JP2008519606A - ｍｉＲＮＡおよびｍｉＲＮＡ阻害分子に関する方法および組成物 - Google Patents

ｍｉＲＮＡおよびｍｉＲＮＡ阻害分子に関する方法および組成物 Download PDF

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Abstract

本発明は、合成核酸分子を使用して、細胞にmiRNA活性または機能を導入する方法および組成物に関する。さらに、本発明は、合成miRNAおよび/またはmiRNA阻害剤がライブラリースクリーニングアッセイにおいて使用される、治療的、診断的、および予後診断的適用に関連性のある特定の細胞機能を有するmiRNAを同定するための方法および組成物に関する。

Description

1. 発明の分野
本発明は、本発明は、概して、分子生物学の分野に関する。より詳しくは、それは、マイクロRNA（miRNA）を刺激するかつmiRNAを阻害する核酸分子に関する方法および組成物に関係する。合成miRNAおよびmiRNA阻害分子に関する方法および組成物が記載される。加えて、細胞プロセスに寄与するmiRNAを同定するための方法および組成物も記載される。加えて、細胞プロセスに寄与するmiRNAの同定は、治療的介入ならびに診断および/または予後診断分析に対する標的を提供する。
本出願は、2005年5月23日出願の米国仮特許出願第60/683,736号、2004年11月12日出願の米国仮特許出願第60/627,171号、および2005年2月3日出願の米国仮特許出願第60/649,634号に対する優先権の恩典を主張し、そのすべては、参照により本明細書に組み入れられる。
2. 関連技術の説明
2001年、いくつかのグループが、C. エレガンス（C. elegans）、ショウジョウバエ（Drosophila）、およびヒトから「マイクロRNA」（miRNA）の大グループを単離しかつ同定するための新規のクローニング方法を使用した（Lagos-Quintana et al., 2001; Lau et al., 2001; Lee and Ambros, 2001）。数百のmiRNAが、植物および動物−ヒトを含む−（内因性siRNAを有するようには見えない）において同定されている。したがって、miRNAは、siRNAと類似であるが、それでもなお異なる。
したがって、ずっと観測されているmiRNAは、長さがおよそ21〜22ヌクレオチドであり、それらは非タンパク質コード遺伝子から転写されるより長い前駆体から生じる。Carrington et al. (2003)の概論を参照されたい。前駆体は、自己相補領域において互いに折り畳む構造を形成する；次いでそれらは、動物におけるDicerまたは植物におけるDCL1というヌクレアーゼよってプロセスされる。miRNA分子は、それらの標的との正確なまたは不正確な塩基対を介して翻訳を妨げる。
miRNAは、遺伝子調節に関与しているように見える。lin-4およびlet-7を含むいくつかのmiRNAは、標的mRNAの部分的に相補的な3'非翻訳領域（3' UTR）に結合することによって、タンパク質合成を阻害する。植物において見出されたScarecrow miRNAを含むその他は、siRNAのように機能し、標的転写を破壊するために、完全に相補的なmRNA配列に結合する（Grishok et al., 2001）。
マイクロRNAに関する研究は、科学者が、これらの分子が真核生物遺伝子発現の調節において果たす広範な役割を高く評価し始めているので、増加している。2つの最も良く理解されたmiRNA、lin-4およびlet-7は、主要なmRNAのファミリーの翻訳を調節することによって、C. エレガンスにおける発生のタイミングを調節する（Pasquinelli, 2002において概説される）。数百のmiRNAが、C. エレガンス、ショウジョウバエ、マウス、およびヒトにおいて同定されている。遺伝子発現を調節する分子に対して予期されるように、miRNAレベルは、組織と発生状態との間で変化することが示されている。加えて、1つの調査が、2つのmiRNAの低下した発現と慢性リンパ球性白血病との間の強い相関を示し、miRNAと癌との間の可能性のある結び付きを提供する（Calin, 2002）。分野はまだ若いが、miRNAが、より高等な真核生物における遺伝子発現を調節することにいて、転写因子と同じくらい重要であり得るという推測がある。
細胞分化、初期発生、ならびにアポトーシスおよび脂肪代謝などの細胞プロセスにおいて重大な役割を果たすmiRNAのいくつかの例がある。lin-4およびlet-7の両方は、C. エレガンス発生の間の一つの幼虫状態から別の状態への経過を調節する（Ambros, 2003）。mir-14およびbantamは、明らかにアポトーシスに関する遺伝子の発現を調節することによって細胞死を調節するショウジョウバエmiRNAである（Brennecke et al., 2003、Xu et al., 2003）。miR14は、脂肪代謝にも関与している（Xu et al., 2003）。Lsy-6およびmiR-273は、化学感覚神経における非対称性を調節するC. エレガンスmiRNAである（Chang et al., 2004）。細胞分化を調節する別の動物miRNAは、miR-181であり、造血細胞分化を誘導する（Chen et al., 2004）。これらの分子は、公知の機能を有する動物miRNAの全範囲を示す。miRNAの機能の強化された理解は、正常発生、分化、細胞間および細胞内コミュニケーション、細胞サイクル、血管形成、アポトーシス、ならびに多くのその他の細胞プロセスに寄与する調節性ネットワークを疑いなく明らかにすると思われる。多くの生物学的機能におけるそれらの重要な役割を鑑みて、miRNAは、治療的介入または診断分析に対する重要なポイントを提示する可能性が高い。
miRNAなどの生体分子の機能を特徴付けることは、分子を細胞に導入することまたは細胞から分子を除去することおよび結果を測定することにしばしば関する。miRNAを細胞に導入することがアポトーシスを引き起こす場合、次いで、そのmiRNAは、アポトーシス経路に疑いなく関与する。細胞からmiRNAを導入するおよび除去するための方法は、記載されている。2つの最近の刊行物は、特定のmiRNAの活性を阻害するために使用され得るアンチセンス分子を記載する（Meister et al., 2004; Hutvagner et al., 2004）。別の刊行物は、内因性RNAポリメラーゼによって転写されかつ細胞にトランスフェクトされる場合に特定のmiRNAを産出するプラスミドの使用を記載する（Zeng et al., 2002）。これらの2つの試薬セットは、単一miRNAを評価するために使用されている。
プラスミドに基づくmiRNA発現システムの限定は、プラスミドに対するトランスフェクション効率が非常に低くなりがちであり、細胞のおよそ50％のみが、トランスフェクトしやすい細胞においてプラスミドからRNAを発現する。初代細胞におけるプラスミドに対するトランスフェクション効率はさらに低く、10％よりも低い細胞が、望ましいRNAを典型的に発現する。それ故に、特徴付けされかつ調査され得るように、miRNA分子を細胞に導入するための代替組成物および方法が必要とされる。
発明の概要
本発明は、様々な生物学的プロセスにおける役割を特徴付けるために、miRNAのように機能するまたは細胞における一つまたは複数のmiRNAの活性を阻害する一つまたは複数の核酸の細胞への導入に関する本発明者らの調査に基づく。本発明は、細胞に導入される場合に、内因性miRNAの活性を行う核酸に関係する。これらの核酸は、いくつかの態様において、合成miRNAである。本発明は、細胞プロセスに関与するmiRNAを同定する目的のために、インビトロまたはインビボで逐次的にまたは組み合わせにおいて一つまたは複数のmiRNAを細胞に導入するために使用され得る様々な公知のmiRNAに特異的な合成miRNAのライブラリーにさらに関係する。本発明は、細胞における一つまたは複数のmiRNAの活性を逐次的にまたは組み合わせにおいて阻害するために使用され得る配列特異的miRNA阻害剤のライブラリーにさらに関する。miRNA特異的試薬の2つのライブラリーは、細胞におけるmiRNAの役割を定義するために、特定のmiRNAまたはmiRNAの組み合わせを導入するまたは排除するために使用される。
「miRNA」という用語は、その普通かつ単純な意味に従って使用され、真核生物において見出され、RNAに基づく遺伝子調節に関与するマイクロRNA分子を指す。例えば、参照により本明細書に組み入れられるCarrington et al., 2003を参照されたい。その用語は、前駆体からプロセスされる一本鎖RNA分子を指すために使用される。個々のmiRNAは、異なる生物体において同定されかつシークエンスされており、それらには名称が与えられている。miRNAの名称およびそれらの配列は、本明細書において提供される。付加的に、その他のmiRNAは、当業者にとって公知であり、本発明の態様において簡単に遂行され得る。方法および組成物は、必ずしも本発明の限定としてではなく、例として提供されるので、本出願において同定されるmiRNAに限定されるべきではない。
本発明は、本発明のいくつかの態様において、細胞においてmiRNAとしてまたはmiRNAの阻害剤として機能する短い核酸分子に関係する。「短い」という用語は、150ヌクレオチド以下である単一ポリヌクレオチドの長さを指す。核酸分子は、合成的である。「合成的」という用語は、核酸分子が、単離されかつ内因性前駆体miRNA分子などの天然の核酸分子と配列（全配列）および/または化学的構造において同一ではないことを意味する。いくつかの態様において、本発明の核酸は、天然の核酸の配列と同一である全配列を有しないが、そのような分子は、天然の配列のすべてまたは一部を包含し得る。しかしながら、細胞に投与される合成核酸は、その構造または配列が成熟miRNA配列などの非合成または天然の核酸と同じであるように、細胞において実質的に修飾または変更され得ることが意図される。例えば、合成核酸は、前駆体miRNAの配列と異なる配列を有し得るが、その配列は、内因性プロセスmiRNAと同じであるように細胞においてひとたび変更され得る。「単離される」という用語は、単離核酸の集団が、少なくとも約90％均質であり、かつその他のポリヌクレオチド分子に対して少なくとも約95、96、97、98、99、または100％均質であり得るように、本発明の核酸分子が、異なる（配列または構造の点から）かつ不要な核酸分子から初めに分離されることを意味する。本発明の多くの態様において、核酸は、それを細胞における内因性核酸とは別個にインビトロで合成することによって単離される。しかしながら、単離核酸は、その後、一緒に混合されかつプールされ得ることが理解されると思われる。
当然、本発明の「合成核酸」は、核酸が天然の核酸の化学的構造または配列を有しないことを意味することが理解される。結果として、「合成miRNA」という用語は、天然のmiRNAとして細胞においてまたは生理学的条件下で機能する「合成核酸」を指すことが理解されると思われる。
本発明の態様の多くが、合成miRNAまたは合成核酸に関するが、本発明のいくつかの態様において、核酸分子は、「合成的」である必要はない。特定の態様において、本発明の方法および組成物において使用される非合成miRNAは、天然のmiRNA前駆体または成熟miRNAの全配列および構造を有し得る。例えば、本発明の方法および組成物において使用される非合成miRNAは、一つまたは複数の修飾ヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体を有しない場合もある。これらの態様において、非合成miRNAは、組換え的に産生される場合もありまたはそうでない場合もある。特定の態様において、本発明の方法および/または組成物における核酸は、特異的に合成miRNAであり、非合成miRNA（すなわち、「合成的」とみなすmiRNAではない）ではない；その他の態様において、本発明は、非合成miRNAに特異的に関連し、合成miRNAには関連しない。合成miRNAの使用に関して議論される任意の態様は、非合成miRNAに対して適用されてもよく、逆の場合も同じである。
「天然の」という用語は、人間による任意の介入なしに生物体において見出されるものを指すことが理解されると思われる；それは、天然の野生型または突然変異分子を指し得ると考えられる。いくつかの態様において、合成miRNA分子は、天然のmiRNA分子の配列を有しない。その他の態様において、合成miRNA分子は、天然のmiRNA分子の配列を有し得るが、分子の化学的構造は、特に正確な配列に具体的に無関係な部分（非配列化学的構造）において、その配列を有する天然のmiRNAの化学的構造と異なる。いくつかの場合において、合成miRNAは、天然のmiRNAにおいて見出されない配列および非配列化学的構造の両方を有する。さらに、合成分子の配列は、どのmiRNAが有効に提供されるまたは阻害されるかを同定する；内因性miRNAは、「対応するmiRNA」と呼ばれる。本発明との関連で使用され得る対応するmiRNA配列は、SEQ ID NO：1〜593における配列および付録に列挙するmiRNAを含むが、それらに限定されない。加えて、本発明の合成核酸は、SEQ ID NO：594〜703ならびに任意のその他のmiRNA配列、miRNA前駆体配列、またはその相補的な任意の配列を含み得る。いくつかの態様において、配列は、付録において同定されるプローブ配列であるかまたはそれに由来し、プローブ配列とともに使用され得る特定のmiRNA（またはmiRNAのセット）を標的にする。
本発明の合成miRNAは、本発明のいくつかの態様において、RNAまたはRNA類似体である。miRNA阻害剤は、DNAもしくはRNA、またはその類似体であり得る。本発明のmiRNAおよびmiRNA阻害剤は、まとめて「合成核酸」と呼ばれる。
いくつかの態様において、17〜130残基の長さを有する合成miRNAがある。本発明は、長さが少なくとももしくは多くとも15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、もしくは130残基、またはそこに導き出せる任意の範囲である合成miRNA分子に関係する。
特定の態様において、合成miRNAは、a）5'から3'までの配列が成熟miRNA配列と同一である「miRNA領域」、およびb）5'から3'までの配列がmiRNA配列と60％〜100％相補的である「相補領域」を有する。特定の態様において、これらの合成miRNAは、上で定義されるように単離もされる。「miRNA領域」という用語は、成熟天然miRNA配列の全配列と少なくとも90％同一である合成miRNA上の領域を指す。特定の態様において、miRNA領域は、天然のmiRNAの配列と少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、99.1、99.2、99.3、99.4、99.5、99.6、99.7、99.8、99.9、または100％同一である。
「相補領域」という用語は、miRNA領域が同一である成熟天然miRNA配列と少なくとも60％相補的である合成miRNAの領域を指す。相補領域は、少なくとも60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、99.1、99.2、99.3、99.4、99.5、99.6、99.7、99.8、99.9、もしくは100％相補的である、またはそこに導き出せる任意の範囲で相補的である。単一ポリヌクレオチド配列とともに、miRNA領域と相補領域との間の化学結合の結果として、ヘアピンループ構造がある。その他の態様において、相補領域は、miRNA領域と異なる核酸分子上にあり、この場合、相補領域は、相補鎖上にあり、miRNA領域は、活性鎖（active strand）上にある。
本発明のその他の態様において、miRNA阻害剤である合成核酸がある。miRNA阻害剤は、長さが約17〜25ヌクレオチドであり、かつ成熟miRNAの5'〜3'配列と少なくとも90％相補的な5'〜3'配列を含む。特定の態様において、miRNA阻害分子は、長さが17、18、19、20、21、22、23、24、もしくは25ヌクレオチド、またはそこに導き出せる任意の範囲である。さらに、miRNA阻害剤は、成熟miRNA、特に成熟天然miRNAの5'〜3'配列と少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、99.1、99.2、99.3、99.4、99.5、99.6、99.7、99.8、99.9、もしくは100％相補的である、またはそこに導き出せる任意の範囲で相補的である配列（5'から3'まで）を有する。miRNAに対するプローブ配列は、付録において開示される。それらは、miRNA阻害剤よりも長い配列を有するが、当業者は、miRNA阻害剤に対する配列として、成熟miRNAの配列と相補的であるプローブ配列の部分を使用し得ると考えられる。表1は、miRNAの成熟配列が何であるかを示す。さらに、プローブ配列のその部分は、なおも成熟miRNAの配列と90％相補的であるように、変更され得る。
本発明のいくつかの態様において、合成miRNAは、一つまたは複数のデザイン要素を含む。これらのデザイン要素は、i）相補領域の5'末端におけるヌクレオチドのリン酸もしくはヒドロキシルに対する置換基；ii）相補領域の最初もしくは最後の1〜6残基における一つもしくは複数の糖修飾；またはiii）相補領域の3'末端の最後の1〜5残基における一つもしくは複数のヌクレオチドとmiRNA領域の対応するヌクレオチドとの間の非相補性を含むが、それらに限定されない。
特定の態様において、合成miRNAは、相補領域のその5'末端に、リン酸および/またはヒドロキシル基が別の化学基で置換されているヌクレオチドを有する（「置換デザイン」と呼ばれる）。いくつかの場合において、リン酸基が置換され、その他の場合において、ヒドロキシル基が置換されている。特定の態様において、置換基は、ビオチン、アミン基、低級アルキルアミン基、アセチル基、2'O-Me（2'酸素-メチル）、DMTO（酸素を有する4,4'-ジメトキシトリチル）、フルオレセイン、チオール、またはアクリジンであるが、その他の置換基は、当業者にとって周知であり、同様に使用され得る。このデザイン要素は、miRNA阻害剤とともに使用されてもよい。
付加的な態様は、相補領域の最初または最後の1〜6残基における一つまたは複数の糖修飾を有する合成miRNAに関係する（「糖置換デザイン」と呼ばれる）。特定の場合において、相補領域の最初の1、2、3、4、5、6、もしくはそれより多くの残基、またはそこに導き出せる任意の範囲における、一つまたは複数の糖修飾がある。付加的な場合において、相補領域の最後の1、2、3、4、5、6、もしくはそれより多くの残基、またはそこに導き出せる任意の範囲における、一つまたは複数の糖修飾があり、糖修飾を有する。「最初」および「最後」という用語は、領域の5'末端から3'末端の残基の順番に関するものであることが理解されると思われる。特定の態様において、糖修飾は、2'O-Me修飾である。さらなる態様において、相補領域の最初もしくは最後の2〜4残基または相補領域の最初もしくは最後の4〜6残基における一つまたは複数の糖修飾がある。このデザイン要素は、miRNA阻害剤とともに使用されてもよい。したがって、miRNA阻害剤は、上で議論されるように、5'末端におけるヌクレオチド上に、このデザイン要素および/または置換基を有し得る。
本発明のその他の態様において、相補領域の3'末端の最後の1〜5残基における一つまたは複数のヌクレオチドがmiRNA領域の対応するヌクレオチドと相補的ではない（「非相補性」）合成miRNAがある（「非相補性デザイン」と呼ばれる）。非相補性は、相補的miRNAの最後の1、2、3、4、および/または5残基にあり得る。特定の態様において、相補領域において少なくとも2つのヌクレオチドによる非相補性がある。
本発明の合成miRNAは、置換、糖修飾、または非相補性デザインの一つまたは複数を有することが意図される。特定の場合において、合成RNA分子は、それらの2つを有するが、その他の場合において、これらの分子は、適所に3つすべてのデザインを有する。
miRNA領域および相補領域は、同じまたは別個のポリヌクレオチド上にあり得る。それらが同じポリヌクレオチド上または内に含まれる場合、miRNA分子は、単一ヌクレオチドと考えられる。異なる領域が別個のポリヌクレオチド上にある態様において、合成miRNAは、2つのポリヌクレオチドからなると考えられる。
RNA分子が単一ポリヌクレオチドである場合、miRNA領域と相補領域との間にリンカー領域がある。いくつかの態様において、単一ポリヌクレオチドは、miRNA領域と相補領域との間の結合の結果としてヘアピンループ構造を形成することが可能である。リンカーは、ヘアピンループを構成する。いくつかの態様において、リンカー領域は、長さが少なくとももしくは多くとも2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、もしくは40残基、またはそこに導き出せる任意の範囲であることが意図される。特定の態様において、リンカーは、長さが3〜30残基（両端の数値を含む）である。
miRNA領域および相補領域を有することに加えて、領域の5'または3'末端のいずれかにさらにフランキング配列があり得る。いくつかの態様においては、これらの領域の片側または両側に隣接する、少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10ヌクレオチドもしくはそれより多く、またはそこに導き出せる任意の範囲が存在する。
本発明は、ライブラリーと呼ばれる合成核酸分子の収集にも関係する。収集は、少なくともまたは多くとも
Figure 2008519606
またはそれより多くの核酸の異なる型（構造および/または配列による）を含み得る。ライブラリーは、合成miRNAおよび/またはmiRNA阻害剤を含み得る。
本発明の核酸を使用するライブラリーおよび方法に関する態様は、miRNAおよびmiRNA阻害剤に適用され得る。したがって、本発明の核酸に関して議論される任意の態様は、概してmiRNAおよびmiRNA阻害分子に適用可能であってもよく、逆の場合も同じである。さらに、miRNAに関して議論される態様は、miRNA阻害剤に適用されてもよく、逆の場合も同じである。
