｈｓａ−ｍｉＲ−２２を導入後、培養７日目の癌細胞（ＳｉＨａ細胞またはＭＣＦ−７細胞）では、老化様の形態が観察された。すなわち、図１７ないし図２０の結果から、二本鎖ｈｓａ−ｍｉＲ−２２を癌細胞（ＳｉＨａ細胞またはＭＣＦ−７細胞）に導入すると、細胞死（アポトーシス）を促進させるのではなく、細胞老化を促進し、その結果、癌細胞の増殖が抑制されるということがわかった。

図１３ないし図２０において示した本実施例５の結果から、二本鎖ｍｉＲ−２２を癌細胞に導入すると、癌細胞が老化細胞と同様の特徴を持つということがわかった。また、ｍｉＲ−２２の遺伝子転写物を癌細胞に導入することによって、細胞老化を促進し、その結果癌細胞の増殖を抑制することがわかった。

（実施例６）
本実施例６では、二本鎖ｈｓａ−ｍｉＲ−２２を導入した癌細胞における細胞の浸潤性に係る実施例について説明する。本発明者は、前述した実施例５の結果から、二本鎖ｈｓａ−ｍｉＲ−２２を導入することで、癌細胞の増殖の抑制のみならず、癌細胞の浸潤までも抑制できるのではないかと考えた。そこで、二本鎖ｈｓａ−ｍｉＲ−２２を導入した癌細胞における細胞浸潤について調べた。以下、詳細に説明する。

癌細胞には、ＳｉＨａ細胞（子宮頸癌細胞）を使用した。ＳｉＨａ細胞の細胞培養条件は実施例１で述べたＴＩＧ−３細胞等と同様である。また、二本鎖ｈｓａ−ｍｉＲ−２２の癌細胞への導入方法は前述した実施例２と同様である。導入から４８時間後、ウェル（well）にマトリゲル（matrigel）を入れてから２時間後の２４−well plateに、培養したＳｉＨａ細胞を播種した。ＳｉＨａ細胞は、無血清状態における細胞１．５×１０^５（cells／well）を添加した。培地は１０％血清を含むものを用いた。次に、４８時間後、ＳｉＨａ細胞を固定し、浸潤した細胞を染色した。その後、浸潤細胞数を計測した。

図２１は、実施例６に係る、二本鎖ｈｓａ−ｍｉＲ−２２を導入したＳｉＨａ細胞の浸潤細胞数のデータを示す図である。なお、図２１において、ｍｉＲ−２２は二本鎖ｈｓａ−ｍｉＲ−２２をＳｉＨａ細胞に導入したものであり、ＣｏｎｔｓｉＲは、AllStars Negative Control ｓｉＲＮＡ（Qiagen）をＳｉＨａ細胞に導入したものである。図２１に示すように、本実施例６に係るＳｉＨａ細胞の浸潤性測定（Invasion assay）において、ｍｉＲ−２２の浸潤した細胞の数（Number of invaded cells）は、ＣｏｎｔｓｉＲと比較すると、５０（％）近く減少した。すなわち、二本鎖ｍｉＲ−２２の導入は、細胞（癌細胞）の浸潤を抑制することがわかった。また、この結果から、癌細胞の転移を抑制できる可能性があることが示唆される。

（実施例７）
本実施例７では、二本鎖ｈｓａ−ｍｉＲ−２２を導入した癌細胞における細胞の遊送能に係る実施例（創傷治癒アッセイ、Wound-healing assay）について説明する。本発明者は、前述した実施例６の結果から示唆される二本鎖ｈｓａ−ｍｉＲ−２２を導入することによる癌細胞の転移の抑制についても明確に調べるため、二本鎖ｈｓａ−ｍｉＲ−２２を導入した癌細胞における細胞の遊送能について観察した。以下、詳細に説明する。

癌細胞としては、ＳｉＨａ細胞を使用した。ＳｉＨａ細胞の細胞培養条件は実施例１で述べたＴＩＧ−３細胞等と同様である。二本鎖ｈｓａ−ｍｉＲ−２２の癌細胞への導入方法は、前述した実施例２と同様である。導入から９６時間後、１００％コンフルエントな状態の３５ｍｍ dishにおいて、無菌２００μｌプラスチックチップによって引っ掻き傷をつけた。その後、０〜４８時間まで創傷閉鎖（Wound closure）の割合について観察した。図２２は、実施例７に係る、二本鎖ｈｓａ−ｍｉＲ−２２を導入したＳｉＨａ細胞の創傷治癒アッセイの創傷閉鎖割合のデータを示す図である。図２２において、ｍｉＲ−２２およびＣｏｎｔｓｉＲの示す意味は、前述した図２１と同様である。なお、図２２は、４８時間（ｈ）のＣｏｎｔｓｉＲの状態、すなわち図示していないが、細胞が遊送し前述した引っ掻き傷が完全に塞がった状態を１００（％）として記載している。

図２２に示すように、本実施例７に係るＳｉＨａ細胞の遊送能において、ＣｏｎｔｓｉＲと比較すると、二本鎖ｈｓａ−ｍｉＲ−２２を導入したＳｉＨａ細胞（ｍｉＲ−２２）では、２４、３６および４８時間のいずれにおいても細胞の遊送が抑制されていることがわかった。細胞（癌細胞）の遊送能が抑制されるということは、すなわち、細胞（癌細胞）が血管内に入り込み難くなる（癌が転移し難くなる）ということが示唆される。

（実施例８）
本発明者は、前述した実施例６および実施例７の結果から想到される、二本鎖ｈｓａ−ｍｉＲ−２２の導入による癌の増殖、浸潤および転移の抑制効果をより確実に検証するために、乳癌転移モデルマウスによる腫瘍抑制試験を行った。まず、本実施例８では、該腫瘍抑制試験において使用するホタルルシフェラーゼ遺伝子を発現するＭＤＡ−ＭＢ−２３１−ｌｕｃ−Ｄ３Ｈ２ＬＮ乳癌細胞に二本鎖ｈｓａ−ｍｉＲ−２２を導入した場合、前述した実施例５と同様に、老化細胞において見られるような現象等が見られるか否かを確認した。以下、詳細に説明する。

ＭＤＡ−ＭＢ−２３１−ｌｕｃ−Ｄ３Ｈ２ＬＮ乳癌細胞（Xenogen、ＵＳＡより提供）は、５％ＣＯ_２、水蒸気飽和、３７℃の条件の下、ＣＯ_２インキュベータ内において培養した。二本鎖ｈｓａ−ｍｉＲ−２２の癌細胞への導入方法は、前述した実施例２と同様である。図２３は、実施例８に係る、二本鎖ｈｓａ−ｍｉＲ−２２を導入したＭＤＡ−ＭＢ−２３１−ｌｕｃ−Ｄ３Ｈ２ＬＮ乳癌細胞を観察した様子を示す図である。図２３において、ＣｏｎｔｍｉＲはnegative control ｍｉＲＮＡを導入したものであり、ｍｉＲ−２２は二本鎖ｈｓａ−ｍｉＲ−２２を導入したものである。また、Morphologyは、negative control ｍｉＲＮＡまたは二本鎖ｈｓａ−ｍｉＲ−２２を導入したＭＤＡ−ＭＢ−２３１−ｌｕｃ−Ｄ３Ｈ２ＬＮ乳癌細胞の形態を微分干渉顕微鏡によって観察した様子を示す。ＳＡ−β−galはこれらの細胞をＳＡ−β−gal染色したものを顕微鏡で観察した様子を示す。ＳＡ−β−gal活性の観察方法は実施例２において述べた方法と同様であり、図中矢印で示す部分はＳＡ−β−gal活性により染色された細胞を指す。なお、図２３において、四つの画像それぞれの右下に示す白線の実際の長さは２０μｍである。

図２３に示すように、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１−ｌｕｃ−Ｄ３Ｈ２ＬＮ乳癌細胞に二本鎖ｈｓａ−ｍｉＲ−２２を導入すると、老化細胞のような大きく広がった形態を誘導することがわかった。また、老化細胞において見られるＳＡ−β−gal活性を誘導することもわかった。すなわち、当該乳癌細胞においても二本鎖ｈｓａ−ｍｉＲ−２２を導入することによって、細胞老化を促進することが確認できた。

（実施例９）
本実施例９では、前述した乳癌転移モデルマウスによる腫瘍抑制試験の詳細に係る実施例について説明する。本発明者は、in vivoでの二本鎖ｈｓａ−ｍｉＲ−２２の導入（投与）による癌の増殖、浸潤および転移の抑制効果を検証するため、前述したホタルルシフェラーゼ遺伝子を発現するＭＤＡ−ＭＢ−２３１−ｌｕｃ−Ｄ３Ｈ２ＬＮ乳癌細胞を用い、モデルマウスでのホタルルシフェラーゼ遺伝子の発現解析を行った。以下、詳細に説明する。