本発明は、細胞におけるmiRNA活性または機能を特徴付けする方法にも関係する。いくつかの態様において、方法は、a）合成miRNA分子を一つまたは複数の細胞に導入する段階；およびb）RNA分子を有する細胞の一つまたは複数の特徴を、合成miRNAが導入されていない細胞と比較する段階を含む。特定の態様において、合成miRNAを有する細胞は、異なる分子（miRNA領域を含まないまたは異なるmiRNAに対するmiRNA領域を有する陰性対照など）が導入された細胞と比較され得る。比較される細胞は、同時に評価される必要がないことが意図される。実際は、比較細胞は、同時に培養されている必要はない；報告または以前の観測を参照されたい。
その他の方法は、a）miRNA阻害剤を細胞に導入する段階を含む、細胞から一つまたは複数のmiRNAの活性を低下させるまたは消失させることを含む。特定の態様において、方法は、miRNA阻害剤を有する細胞の一つまたは複数の特徴を、miRNA阻害剤を有しない細胞と比較することも含む。
上でおよび本明細書において議論される合成核酸は、本発明の方法において使用され得る。したがって、特定の態様において、方法は、それらにおいて異なるデザインを有する合成核酸に関する。
評価され得る細胞の特徴は、限定されない。それらは、以下の特徴および以下に関連する特徴を含む：細胞増殖、分裂指数、細胞周期、アポトーシス、運動性、接着、シグナル伝達、タンパク質局在、遺伝子発現、RNA局在、細胞分裂、DNA複製、翻訳後修飾、分化、脱分化、転写活性化、タンパク質活性化、血管形成、代謝（エネルギー産生および/または消費）、タンパク質分解、クロマチン凝縮、微小管産生、DNA複製、組換え、およびDNA修復機能。これらの特徴は、細胞（例えば、低下した全体のタンパク質産生）または細胞における個々の種（例えば、特定のタンパク質の誘導）に全体的に関連性があり得る。
この方法が、別個のまたは同じ細胞における様々な異なる合成および/または非合成miRNAに対して適用され得ることが意図される。いくつかの場合において、以下の数の異なる合成miRNA分子が、異なる細胞に導入され得る：
Figure 2008519606
もしくはそれより多く、またはそこに導き出せる任意の範囲（または少なくとももしくは多くともこれらの数）。本発明は、細胞型によって限定されない。miRNAを発現する任意の細胞またはmiRNAによって変更された特徴を有する任意の細胞が、本発明の方法および組成物に従うことが意図される。二つ以上のmiRNAの使用は、カクテルとして単一の薬学的組成物において組み合わせられ得る、または本発明の任意の治療的、診断的、もしくは予後診断的方法において使用され得る。本発明の方法が、少なくとももしくは多くとも
Figure 2008519606
もしくはそれより多くの、またはそこに導き出せる任意の範囲の異なるmiRNAに対応する核酸分子を含み得ることが意図される。そのような核酸分子は、合成miRNA分子、非合成miRNA分子、およびmiRNA阻害剤を含む。
いくつかの態様において、細胞が特定のmiRNAを内因的に発現するかどうか、またはそのような発現が特定の条件下で影響を受けるかどうか、またはそれはいつ特定の疾患状態にあるのかを知ることは有用であり得る。したがって、本発明のいくつかの態様において、方法は、有効に合成miRNA分子によって導入されているまたはmiRNA阻害剤によって阻害されているmiRNAの存在に対して細胞をアッセイする段階を含む。結果として、いくつかの態様において、方法は、試料に対するmiRNAプロファイルを生成する段階を含む。「miRNAプロファイル」という用語は、試料における複数のmiRNAに対する発現パターンに関するデータのセットを指す；miRNAプロファイルは、miRNAアレイを使用して得られうることが意図される。本発明のいくつかの態様において、miRNAプロファイルは、以下を含む段階によって生成される：a）試料におけるmiRNAを標識する段階；b）miRNAをmiRNAアレイにハイブリダイズさせる段階；およびc）アレイへのmiRNAハイブリダイゼーションを決定し、miRNAプロファイルが生成される段階。すべて参照により本明細書に組み入れられる、米国仮特許出願第60/575,743号および米国仮特許出願第60/649,584号、ならびに米国特許出願第11/141,707号を参照されたい。
付加的に、合成miRNAまたはmiRNA阻害剤を導入される細胞は、その後、内因性または外因性miRNAまたはmiRNA阻害剤の量に対して評価またはアッセイされ得る。任意の細胞型は、本発明との使用に対して意図される。細胞は、サル、ウマ、ウシ、ブタ、ヒツジ、イヌ、ネコ、ウサギ、マウス、ラット、またはヒトなどの、哺乳動物由来または哺乳動物のものであり得る。
本発明のその他の方法において、合成RNA分子を合成するまたは取得する段階が含まれる。
付加的な態様において、合成核酸は、リン酸カルシウムトランスフェクション、脂質トランスフェクション、電気穿孔法、マイクロインジェクション、またはインジェクションによって細胞に導入される。加えて、細胞は、患者または動物モデルであり得る被験体におけるものであってもよい。この場合において、合成核酸は、特に治療的適用に対する、当業者にとって周知である投与の様式を使用して、被験体または患者に投与され得る。患者が、ヒトまたは任意のその他の哺乳動物またはmiRNAを有する動物であることが特に意図される。
本発明は、特定の合成miRNA分子または合成miRNA阻害分子などの特定の核酸を細胞に提供することによって特定の細胞特徴を誘導することにも関係する。しかしながら、本発明の方法において、miRNA分子またはmiRNA阻害剤は、合成的である必要はない。それらは、天然のmiRNAと同一である配列を有する場合もありまたは任意のデザイン修飾を有しない場合もある。特定の態様において、miRNA分子および/またはmiRNA阻害剤は、上で議論されるように、合成的である。
細胞に提供される特定の核酸分子は、細胞における特定のmiRNAに対応すると理解されており、したがって、細胞におけるmiRNAは、「対応するmiRNA」と呼ばれる。名付けられたmiRNA分子が細胞に導入される状況において、対応するmiRNAは、誘導miRNAであると理解されると思われる。しかしながら、細胞に導入される提供されるmiRNA分子は、成熟miRNAではなく、適当な生理学的条件下で成熟miRNAになることが可能であることが意図される。特定の対応するmiRNAがmiRNA阻害剤によって阻害されている場合において、特定のmiRNAは、標的miRNAと呼ばれると思われる。複数の対応するmiRNAが関与し得ることが意図される。特定の態様において、複数のmiRNA分子が、細胞に導入される。さらに、その他の態様において、複数のmiRNA阻害剤が、細胞に導入される。さらに、miRNA分子とmiRNA阻害剤との組み合わせが、細胞に導入され得る。
方法は、それらの細胞特徴を誘導することを必要とする細胞または患者を同定する段階を含む。細胞または生物体に提供される合成核酸の量が、特定の細胞特徴を誘導することなどの望ましい目標を達成するために必要とされる量を指す「有効量」であることも理解されると思われる。
特定の態様において、方法は、望ましい生理学的結果を達成するのに有効な量で、細胞における成熟miRNAに対応する核酸分子を細胞に提供するまたは導入する段階を含む。そのような方法は、本明細書において開示される。さらに、本発明の方法は、miRNA発現プロファイルに基づいて患者を診断することに関する。特定の態様において、細胞における特定のmiRNAの発現のレベルにおける上昇または低下は、正常細胞におけるそのmiRNAの発現レベルと比較して、疾患状態と相関がある。miRNAの発現レベルが、査定される生物学的試料において測定され、次いで正常細胞の発現レベルと比較される場合に、この相関によって診断方法の実施が可能になる。
これらの異なる方法において、方法に関する対応するmiRNAは、少なくとも以下の一つまたは複数であり得る。
Figure 2008519606
さらに、方法は、合成または非合成miRNA分子を提供することに関し得る。これらの態様において、方法は、一つもしくは複数の合成miRNA分子のみまたは一つもしくは複数の非合成miRNA分子のみを提供することに限定される場合もありまたは限定されない場合もある。したがって、特定の態様において、方法は、合成および非合成miRNA分子の両方を提供することに関し得る。この状況において、細胞または複数の細胞には、特定のmiRNAに対応する合成miRNA分子および異なるmiRNAに対応する非合成miRNA分子が提供される可能性が非常に高い。さらに、マーカッシュ（Markush）グループの文言を使用してmiRNAのリストを明確に示した任意の方法は、むしろマーカッシュグループの文言および離接語（すなわち、または（or））なしで明確に示すことができ、逆の場合も同じである。
いくつかの態様において、i）miRNA阻害分子またはii）miRNA配列に対応する合成もしくは非合成miRNA分子の有効量を細胞に導入するまたは提供する段階を含む、細胞における細胞増殖を低下させるまたは阻害するための方法がある。特定の態様において、方法は、i）mir-31、mir-92、mir-99a、mir-100、mir-125a、mir-129、mir-130a、mir-150、mir-187、miR-190、miR-191、miR-193、miR 204、mir-210、mir-211、mir-212、mir-213、mir-215、mir-216、mir-217、mir 218、mir-224、mir-292、mir-294、mir-320、mir-324、mir-325、mir-326、mir-330、mir-331、mir-338、mir-341、mir-369、およびmir-370からなる群より選択される成熟miRNAの5'〜3'配列と少なくとも90％相補的な5'〜3'配列を有するmiRNA阻害分子；またはii）miR-15a、miR-16、miR 21、miR 24、miR-96、miR-101、miR-105、miR-124、miR-126、miR-142、miR-147、miR-192、miR-194、miR-206、miR-215、もしくはmiR-346からなる群より選択されるmiRNA配列に対応する合成もしくは非合成miRNA分子の有効量を細胞に導入することに関する。
加えてまたはあるいは、miRNA阻害分子（i）が選ばれ得る群には以下のいずれかが含まれ得る：Let-7a、Let-7b、Let-7c、Let-7d、Let-7g、miR-7、mir-9、miR-10a、miR-10b、miR-18、miR-19a、miR-17-3p、miR-20、miR-23b、mir-25、miR-26a、miR-26a、mir-30e-5p、mir-31、mir-32、mir-92、mir-93、miR-100、miR-125a、miR-125b、mir-127、miR-128、miR-129、mir-130a、mir-135、mir-138、mir-139、miR-140、mir-141、mir-143、mir-145、mir-146、miR-150、mir-154、mir-155、mir-181a、miR-182、mir-186、miR-187、miR-188、mir-190、mir-191、mir-193、mir-196、mir-197、mir-198、mir-199、mir-201、mir-204、mir-216、mir-218、miR-223、mir-293、miR-291-3p、miR-294、miR-295、miR-322、mir-333、mir-335、mir-338、mir-341、mir-350、mir-369、miR-373、mir-410、およびmir-412。加えてまたはあるいは、miRNA配列に対応するmiRNA分子（ii）が選ばれ得る群には以下のいずれかが含まれ得る：let7a-1、Let-7a、Let-7b、let7b-1、let7c、let7d、Let-7g、mir-9、mir-10a、mir-10b、mir-15a、mir-16、mir-21、mir-23a、mir-23b、mir-24、mir-25、mir-92、mir-95、mir-133a、mir-133a-2、mir-133b、mir-142、mir-152、mir-153、mir-155、mir-181a、mir-182、mir-183、mir-184、mir-186、mir-187、mir-191、mir-193、mir-194、mir-196、mir-199a-1、mir-200b、mir-204、mir-206、mir-211、mir-222、mir-223、mir-298、mir-328、mir-342、mir-371、およびmir-412。
言い換えると、方法は、
Figure 2008519606
である対応するmiRNAの5'〜3'配列と少なくとも90％相補的な配列を有する合成miRNA阻害剤を提供することに関する。あるいはまたは付加的に、方法は、miR-15a、miR-16、miR 21、miR 24、miR-96、miR-101、miR-105、miR-124、miR-126、miR-142、miR-147、miR-192、miR-194、miR-206、miR-215、miR-346、let7a-1、Let-7a、Let-7b、let7b-1、let7c、let7d、Let-7g、mir-9、mir-10a、mir-10b、mir-15a、mir-16、mir-21、mir-23a、mir-23b、mir-24、mir-25、mir-92、mir-95、mir-133a、mir-133a-2、mir-133b、mir-142、mir-152、mir-153、mir-155、mir-181a、mir-182、mir-183、mir-184、mir-186、mir-187、mir-191、mir-193、mir-194、mir-196、mir-199a-1、mir-200b、mir-204、mir-206、mir-211、mir-222、mir-223、mir-298、mir-328、mir-342、mir-371、またはmir-412に対応する合成または非合成miRNA分子を提供することに関する。細胞増殖を低下させるまたは阻害するための方法は、癌などの過剰増殖性疾患を含むがそれらに限定されない疾患および病態に対する処置として使用され得る。
本発明は、i）miRNA阻害分子またはii）miRNA配列に対応する合成もしくは非合成miRNA分子の有効量を細胞に導入するまたは提供する段階を含む、細胞における細胞増殖を誘導するまたは増加させるための方法にも関係する。特定の態様において、方法は、i）let7a-1、Let-7a、Let-7b、let7b-1、let7c、let7d、Let-7g、mir-9、mir-10a、mir-10b、mir-15a、mir-16、mir-21、mir-23a、mir-23b、mir-24、mir-25、mir-92、mir-95、mir-133a、mir-133a-2、mir-133b、mir-142、mir-152、mir-153、mir-155、mir-181a、mir-182、mir-183、mir-184、mir-186、mir-187、mir-191、mir-193、mir-194、mir-196、mir-199a-1、mir-200b、mir-204、mir-206、mir-211、mir-222、mir-223、mir-298、mir-328、mir-342、mir-371、およびmir-412に対応するmiRNA阻害剤；またはii）Let-7a、Let-7b、Let-7c、Let-7d、Let-7g、miR-7、mir-9、miR-10a、miR-10b、miR-15a、miR-18、miR-19a、miR-17-3p、miR-20、miR-23b、mir-25、miR-26a、miR-26a、mir-30e-5p、mir-31、mir-32、mir-92、mir-93、miR-100、miR-125a、miR-125b、miR-126、mir-127、miR-128、miR-129、mir-130a、mir-135、mir-138、mir-139、miR-140、mir-141、mir-143、mir-145、mir-146、miR-150、mir-154、mir-155、mir-181a、miR-182、mir-186、miR-187、miR-188、mir-190、mir-191、mir-193、mir-194、mir-196、mir-197、mir-198、mir-199、mir-201、mir-204、mir-216、mir-218、miR-223、mir-293、miR-291-3p、miR-294、miR-295、miR-322、mir-333、mir-335、mir-338、mir-341、mir-350、mir-369、miR-373、mir-410、およびmir-412に対応するmiRNA分子の有効量を細胞に導入するまたは提供することに関する。あるいはまたは付加的に、miRNA阻害剤の群は、miR-15a、miR-16、miR 21、miR 24、miR-96、miR-101、miR-105、miR-124、miR-126、miR-142、miR-147、miR-192、miR-194、miR-206、miR-215、またはmiR-346を含み、miRNAに対応するmiRNA分子の群は、mir-31、mir-92、mir-99a、mir-100、mir-125a、mir-129、mir-130a、mir-150、mir-187、miR-190、miR-191、miR-193、miR 204、mir-210、mir-211、mir-212、mir-213、mir-215、mir-216、mir-217、miR 218、mir-224、mir-292、mir-294、mir-320、mir-324、mir-325、mir-326、mir-330、mir-331、mir-338、mir-341、mir-369、およびmir-370を含む。
そのような方法は、創傷、熱傷、虚血、または細胞増殖が望ましい任意のその他の病態、疾患、もしくは症状の処置に対して使用され得る。
本発明の方法において、細胞または生物体（患者を含む）などのその他の生物学的物体（biological matter）には、ひとたび細胞の内部に入ると対応するmiRNAとして機能する核酸分子を細胞または生物体に投与することによって、miRNAまたは特定のmiRNAに対応するmiRNA分子が提供され得ることが理解されると思われる。細胞に提供される分子の形態は、ひとたび細胞の内部に入るとmiRNAとして作用するといった形態ではない場合もある。したがって、いくつかの態様において、生物学的物体には、ひとたび細胞のmiRNAプロセシング機構へのアクセスを有すると成熟および活性miRNAにプロセスされるものなどの、合成miRNAまたは非合成miRNAが提供されることが意図される。特定の態様において、生物学的物体に提供されるmiRNA分子は、成熟miRNA分子ではなく、ひとたびmiRNAプロセシング機構にアクセス可能であると成熟miRNAにプロセスされ得る核酸分子であることが具体的に意図される。miRNAとの関連で「非合成的」という用語は、miRNAが、本明細書において定義されるような「合成的」ではないことを意味する。さらに、合成miRNAの使用に関係する本発明の態様において、対応する非合成miRNAの使用も、本発明の局面とみなされることが意図され、逆の場合も同じである。
その他の態様において、方法は、i）miRNA阻害分子またはii）miRNA配列に対応する合成もしくは非合成miRNA分子の有効量を細胞に導入するまたは提供する段階を含む、細胞生存率を低下させることに関する。特定の態様において、方法は、i）miR-107、miR-133、miR-137、miR-152、miR-155、miR-181a、miR-191、miR-203、もしくはmiR-215に対応するmiRNA阻害剤；またはii）let-7a、let-7b、mir-1、mir-7、miR-10b、miR-17-3p、miR-19a、mir-23、mir-24、mir-27a、miR-29a、miR-30a-3p、mir-31、mir-32、miR-34a、miR-101、miR-107、miR-108、miR-122、mir-124、miR-133a、miR-134、miR-135、miR-139、mir-140、miR-141、miR-145、mir-150、mir-192、mir-193、mir-195、mir-206、mir-208、mir-210、mir-210、mir-292-3p、mir-293、mir-297、mir-299、mir-329、mir-337、mir-337、mir-345、mir-346、およびmir-409に対応するmiRNA分子の有効量を一つまたは複数の細胞に導入することに関する。あるいはまたは付加的に、miRNA阻害剤の群（群i）は、let-7a、let-7b、let-7c、let-7d、let-7g、miR-10a、miR-10b、miR-15a、miR-17-3p、miR-18、miR-19a、miR-20、mir-23a、mir-23b、mir-24、miR-25、miR-26a、mir-32、miR-107、miR-125a、miR-126、mir-128、miR-129、miR-133、miR-137、mir-139、miR-143、miR-152、miR-155、miR-181a、miR-182、miR-191、miR-203、miR-215、およびmir-331を含む。