まず、乳癌転移モデルマウスの作製を行った。モデルマウスとしては、Female Ｃ．Ｂ１７／ｌｃｒ−ｓｃｉｄ（Ｓｃｉｄ／ｓｃｉｄ）マウス（生後５週間、ＣＬＥＡ、Ｉｎｃ．）を使用した。該マウスの脂肪組織内に、前述したＭＤＡ−ＭＢ−２３１−ｌｕｃ−Ｄ３Ｈ２ＬＮ乳癌細胞（２×１０^６cell／５０μｌ／site）とＥＣＭ gelとの複合体（細胞懸濁液：ＥＣＭ gel＝１：１）を同所移植した。当該癌細胞を移植した日を０日目とした。マウスは、negative control ｍｉＲＮＡを投与するものと、二本鎖ｈｓａ−ｍｉＲ−２２を投与するものとでそれぞれ６匹ずつ観察した。

投与方法は、negative control ｍｉＲＮＡまたは二本鎖ｈｓａ−ｍｉＲ−２２のｍｉＲＮＡと、ｊｅｔＰＥＩとの複合体（in vivo−ｊｅｔＰＥＩ：Polyplus Transfection＝１：１）を、１００μｌ（２０μｇ／site）ずつ腫瘍内に注射した。投与は、癌細胞移植後１３日目から、１日おきに週３回（１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９および３１日目）行い、合計１０回投与した。その後、癌細胞移植後４６日目においてin vivo発光イメージング解析を行った。in vivoでの生物発光イメージングは、各マウスにＤ−luciferin（１５０ｍｇ／ｋｇ、Promega、Madison、ＷＩ）を腹腔内投与し、１０分後にＩＶＩＳイメージングシステム（Xenogen）を用いてホタルルシフェラーゼからのフォトン値（Photon/second、光子量）を計測した。データ解析には、LivingImage software（version ２．５０、Xenogen）を使用した。

図２４は、実施例９に係る、癌細胞移植後４６日目のマウスのin vivoにおける発光イメージングの様子を示す図である。それぞれのマウス６匹中、３匹ずつのin vivo発光イメージングの様子を示している。図２５は、実施例９に係る、癌細胞移植後４６日目のマウスにおけるフォトン値のデータを示す図である。該データは、それぞれの６匹を計測した結果からの、１匹当たりの平均フォトン値を示している。

図２６は、実施例９に係る、解剖した癌細胞移植後４６日目のマウスの臓器における発光イメージングの様子を示す図である。それぞれのマウス６匹中、１匹ずつの取り出した臓器の腫瘍の発光イメージングの様子を示している。それぞれ、Ｌ（Liver、肝臓）、Ｋ（Kindney、腎臓）、Ｓｐ（Spleen、脾臓）、Ｓｔ（Stomach、胃）およびＳｉ（Small intestine、小腸）の様子を示す。図２７は、実施例９に係る、解剖した癌細胞移植後４６日目のマウスの臓器におけるフォトン値のデータを示す図である。該データは、それぞれの解剖した６匹における前述した各臓器を計測した結果からの、１匹当たりの平均フォトン値を示している。図２４ないし図２７において、ＣｏｎｔｍｉＲはnegative control ｍｉＲＮＡを包含する複合体を投与したものを示し、ｍｉＲ−２２は二本鎖ｈｓａ−ｍｉＲ−２２を包含する複合体を投与したものを示す。

図２４および図２５に示すように、ＣｏｎｔｍｉＲと比較すると、ｍｉＲ−２２は、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１−ｌｕｃ−Ｄ３Ｈ２ＬＮ乳癌細胞によるホタルルシフェラーゼからの発光の広がりが小さく、１匹中の合計平均フォトン値も小さかった。すなわち、二本鎖ｈｓａ−ｍｉＲ−２２の投与によって、当該乳癌細胞の増殖および浸潤が抑制されていた。さらに、図２６および図２７に示すように、ＣｏｎｔｍｉＲと比較すると、ｍｉＲ−２２は、前述した各臓器のうちホタルルシフェラーゼによる発光が見られる臓器が少なく、やはり解剖した場合でも１匹中の合計平均フォトン値が小さかった。すなわち、二本鎖ｈｓａ−ｍｉＲ−２２の投与によって、当該乳癌細胞の増殖および浸潤、さらに転移までもが抑制されていた。