本発明のその他の局面は、i）miRNA阻害分子またはii）miRNA配列に対応する合成もしくは非合成miRNA分子の有効量を細胞に導入するまたは提供する段階を含む、細胞生存率を増加させるための方法を含む。特定の態様において、方法は、i）miR-7、miR-19a、miR-23、miR-24、miR-27a、miR-31、miR-32、miR-134、miR-140、miR-150、miR-192、もしくはmiR-193に対応するmiRNA阻害剤；またはii）let-7a、let-7b、let-7c、let-7d、let-7g、miR-10a、miR-10b、miR-15a、miR-17-3p、miR-18、miR-19a、miR-20、mir-23a、mir-23b、mir-24、miR-25、miR-26a、mir-32、miR-107、miR-125a、miR-126、mir-128、miR-129、miR-133、miR-137、mir-139、miR-143、miR-152、miR-155、miR-181a、miR-182、miR-191、miR-203、miR-215、およびmir-331に対応するmiRNA分子の有効量を一つまたは複数の細胞に導入することに関する。あるいはまたは付加的に、miRNA阻害剤の群（群i）は、let-7a、let-7b、mir-1、mir-7、miR-10b、miR-17-3p、miR-19a、mir-23、mir-24、mir-27a、miR-29a、miR-30a-3p、mir-31、mir-32、miR-34a、miR-101、miR-107、miR-108、miR-122、mir-124、miR-133a、miR-134、miR-135、miR-139、mir-140、miR-141、miR-145、mir-150、mir-192、mir-193、mir-195、mir-206、mir-208、mir-210、mir-210、mir-292-3p、mir-293、mir-297、mir-299、mir-329、mir-337、mir-337、mir-345、mir-346、またはmir-409を含み、miRNAに対応するmiRNA分子の群（群ii）は含む。本発明は、i）miRNA阻害分子またはii）miRNA配列に対応する合成もしくは非合成miRNA分子の有効量を細胞に導入するまたは提供する段階を含む、細胞におけるアポトーシスを誘導するための方法にも関係する。特定の態様において、方法は、i）miR-31もしくはmiR-214に対応するmiRNA阻害剤；またはii）let-7b、let-7g、mir-1、mir-1d、mir-7、mir-10a、miR-10b、miR-17-3p、miR-19a、miR-28、miR-28、miR-28、miR-29a、miR-32、miR-34a、miR-122、mir-148、mir-149、mir-154、mir-184、mir-186、mir-188、mir-192、mir-195、mir-196、mir-199a、mir-204、mir-208、mir-210、mir-211、mir-212、mir-214、mir-215、mir-216、mir-217、mir-218、mir-293、mir-296、mir-299、mir-321、mir-328、もしくはmir-344に対応するmiRNA分子の有効量を細胞に導入することに関する。あるいはまたは付加的に、miRNA阻害剤の群（群i）は、Let-7b、mir-21、mir-23b、mir-25、miR-26a、mir-28、mir-29a、mir-31、miR-32、mir-30a-3p、mir-34a、mir-96、miR-98、mir-100、mir-101、mir-105、mir-108、miR-125b、miR-126、mir-126、mir-128、mir-137、miR-143、miR-155、mir-207、mir-214、mir-216、mir-223、mir-292-3p、mir-328、mir-335、mir-340、mir-341、mir-367、mir-368、mir-380-3p、およびmir-410を含む。
アポトーシスを誘導するための方法は、癌の処置を含むがそれに限定されない多くの治療的適用を有する。
本発明のその他の態様は、i）miRNA阻害分子またはii）miRNA配列に対応する合成もしくは非合成miRNA分子の有効量を細胞に導入するまたは提供する段階を含む、細胞におけるアポトーシスを阻害するための方法に関する。特定の態様において、方法は、i）miR-7、miR-1-2、miR-148、miR-195、miR-196、miR-199a、miR-204、miR-210、miR-211、miR-212、miR-215、miR-216、miR-218、miR-296、もしくはmiR-321に対応するmiRNA阻害剤；またはii）Let-7b、mir-21、mir-23b、mir-25、miR-26a、mir-28、mir-29a、mir-31、miR-32、mir-30a-3p、mir-34a、mir-96、miR-98、mir-100、mir-101、mir-105、mir-108、miR-125b、miR-126、mir-126、mir-128、mir-137、miR-143、miR-155、mir-207、mir-214、mir-216、mir-223、mir-292-3p、mir-328、mir-335、mir-340、mir-341、mir-367、mir-368、mir-380-3p、もしくはmir-410に対応するmiRNA分子の有効量を細胞に導入することに関する。あるいはまたは付加的に、miRNA阻害剤の群（群i）は、let-7b、let-7g、mir-1、mir-1d、mir-7、mir-10a、miR-10b、miR-17-3p、miR-19a、miR-28、miR-28、miR-28、miR-29a、miR-32、miR-34a、miR-122、mir-148、mir-149、mir-154、mir-184、mir-186、mir-188、mir-192、mir-195、mir-196、mir-199a、mir-204、mir-208、mir-210、mir-211、mir-212、mir-214、mir-215、mir-216、mir-217、mir-218、mir-293、mir-296、mir-299、mir-321、mir-328、またはmir-344を含む。
本発明は、疾患もしくは病態を処置するために、または疾患もしくは病態の処置に対する治療薬を調製するために、miRNA組成物を使用することにも関係する。いくつかの態様において、本発明は、let-7、miR-10a、miR-15a、miR-16、miR-17、miR-21、miR-22、miR-23、miR-24、miR-26a、miR-29b、miR-30a、miR-96、miR-101、miR-105、miR-106、miR-124、miR-125a、miR-126、miR-130、miR130a、miR-133、miR-142、miR-143、miR-144、miR-145、miR-147、miR-181a、miR-182、miR-183、miR-188、miR-189、miR-192、miR-194、miR-195、miR-199a、miR-200b、miR-201、miR-205、miR-219、206、miR-215、miR-219、miR-223、miR-224、miR-321、miR-328、miR-331、miR-342、およびmiR-219、346からなる群より選択される一つまたは複数のヒトmiRNAに関する。1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40またはそれより多くのmiRNA（またはそこに導き出せる任意の範囲）が、これらの態様に対して使用され得ることが意図される。特定の態様において、方法は、特に癌の処置または予防に対して、これらのmiRNAのいずれかに対応する一つまたは複数のmiRNA阻害剤および/またはmiRNA分子に関する。癌は、悪性癌、腫瘍、転移性癌、切除不能癌、化学療法および/または放射線に耐性の癌、ならびに末期癌を含むが、それらに限定されない。
本発明のいくつかの態様において、方法は、miR-17、miR-21、miR-126、miR-143、miR-145、miR-188、miR-200b、miR-219、またはmiR-331に対応する一つまたは複数のmiRNA阻害剤および/またはmiRNA分子に関する。特定の態様において、方法は、1）miR-17、miR-21、miR-182、miR-183、miR-200b、miR-205、miR-223、および/もしくはmiR-224の阻害剤；ならびに/または2）let-7、miR-10a、miR-16、miR-22、miR-23、miR-24、miR-26a、miR-29b、miR-30a、miR-106、miR-125a、miR-126、miR-130、miR-133、miR-143、miR-144、miR-145、miR-181a、miR-188、miR-219、miR-192、miR-194、miR-195、miR-199a、mmu-miR-201、miR-215、miR-321、miR-328、miR-331、および/もしくはmiR-342に対応するmiRNAの一つまたは複数に関する。そのような方法は、特定の癌を含む癌を処置するためのいくつかの態様において、使用され得る。付加的に、miR-15a、miR-16、miR-96、miR-101、miR-105、miR-124、miR-126、miR-142、miR-147、miR-192、miR-194、miR-206、miR-215、またはmiR-346の一つまたは複数に対応するmiRNAは、癌を処置するまたは細胞増殖を阻害するために使用され得る。これらのmiRNAは、増殖が望ましくない細胞の源を問わず使用され得ることが意図される。
他に特に示されなければ、miRNAの総称的な説明がその遺伝子ファミリーメンバー（番号によって識別される）の任意を指すように、簡単な表記法が使用されることが理解されると思われる。「遺伝子ファミリー」が、同じmiRNAコード配列を有する遺伝子の群を指すことが、当業者によって理解される。典型的には、遺伝子ファミリーのメンバーは、初めの記号に続く数によって同定される。例えば、miR-16-1およびmiR-16-2は、miR-16遺伝子ファミリーのメンバーであり、「mir-7」は、miR-7-1、miR-7-2、およびmiR-7-3を指す。さらに、他に特に示されなければ、簡単な表記法は、関連miRNA（文字によって識別される）を指す。したがって、例えば、「let-7」は、let-7a-1、let7-a-2、let-7b、let-7c、let-7d、let-7e、let-7f-1、およびlet-7f-2を指す。この簡単な表記法に対する例外は、他に同定されると思われる。
本発明は、i）miRNA阻害分子またはii）miRNA配列に対応する合成もしくは非合成miRNA分子の有効量を細胞に導入するまたは提供することによって、乳癌を処置することまたは乳癌細胞の細胞増殖を減少させることに関係する。特定の態様において、方法は、少なくとも1）miR-21、miR-15a、miR-16、miR-24、および/もしくはmiR-25に対応する一つもしくは複数のmiRNA阻害剤、ならびに/または2）miR-99、miR-100、miR-205、miR-197、miR-126、miR-143、miR-145、および/もしくはmiR-321に対応する一つもしくは複数のmiRNAの有効量を提供することに関する。あるいはまたは付加的に、miRNAに対応するmiRNA分子（群ii）は、mir-27a、mir-92、mir-96、mir-98、mir-99a、mir-101、mir-105、mir-124、mir-126、mir-129、mir-132、mir-142、mir-147、mir-192、mir-201、mir-206、mir-208、mir-210、mir-211、mir-214、mir-215、mir-219、mir-220、mir-221、mir-223、mir-297、mir-329、mir-331、mir-345、mir-346、mir-409、またはmir-411を含み得る。
薬剤を「提供する」という用語が、患者に薬剤を「投与する」ことを含むために使用されることが理解されると思われる。
本発明は、i）miRNA阻害分子またはii）miRNA配列に対応する合成もしくは非合成miRNA分子の有効量を結腸癌細胞に導入するまたは提供することによって、結腸癌を処置することにも関する。特定の態様において、方法は、1）miR-21、miR-106、miR-200b、miR-223、miR-224、miR-31、および/もしくはmiR-17に対応する一つもしくは複数のmiRNA阻害剤；ならびに/または2）miR-145、miR-143、miR-133、miR-342、miR-125a、miR-195、miR-30a、miR-10a、miR-130、miR-192、miR-194、miR-215、miR-144、miR-23、miR-26a、miR-126、miR-199a、miR-188、miR-331、および/もしくはmiR-21に対応する一つもしくは複数のmiRNAを提供することに関する。
さらに、甲状腺癌を処置するための方法は、i）miRNA阻害分子またはii）miRNA配列に対応する合成もしくは非合成miRNA分子の有効量を甲状腺癌細胞に導入するまたは提供することに関する。特定の態様において、方法は、1）miR-21、miR-125、miR-24、miR-200b、miR-29b、miR-221、miR-222、miR-224、miR-10a、および/もしくはmiR-183に対応する一つもしくは複数のmiRNA阻害剤；ならびに/または2）miR-145、miR-22、miR-331、miR-126、miR-30a、miR-199a、miR-223、および/もしくはmiR-321に対応する一つもしくは複数のmiRNAを患者に提供することに関する。
肺癌の処置も、本発明の一部として意図される。方法は、i）miRNA阻害分子またはii）miRNA配列に対応する合成もしくは非合成miRNA分子の有効量を肺癌細胞に導入するまたは提供することに関する。特定の態様において、方法は、1）miR-223、miR-106、miR-21、miR-200b、miR-321、miR-182、miR-183、miR-17、および/もしくはmiR-205に対応する一つもしくは複数のmiRNA阻害剤；ならびに/または2）miR-130a、miR-145、miR-126、miR-331、miR-342、miR-143、Let-7、miR-30a、miR-16、miR-26a、miR-125a、miR-29b、miR-24、miR-328、miR-195、miR-22、miR-181a、miR-331、および/もしくはmiR-321に対応する一つもしくは複数のmiRNAを患者に提供することに関する。あるいはまたは付加的に、miRNA阻害剤の群（群1）は、mir-30e-5p、mir-25、mir-32、mir-92、mir-130a、mir-135、mir-145、mir-216、mir-293、mir-294、mir-333、mir-335、mir-338、mir-341、mir-350、mir-369、またはmir-412を含み、miRNAに対応するmiRNA分子の群（群2）は、ambi-mir7100、Let-7b、Let-7d、Let-7g、mir-7、mir-15a、mir-16、mir-22、mir-28、mir-29a、mir-34a、mir-96、mir-101、mir-105、mir-108、mir-122、mir-124、mir-125a、mir-125b、mir-126、mir-128、mir-129、mir-132、mir-133A、mir-136、mir-137、mir-141、mir-142、mir-147、mir-149、mir-151、mir-152、mir-182、mir-183、mir-186、mir-188、mir-192、mir-193、mir-195、mir-223、mir-292-3p、mir-337、mir-337、mir-344、mir-345、mir-346、mir-377、またはmir-526b*を含む。
本発明は、少なくとも1）Let-7a、Let-7b、Let-7c、Let-7d、Let-7g、mir-9、mir-145、mir-155、mir-181a、mir-186、mir-190、mir-191、もしくはmir-199に対応する一つもしくは複数のmiRNA阻害剤、および/または2）mir-1、mir-34a、mir-101、mir-124、mir-192、mir-193、mir-195、mir-201、mir-206、mir-208、mir-210、mir-215、mir-292-3p、mir-293、mir-297、mir-299、mir-337、mir-339、mir-340、mir-344、mir-345、mir-367、もしくはmir-409に対応する一つもしくは複数のmiRNAの有効量を提供することによって、子宮頚癌を処置することまたは子宮頚癌細胞の細胞増殖を減少させることに関係する。
本発明は、i）miRNA阻害分子またはii）miRNA配列に対応する合成もしくは非合成miRNA分子の有効量を細胞に導入するまたは提供することによって、前立腺癌を処置することまたは前立腺癌細胞の細胞増殖を減少させることに関係する。特定の態様において、方法は、少なくとも1）Let-7a、Let-7b、mir-93、mir-127、mir-154、mir-181a、mir-194、mir-198、mir-199、mir-201、もしくはmir-369に対応する一つもしくは複数のmiRNA阻害剤、および/または2）mir-15a、mir-16、mir-27a、mir-28、mir-30a-3p、mir-34a、mir-101、mir-103、mir-105、mir-107、mir-124、mir-126、mir-128、mir-129、mir-132、mir-135、mir-137、mir-141、mir-142、mir-147、もしくはmir-297に対応する一つもしくは複数のmiRNAの有効量を提供することに関する。
本発明は、i）miRNA阻害分子またはii）miRNA配列に対応する合成もしくは非合成miRNA分子の有効量を細胞に導入するまたは提供することによって、皮膚癌を処置することまたは皮膚癌細胞の細胞増殖を減少させることに関係する。特定の態様において、方法は、少なくとも1）miR-26a、miR-125a、miR-128、mir-138、mir-139、mir-141、mir-143、miR-145、mir-146、miR-150、miR-187、mir-188、mir-190、mir-196、mir-197、mir-198、mir-199、miR-201、mir-204、mir-216、miR-223、miR-291-3p、miR-294、miR-295、miR-322、miR-373、mir-410、もしくはmir-412に対応する一つもしくは複数のmiRNA阻害剤、および/または2）let 7a、mir-1、mir-7、mir-15a、mir-16、mir-20、mir-26a、mir-28、mir-34a、mir-96、mir-101、mir-105、miR-105、mir-124、mir-126、mir-128、mir-132、mir-133A、mir-136、mir-137、mir-141、mir-142、mir-144、miR-147、mir-154、mir-181a、mir-192、mir-193、miR-195、mir-201、mir-206、mir-206、mir-215、mir-221、mir-223、mir-291、mir-297、mir-302、miR-324-3p、mir-329、mir-330、mir-337、mir-346、mir-346、mir-373、mu-mir-376b、mir-380-3p、もしくはmir-411に対応する一つもしくは複数のmiRNAの有効量を提供することに関する。本発明は、i）miRNA阻害分子またはii）miRNA配列に対応する合成もしくは非合成miRNA分子の有効量を細胞に導入するまたは提供することによって、白血病を処置することまたは癌性T細胞の細胞増殖を減少させることに関係する。特定の態様において、方法は、少なくとも1）miR-15a、miR-23b、miR-25、miR-26a、miR-100、miR-125b、miR-126、miR-129、miR-140、miR-143、もしくはmiR-155に対応する一つもしくは複数のmiRNA阻害剤、および/または2）let-7a、let-7b、miR-10b、miR-17-3p、miR-29a、miR-30a-3p、miR-34a、miR-101、miR-122、もしくはmiR-133aに対応する一つもしくは複数のmiRNAの有効量を提供することに関する。あるいはまたは付加的に、miRNA阻害剤の群（群1）は、let-7a、let-7b、let-7c、let-7d、let-7g、miR-7、miR-10a、miR-10b、miR-15a、miR-17-3p、miR-18、miR-19a、miR-20、miR-125a、miR-126、またはmiR-182を含み、miRNAに対応するmiRNA分子の群（群2）は、miR-107、miR-134、miR-135、miR-139、miR-141、またはmiR-145を含む。さらに、そのような方法は、概してT細胞にまで及び得る。
細胞増殖を減少させることとの関連で本明細書において開示される任意のmiRNAに加えて、本発明の態様は、i）miRNA阻害分子またはii）miRNA配列に対応する合成もしくは非合成miRNA分子の有効量を細胞に導入するまたは提供する段階を含む、細胞増殖を減少させるための方法を含む。特定の態様において、方法は、少なくとも1）Let-7a、Let-7b、Let-7c、Let-7d、Let-7g、miR-7、mir-9、miR-10a、miR-10b、miR-15a、miR-18、miR-19a、miR-17-3p、miR-20、miR-23b、mir-25、miR-25、miR-26a、miR-26a、mir-30e-5p、mir-32、mir-92、mir-93、miR-100、miR-125a、miR-125b、miR-126、mir-127、miR-128、miR-129、mir-130a、mir-135、mir-138、mir-139、miR-140、mir-141、mir-143、mir-145、mir-146、miR-150、mir-154、mir-155、mir-181a、miR-182、mir-186、miR-187、miR-188、mir-190、mir-191、mir-194、mir-196、mir-197、mir-198、mir-199、mir-201、mir-204、mir-216、mir-223、mir-293、miR-291-3p、miR-294、miR-295、miR-322、mir-333、mir-335、mir-338、mir-341、mir-350、mir-369、miR-373、mir-410、もしくはmir-412に対応する一つもしくは複数のmiRNA阻害剤、および/または2）
Figure 2008519606
に対応する一つもしくは複数のmiRNAの有効量を提供するまたは導入することに関する。そのような方法は、過剰増殖性疾患および病態などの、細胞増殖が役割を果たす癌または別の疾患もしくは病態を処置することとの関連で使用され得ることが意図される。
本発明は、i）miRNA阻害分子またはii）miRNA配列に対応する合成もしくは非合成miRNA分子の有効量を細胞に導入するまたは提供する段階を含む、細胞増殖を増加させるための態様方法にも関係する。特定の態様において、方法は、少なくとも1）
Figure 2008519606
に対応する一つもしくは複数のmiRNA阻害剤、および/または2）Let-7a、Let-7b、Let-7c、Let-7d、Let-7g、miR-7、mir-9、miR-10a、miR-10b、miR-15a、miR-18、miR-19a、miR-17-3p、miR-20、miR-23b、mir-25、miR-25、miR-26a、miR-26a、mir-30e-5p、mir-32、mir-92、mir-93、miR-100、miR-125a、miR-125b、miR-126、mir-127、miR-128、miR-129、mir-130a、mir-135、mir-138、mir-139、miR-140、mir-141、mir-143、mir-145、mir-146、miR-150、mir-154、mir-155、mir-181a、miR-182、mir-186、miR-187、miR-188、mir-190、mir-191、mir-194、mir-196、mir-197、mir-198、mir-199、mir-201、mir-204、mir-216、mir-223、mir-293、miR-291-3p、miR-294、miR-295、miR-322、mir-333、mir-335、mir-338、mir-341、mir-350、mir-369、miR-373、mir-410、もしくはmir-412に対応する一つもしくは複数のmiRNAの有効量を提供するまたは導入することに関する。そのような態様に限定されないが、そのような方法に対する一つの使用は、前処置または治療との関連で、正常細胞またはその他の望ましい細胞の増殖を増加させるまたは誘導することである。
本発明のその他の局面は、全身性紅斑性狼瘡（SLE）の処置を含む。特定の態様において、方法は、i）miRNA阻害分子またはii）miRNA配列に対応する合成もしくは非合成miRNA分子の有効量を患者に導入するまたは提供することに関係する。特定の態様において、方法は、1）miR-21、miR-223、および/もしくはmir-342発現に対応する一つもしくは複数のmiRNA阻害剤；ならびに/または2）miR-95、miR-105、miR-137、miR-186、miR-188、miR-199、miR-211、miR-215、mu-miR-290、miR-301、および/もしくはmiR-331に対応する一つもしくは複数のmiRNAを、SLEを有するまたはSLEを有することが疑われる患者に提供することに関する。
プリオン病の処置または予防は、本発明の方法に含まれる。いくつかの場合において、方法は、i）miRNA阻害分子またはii）miRNA配列に対応する合成もしくは非合成miRNA分子の有効量を、プリオン病を有する患者に導入するまたは提供する段階を含む。特定の態様において、方法は、1）miR-7、miR-9、miR-16、miR-24、miR-26A、miR-27A、および/もしくはmiR-130Aに対応する一つもしくは複数のmiRNA阻害剤；ならびに/または2）miR-95および/もしくはmiR-135Aに対応する一つもしくは複数のmiRNAを患者に提供することに関する。患者は、プリオン病を有すると診断されたもの、プリオン病に対するリスクがあるもの、またはプリオン病を有することが疑われるものであり得る。本発明のいくつかの態様において、miRNAに対応する核酸分子が二本鎖であり、両鎖が、それが対応する成熟miRNAの配列を有することが具体的に意図される。そのような分子は、本発明の態様において、「as」という接尾辞で指定され得る。例えば、miR-9-asと呼ばれる核酸分子は、本明細書において記載されるいくつかの実験において使用された。いくつかの態様において、核酸分子がmiRNA-as分子であることが意図される。
本発明は、虚血を有すると診断された患者、虚血に対するリスクがある患者、虚血を有することが疑われる患者、または虚血の症状を有する患者にも関係する。方法は、i）miRNA阻害分子またはii）miRNA配列に対応する合成もしくは非合成miRNA分子の有効量を患者に導入するまたは提供することに関する。特定の態様において、方法は、1）miR-28、miR-30A、miR-31、miR-138、miR-139、miR-140、miR-291、および/もしくはmmu-miR-298に対応する一つもしくは複数のmiRNA阻害剤；ならびに/または2）Let-7f-2および/もしくはmiR-16に対応する一つもしくは複数のmiRNAを患者に提供することに関する。
特定の実験において、センスおよびアンチセンス鎖の両方が単一の前駆体miRNAに由来する合成miRNAが、本発明の方法および組成物において使用される。これらは、sanger.ac.uk/cgi-bin/rfam/mirnaにおけるワールドワイドウェブ上で記載されるように、「P」という接尾辞で頻繁に指定され、「5P」は、成熟miRNAが前駆体の5'末端に由来することを示し、対応する「3P」は、それが前駆体の3'末端に由来することを示す。さらに、いくつかの態様において、公知のヒトmiRNAに対応しないmiRNAが評価された。これらの非ヒトmiRNAは、本発明の態様において使用され得ること、または非ヒトmiRNAと相同であるヒトmiRNAが存在し得ることが意図される。
本発明は、いくつかの態様において、i）miRNA阻害分子またはii）miRNA配列に対応する合成もしくは非合成miRNA分子の有効量を細胞に導入するまたは提供する段階を含む、細胞生存率を低下させるための方法に関係する。特定の態様において、方法は、1）細胞の内部にある場合にlet-7a、let-7b、miR-1、miR-10b、miR-17、miR-19a、miR-20、miR-28、miR-29a、miR-30a、miR-32、miR-34a、miR-96、miR-101、miR-122、miR-124、miR-132、miR-133a、miR-134、miR-139、miR-140、miR-144、miR-145、miR-147、miR-155、miR-182、miR-183、miR-184、miR-186、miR-190、miR-193、miR-197、miR-206、miR-208、miR-210、miR-216、miR-217、miR-224、mu-miR-292、mu-miR-293、mu-miR-298、miR-299、miR-301、mu-miR-329、miR-337、mu-miR-344、miR-345、miR-346、miR-369、mu-miR-380、もしくはmu-miR-409の成熟miRNAにプロセスされることが可能な少なくとも一つの核酸分子；または2）let-7a、let-7b、let-7c、miR-9、miR-10a、miR-10b、miR-15a、miR-17、miR-18、miR-20、mir-23b、miR-25、miR-26a、miR-98、miR-100、miR-125a、miR-125b、miR-126、miR-129、miR-140、miR-141、miR-143、miR-155、もしくはmiR-181-aに対応する少なくとも一つのmiRNA阻害剤の有効量を細胞に提供するまたは導入することに関する。「細胞生存率を低下させる」という用語は、生細胞の数を低下させることを意味する。
細胞生存率および細胞増殖に関係する方法は、概して、治療薬、診断法、興味深い研究特性を有する細胞株の作製、および分化の誘導に対して使用され得る。癌細胞の増殖を選択的に低下させるmiRNAは、それらが癌および非癌細胞に同様に送達され得るが癌性細胞の成長にのみ影響を及ぼすと思われるので、治療薬として使用され得る。加えて、方法は、転移を停止するもしくは予防するまたは転移の数を低下させるために使用され得る。
細胞生存率における低下などの効果が望ましい細胞（「標的細胞」と呼ばれる）が、罹患しているまたは疾患もしくは病態を維持する、促進する、もしくは引き起こすことに関与する細胞であり得ることが、いくつかの態様において意図される。特定の態様において、細胞は癌細胞であるが、その他の態様において、健康な（非罹患）細胞であることが意図される。特定の態様において、標的細胞は、生物体にある。
さらに、細胞の内部にある場合に成熟miRNAにプロセスされることが可能な核酸分子が、本発明のいくつかの態様において、合成miRNAであることが特に意図される。
その他の態様において、本発明は、i）miRNA阻害分子またはii）miRNA配列に対応する合成もしくは非合成miRNA分子の有効量を細胞に導入するまたは提供する段階を含む、細胞生存率を増加させるための方法に関する。特定の態様において、方法は、1）細胞の内部にある場合にlet-7a、let-7b、let-7c、miR-9、miR-10a、miR-10b、miR-15a、miR-17、miR-18、miR-20、mir-23b、miR-25、miR-26a、miR-98、miR-100、miR-125a、miR-125b、miR-126、miR-129、miR-140、miR-141、miR-143、miR-155、もしくはmiR-181-aの成熟miRNAにプロセスされることが可能な少なくとも一つの核酸分子；または2）let-7a、let-7b、miR-1、miR-10b、miR-17、miR-19a、miR-20、miR-28、miR-29a、miR-30a、miR-32、miR-34a、miR-96、miR-101、miR-122、miR-124、miR-132、miR-133a、miR-134、miR-139、miR-140、miR-144、miR-145、miR-147、miR-155、miR-182、miR-183、miR-184、miR-186、miR-190、miR-193、miR-197、miR-206、miR-208、miR-210、miR-216、miR-217、miR-224、mu-miR-292、mu-miR-293、mu-miR-298、miR-299、miR-301、mu-miR-329、miR-337、mu-miR-344、miR-345、miR-346、miR-369、mu-miR-380、もしくはmu-miR-409に対応する少なくとも一つのmiRNA阻害剤の有効量を細胞に提供するまたは導入することに関する。「細胞生存率を増加させる」という用語は、細胞死が阻害されることを意味する。特定の態様において、白血病細胞などの癌細胞には、成熟let-7a、let-7b、またはmiR-10b分子にプロセスされることが可能な核酸の有効量が提供される。
本発明の方法は、i）miRNA阻害分子またはii）miRNA配列に対応する合成もしくは非合成miRNA分子の有効量を細胞に導入するまたは提供する段階を含む、細胞増殖を阻害することにも関する。特定の態様において、方法は、1）細胞の内部にある場合にlet-7a、let-7b、let-7c、let-7d、let-7g、miR-1、miR-7、miR-15a、miR-16、miR-19a、miR-22、miR-28、miR-29a、miR-34a、miR-92、miR-96、miR-98、miR-101、miR-122、miR-124、miR-126、miR-129、miR-133b、miR-137、miR-147、miR-192、miR-193、miR-195、miR-205、miR-206、miR-208、miR-210、mu-miR-292、mu-miR-297、miR-299、miR-337、mu-miR-344、miR-345、もしくはmiR-346の成熟miRNAにプロセスされることが可能な少なくとも一つの核酸分子；または2）miR-25、miR-27a、miR-31、miR-32、miR-92、miR-139、miR-145、miR-198、miR-212、mu-miR-290、mu-miR-294、miR-323、miR-324、miR-325、miR-331、miR-335、mu-miR-351、miR-369、miR-370、もしくはmiR-373に対応する少なくとも一つのmiRNA阻害剤の有効量を細胞に提供するまたは導入することに関する。
いくつかの態様において、i）miRNA阻害分子またはii）miRNA配列に対応する合成もしくは非合成miRNA分子の有効量を細胞に導入するまたは提供する段階を含む、細胞増殖を増加させる方法がある。特定の態様において、方法は、1）細胞の内部にある場合にmiR-25、miR-27a、miR-31、miR-32、miR-92、miR-139、miR-145、miR-198、miR-212、mu-miR-290、mu-miR-294、miR-323、miR-324、miR-325、miR-331、miR-335、mu-miR-351、miR-369、miR-370、もしくはmiR-373の成熟miRNAにプロセスされることが可能な少なくとも一つの核酸分子；または2）let-7a、let-7b、let-7c、let-7d、let-7g、miR-1、miR-7、miR-15a、miR-16、miR-19a、miR-22、miR-28、miR-29a、miR-34a、miR-92、miR-96、miR-98、miR-101、miR-122、miR-124、miR-126、miR-129、miR-133b、miR-137、miR-147、miR-192、miR-193、miR-195、miR-205、miR-206、miR-208、miR-210、mu-miR-292、mu-miR-297、miR-299、miR-337、mu-miR-344、miR-345、もしくはmiR-346に対応する少なくとも一つのmiRNA阻害剤の有効量を細胞に提供するまたは導入することに関する。
本発明は、i）miRNA阻害分子またはii）miRNA配列に対応する合成もしくは非合成miRNA分子の有効量を細胞に導入するまたは提供する段階を含む、ERK活性化を阻害する方法もカバーする。特定の態様において、方法は、let-7a、mir-294、mir-295、miR-19a、miR-25、miR-96、miR-125a、miR-134、miR-148、miR-152、miR-206、miR-207、miR-210、miR-212、miR-216、miR-217、miR-218、miR-223、mu-miR-294、mu-miR-295、miR-301、miR-328、mu-miR-329、miR-339、miR-370、またはmiR-372に対応する一つまたは複数のmiRNA阻害剤の有効量を細胞に提供するまたは導入する段階を含むことに関する。
特定の態様において、それは、i）miRNA阻害分子またはii）miRNA配列に対応する合成もしくは非合成miRNA分子の有効量を細胞に導入するまたは提供することによってERKを活性化する方法もカバーする。特定の態様において、方法は、細胞の内部にある場合にmiR-19a、miR-25、miR-96、miR-125a、miR-134、miR-148、miR-152、miR-206、miR-207、miR-210、miR-212、miR-216、miR-217、miR-218、miR-223、mu-miR-294、mu-miR-295、miR-301、miR-328、mu-miR-329、miR-339、miR-370、またはmiR-372の成熟miRNAにプロセスされることが可能な一つまたは複数の核酸分子の有効量を細胞に提供するまたは導入することに関する。あるいはまたは加えて、成熟miRNAは、let-7、miR-19a、miR-25、miR-96、miR-125a、miR-134、miR-148、miR-152、miR-206、miR-207、miR-210、miR-212、miR-216、miR-217、miR-218、miR-223、mu-miR-294、mu-miR-295、miR-301、miR-328、mu-miR-329、miR-339、miR-370、またはmiR-372である。
本発明のその他の態様において、i）miRNA阻害分子またはii）miRNA配列に対応する合成もしくは非合成miRNA分子の有効量を細胞に導入するまたは提供する段階を含む、集団におけるアポトーシス細胞のパーセンテージを増加させる方法がある。特定の態様において、方法は、1）細胞の内部にある場合にlet-7d、miR-22、miR-23a、miR-23b、miR-24、miR-27a、miR-31、miR-128、miR-181a、miR-196、miR-198、miR-199、miR-214、miR-217、mu-miR-290、mu-miR-293、miR-324、miR-338、もしくはmu-miR-412の成熟miRNAにプロセスされることが可能な一つもしくは複数の核酸分子；または2）miR-34a、miR-96、miR-101、miR-105、miR-126、miR-137、もしくはmu-miR-292に対応するmiRNA阻害剤の有効量を細胞に提供するまたは導入することに関する。細胞の集団は、罹患していてもよくまたは疾患もしくは病態に関連していてもよいことが具体的に意図される。
本発明のさらなる態様において、i）miRNA阻害分子またはii）miRNA配列に対応する合成もしくは非合成miRNA分子の有効量を細胞に導入するまたは提供する段階を含む、集団におけるアポトーシス細胞のパーセンテージを減少させる方法がある。特定の態様において、方法は、1）細胞の内部にある場合にmiR-34a、miR-96、miR-101、miR-105、miR-126、miR-137、もしくはmu-miR-292の成熟miRNAにプロセスされることが可能な少なくとも一つの核酸分子；または2）let-7d、miR-22、miR-23a、miR-23b、miR-24、miR-27a、miR-31、miR-128、miR-181a、miR-196、miR-198、miR-199、miR-214、miR-217、mu-miR-290、mu-miR-293、miR-324、miR-338、もしくはmu-miR-412に対応する少なくとも一つのmiRNA阻害剤の有効量を細胞に提供するまたは導入することに関する。細胞の集団は、アポトーシスの結果としての萎縮症または健康な細胞の数における減少に関わる疾患または病態に関与し得ることが意図される。アポトーシスを誘導するmiRNAの一つまたは複数は、細胞死を誘導するために癌細胞などの異常な細胞に導入でき、治療的応答を提供する。これは、アポトーシス誘導合成miRNAが腫瘍組織に直接的にインジェクションされるまたはそうでなければ原発もしくは転移性癌細胞に高効率で送達される場合、特に有益であり得る。これらの同じmiRNAは、それらの活性を補いかつ治療的応答を喚起するために、化学療法薬などのその他の治療剤と共送達され得る。または、アポトーシスを低下させるmiRNAは、アポトーシスを誘導する化学療法試薬を導入するのと同時に正常細胞に導入でき、正常細胞に対する保護のある程度のレベルを提供するが、癌細胞は細胞死を起こすように誘導される。miRNAは、診断的アッセイに対する標的として、または細胞を分化させるためもしくは興味深い研究特性を有する細胞株を作製するために使用されてもよい。
本発明の方法は、i）miRNA阻害分子またはii）miRNA配列に対応する合成もしくは非合成miRNA分子の有効量を細胞に導入するまたは提供する段階を含む、細胞におけるhTert活性を阻害するまたは妨げるための方法を含む。特定の態様において、方法は、少なくとも一つのi）miR-15a、miR-16、miR-21、mir-24、miR-26a、miR-92、miR-105、miR-125a、miR-125b、miR-128、mir-147、miR-195、miR-207、miR-224、miR-295、mir-301、miR-337、mir-368、もしくはmir-371に対応するmiRNA阻害剤またはii）細胞の内部にある場合にmiR-26a、miR-147、mir-195、およびmir-368の成熟miRNAにプロセスされることが可能な核酸分子の有効量を細胞に提供するまたは導入することに関する。癌細胞または癌に対するリスクがあるもしくは癌を有することが疑われる患者においてhTert活性を阻害することが望ましいことが具体的に意図される。本発明の方法は、細胞の内部にある場合にmiR-15a、miR-16、miR-21、mir-24、miR-26a、miR-92、miR-105、miR-125a、miR-125b、miR-128、mir-147、miR-195、miR-207、miR-224、miR-295、mir-301、miR-337、mir-368、またはmir-371の成熟miRNAにプロセスされることが可能な少なくとも一つの核酸分子の有効量を細胞に提供するまたは導入する段階を含む、細胞におけるhTert活性を誘導するための方法を含む。あるいはまたは付加的に、hTert活性は、細胞に導入されてもよく、miR-26a、miR-147、mir-195、またはmir-368に対応するmiRNA阻害剤を細胞に提供するまたは導入することを含む。
本発明のその他の態様において、a）細胞に候補miRNAを細胞に導入する段階；およびb）miRNAを欠く細胞と比較して、hTertの発現または活性における低下が、hTert活性化遺伝子産物の潜在的な阻害剤としてmiRNAを同定する、細胞におけるhTert発現またはhTert活性のレベルをアッセイする段階を含む、hTert活性化遺伝子産物を阻害するmiRNAを同定するための方法がある。特定の態様において、候補miRNAの配列は、hTert活性化遺伝子産物を阻害する能力に対してあらかじめ評価された。コンピュータープログラムおよびアルゴリズムは、特定のmiRNA配列が、特定の細胞遺伝子を標的にし得るかどうかを査定するために使用され得る。特定の態様において、hTert活性化遺伝子産物は、ACOX1、AKT1、APAF1、COX-5B、COX6、COX7B、CPOX、DUOX2、GPX1、GPX2、GPX4、LPO、MAPK1、MAPK4、MTCO1、NOX3、NOX5、PAOX、PPOX、PRKCA、PRKCD、およびTNFRSF6からなる群より選択される。これらの方法は、テロメラーゼ活性および癌進行に対抗するために使用され得る。本発明は、i）miRNA阻害分子またはii）miRNA配列に対応する合成もしくは非合成miRNA分子の有効量を細胞に導入するまたは提供する段階を含む、細胞におけるStat3の刺激を阻害するための方法も含む。特定の態様において、方法は、mir-93、mir-100、mir-134、mir-99a、mir-103、mir-128、mir-129、mir-181b、mir-193、mir-197、mir-212、mir-218、mir-219、mir-302、mir-323、mir-324-3p、mir-325、mir-330、mir-331、mir-340、mmu-mir-350、mir-425、mir-491、mir-518f、mir-520a*からなる群より選択されるmiRNAの有効量を細胞に提供することに関する。そのような方法は、炎症によって特徴付けられる疾患または病態を処置するために使用され得る。これらは、組織破壊、器官不全、または関節リウマチ、乾癬、喘息、炎症性腸疾患（クローン病および関連病態）、多発性硬化症、閉塞性肺疾患（COPD）、アレルギー性鼻炎（花粉症）、および心臓血管疾患などの炎症性疾患を含むが、それらに限定されない。付加的に、そのような方法は、治療薬、診断法、予後診断法、興味深い研究特性を有する細胞株の作製、および分化の誘導に対して使用され得る。