（実施例１０）
本実施例１０では、前述した実施例９でのin vivo乳癌転移モデルマウスにおける、免疫組織化学的な実施例について説明する。

実施例９において作製した、ＣｏｎｔｍｉＲ（negative control ｍｉＲＮＡを包含する複合体を投与したもの）およびｍｉＲ−２２（二本鎖ｈｓａ−ｍｉＲ−２２のｍｉＲＮＡと、ｊｅｔＰＥＩとの複合体を投与したもの）の乳癌転移モデルマウス（図２４ないし図２７参照）を使用し、in vivoでの腫瘍部位の切片に対し（in vivo−ｊｅｔＰＥＩ：Polyplus Transfection＝１：１）、ＳＡ−β−gal染色およびＨＥ（Hematoxylin-Eosin）染色を行った。なお、ＳＡ−β−gal染色の方法は前述した実施例２の方法と同様である。ＨＥ染色については、一般的な染色方法であるヘマトキシリンおよびエオジンによる染色、水洗、脱水、透徹および封入からなる方法と同様に行い、顕微鏡によって観察した。

図２８は、実施例１０に係る、腫瘍部位にin vivoにおいてＳＡ−β−gal染色およびＨＥ染色を行った様子を示す図である。図２８に示すように、negative control ｍｉＲＮＡのモデルマウスの方（ＣｏｎｔｍｉＲ）では、ＳＡ−β−gal法（ＳＡ−β−gal assay）およびＨＥ染色（ＨＥ staining）の結果を見ると、老化の誘導はあまり観察されなかった。しかし、二本鎖ｈｓａ−ｍｉＲ−２２を包含する複合体を投与したマウスの方（ｍｉＲ−２２）では、ＳＡ−β−gal法およびＨＥ染色の結果が示すように、老化の誘導が観察された。これらのin vivoにおける実験結果から、前述した実施例９での乳癌細胞の増殖、浸潤および転移の抑制は、細胞老化が誘導されたためであることがより強く示唆された。

（実施例１１）
本実施例１１では、MultiTox assayによって、二本鎖ｈｓａ−ｍｉＲ−２２を導入したＳｉＨａ細胞では、実施例１０の結果によって示唆されるよう、本当にアポトーシスを引き起こしていないのかどうかについて検証した。

当業者にとって一般的な方法でMultiTox assay（細胞毒性試験、Promega）を行い、同一ウェル内における蛍光強度および発光強度を測定した。なお、コントロールとしては、アポトーシスを誘導することが既知であるｍｉＲＮＡのｍｉＲ−３４ａおよびnegative control ｍｉＲＮＡを用いた。

図２９は、実施例１１に係る、MultiTox assayによる二本鎖ｈｓａ−ｍｉＲ−２２を導入したＳｉＨａ細胞の生細胞の結果のデータを示す図である。一方、図３０は、実施例１１に係る、MultiTox assayによる二本鎖ｈｓａ−ｍｉＲ−２２を導入したＳｉＨａ細胞の死細胞の結果のデータを示す図である。図２９に示すように、生細胞（Live cells）数を示す蛍光強度（Fluorescent intensity（×１０^３Ｕ））の結果から、二本鎖ｈｓａ−ｍｉＲ−２２（ｍｉＲ−２２）を導入したＳｉＨａ細胞の生細胞数は、アポトーシスを誘導するｍｉＲ−３４ａを導入したＳｉＨａ細胞の生細胞数よりも多く、negative control ｍｉＲＮＡ（ＣｏｎｔｍｉＲ）を導入したＳｉＨａ細胞の生細胞数との差が小さいことが確認できた。一方、図３０に示すように、死細胞（Dead cells）数を示す発光強度（Luminescent intensity（×１０^３Ｕ））の結果から、ｍｉＲ−２２を導入したＳｉＨａ細胞の死細胞数は、アポトーシスを誘導するｍｉＲ−３４ａを導入したＳｉＨａ細胞の死細胞数よりも少なく、ＣｏｎｔｍｉＲを導入したＳｉＨａ細胞の死細胞数との差が小さいことが確認できた。