本発明は、細胞または細胞の集団の細胞周期に影響を与える方法にも関係する。方法は、S、G1、G2/Mなどの細胞周期の特定の期における、または染色体の数が2Nよりも多い場合に、細胞の数を相対的に増加させることに関し得ることが意図される。または、それは、細胞におけるDNA合成を誘導することに関し得る。細胞周期に関与するmiRNAの一つまたは複数は、細胞、特に癌細胞をモジュレートするために使用することができ、そのような細胞を有する患者に対する治療的利益が達成される。そのような方法は、例えば、治療剤の効力を強化するために使用され得る、またはそれらは、例えば、細胞のより均質な集団を生成するために細胞を同調させるための研究との関連で使用され得る。さらに、これらのmiRNAは、細胞周期進行を制御することに関与する遺伝子を調節し得る。これらのmiRNAの一つまたは複数の誤発現（mis-expression）は、それらが存在する細胞に大いに影響を及ぼすことがあり、潜在的に変更された細胞周期調節に関連する癌またはその他の疾患をもたらす。診断検体としてこれらのmiRNAを使用することに加えて、それらは、疾患を処置するための標的も提供し得ると考えられる。例えば、細胞周期特異的miRNAを有することによって重大な細胞周期シグナルを回避した癌細胞は、miRNAを導入することによって正常状態に戻り得ると考えられる。
細胞がS期であることを促進する方法は、i）miRNA阻害分子またはii）miRNA配列に対応する合成もしくは非合成miRNA分子の有効量を細胞に導入するまたは提供することによって達成され得る。特定の態様において、方法は、1）細胞の内部にある場合にlet-7a、mir-15a、mir-16、mir-20、mir-26a、mir-191、mir-197、mir-205、mir-220、mir-224、mir-290、mir-291、mir-294、mir-295、mir-302、mir-345、mir-372、もしくはmir-411の成熟miRNAにプロセスされることが可能な少なくとも一つの核酸分子；または2）mir-108、mir-122、mir-128、mir-129、mir-137、mir-142、mir-146、mir-147、mir-186、mir-187、mir-195、mir-297、mir-324-3p、mir-337、もしくはmir-376bに対応する少なくとも一つのmiRNA阻害剤の有効量を細胞に提供するまたは導入することに関する。
本発明は、i）miRNA阻害分子またはii）miRNA配列に対応する合成もしくは非合成miRNA分子の有効量を細胞に導入するまたは提供することによって、細胞がS期であることを阻害する方法も含む。特定の態様において、方法は、1）細胞の内部にある場合にmir-108、mir-122、mir-128、mir-129、mir-137、mir-142、mir-146、mir-147、mir-186、mir-187、mir-195、mir-297、mir-324-3p、mir-337、もしくはmir-376bの成熟miRNAにプロセスされることが可能な少なくとも一つの核酸分子；または2）let-7a、mir-15a、mir-16、mir-20、mir-26a、mir-191、mir-197、mir-205、mir-220、mir-224、mir-290、mir-291、mir-294、mir-295、mir-302、mir-345、mir-372、もしくはmir-411に対応する少なくとも一つのmiRNA阻害剤の有効量を細胞に提供するまたは導入することに関する。
細胞がG1期であることを促進する方法は、i）miRNA阻害分子またはii）miRNA配列に対応する合成もしくは非合成miRNA分子の有効量を細胞に導入するまたは提供することによって達成され得る。特定の態様において、方法は、1）細胞の内部にある場合にmir-108、mir-122、mir-124、mir-125a、mir-126、mir-128、mir-129、mir-137、mir-142、mir-146、mir-147、mir-195、mir-201、mir-297、mir-320、mir-325、mir-324-3p、mir-337、mir-371、mir-376b、もしくはmir-409の成熟miRNAにプロセスされることが可能な少なくとも一つの核酸分子；または2）Let-7a、mir-1、mir-7d、mir-20、mir-21、mir-26a、mir-192、mir-193、mir-206、mir-220、mir-290、mir-294、mir-329、mir-371、mir-373、もしくはmir-409に対応する少なくとも一つのmiRNA阻害剤の有効量を細胞に提供するまたは導入することに関する。
その他の方法は、i）miRNA阻害分子またはii）miRNA配列に対応する合成もしくは非合成miRNA分子の有効量を細胞に導入するまたは提供することによって、G1期における細胞を阻害することに関係する。特定の態様において、方法は、1）細胞の内部にある場合にLet-7a、mir-1、mir-7d、mir-20、mir-21、mir-26a、mir-192、mir-193、mir-206、mir-220、mir-290、mir-294、mir-329、mir-371、mir-373、mir-409の成熟miRNAにプロセスされることが可能な少なくとも一つの核酸分子；または2）mir-108、mir-122、mir-124、mir-125a、mir-126、mir-128、mir-129、mir-137、mir-142、mir-146、mir-147、mir-195、mir-201、mir-297、mir-320、mir-325、mir-324-3p、mir-337、mir-371、mir-376b、もしくはmir-409に対応する少なくとも一つのmiRNA阻害剤の有効量を細胞に提供するまたは導入することに関する。
i）miRNA阻害分子またはii）miRNA配列に対応する合成もしくは非合成miRNA分子の有効量を細胞に導入するまたは提供することによって、細胞がG2/M期であることを促進する方法もある。特定の態様において、方法は、1）細胞の内部にある場合にmir-1、mir-7a、mir-7d、mir-7g、mir-20、mir-21、mir-26a、mir-145、mir-187、mir-192、mir-193、mir-206、mir-215、mir-220、mir-223、mir-294、mir-329、mir-371、mir-373、もしくはmir-409の成熟miRNAにプロセスされることが可能な少なくとも一つの核酸分子；または2）mir-15a、mir-18、mir-122、mir-124、mir-126、mir-128、mir-129、mir-137、mir-146、mir-147、mir-195、mir-219、mir-337、もしくはmir-371に対応する少なくとも一つのmiRNA阻害剤の有効量を細胞に提供するまたは導入することに関する。
その他の態様において、i）miRNA阻害分子またはii）miRNA配列に対応する合成もしくは非合成miRNA分子の有効量を細胞に導入するまたは提供することによって、細胞がG2/M期であることを阻害することに関する方法がある。特定の態様において、方法は、1）細胞の内部にある場合にmir-15a、mir-18、mir-122、mir-124、mir-126、mir-128、mir-129、mir-137、mir-146、mir-147、mir-195、mir-219、mir-337、もしくはmir-371の成熟miRNAにプロセスされることが可能な少なくとも一つの核酸分子；または2）mir-1、mir-7a、mir-7d、mir-7g、mir-20、mir-21、mir-26a、mir-145、mir-187、mir-192、mir-193、mir-206、mir-215、mir-220、mir-223、mir-294、mir-329、mir-371、mir-373、もしくはmir-409に対応する少なくとも一つのmiRNA阻害剤の有効量を細胞に提供するまたは導入することに関する。
本発明は、i）miRNA阻害分子またはii）miRNA配列に対応する合成もしくは非合成miRNA分子の有効量を細胞に導入するまたは提供する段階を含む、細胞において2×以上のDNAを有する細胞の数を増加させる方法も含む。特定の態様において、方法は、細胞の内部にある場合にmiR-1、miR-20、miR-21、miR-337、miR-345、またはmiR-373の成熟miRNAにプロセスされることが可能な少なくとも一つの核酸分子の有効量を細胞に提供するまたは導入することに関する。本発明は、miR-1、miR-20、miR-21、miR-337、miR-345、またはmiR-373に対応するmiRNA阻害剤の有効量を細胞に提供するまたは導入することを含む、2×（2Nとも呼ばれ、Nは、染色体のセットの数である）を有する細胞の数を低下させることにも関係する。
特定の態様において、方法は、細胞または生物体においてモジュレートするためにmiRNAを標的にすることも含む。「モジュレートするためにmiRNAを標的にする」という用語は、本発明の核酸が、選択されたmiRNAをモジュレートするために使用されることを意味する。いくつかの態様において、モジュレーションは、標的miRNAに対応する合成または非合成miRNAを用いて達成され、細胞または生物体に標的miRNAを有効に提供する（陽性モジュレーション）。その他の態様において、モジュレーションは、miRNA阻害剤を用いて達成され、細胞または生物体における標的miRNAを有効に阻害する（陰性モジュレーション）。
いくつかの態様において、モジュレートされるように標的にされるmiRNAは、疾患、病態、または経路に影響を及ぼすmiRNAである。特定の態様においては、標的miRNAの陰性モジュレーションによって処置が提供され得るので、miRNAが標的とされる。その他の態様においては、標的miRNAの陽性モジュレーションによって処置が提供され得るので、miRNAが標的とされる。
本発明のさらなる態様においては、標的miRNAの陰性モジュレーションを達成する本発明の核酸分子を得る段階がある。または、いくつかの場合においては、標的miRNAの陽性モジュレーションを達成する本発明の核酸分子を得る段階がある。したがって、方法が、特定の疾患、病態、経路、または経路における因子に関与する、それらに影響を及ぼす、またはそれらの特徴であるものなどの、標的miRNAに対応する合成miRNA、非合成miRNA、またはmiRNA阻害剤（まとめて「miRNAモジュレーター」）を選択することおよび/または得ることに関することが意図される。
本発明の特定の方法においては、標的miRNAのモジュレーションに関連する処置を必要とするまたは本明細書において議論される生理学的もしくは生物学的結果（特定の細胞経路または細胞生存率における減少などの結果に関するなど）を必要とする細胞、組織、器官、または生物体（まとめて「生物学的物体」）に、選択されたmiRNAモジュレーターを投与するさらなる段階がある。結果として、本発明のいくつかの方法において、miRNAモジュレーターによって提供され得る処置を必要とする患者を同定する段階がある。miRNAモジュレーターの有効量が、いくつかの態様において投与され得ることが意図される。特定の態様においては、生物学的物体に与えられる治療的利益があり、「治療的利益」とは、疾患もしくは病態に関連する一つもしくは複数の病態もしくは症状における改善、または疾患に関する予後診断、期間、もしくは現況における改善を指す。治療的利益は、痛みにおける減少、罹患率における減少、症状における減少を含むが、それらに限定されないことが意図される。例えば、癌に関して、治療的利益は、腫瘍成長の阻害、転移の予防、転移の数における低下、癌細胞増殖の阻害、癌細胞増殖の阻害、癌細胞における細胞死の誘導、癌細胞の近くの血管形成の阻害、癌細胞のアポトーシスの誘導、痛みにおける低下、再発のリスクにおける低下、癌細胞における化学療法もしくは放射線感受性の誘導、生命の延長、および/または癌に直接的もしくは間接的に関連する死の遅延であり得ることが意図される。
患者、特に特定の疾患または病態を有することが疑われる患者に対するmiRNAプロファイルは、本出願において議論されるmiRNAのいずれかを評価することによって生成され得ることが具体的に意図される。患者から生成されるmiRNAプロファイルは、特定の疾患または病態に関する情報を提供するものであると思われる。多くの態様において、miRNAプロファイルは、議論されるmiRNAアレイを使用して生成される。
さらに、miRNA組成物は、伝統的な治療または予防的薬剤とともに、患者への治療の一部として提供され得ることが意図される。さらに、治療との関連で議論される任意の方法は、特に潜在的に治療を必要とするまたは治療が必要とされる病態もしくは疾患のリスクがあると同定される患者において、予防的に適用され得ることが意図される。
その他の態様において、本発明は、mir-192、mir-198、およびmir-199からなる群より選択される少なくとも一つのmiRNAの有効量を細胞に投与する段階を含む、細胞における形質転換を誘導するための方法に関係する。または、細胞形質転換を予防するための方法は、mir-192、mir-198、またはmir-199の少なくとも一つのmiRNA阻害剤の有効量を細胞に投与することによって達成され得る。
加えて、本発明の方法は、miRNAに対応する一つまたは複数の核酸および治療薬物を使用することに関係する。核酸は、薬物の効果もしくは効力を強化し、任意の副作用もしくは毒性を低減し、その生体利用性を改変し、かつ/または必要とされる投薬量もしくは頻度を減少させ得る。特定の態様において、治療薬物は、癌治療薬である。結果として、いくつかの態様において、癌治療薬と、癌治療薬の効力を改善するかまたは非癌細胞を保護する少なくとも一つのmiRNA分子の有効量とを患者に投与する段階を含む、患者における癌を処置する方法がある。さらに、いくつかの場合において、miRNA分子は、癌治療薬の効力を強化し、ambi-miR-7100、mir-28、mir-101、mir-124、mir-125a、mir-126、mir-132、mir-136、mir-147、mir-155、mir-182、mir-186、mir-202、mir-206、mir-216、mir-221、mir-224、mir-291、mir-292-3p、mir-297、mir-302、mir-337、mir-372、mir-373、およびmir-376bからなる群より選択される。
癌治療は、化学物質および放射線に基づく処置の両方との様々な組み合わせ治療も含む。組み合わせ化学療法は、例えば、ベバシズマブ、シスプラチン（CDDP）、カルボプラチン、EGFR阻害剤（ゲフィチニブおよびセツキシマブ）、プロカルバジン、メクロレタミン、シクロホスファミド、カンプトテシン、COX-2阻害剤（例えば、セレコキシブ）、イホスファミド、メルファラン、クロラムブシル、ブスルファン、ニトロソウレア、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン（アドリアマイシン）、ブレオマイシン、プリコマイシン（plicomycin）、マイトマイシン、エトポシド（VP16）、タモキシフェン、ラロキシフェン、エストロゲン受容体結合剤、タキソール、タキソテール、ゲムシタビン、ナベルビン、ファルネシルタンパク質トランスフェラーゼ阻害剤、トランスプラチナ（transplatinum）、5-フルオロウラシル、ビンクリスチン、ビンブラスチン、およびメトトレキサート、または前述の任意の類似体もしくは誘導体変異体を含むが、それらに限定されない。
あるいはまたは付加的に、本発明の方法におけるmiRNA分子は、癌治療薬から非癌細胞を保護し、mir-16、mir-24、mir-30a-3p、mir-125b、mir-152、mir-194、mir-197、mir-214、およびmir-331からなる群より選択される。
概して、miRNAの阻害剤は、成熟miRNAに対応する核酸分子が与えられる場合と比較して、反対の効果を達成するために与えられ得る。同様に、成熟miRNAに対応する核酸分子は、miRNAの阻害剤が与えられる場合と比較して、反対の効果を達成するために与えられ得る。例えば、細胞増殖を増加させるmiRNA分子は、増殖を増加させるために細胞に提供することができ、またはそのような分子の阻害剤は、細胞増殖を減少させるために細胞に提供することができる。本発明は、本明細書において開示される異なるmiRNA分子およびmiRNA阻害剤で観測される異なる生理学的効果との関連でこれらの態様を意図する。これらは、以下の生理学的効果を含むが、それらに限定されない：細胞増殖を増加させることおよび減少させること、アポトーシスを増加させることまたは減少させること、形質転換を増加させること、細胞生存率を増加させることまたは減少させること、ERKを活性化すること、hTertを活性化/誘導することまたは阻害すること、Stat3の刺激を阻害すること、生存細胞数を低下させるまたは増加させること、および細胞周期の特定の期における細胞の数を増加させるまたは減少させること。本発明の方法は、概して、一つまたは複数の異なるmiRNA分子に対応する一つまたは複数の異なる核酸分子を提供するまたは導入する段階を含むことが意図される。以下の、少なくとも以下の、または多くとも以下の数の異なる核酸分子が、提供され得るまたは導入され得ることが意図される：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、またはそこに導き出せる任意の範囲。これは、細胞に提供され得るまたは導入され得る異なるmiRNA分子の数にも適用する。
本発明は、本発明の組成物または本発明の方法を遂行するための組成物を含むキットにも関係する。いくつかの態様において、キットは、一つまたは複数のmiRNA分子を評価するために使用され得る。特定の態様において、キットは、少なくとももしくは多くとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、もしくはそれより多くの合成miRNA分子もしくはmiRNA阻害剤、またはそこに導き出せる任意の範囲および組み合わせを含む。いくつかの態様において、細胞におけるmiRNA活性を評価するためのキットがある。
キットは、チューブ、ボトル、バイアル、シリンジなどの容器、またはその他の適した容器手段に個々に包装することができるまたは入れることができる、構成要素を含み得る。
個々の構成要素は、濃縮量でキットにおいて提供されてもよい；いくつかの態様において、構成要素は、それがその他の構成要素との溶液におけるのと同じ濃度で個々に提供される。構成要素の濃度は、1×、2×、5×、10×、もしくは20×、またはそれより高い濃度として提供され得る。
治療的、予後診断的、または診断的適用に対する本発明の合成miRNA、非合成、および/またはmiRNA阻害剤を使用するためのキットは、本発明の一部として含まれる。本明細書において議論されるものなどの生物学的活性に影響を与えることが報告される任意のmiRNAに対応する任意のそのような分子が、具体的に意図される。
陰性および/または陽性対照合成miRNAおよび/またはmiRNA阻害剤が、いくつかのキット態様に含まれる。対照分子は、トランスフェクション効率および/または細胞におけるトランスフェクション誘導変化に対する対照を検証するために使用され得る。
本明細書において記載される任意の方法または組成物は、本明細書において記載される任意のその他の方法または組成物に関して遂行され得ること、および異なる態様が組み合わせられ得ることが意図される。miRNA分子またはmiRNAに関して本明細書において議論される任意の方法および組成物は、生理学的環境下で成熟miRNAになることを可能にするのに適した条件に合成miRNAが曝露される程度まで、合成miRNAに対して遂行され得ることが具体的に意図される。出願当初の特許請求の範囲は、任意の出願した特許請求の範囲または出願した特許請求の範囲の組み合わせに複数従属している特許請求の範囲をカバーすることが意図される。
特定のmiRNAに名称が関連する本発明の任意の態様は、配列が特定のmiRNAの成熟配列と少なくとも80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99％同一であるmiRNAに関連する態様をカバーすることも意図される。
本出願の全体において、「約」という用語は、値が、値を決定するために使用したデバイスまたは方法に対するエラーの標準偏差を含むことを示すために使用される。
請求項の範囲および/または明細書において、「含む」という用語とともに使用される場合、「一つの（a）」または「一つの（an）」という単語の使用は、「一つ」を意味し得るが、それは、「一つまたは複数」、「少なくとも一つ」および「一つまたは一つよりも多い」の意味とも一致する。
実施例セクションにおいて記載される任意の態様が、本発明の態様として含まれることが具体的に意図される。
本発明のその他の目的、特徴、および利点は、以下の詳細な説明から明白になると思われる。しかしながら、本発明の精神および範囲内での様々な変化および改変が、この詳細な説明から当業者にとって明白になると思われるので、詳細な説明および特定の例は、本発明の特定の態様を示すが、実例としてのみ与えられる、ということが理解されるべきである。
添付の図面は、本明細書の一部を形成し、本発明の特定の局面をさらに実証するために含まれる。本発明は、本明細書において提示される特定の態様の詳細な説明との組み合わせにおいて、これらの図面の一つまたは複数を参照することによって、より良く理解され得る。
実施態様の説明
本発明は、miRNAの調製および特徴付けに関する組成物および方法、ならびに治療的、予後診断的、および診断的適用に対するmiRNAの使用に向けられる。細胞にmiRNAを導入するための以前の不十分なプラスミドに基づくシステムにともなう問題を克服するために、本発明者らは、不死化および初代細胞の両方に高効率で送達され得る小さな部分的二本鎖RNAを開発した。小さなRNAは、内因的に発現されるmiRNAと同じ機能的活性を有する。小さなRNAは、プラスミドよりもより高効率で細胞に送達され得るので、それらは、より検出かつ定量しやすいより強い表現型を誘導し、細胞におけるmiRNAの機能の多くを同定することを可能にする。
本発明者らは、細胞にmiRNAを導入するために使用され得る小さな二本鎖RNA分子のライブラリー、ならびに細胞に存在する公知のmiRNAの活性を阻害するアンチセンス分子のライブラリーも作製した。これらのライブラリーは、細胞周期、アポトーシス、分化、生存率、血管形成、代謝、および治療的潜在性を有するその他のプロセスなどの細胞プロセスに対して不可欠であるmiRNAを同定するために、細胞における一つまたは複数のmiRNAを逐次上方制御または下方制御するために使用されている。p53、MYC、およびRASなどの重要な遺伝子の発現を調節するmiRNAも、疾患を処置することに対して重要な介入ポイントを提供し得ると考えられるmiRNAをさらに突き止めるために、同定されかつ特徴付けられている。例えば、let-7は、RASに関与することが示されている。参照により本明細書に組み入れられるJohnson et al., 2005を参照されたい。miRNA活性を連続的にモジュレートするおよび細胞表現型に関してアッセイするこれらのプロセスは、まとめてmiRNA機能的スクリーニングと呼ばれる。
I. miRNA分子
マイクロRNA分子（「miRNA」）は、概して、長さが21〜22ヌクレオチドであるが、17および25までのヌクレオチドの長さが報告されている。miRNAは、より長い前駆体RNA分子（「前駆体miRNA」）から各々プロセスされる。前駆体miRNAは、非タンパク質コード遺伝子から転写される。前駆体miRNAは、ステムループまたは折り畳み様構造を形成することを可能にする相補性の2つの領域を有し、動物においてはDicerと呼ばれる酵素によって切断される。Dicerは、リボヌクレアーゼIII様ヌクレアーゼである。プロセスされたmiRNAは、典型的にはステムの一部である。
プロセスされたmiRNA（「成熟miRNA」とも呼ばれる）は、特定の標的遺伝子を下方制御するために、大きな複合体の一部となる。動物miRNAの例は、標的と不完全に塩基対をなし、翻訳を停止するものを含む（Olsen et al., 1999; Seggerson et al., 2002）。siRNA分子も、Dicerによってプロセスされるが、長い二本鎖RNA分子からである。siRNAは、動物細胞において天然に見出されていないが、RNA誘導サイレンシング複合体（RISC）においてそのような細胞内で機能し、mRNA標的の配列特異的切断を方向付けることができる（Denli et al., 2003）。
内因性miRNA分子の調査は、全体として参照により本明細書に組み入れられる米国特許出願第60/575,743号において記載される。
合成miRNA
miRNAは、miRNAにハイブリダイズするmRNAの翻訳を調節するタンパク質複合体が成熟一本鎖RNAと結合する場合に、細胞において明らかに活性がある。内因的に発現されるmiRNAと同じ方式で細胞に影響を及ぼす外因性RNA分子を導入することは、内因性成熟miRNAと同じ配列の一本鎖RNA分子が、翻訳制御を促進するタンパク質複合体によって取り込まれることを必要とする。様々なRNA分子デザインが評価されている。miRNA経路による望ましい一本鎖miRNAの取り込みを最大にする三つの一般的なデザインが同定されている。三つのデザインの少なくとも一つを有するmiRNA配列を有するRNA分子は、合成miRNAと呼ばれる。
本発明の合成miRNAは、いくつかの態様において、二つのRNA分子を含み、一つのRNAは、天然の成熟miRNAと同一である。成熟miRNAと同一であるRNA分子は、活性鎖と呼ばれる。相補鎖と呼ばれる第二のRNA分子は、活性鎖と少なくとも部分的に相補的である。活性および相補鎖は、細胞におけるmiRNA活性化の直前にタンパク質複合体によって結合される天然のmiRNA前駆体と類似の合成miRNAと呼ばれる二本鎖RNAを作製するためにハイブリダイズされる。合成miRNAの活性を最大にすることは、活性鎖の取り込みを最大にすること、および翻訳のレベルにおいて遺伝子発現を調節するmiRNAタンパク質複合体による相補鎖の取り込みを最小にすることを必要とする。最適なmiRNA活性を提供する分子デザインは、相補鎖に対する修飾に関する。
二つのデザインは、相補鎖に化学的修飾を組み入れる。第一の修飾は、その5'末端におけるリン酸またはヒドロキシル以外の化学基を有する相補的RNAを作製することに関する。5'修飾の存在は、相補鎖の取り込みを明らかに排除し、その後、miRNAタンパク質複合体による活性鎖の取り込みを助ける。5'修飾は、NH2、NHCOCH3、ビオチン、およびその他を含む様々な分子のいずれかであり得る。
miRNA経路による相補鎖の取り込みを有意に低下させる第二の化学的修飾戦略は、相補鎖の最初の2〜6ヌクレオチドに糖修飾を有するヌクレオチドを組み入れることである。第二のデザイン戦略と一致する糖修飾は、合成miRNA活性をさらに強化するために、第一のデザイン戦略と一致する5'末端修飾と連結され得ることが留意されるべきである。
第三の合成miRNAデザインは、活性鎖と相補的でない相補鎖の3'末端にヌクレオチドを組み入れることに関する。結果として生じる活性および相補的RNAのハイブリッドは、活性鎖の3'末端において非常に安定であるが、活性鎖の5'末端において比較的不安定である。siRNAをともなう調査は、5'ハイブリッド安定性が、細胞におけるmiRNA経路に少なくとも関連するRNA干渉を支持するタンパク質複合体によるRNA取り込みの主要な指標であることを示す。本発明者らは、相補的RNA鎖におけるミスマッチの賢明な使用が、合成miRNAの活性を有意に強化することを見出した。
MiRNAライブラリー
合成miRNAに対する主要な適用は、miRNAの個々または群に対する細胞機能の同定である。本発明者らは、培養細胞に公知のmiRNAの各々を逐次導入するために使用され得る合成miRNAのライブラリーを作製した（図6）。次いで、異なる合成miRNAの各々を有する細胞集団は、存在が細胞表現型を誘導するmiRNAを同定するためにアッセイされ得る。
本発明者らは、miRNA活性を阻害するアンチセンス分子のライブラリーを作製した。miRNA阻害剤は、非存在が細胞表現型を誘導するmiRNAを同定するために、細胞におけるmiRNAの活性を連続的に阻害するために使用される。
ライブラリーにおける異なる合成miRNAまたはmiRNA阻害剤の数は、可変である。ライブラリーに少なくとももしくは多くとも
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もしくはそれより多く、またはそこに導き出せる任意の範囲の異なるmiRNA特異的分子があり得ることが意図される。特定の態様において、ライブラリーは、5〜1000の異なるmiRNA特異的分子、20〜500の異なるmiRNA特異的分子、50〜250の異なるmiRNA特異的分子、または100〜225のmiRNA特異的分子を有する。「異なる」miRNA特異的分子は、異なる配列を有するmiRNAに特異的である核酸を指す。
合成miRNAは、主としてRNAから作られることが意図されるが、いくつかの態様において、それらは、RNA、ヌクレオチド類似体、DNA、またはDNA、RNA、ヌクレオチド類似体、およびPNAの任意の組み合わせであり得る。
上で示唆されるように、本発明のライブラリーは、一つまたは複数のmiRNAに特異的であり得ることが意図される。本発明の態様において、ライブラリーは
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もしくはそれより多く、またはそこに導き出せる任意の範囲の異なるmiRNAまたはmiRNA阻害剤を有する。従って、ライブラリーは、これらの異なるmiRNAに対する一つまたは複数の核酸を含むことが理解される。特定の態様において、ライブラリーは、ヒトmiRNAに特異的であるが、複数の生物体に対するライブラリーが意図される。
本発明のRNA分子は、miRNA領域または相補領域を有する。特定の態様において、合成miRNAまたはmiRNA阻害剤は、SEQ ID NO：1〜805（両端の数値を含む）のいずれかに由来する配列または相補的配列を有する。本発明の合成核酸分子は、SEQ ID NO：1〜805またはそれらの相補体における成熟miRNA配列のいずれかに由来し得ることが特に意図される。
上で議論されるように、miRNAは、前駆体分子からプロセスされる。特定の態様において、成熟miRNAの特定の長さは未知である。合成miRNAおよびmiRNA阻害剤ライブラリーのバージョンは、予測miRNA配列の上流および/または下流にコード配列の少なくとも1〜5ヌクレオチドを伸張する配列を含むことが意図される。いくつかの態様において、分子は、片側または両側（5'および/または3'末端）の優勢プロセスmiRNAをコードする配列に隣接する1、2、3、4、5、6、7まで、もしくはそれより多くの連続したヌクレオチド、またはそこに導き出せる任意の範囲を有する。
本発明は、公知のmiRNAのすべてに対する機能的プロファイルを作製するための方法に関係する。「機能的プロファイル」という用語は、合成miRNAおよびmiRNA阻害剤ライブラリーを使用して、細胞におけるmiRNAを導入するおよび阻害することに起因する細胞表現型に関するデータのセットを指す。個々のmiRNAに対する機能的プロファイルは、治療的または診断的潜在性を有するmiRNAの同定を可能にすると思われる。例えば、miRNAに対する機能的プロファイルは、その非存在が、無制御細胞増殖およびDNA損傷後にアポトーシスを誘導することの不可能性をもたらすことを明らかにし得ると考えられる。さらに、p53の発現は、miRNAが合成miRNAで上方制御されている、またはmiRNA阻害剤で下方制御されているかどうかと相関する。細胞増殖、アポトーシス、およびp53発現へのそのつながりに基づいて、このmiRNAは、癌治療薬に対する標的であり得ると考えられる。
特定の態様において、方法は、特定のmiRNAの活性と疾患または病態に一致する細胞表現型との間の相関を検出することによって、疾患または病態を示すmiRNAを同定することに関係する。
本発明のライブラリーは、ヒト、マウス、およびラットなどの哺乳動物を具体的に含むがそれらに限定されない、miRNAを有する任意の生物体からのmiRNA配列を含み得る。少なくともまたは多くとも
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またはそれより多くの異なる合成miRNAおよび/またはmiRNA阻害剤（すなわち、異なるmiRNA遺伝子に由来する異なる配列を有するmiRNA特異的分子）を有するライブラリーが、具体的に意図される。SEQ ID NO：1〜805、特にmiRNA配列（成熟配列）またはその相補体に対応するもののいずれかに関して先の文において記載されるようなライブラリーが、具体的に意図される。
A. 核酸
本発明は、培養細胞においてmiRNAを導入または阻害し得る核酸分子に関係する。核酸は、化学的合成によって選択的に産生されるが、細胞においてまたは精製酵素によってインビトロで産生されている可能性がある。それらは、粗製であり得るまたは精製され得る。「miRNA」という用語は、他に特に示されなければ、その前駆体から切断された後の、プロセスされたRNAを指す。表1は、どのSEQ ID NOが、miRNAの特定の前駆体配列に対応し、SEQ ID NO内のどの配列が、成熟配列に対応するのかを示す。miRNAの名称は、状況に応じて、しばしば短縮されて接頭語なしで呼ばれ、そのようなものとして理解されると思われる。他に特に示されなければ、本出願において言及されるmiRNAは、mir-Xまたはlet-Xとして同定されるヒト配列であり、Xは番号および/または文字である。
（表１）ヒトmiRNA配列
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（表２）マウスmiRNA配列
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（表３）ラットmiRNA配列
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miRNAは、ゲノム配列または遺伝子に由来することが理解される。この点において、「遺伝子」という用語は、所与のmiRNAに対する前駆体miRNAをコードするゲノム配列を指すために単純化のために使用される。しかしながら、本発明の態様は、プロモーターまたはその他の調節性配列などの、その発現に関与するmiRNAのゲノム配列を含み得る。
「組換え」という用語が使用されることがあり、これは、概して、インビトロで操作されている分子、またはそのような分子の複製もしくは発現産物である分子を指す。
「核酸」という用語は、当技術分野において周知である。本明細書において使用されるような「核酸」は、概して、核酸塩基を含むDNA、RNA、またはその誘導体もしくは類似体の分子（一本または複数鎖）を指すと思われる。核酸塩基は、例えば、DNA（例えば、アデニン「A」、グアニン「G」、チミン「T」、またはシトシン「C」）またはRNA（例えば、A、G、ウラシル「U」、またはC）において見出される天然のプリンまたはピリミジン塩基を含む。「核酸」という用語は、各々「核酸」という用語の亜属として、「オリゴヌクレオチド」および「ポリヌクレオチド」という用語を包含する。
「miRNA」という用語は、概して、一本鎖分子を指すが、特定の態様において、本発明において遂行される分子は、同じ一本鎖分子の別の領域または別の核酸と、部分的に（鎖の長さにわたって10〜50％相補的）、実質的に（鎖の長さにわたって50％よりも高いが100％よりは低く相補的）、または完全に相補的である、領域または付加的な鎖も包含すると思われる。したがって、核酸は、一つもしくは複数の相補鎖もしくは自己相補鎖、または分子を含む特定の配列の「相補体」を含む分子を包含し得る。例えば、前駆体miRNAは、100％まで相補的である自己相補領域を有し得る。
本明細書において使用されるように、「ハイブリダイゼーション」、「ハイブリダイズする」、または「ハイブリダイズすることが可能な」は、二本鎖もしくは三本鎖分子、または部分的な二本鎖もしくは三本鎖性質を有する分子の形成を意味することが理解される。本明細書において使用されるような「アニールする」という用語は、「ハイブリダイズする」の同義語である。「ハイブリダイゼーション」、「ハイブリダイズする」、または「ハイブリダイズすることが可能な」という用語は、「ストリンジェントな条件」または「高ストリンジェンシー」という用語、および「低ストリンジェンシー」または「低ストリンジェンシー条件」という用語を包含する。
本発明の合成核酸は、いくつかの態様において、SEQ ID NO：1〜805において記載される任意のmiRNAのmiRNA配列、および/またはその相補体を有する任意の配列を含むと思われる。本発明の核酸配列は、SEQ ID NO：1〜805からの少なくともまたは多くとも5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150の連続したヌクレオチド（またはそこに導き出せる任意の範囲）を有し得る、またはその相補体であり得ることが意図される。その他の態様において、核酸は、SEQ ID NO：1〜805のmiRNA配列と、またはSEQ ID NO：1〜805の任意の全配列と、またはそこに導き出せる任意の組み合わせもしくは範囲と、少なくともまたは多くとも80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100％同一または相補的である。
さらに、付録において配列が提供される。付録は、1）スクリーニングされたmiRNA、そのうちの任意の一つが、本発明の任意のアレイまたは方法を使用するためにスクリーニングされ得る；2）そのmiRNAに対してスクリーニングするために使用されるプローブの名称；および3）名付けられたプローブの配列、のリストを提供する。特定のプローブが、一つもしくは複数の標的miRNAまたは標的miRNAのセット（標的miRNAのセットは、関連するまたは同じ遺伝子ファミリーであるセットに加えて、無関係なRNAを完全に含み得る）の発現のレベルを同定するために使用され得ることは明らかである。付録におけるこれらの配列のいずれかが、本発明の態様において使用され得ることが意図される。
1. 核酸塩基
本明細書において使用されるように、「核酸塩基」は、例えば、少なくとも一つの天然の核酸（すなわち、DNAおよびRNA）において見出される天然の核酸塩基（すなわち、A、T、G、C、またはU）、ならびにそのような核酸塩基の天然のまたは非天然の誘導体および類似体などの、複素環式塩基を指す。核酸塩基は、概して、天然の核酸塩基対（例えば、AとT、GとC、およびAとUの間の水素結合）を置換し得る様式で、少なくとも一つの天然の核酸塩基との一つまたは複数の水素結合を形成し得る（「アニールする」または「ハイブリダイズする」）。
「プリン」および/または「ピリミジン」核酸塩基は、天然のプリンおよび/またはピリミジン核酸塩基を包含し、アルキル、カルボキシアルキル、アミノ、ヒドロキシル、ハロゲン（すなわち、フルオロ、クロロ、ブロモ、またはヨード）、チオール、またはアルキルチオール部分の一つまたは複数によって置換されるプリンまたはピリミジンを含むがそれらに限定されない、その誘導体および類似体も包含する。好ましいアルキル（例えば、アルキル、カルボキシアルキルなど）部分は、約1から、約2、約3、約4、約5、約6までの炭素原子からなる。プリンまたはピリミジンのその他の非限定的な例は、デアザプリン、2,6-ジアミノプリン、5-フルオロウラシル、キサンチン、ヒポキサチン、8-ブロモグアニン、8-クロログアニン、ブロモチミン、8-アミノグアニン、8-ヒドロキシグアニン、8-メチルグアニン、8-チオグアニン、アザグアニン、2-アミノプリン、5-エチルシトシン、5-メチルシトシン、5-ブロモウラシル、5-エチルウラシル、5-ヨードウラシル、5-クロロウラシル、5-プロピルウラシル、チオウラシル、2-メチルアデニン、メチルチオアデニン、N,N-ジメチルアデニン、アザアデニン、8-ブロモアデニン、8-ヒドロキシアデニン、6-ヒドロキシアミノプリン、6-チオプリン、4-(6-アミノヘキシル/シトシン)、および同様のものを含む。その他の例は、当業者にとって周知である。
核酸塩基は、本明細書において記載されるまたは当業者にとって公知の任意の化学的または天然の合成方法を使用して、ヌクレオシドまたはヌクレオチドに含まれ得る。そのような核酸塩基は、標識され得る、またはそれは、標識されかつ核酸塩基を含む分子の一部であり得る。
2. ヌクレオシド
本明細書において使用されるように、「ヌクレオシド」は、核酸塩基リンカー部分に共有結合される核酸塩基を含む、個々の化学的ユニットを指す。「核酸塩基リンカー部分」の非限定的な例は、5-炭素原子を含む糖（すなわち、「五炭糖（5-carbon sugar）」）であり、デオキシリボース、リボース、アラビノース、または五炭糖の誘導体もしくは類似体を含むが、それらに限定されない。五炭糖の誘導体または類似体の非限定的な例は、2'-フルオロ-2'-デオキシリボースまたは糖環において炭素が酸素原子に置換される炭素環式糖を含む。
核酸塩基リンカー部分への核酸塩基の共有結合の異なる型は、当技術分野において公知である。非限定的な例として、プリン（すなわち、AまたはG）または7-デアザプリン核酸塩基を含むヌクレオシドは、典型的には、プリンまたは7-デアザプリンの9位を五炭糖の1'位に共有結合させる。別の非限定的な例において、ピリミジン核酸塩基（すなわち、C、T、またはU）を含むヌクレオシドは、典型的には、ピリミジンの1位を五炭糖の1'位に共有結合させる（Kornberg and Baker, 1992）。
3. ヌクレオチド
本明細書において使用されるように、「ヌクレオチド」とは、「骨格部分」をさらに含むヌクレオシドを指す。骨格部分は、概して、核酸を形成するために、ヌクレオチドを含む別の分子または別のヌクレオチドに、ヌクレオチドを共有結合させる。天然のヌクレオチドにおける「骨格部分」は、典型的には、五炭糖に共有結合しているリン部分を含む。骨格部分の付着は、典型的には、五炭糖の3'または5'位のいずれかにおいて生じる。しかしながら付着のその他の型は、特に、ヌクレオチドが天然の五炭糖またはリン部分の誘導体または類似体を含む場合、当技術分野において公知である。
4. 核酸類似体
核酸は、天然の核酸に存在し得る、核酸塩基の誘導体または類似体、核酸塩基リンカー部分および/または骨格部分を含み得る、または完全にそれらからなり得る。核酸類似体を有するRNAは、本発明の方法に従って標識されてもよい。本明細書において使用されるように、「誘導体」は、天然の分子の化学的に修飾または変更された形態を指し、「模倣体」または「類似体」という用語は、天然の分子または部分に構造的に類似している場合もありまたは類似していない場合もあるが、同様の機能を保有する分子を指す。本明細書において使用されるように、「部分」は、概して、より大きな化学的または分子的構造のより小さな化学的または分子的構成要素を指す。核酸塩基、ヌクレオシド、およびヌクレオチド類似体または誘導体は、当技術分野において周知であり、記載されている（例えば、参照により本明細書に組み入れられるScheit, 1980を参照されたい）。