（実施例１２）
本実施例１２でも、二本鎖ｈｓａ−ｍｉＲ−２２を導入したＳｉＨａ細胞では本当にアポトーシスを引き起こしていないのかどうかについて検証するため、ＴＵＮＥＬ染色法による実施例を行った。

ＤＡＰＩおよびＦＩＴＣ（fluorescein isothiocyanate）で染色し、蛍光顕微鏡を用いて観察した。ＳｉＨａ細胞の固定方法、これらの染色方法およびラベル化方法等は、実施例２にてヒト線維芽細胞において述べた方法と同様である。なお、コントロールとしては、実施例１１と同様のｍｉＲ−３４ａ、negative control ｍｉＲＮＡおよびpositive controlと比較した。

図３１は、実施例１２に係る、二本鎖ｈｓａ−ｍｉＲ−２２を導入したＳｉＨａ細胞にＴＵＮＥＬ染色法を行った様子を示す図である。図３１に示すように、ｍｉＲ−２２では、ＤＡＰＩおよびＦＩＴＣを用いた染色によって検出されたアポトーシス細胞が、ｍｉＲ−３４ａを導入したＳｉＨａ細胞およびＰＣ（positive control）を導入したＳｉＨａ細胞より少なかった。なお、MergeはそれぞれのＤＡＰＩとＦＩＴＣの画像を合成したものである。

前述した実施例の結果から、二本鎖ｈｓａ−ｍｉＲ−２２を包含する癌抑制剤は、アポトーシスが誘導された結果ではなく、（癌）細胞の老化が促進させられた結果により、癌の増殖、浸潤および転移を抑制することができるということが確認できた。さらに、この結果から、Ｐｒｅ−ｈｓａ−ｍｉＲ−２２またはヒト以外の他のｍｉＲ−２２の遺伝子転写物を有効成分として含む癌抑制剤であれば、同様の効果が得られることが示唆される。

本発明は、上記発明の実施の形態および実施例の説明に何ら限定されるものではない。特許請求の範囲の記載を逸脱せず、当業者が容易に想到できる範囲で種々の変形態様もこの発明に含まれる。

本明細書の中で明示した論文、公開特許公報および特許公報等の内容は、その全ての内容を援用によって引用することとする。

本出願は、２００９年１２月２１日に出願された日本国特許出願２００９−２８８７０７号、および、２０１０年３月５日に出願された日本国特許出願２０１０−０４９９２８号に基づく。本明細書中に、日本国特許出願２００９−２８８７０７号および日本国特許出願２０１０−０４９９２８号の、明細書、特許請求の範囲、図面全体を参照として取り込むものとする。

本発明によれば、検体の老化の程度（細胞老化等）を判断することができる老化マーカーが提供される。また、老化（細胞老化等）を抑制することができる物質を評価することができる老化抑制物質の評価、スクリーニング方法も提供される。さらには、当該老化マーカーを利用することによって、細胞を老化させ、癌の増殖、浸潤および／または転移を抑制することができる癌抑制剤も提供される。

Claims

ｍｉＲ−２２の遺伝子転写物を有効成分として含有し、細胞老化を促進させ、癌の浸潤および／または転移を抑制し、
胃癌用細胞老化促進剤、子宮癌用細胞老化促進剤、咽頭癌用細胞老化促進剤、乳癌用細胞老化促進剤、子宮頸癌用細胞老化促進剤および／または結腸癌用細胞老化促進剤であることを特徴とする、癌疾患用細胞老化促進剤。
子宮頸癌用細胞老化促進剤および／または乳癌用細胞老化促進剤であることを特徴とする、請求項１に記載の癌疾患用細胞老化促進剤。
前記ｍｉＲ−２２の遺伝子転写物は、配列番号１に記載の塩基配列からなるＲＮＡ、配列番号２に記載の塩基配列からなるＲＮＡ、および／または、配列番号３に記載の塩基配列からなるＲＮＡを含むことを特徴とする、請求項１または２に記載の癌疾患用細胞老化促進剤。
前記ｍｉＲ−２２の遺伝子転写物は、Ｐｒｅ−ｈｓａ−ｍｉＲ−２２、および／または、二本鎖ｈｓａ−ｍｉＲ−２２を含むことを特徴とする、請求項１または２に記載の癌疾患用細胞老化促進剤。