五炭糖および/または骨格部分誘導体もしくは類似体を含むヌクレオシド、ヌクレオチド、または核酸の付加的な非限定的な例は、以下におけるものを含む：dsDNAと三重らせんを形成しかつ/またはdsDNAの発現を妨げるプリン誘導体を含むオリゴヌクレオチドを記載する、米国特許第5,681,947号；特に蛍光核酸プローブとしての使用のために、DNAまたはRNAにおいて見出されたヌクレオシドの蛍光類似体を組み入れる核酸を記載する、米国特許第5,652,099号および第5,763,167号；強化ヌクレアーゼ安定性を保有するピリミジン環における置換をともなうオリゴヌクレオチド類似体を記載する、米国特許第5,614,617号；核酸検出において使用される修飾五炭糖（すなわち、修飾2'-デオキシフラノシル部分）を有するオリゴヌクレオチド類似体を記載する、米国特許第5,670,663号、第5,872,232号、および第5,859,221号；ハイブリダイゼーションアッセイにおいて使用され得る、水素以外の置換基によって4'位で置換される少なくとも一つの五炭糖部分を含むオリゴヌクレオチドを記載する、米国特許第5,446,137号；3'-5'インターヌクレオチドリンケージを有するデオキシリボヌクレオチドおよび2'-5'インターヌクレオチドリンケージを有するリボヌクレオチドの両方を有するオリゴヌクレオチドを記載する、米国特許第5,886,165号；インターヌクレオチドリンケージの3'位酸素が、核酸のヌクレアーゼ耐性を強化するために、炭素によって置換される、修飾インターヌクレオチドリンケージを記載する、米国特許第5,714,606号；ヌクレアーゼ耐性を強化する一つまたは複数の5'メチレンホスホン酸インターヌクレオチドリンケージを含むオリゴヌクレオチドを記載する、米国特許第5,672,697号；強化ヌクレアーゼ安定性および薬物を送達する能力または検出部分を提供するために、オリゴヌクレオチドの2'炭素への薬物または標識を含み得る置換基部分のリンケージを記載する、米国特許第5,466,786号および第5,792,847号；細胞取り込み、ヌクレアーゼへの耐性、および標的RNAへのハイブリダイゼーションを強化するために、隣接五炭糖部分の4'位および3'位を付着させる2または3炭素骨格リンケージを有するオリゴヌクレオチド類似体を記載する、米国特許第5,223,618号；核酸ハイブリダイゼーションプローブとして有用である少なくとも一つのスルファミン酸またはスルファミドインターヌクレオチドリンケージを含むオリゴヌクレオチドを記載する、米国特許第5,470,967号；改善されたヌクレアーゼ耐性、細胞取り込み、およびRNA発現を調節することに対して使用されるホスホジエステル骨格部分を置換する3または4の原子リンカー部分を有するオリゴヌクレオチドを記載する、米国特許第5,378,825号、第5,777,092号、第5,623,070号、第5,610,289号、および第5,602,240号；それらの膜浸透性および安定性を強化するために、オリゴヌクレオチドの2'-O位へ付着する疎水性担体薬剤を記載する、米国特許第5,858,988号；DNAまたはRNAへの強化ハイブリダイゼーション、ヌクレアーゼへの強化安定性を保有する、5'末端においてアントラキノンに接合するオリゴヌクレオチドを記載する、米国特許第5,214,136号；DNAが、強化ヌクレアーゼ耐性、結合親和性、およびRNA分解酵素Hを活性化する能力のために、2'-デオキシ-エリスロ-ペントフラノシルヌクレオチドを含む、PNA-DNA-RNAキメラを記載する、米国特許第5,700,922号；ならびに、DNA-RNAハイブリッドを形成するために、DNAに連結されるRNAを記載する、米国特許第5,708,154号；ユニバーサル蛍光標識を用いるヌクレオシド類似体の標識化を記載する、米国特許第5,728,525号。
ヌクレオシド類似体および核酸類似体に対する付加的な開示は、末端標識されるヌクレオシド類似体を記載する、米国特許第5,728,525号；米国特許第5,637,683号、第6,251,666号（L-ヌクレオチド置換）、および第5,480,980号（7-デアザ-2'デオキシグアノシンヌクレオチドおよびその核酸類似体）である。
その他の類似体の使用は、本発明との関連で使用に対して具体的に意図される。そのような類似体は、分子全体でまたは選択されたヌクレオチドでの両方で、本発明の合成核酸分子において使用され得る。それらは、1）リボース修飾（2'F、2'NH2、2'N3、4'チオ、または2'O-CH3）および2）リン酸修飾（ホスホロチオエート、ホスホン酸メチル、およびホスホロボレートなど）を含むが、それらに限定されない。そのような類似体は、リボヌクレアーゼによって切断されるそれらのキャパシティを低下させるまたは消失させることによってRNAに安定性を与えるように作製されている。それらのヌクレオチド類似体がRNAに存在する場合、それらは、動物におけるRNAの安定性に対する陽性効果を大いに有し得る。ヌクレオチド類似体の使用は、単独でまたは本発明の任意の核酸に対する合成miRNAの任意のデザイン修飾とともに使用され得る。
5. 修飾ヌクレオチド
本発明の合成miRNAおよびmiRNA阻害剤の両方は、それらの活性を強化するために修飾されるヌクレオチドの使用を具体的に意図する。そのようなヌクレオチドは、RNAの5'または3'末端にあるもの、ならびに分子内部にあるものを含む。合成miRNAの相補鎖において使用される修飾ヌクレオチドは、RNAの5'OHもしくはリン酸塩をブロックする、または合成miRNAの活性鎖の取り込みを強化する内部糖修飾を導入する。miRNA阻害剤に対する修飾は、ハイブリダイゼーションを強化するならびに細胞における分子を安定化させる内部糖修飾、および細胞における核酸をさらに安定化させる末端修飾を含む。合成miRNAまたはmiRNA阻害剤を含む細胞を同定するために、顕微鏡法またはその他の方法によって検出され得る修飾がさらに意図される。
B. 核酸の調製
核酸は、例えば、化学的合成、酵素的産生、または生物学的産生などの、当業者にとって公知の任意の技術によって作られ得る。本発明に従って合成miRNAは、組換え法を使用して産生され得ると考えられるが、化学的合成または酵素的産生によって合成miRNAを産生することが好ましい。同様に、miRNA阻害剤は、化学的合成または酵素的産生によって選択的に産生される。非合成miRNAは、組換えDNA技術に関する方法を含む多くの方法によって産生され得る。
核酸合成は、標準的な方法に従って行われる。例えば、Itakura and Riggs (1980)を参照されたい。付加的に、米国特許第4,704,362号、米国特許第5,221,619号、および米国特許第5,583,013号は、各々、合成核酸を調製する様々な方法を記載する。合成核酸（例えば、合成オリゴヌクレオチド）の非限定的な例は、参照により本明細書に組み入れられる欧州特許第266,032号において記載されるようなホスホトリエステル、ホスファイト、もしくはホスホロアミダイト化学、および固相技術を使用するインビトロ化学的合成によって、または参照により本明細書に各々組み入れられるFroehler et al., 1986および米国特許出願第5,705,629号によって記載されるようなデオキシヌクレオシドH-ホスホン酸中間体によって作られる核酸を含む。本発明の方法において、一つまたは複数のオリゴヌクレオチドが使用され得る。オリゴヌクレオチド合成の様々な異なるメカニズムが、例えば、米国特許第4,659,774号、第4,816,571号、第5,141,813号、第5,264,566号、第4,959,463号、第5,428,148号、第5,554,744号、第5,574,146号、第5,602,244号において開示されており、その各々が参照により本明細書に組み入れられる。
酵素的に産生される核酸の非限定的な例は、PCR(商標)（例えば、参照により本明細書に各々組み入れられる米国特許第4,683,202号および米国特許第4,682,195号を参照されたい）などの増幅反応、または参照により本明細書に組み入れられる米国特許第5,645,897号において記載されるオリゴヌクレオチドの合成において、酵素によって産生されるものを含む。
オリゴヌクレオチド合成は、当業者にとって周知である。オリゴヌクレオチド合成の様々な異なるメカニズムが、例えば、米国特許第4,659,774号、第4,816,571号、第5,141,813号、第5,264,566号、第4,959,463号、第5,428,148号、第5,554,744号、第5,574,146号、第5,602,244号において開示されており、その各々が参照により本明細書に組み入れられる。
基本的に、化学的合成は、ジエステル法、トリエステル法、ポリヌクレオチドホスホリラーゼ法によって、および固相化学によって、達成され得る。これらの方法は、以下でさらに詳細に議論される。
ジエステル法
ジエステル法は、主としてKhoranaおよび共同研究者らによって、使用可能な状態まで開発された最初のものであった（Khorana, 1979）。基本的な段階は、ホスホジエステル結合を含むジデオキシヌクレオチドを形成するための、二つの適切に保護されたデオキシヌクレオチドの接合である。ジエステル法は、良く確立されており、DNA分子を合成するために使用されている（Khorana, 1979）。
トリエステル法
ジエステル法とトリエステル法の主な差は、後者における、反応物質および産物のリン酸原子上の余分な保護基の存在である（Itakura et al., 1975）。リン酸保護基は、通常はクロロフェニル基であり、ヌクレオチドおよびポリヌクレオチド中間体が有機溶剤において可溶であるようにする。それ故に、精製は、クロロホルム溶液において行われる。方法におけるその他の改善は、（i）トリマーとより大きなオリゴマーとのブロックカップリング、（ii）中間体および最終産物の両方の精製に対する高性能液体クロマトグラフィーの大規模な使用、ならびに（iii）固相合成を含む。
ポリヌクレオチドホスホリラーゼ法
これは、多くの有用なオリゴヌクレオチドを合成するために使用され得る、DNA合成の酵素的方法である（Gillam et al., 1978; Gillam et al., 1979）。制御条件下で、ポリヌクレオチドホスホリラーゼは、主に、短いオリゴヌクレオチドに単一のヌクレオチドを付加する。クロマトグラフィー精製は、望ましい単一の付加化合物を得ることを可能にする。少なくともトリマーは、手順を開始するために必要とされ、このプライマーは、あるその他の方法によって得られなければならない。ポリヌクレオチドホスホリラーゼ法は、正常に機能し、関与する手順がほとんどの生化学者に良く知られているという利点を有する。
固相法
ポリペプチドの固相合成のために開発された技術を利用して、初めのヌクレオチドを固体支持体材料に付着させ、ヌクレオチドの段階的な付加を進めることが可能である。すべての混合および洗浄段階は、簡略化されており、手順は自動化できるようになる。これらの合成は、現在、自動核酸合成器を使用して、日常的に実施されている。
ホスホロアミダイト化学（Beaucage and Lyer, 1992）は、オリゴヌクレオチドの合成に対して、断然最も広く使用されるカップリング化学になった。当業者にとって周知のように、オリゴヌクレオチドのホスホロアミダイト合成は、活性化中間体を形成するための活性化剤を用いた反応による、ヌクレオシドホスホロアミダイトモノマー前駆体の活性化に関与し、その後にオリゴヌクレオチド産物を形成するための成長オリゴヌクレオチド鎖への活性化中間体の逐次付加（概して、適した固体支持体へ一端で固定される）が続く。
組換え法
細胞において核酸を産生するための組換え法は、当業者にとって周知である。これらは、（大量の望ましいRNA分子を産生するために）標的細胞または単に宿主細胞であり得る細胞へ核酸を送達するための、ベクター、プラスミド、コスミド、およびその他の媒体の使用を含む。または、そのような媒体は、RNA分子を生成するための試薬が存在する限りは、細胞を含まないシステムとの関連で使用され得る。そのような方法は、参照により本明細書に組み入れられるSambrook, 2003、Sambrook, 2001、およびSambrook, 1989において記載されるものを含む。
特定の態様において、本発明は、合成的ではない核酸分子に関係する。いくつかの態様において、核酸分子は、天然の核酸の化学的構造、および一本鎖一次miRNA（Lee 2002を参照されたい）、一本鎖前駆体miRNA、または一本鎖成熟miRNAの正確で完全な配列などの、天然の核酸の配列を有する。組換え技術の使用に加えて、そのような非合成核酸は、例えば、オリゴヌクレオチドを作製するために使用される技術を用いることによって、化学的に生成され得る。
C. 合成miRNAのデザイン
合成miRNAは、典型的には、調査されている成熟miRNAと配列が同一である活性鎖および活性鎖と少なくとも部分的に相補的である相補鎖の二つの鎖を含む。活性鎖は、生物学的に関連性がある分子であり、mRNA分解または翻訳制御のいずれかを介して翻訳をモジュレートする細胞における複合体によって選択的に取り込まれるはずである。活性鎖の選択的取り込みは、二つの重大な結果を有する：（1）合成miRNAの観測される活性が、劇的に増加する、および（2）相補鎖の取り込みおよび活性化によって誘導される意図されない効果が、本質的に排除される。本発明に従って、いくつかの合成miRNAデザインは、活性鎖の選択的取り込みを確実にするために使用され得る。
5'ブロッキング剤
相補鎖の5'末端におけるリン酸またはヒドロキシル以外の安定部分の導入は、miRNA経路におけるその活性を害する。これは、合成miRNAの活性鎖のみが、細胞における翻訳を調節するために使用されることを確実にする。5'修飾は、NH2、ビオチン、アミン基、低級アルキルアミン基、アセチル基、2'O-Me、DMTO、フルオレセイン、チオール、もしくはアクリジン、または官能性のこの型を有する任意のその他の基を含むが、それらに限定されない。
その他のセンス鎖修飾
合成miRNAの相補鎖における2'-OMe、NH2、ビオチン、アミン基、低級アルキルアミン基、アセチル基、DMTO、フルオレセイン、チオール、もしくはアクリジン、または官能性のこの型を有する任意のその他の基などのヌクレオチド修飾の導入は、相補鎖の活性を消失させ、かつmiRNAの活性鎖の取り込みを強化し得る。
センス鎖における塩基ミスマッチ
siRNA（Schwarz 2003）と同様に、合成miRNAの活性鎖の5'および3'末端の相対安定性は、miRNA経路による活性鎖の取り込みおよび活性化を明らかに決定する。合成miRNAの相補鎖の3'末端における塩基ミスマッチの戦略的配置によって合成miRNAの活性鎖の5'末端を不安定化することは、活性鎖の活性を強化し、かつ相補鎖の活性を本質的に消失させる。
D. 宿主細胞および標的細胞
miRNA機能を理解するために使用される細胞は、任意の生物体（例えば、植物、動物、原生動物、ウイルス、細菌、または真菌）に由来し得る、または含まれ得る。植物は、単子葉植物、双子葉植物、または裸子植物であり得る；動物は、脊椎動物または無脊椎動物であり得る。好ましい微生物は、農業においてまたは工業によって使用されるもの、および植物または動物に対して病原性であるものである。真菌は、カビおよび酵母形態の両方における生物体を含む。脊椎動物の例は、魚類、ならびにウシ、ヤギ、ブタ、ヒツジ、ハムスター、マウス、ラット、およびヒトを含む哺乳類を含む；無脊椎動物は、線虫、昆虫、クモ形類動物、およびその他の節足動物を含む。好ましくは、細胞は、脊椎動物細胞である。より好ましくは、細胞は、哺乳動物細胞である。
miRNA機能を理解するために使用される細胞は、生殖細胞系もしくは体細胞、分化全能性もしくは多能性、分裂もしくは非分裂、実質もしくは上皮、不死化もしくは形質転換、または同様のものからであり得る。細胞は、配偶子または胚であり得る；胚の場合、それは、単一細胞胚または構成細胞または多細胞胚からの細胞であり得る。したがって、「胚」という用語は、胎児組織を包含する。miRNA機能分析に対して使用される細胞は、幹細胞などの未分化細胞、または胎児組織を含む器官もしくは組織の細胞からなどの分化細胞、または生物体に存在する任意のその他の細胞であり得る。分化した細胞型は、脂肪細胞、線維芽細胞、筋細胞、心筋細胞、内皮細胞、ニューロン、グリア、血液細胞、巨核球、リンパ球、マクロファージ、好中球、好酸球、好塩基球、肥満細胞、白血球、顆粒球、ケラチノサイト、軟骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞、肝細胞、および内分泌または外分泌腺の細胞を含む。または、細胞は、生殖細胞、ナース細胞、上皮細胞、内皮細胞、ホルモン分泌細胞、収縮性細胞、骨格筋細胞、心筋細胞、血液細胞、または骨、骨髄、脳、乳房、子宮頚、結腸、胃腸管、心臓、腎臓、大腸、肝臓、肺、リンパ節、卵巣、膵臓、前立腺、小腸、脊椎もしくは脊髄、脾臓、胃、精巣、胸腺、または子宮からの細胞とみなされ得る。
本明細書において使用されるように、「細胞」、「細胞株」、および「細胞培養」という用語は、ほとんど同じ意味で使用され得る。これらの用語のすべては、細胞分裂によって形成される任意のおよびすべてのその後の世代である、それらの子孫も含む。すべての子孫は、故意のまたは故意でない突然変異により、同一でない場合もあることが理解される。宿主細胞は、外因性核酸が宿主細胞に移されるまたは導入されるプロセスを指す「トランスフェクト」または「形質転換」され得る。形質転換細胞は、初代被験体細胞およびその子孫を含む。本明細書において使用されるように、「遺伝子工学的」および「組換え」細胞または宿主細胞という用語は、例えば低分子干渉RNAまたはレポーター遺伝子をコードする鋳型構築物などの外因性核酸配列が導入されている細胞を指すことが意図される。それ故に、組換え細胞は、組換え的に導入された核酸を含まない天然の細胞と識別可能である。
組織は、核酸送達組成物および/または付加的な薬剤で形質転換されるまたは接触される宿主細胞または細胞を含み得る。組織は、生物体から離れるまたは分離され得る。特定の態様において、組織およびその構成細胞は、血液（例えば、造血細胞（ヒト造血前駆細胞、ヒト造血幹細胞、CD34+細胞、CD4+細胞など）、リンパ球、およびその他の血液系統細胞）、骨髄、脳、幹細胞、血管、肝臓、肺、骨、乳房、軟骨、子宮頚、結腸、角膜、胚、子宮内膜、内皮、上皮、食道、筋膜、線維芽細胞、濾胞、神経節細胞、グリア細胞、杯細胞、腎臓、リンパ節、筋、ニューロン、卵巣、膵臓、末梢血、前立腺、皮膚、皮膚、小腸、脾臓、胃、精巣を含み得るが、それらに限定されない。
特定の態様において、宿主細胞または組織は、少なくとも一つの生物体に含まれ得る。特定の態様において、生物体は、ヒト、霊長類、またはネズミであり得る。その他の態様において、生物体は、当業者によって理解されるように、任意の真核生物またはさらに原核生物（例えば、真性細菌、古細菌）であり得る（例えば、ウェブページhttp://phylogeny.arizona.edu/tree/phylogeny.htmlを参照されたい）。当業者は、上に記載される宿主細胞のすべてを、それらを維持しかつ分裂させて子孫を形成させるためのインキュベート条件をさらに理解すると考えられる。
E. 標識およびタグ
合成miRNAおよびmiRNA阻害剤は、検出または単離目的に対して、放射性、酵素、比色、またはその他の標識またはタグで標識され得る。核酸は、本発明のいくつかの態様において、蛍光で標識され得る。複合体としての使用に対して意図される蛍光標識は、Alexa 350、Alexa 430、AMCA、BODIPY 630/650、BODIPY 650/655、BODIPY-FL、BODIPY-R6G、BODIPY-TMR、BODIPY-TRX、カスケードブルー（Cascade Blue）、Cy3、Cy5、6-FAM、イソチオシアン酸フルオレセイン、HEX、6-JOE、オレゴングリーン488、オレゴングリーン500、オレゴングリーン514、パシフィックブルー（Pacific Blue）、REG、ローダミングリーン、ローダミンレッド、レノグラフィン（Renographin）、ROX、SYPRO、TAMRA、TET、テトラメチルローダミン、および/またはテキサスレッドを含むが、それらに限定されない。
合成miRNAおよびmiRNA阻害剤は、二つの異なる標識で標識され得ることが意図される。さらに、蛍光共鳴エネルギー移動（FRET）が、本発明の方法において使用され得る（例えば、Klostermeier et al., 2002；Emptage, 2001；Didenko, 2001、参照により各々組み入れられる）。
標識核酸を可視化するまたは検出するための多くの技術が、簡単に利用できる。Stanley T. Crooke, 2000による参照は、そのような技術の議論を有し（6章）、参照により組み入れられる。そのような技術は、顕微鏡法、アレイ、蛍光光度法、ライトサイクラーまたはその他のリアルタイムPCR(商標)マシン、FACS分析、シンチレーションカウンター、ホスホイメージャー、ガイガーカウンター、MRI、CAT、抗体に基づく検出方法（ウェスタン、免疫蛍光、免疫組織化学）、組織化学技術、HPLC（Griffey et al., 1997）、分光法、キャピラリーゲル電気泳動（Cummins et al., 1996）、分光法；質量分析；放射線技術；および物質収支技術を含む。または、核酸は、それらの効率的な単離を可能にするために、標識またはタグされ得る。本発明のその他の態様において、核酸は、ビオチン化される。
F. 送達方法
本発明は、いくつかの態様において、細胞に核酸を送達することに関する。これは、スクリーニング方法の一部としてなされ得る、またはそれは、治療的もしくは診断的適用に関連し得る。
RNA分子は、ベクターに含まれる核酸分子によってコードされ得る。「ベクター」という用語は、核酸配列がそれが複製され得る細胞への導入のために挿入され得る担体核酸分子を指すために使用される。核酸配列は、それがベクターが導入されている細胞に対して外来であること、または配列が細胞における配列と相同であるが、配列が普通は見出されない宿主細胞核酸内の位置にあることを意味する「外因性」であり得る。ベクターは、プラスミド、コスミド、ウイルス（バクテリオファージ、動物ウイルス、および植物ウイルス）、および人工染色体（例えば、YAC）を含む。当業者は、両方とも参照により本明細書に組み入れられるSambrook et al., 1989およびAusubel et al., 1996において記載される標準的な組換え技術を介してベクターを構築する設備が良く整っていると考えられる。修飾ゲロニンなどの修飾ポリペプチドをコードすることに加えて、ベクターは、タグまたは標的分子などの非修飾ポリペプチド配列をコードし得る。標的分子は、望ましい核酸を特定の器官、組織、細胞、または被験体の体におけるその他の場所に向けるものである。
「発現ベクター」という用語は、転写されることが可能な遺伝子産物の少なくとも一部に対する核酸配列コードを含むベクターを指す。発現ベクターは、特定の宿主生物体において機能的に連結されるコード配列の転写およびおそらく翻訳に対して必要な核酸配列を指す様々な「制御配列」を含み得る。転写および翻訳を支配する制御配列に加えて、ベクターおよび発現ベクターは、同様にその他の機能を果たしかつ記載される核酸配列を含み得る。
発現ベクターが細胞に導入され得る多くの手法がある。本発明の特定の態様において、発現ベクターは、ウイルスまたはウイルスゲノムに由来する遺伝子工学ベクターを含む。特定のウイルスが、受容体媒介エンドサイトーシスを介して細胞に入る、宿主細胞ゲノムに組み込む、かつ安定にかつ効率的にウイルス遺伝子を発現する能力は、それらを哺乳動物細胞への外来遺伝子の移動に対して魅力的な候補にした（Ridgeway, 1988; Nicolas and Rubenstein, 1988; Baichwal and Sugden, 1986; Temin, 1986）。遺伝子ベクターとして使用された最初のウイルスは、パポバウイルス（シミアンウイルス40、ウシパピローマウイルス、およびポリオーマ）（Ridgeway, 1988; Baichwal and Sugden, 1986）およびアデノウイルス（Ridgeway, 1988; Baichwal and Sugden, 1986）を含むDNAウイルスであった。これらは、外来DNA配列に対して比較的低いキャパシティを有し、制限宿主スペクトルを有する。さらに、許容細胞におけるそれらの癌遺伝子潜在性および細胞変性効果は、安全性懸案事項をもたらす。それらは、8 kbまでの外来遺伝子材料のみに適合し得るが、様々な細胞株および実験動物に簡単に導入され得る（Nicolas and Rubenstein, 1988; Temin, 1986）。
レトロウイルスは、感染細胞においてそれらのRNAを二本鎖DNAに変換する能力によって特徴付けられる一本鎖RNAウイルスの群である；それらも、ベクターとして使用され得る。その他のウイルスベクターは、本発明における発現構築物として使用され得る。ワクシニアウイルス（Ridgeway, 1988; Baichwal and Sugden, 1986; Coupar et al., 1988）、アデノ関連ウイルス（AAV）（Ridgeway, 1988; Baichwal and Sugden, 1986; Hermonat and Muzycska, 1984）、およびヘルペスウイルスなどのウイルスに由来するベクターが使用され得る。それらは、様々な哺乳動物細胞に対していくつかの魅力的な特徴を提示する（Friedmann, 1989; Ridgeway, 1988; Baichwal and Sugden, 1986; Coupar et al., 1988; Horwich et al., 1990）。
本発明の組成物の発現に影響を与えるためのその他の核酸送達に適した方法は、核酸（例えば、DNA、ウイルスおよび非ウイルスベクターを含む）が、本明細書において記載されるように、または当業者にとって公知であるように、細胞小器官、細胞、組織、または生物体に導入され得る任意の方法を事実上含むと考えられている。そのような方法は、マイクロインジェクション（Harlan and Weintraub, 1985；米国特許第5,789,215号、参照により本明細書に組み入れられる）を含むインジェクション（米国特許第5,994,624号、第5,981,274号、第5,945,100号、第5,780,448号、第5,736,524号、第5,702,932号、第5,656,610号、第5,589,466号、および第5,580,859号、各々参照により本明細書に組み入れられる）による；電気穿孔法（米国特許第5,384,253号、参照により本明細書に組み入れられる）による；リン酸カルシウム沈殿（Graham and Van Der Eb, 1973; Chen and Okayama, 1987; Rippe et al., 1990）による；ポリエチレングリコールが後に続くDEAE-デキストランを使用すること（Gopal, 1985）による；直接的なソニックローディング（Fechheimer et al., 1987）による；リポソーム媒介トランスフェクション（Nicolau and Sene, 1982; Fraley et al., 1979; Nicolau et al., 1987; Wong et al., 1980; Kaneda et al., 1989; Kato et al., 1991）による；マイクロプロジェクタイル照射（PCT出願国際公開公報第94/09699号および第95/06128号；米国特許第5,610,042号；第5,322,783号、第5,563,055号、第5,550,318号、第5,538,877号、および第5,538,880号、各々参照により本明細書に組み入れられる）による；シリコンカーバイドファイバーとの攪拌（Kaeppler et al., 1990；米国特許第5,302,523号および第5,464,765号、各々参照により本明細書に組み入れられる）による；アグロバクテリウム（Agrobacterium）媒介形質転換（米国特許第5,591,616号および第5,563,055号、各々参照により本明細書に組み入れられる）による；またはプロトプラストのPEG媒介形質転換（Omirulleh et al., 1993；米国特許第4,684,611号および第4,952,500号、各々参照により本明細書に組み入れられる）による；乾燥/阻害媒介DNA取り込み（Potrykus et al., 1985）による、DNAの直接的な送達を含むが、それらに限定されない。これらなどの技術の適用を介して、細胞小器官、細胞、組織、または生物体は、安定にまたは一過的に形質転換され得る。
II. 合成miRNAおよびmiRNA阻害剤ライブラリーを用いたスクリーニング
本特許出願において使用されるように、スクリーニングは、複数のmiRNA特異的試薬が、個々の細胞集団または動物に別個に送達されるプロセスである。送達後の一つまたは複数の指定時間において、細胞集団または動物は、一つまたは複数の表現型に対してアッセイされる。陰性対照群における細胞または動物と有意に異なる表現型を有する細胞または動物は、陽性として分類される。試料において操作されていたmiRNAは、ヒットとして定義される。ヒットは、付加的な研究および潜在的な治療的開発に対する標的を示す。
いくつかの態様において、スクリーニングに対して複数段階プロセスがある。特定の態様において、四つの一般的な段階がある。
（1）調査される細胞プロセスをモニターするための定量アッセイを開発する
細胞表現型の強度を測定するアッセイは、細胞サイズ、細胞周期現況、または抗体染色をモニターする顕微鏡アッセイから、溶解物、細胞、または媒質における生体分子または小分子の測定を方向付けるための細胞溶解物における特定の基質の代謝回転を査定する酵素的アッセイまでの範囲である。
スクリーニングの成功に対して不可欠なのは、細胞表現型を正確に測定しかつアッセイのシグナル対ノイズ比を最大にするアッセイを作製することである。シグナル対ノイズ比を最大にすることは、アッセイ時間、アッセイ構成要素、細胞型、およびトランスフェクションとアッセイとの間の時間の長さなどの変数をテストすることに関する。陰性表現型と陽性対照表現型のアッセイ結果における差が大きいほど、スクリーニング結果における広がりがより大きくなり、興味深い遺伝子を同定する機会がより良くなると思われる。
（2）望ましい細胞に対するトランスフェクション条件を最適化する
このプロセスにおける第一段階は、合成miRNAまたはmiRNA阻害剤の取り込みを最大にするが高細胞生存率を維持する、トランスフェクション試薬およびプレート条件を同定することである。本発明者らは、細胞株を使用する場合には2〜5の異なるトランスフェクション試薬、または初代もしくは懸濁細胞を使用する場合には5〜10の電気穿孔法条件をテストすることが有用であることを見出す。トランスフェクションは、テストされる条件の中で最も良く正常に機能した試薬または電気穿孔法条件に対して最適化され得る。miRNA特異的ライブラリーをスクリーニングすることは、ハイスループットトランスフェクションに対する条件を必要とする。本発明者らは、ロボット工学に対する必要性をともなわずに1時間よりも速く1,000ウェルまでのトランスフェクションを促進する迅速なプロセスを開発しかつ使用した（以下の送達を参照されたい）。
（3）スクリーニングする
アッセイおよびトランスフェクションプロセスが開発されたら、合成miRNAまたはmiRNA阻害剤のライブラリーは、24または96ウェルプレートにおいて細胞に逐次導入され得る。各々の試薬に対する三連でのトランスフェクションは、合理的な統計分析に対する十分なデータを提供する。
（4）ヒットを認証する
ヒットを認証することは、観測された表現型が標的にされたmiRNAによるものであることを示すことに関する。ヒットは、典型的には、ヒットとして登録された一連のmiRNA阻害剤または合成miRNAの希釈物を、元来アッセイされた細胞に送達することによって確認される。真のヒットは用量応答を示すことは、本発明者らの経験である。
A. 合成miRNAおよびmiRNA阻害剤ライブラリー調製
本発明は、細胞における特定のmiRNAの活性における変化を誘導するための、合成miRNAおよびmiRNA阻害剤ライブラリーの調製および使用に関係する。合成miRNAおよびmiRNA阻害剤の調製は、典型的には、本出願において記載される方法のいずれかを使用して、合成miRNAの活性および相補鎖ならびに一本鎖miRNA阻害剤の化学的合成に関する。合成miRNAの活性および相補鎖が、二つの相異なる分子である場合、次いで、二つの鎖は、送達に先行してハイブリダイズされなければならない。ハイブリダイゼーションは、大体等モル量で二つの核酸を一緒に混合し、かつハイブリダイゼーションに適当な時間および温度でインキュベートすることによって達成され得る。塩（例えば、NaClまたはNaOAC）の添加は、ハイブリダイゼーションに対して使用されるインキュベーションに先行する熱変性段階の含有のように、ハイブリダイゼーションを強化する。
B. 合成miRNAおよびmiRNA阻害剤の送達
本発明のライブラリーは、試料における一つまたは複数のmiRNAを逐次上方制御または下方制御するために使用され得る。これは、関連細胞アッセイを用いて合成miRNAおよびmiRNA阻害剤を細胞型に導入するための方法を必要とする。脂質に基づくトランスフェクションは、典型的には、核酸を不死化細胞に導入するために使用され、初代細胞に対しては電気穿孔法である。
本発明に従って核酸送達に適した方法は、核酸（例えば、DNA、RNA、ウイルスおよび非ウイルスベクターを含む）が、本明細書において記載されるように、または当業者にとって公知であるように、細胞小器官、細胞、組織、または生物体に導入され得る任意の方法を事実上含むと考えられている。そのような方法は、マイクロインジェクション（Harland and Weintraub, 1985；米国特許第5,789,215号、参照により本明細書に組み入れられる）を含むインジェクション（米国特許第5,994,624号、第5,981,274号、第5,945,100号、第5,780,448号、第5,736,524号、第5,702,932号、第5,656,610号、第5,589,466号、および第5,580,859号、各々参照により本明細書に組み入れられる）による；電気穿孔法（米国特許第5,384,253号、参照により本明細書に組み入れられる）による；リン酸カルシウム沈殿（Graham and Van Der Eb, 1973; Chen and Okayama, 1987; Rippe et al., 1990）による；ポリエチレングリコールが後に続くDEAE-デキストランを使用すること（Gopal, 1985）による；直接的なソニックローディング（Fechheimer et al., 1987）による；リポソーム媒介トランスフェクション（Nicolau and Sene, 1982; Fraley et al., 1979; Nicolau et al., 1987; Wong et al., 1980; Kaneda et al., 1989; Kato et al., 1991）による；マイクロプロジェクタイル照射（PCT出願国際公開公報第94/09699号および第95/06128号；米国特許第5,610,042号；第5,322,783号、第5,563,055号、第5,550,318号、第5,538,877号、および第5,538,880号、各々参照により本明細書に組み入れられる）による；シリコンカーバイドファイバーとの攪拌（Kaeppler et al., 1990；米国特許第5,302,523号および第5,464,765号、各々参照により本明細書に組み入れられる）による；アグロバクテリウム媒介形質転換（米国特許第5,591,616号および第5,563,055号、各々参照により本明細書に組み入れられる）による；またはプロトプラストのPEG媒介形質転換（Omirulleh et al., 1993；米国特許第4,684,611号および第4,952,500号、各々参照により本明細書に組み入れられる）による；乾燥/阻害媒介DNA取り込み（Potrykus et al., 1985）による、核酸の直接的な送達を含むが、それらに限定されない。これらなどの技術の適用を介して、細胞小器官、細胞、組織、または生物体は、安定にまたは一過的に形質転換され得る。
様々な化合物は、細胞膜を介するそれらの輸送を促進するために、オリゴヌクレオチドの末端に付着している。HIV TAT、HSV VP22、ショウジョウバエ・アンテナペディア（antennapedia）、およびその他のタンパク質において見出された短いシグナルペプチドは、膜を介する生体分子の迅速な移動を可能にすることが見出されている（Schwarze 2000によって概説される）。タンパク質伝達ドメイン（PTD）と呼ばれるこれらのシグナルペプチドは、培養細胞へのそれらの送達を促進するためにオリゴヌクレオチドに付着している。コレステロールは、動物における細胞へのそれらの取り込みを改善するために、オリゴヌクレオチドに接合している（MacKellar 1992）。末端コレステロール基は、細胞の表面上の受容体または脂質と明らかに相互作用し、修飾オリゴヌクレオチドの内在化を促進する。同様に、ポリ-l-リジンは、正味負電荷を減少させかつ細胞への取り込みを改善するために、オリゴヌクレオチドに接合している（Leonetti 1990）。
核酸と複合体を形成し、それらを細胞の表面に送達し、かつそれらの取り込みおよびエンドドームからの放出を促進する様々な化合物が開発されている。これらの中には、（1）DOTAP（またはその他の陽イオン性脂質）、DDAB、DHDEAB、およびDOPEなどの様々な脂質、および（2）ポリエチレンイミン、ポリアミドアミン、ならびにこれらおよびその他のポリマーのデンドリマーなどの非脂質ベースのポリマーが含まれる。これらの態様の特定において、DOTAPおよびコレステロールまたはコレステロール誘導体などの脂質の組み合わせが使用される（米国特許第6,770,291号、参照により本明細書に組み入れられる）。これらの試薬のいくつかは、動物における核酸取り込みを促進することが示されている。
miRNA経路に関与する細胞構成要素は、公知になってきている。細胞内でmiRNAを安定化しかつ/または輸送するタンパク質は、それらが細胞内にあるとそれらが結合miRNAを保護しかつ導くはずなので、miRNAの安定性および活性を強化し得ると考えられる。miRNA-トランスポータータンパク質とmiRNAとの混合物は、miRNAに基づく治療薬の効力を強化し得ると考えられる。
RNAは、それらの陰イオン性リン酸および糖骨格により親水性分子である。核酸塩基は疎水性であるが、リン酸および糖残基に起因する大規模な水素により、親水性が優越する。親水性特徴および陰イオン性骨格は、細胞透過を低下させる。コレステロールなどの親油性基（Manoharan, 2002）とC32官能性を有するラウリン酸およびリトコール酸誘導体（Lorenz et al., 2004）との接合は、細胞取り込みを改善することが示されている。LDLなどの血流における異なるリポタンパク質へのステロイド接合オリゴヌクレオチドのさらなる結合は、それらの完全性を保護し、かつそれらの生体分布を支配する（Rump et al., 2000）。アンチセンス分子（Bijsterbosch et al., 2001）およびアプタマー（Rusconi et al., 2004）に付着したコレステロールは、リポタンパク質に結合させることによって、オリゴヌクレオチドを安定化することも示されている。コレステロールは、インビトロ（Lorenz et al., 2004）およびインビボ（Soutschek et al., 2004）でsiRNAの取り込みおよび血清安定性を強化することが実証されている。付加的に、SB-435495（Blackie et al., 2002）、イスラジピン（Oravcova et al., 1994）、アムロジピン（Oravcova et al., 1994）、および2,2',4,4',5,5'-ヘキサクロロビフェニル（Borlakoglu et al., 1990）などの多くの小分子は、細胞取り込みを強化でき、かつリポタンパク質結合を促進することによってヌクレアーゼ耐性を改善できると考えられる。
本方法およびキットは、高容積スクリーニングに対して使用され得る。合成miRNAおよび/またはmiRNA阻害剤のライブラリーは、本発明の方法を使用して作製され得る。次いで、このライブラリーは、マイクロアレイを含むハイスループットアッセイにおいて使用され得る。Ziauddin and Sabatini (2001)によって記載されるものなどのチップに基づく核酸技術が、本発明者らによって具体的に意図される。手短に、核酸は、固体基底剤上に固定され得る。次いで、細胞を、固体基底剤上にオーバーレイすることができ、定義された場所で核酸を取り込むことができる。次いで、望ましい効果を有しているカクテルを同定するために、細胞に対する影響が測定され得る。
C. 標識化および標識化技術
いくつかの態様において、本発明は、特定のmiRNA種の治療的または診断的関連性を評価するためのスクリーニングアッセイに対してなど、標識されるmiRNAに関係する。miRNAは、標識化に先行して、最初に単離（miRNAが細胞に対して内因性である細胞からまたはmiRNAが細胞に対して外因性である細胞から）および/または精製され得る。これは、標識化に先行してmiRNAが単離または精製されない試料におけるその他のRNAとは対照的に、miRNAをより効率的に標識する反応を達成し得る。本発明の多くの態様において、標識は非放射性である。概して、核酸は、標識ヌクレオチドを付加すること（一段階プロセス）、またはヌクレオチドを付加し、かつ付加されたヌクレオチドを標識すること（二段階プロセス）によって、標識され得る。
さらに、miRNAは、参照により本明細書に組み入れられる米国特許出願第60/649,584号において記載されるように標識され得る。そのようなヌクレオチドは、蛍光色素を含む色素またはビオチンなどの分子で標識され得るものを含む。標識ヌクレオチドは、簡単に利用できる；それらは、商業的に入手し得る、またはそれらは、当業者にとって公知の反応によって合成され得る。
1. 標識化に対するヌクレオチド
標識化に対するヌクレオチドは、天然のヌクレオチドではなく、その代わり、それらの上に反応性部分を有する調製ヌクレオチドを指す。対象となる特定の反応性官能性は、以下を含む：アミノ、スルフィドリル、スルホキシル、アミノスルフィドリル、アジド、エポキシド、イソチオシアン酸、イソシアン酸、無水、モノクロロトリアジン、ジクロロトリアジン、一または二ハロゲン置換ピリジン、一または二置換ジアジン、マレイミド、エポキシド、アジリジン、ハロゲン化スルホニル、ハロゲン化酸、ハロゲン化アルキル、ハロゲン化アリール、アルキルスルホン酸、N-ヒドロキシスクシンイミドエステル、イミドエステル、ヒドラジン、アジドニトロフェニル、アジド、3-(2-ピリジルジチオ)-プロピナミド、グリオキサル、アルデヒド、ヨードアセチル、シアノメチルエステル、p-ニトロフェニルエステル、o-ニトロフェニルエステル、ヒドロキシピリジンエステル、カルボニルイミダゾール、およびその他のそのような化学基。いくつかの態様において、反応性官能性は、ヌクレオチドに直接的に結合され得る、またはそれは、連結基を介してヌクレオチドに結合され得る。官能部分および任意のリンカーは、実質的には、ヌクレオチドがmiRNAに付加されるまたは標識される能力を害しないことになっている。代表的な連結基は、典型的には約2〜18、通常は約2〜8の炭素原子の範囲で、炭素含有連結基を含み、炭素含有連結基は、例えば、S、O、Nなどの一つまたは複数のヘテロ原子を含む場合もありまたは含まない場合もあり、かつ不飽和の一つまたは複数の部位を含む場合もありまたは含まない場合もある。多くの態様において特に関心対象であるのは、アルキル連結基であり、典型的には1〜16の、通常は1〜4の炭素原子の低級アルキル連結基であり、連結基は、不飽和の一つまたは複数の部位を含み得る。官能化標的生成の上記の方法において使用される官能化ヌクレオチド（またはプライマー）は、公知のプロトコールを使用して加工され得る、または例えば、Sigma、Roche、Ambion、およびNENなどの商業的製造業者から購入され得る。官能基は、参照によりすべて組み入れられる、米国特許第4,404,289号；第4,405,711号；第4,337,063号および第5,268,486号、ならびにブラジル特許第1,529,202号において見出される代表的な情報を含む、当業者にとって公知の手法に従って調製され得る。
アミン修飾ヌクレオチドは、本発明のいくつかの態様において使用される。アミン修飾ヌクレオチドは、標識の付着のために反応性アミン基を有するヌクレオチドである。任意のリボヌクレオチド（G、A、U、またはC）またはデオキシリボヌクレオチド（G、A、T、またはC）が、標識化のために修飾され得ることが意図される。例は、以下の修飾リボ-およびデオキシリボ-ヌクレオチドを含むが、それらに限定されない：5-(3-アミノアリル)-UTP；8-[(4-アミノ)ブチル]-アミノ-ATPおよび8-[(6-アミノ)ブチル]-アミノ-ATP；N6-(4-アミノ)ブチル-ATP、N6-(6-アミノ)ブチル-ATP、N4-[2,2-オキシ-ビス-(エチルアミン)]-CTP；N6-(6-アミノ)ヘキシル-ATP；8-[(6-アミノ)ヘキシル]-アミノ-ATP；5-プロパルギルアミノ-CTP；5-プロパルギルアミノ-UTP；5-(3-アミノアリル)-dUTP；8-[(4-アミノ)ブチル]-アミノ-dATPおよび8-[(6-アミノ)ブチル]-アミノ-dATP；N6-(4-アミノ)ブチル-dATP、N6-(6-アミノ)ブチル-dATP、N4-[2,2-オキシ-ビス-(エチルアミン)]-dCTP；N6-(6-アミノ)ヘキシル-dATP；8-[(6-アミノ)ヘキシル]-アミノ-dATP；5-プロパルギルアミノ-dCTP、ならびに5-プロパルギルアミノ-dUTP。そのようなヌクレオチドは、当業者にとって公知の方法に従って調製され得る。さらに、当業者は、5-(3-アミノアリル)-UTPの代わりに5-(3-アミノアリル)-CTP、GTP、ATP、dCTP、dGTP、dTTP、またはdUTPなどの、同じアミン修飾を用いてその他のヌクレオチド実体を調製し得ると考えられる。
2. 標識化技術
いくつかの態様において、核酸は、すでに標識されたヌクレオチドまたは複数のヌクレオチドを核酸に触媒的に付加することによって標識される。一つまたは複数の標識ヌクレオチドが、miRNA分子に付加され得る。参照により本明細書に組み入れられる、米国特許第6,723,509号を参照されたい。
その他の態様において、非標識ヌクレオチドまたは複数の非標識ヌクレオチドは、miRNAに触媒的に付加され、非標識ヌクレオチドは、後に続く標識を可能にする化学的部分によって修飾される。本発明の態様において、化学的部分は、ヌクレオチドがアミン修飾ヌクレオチドであるような、反応性アミンである。
アミン修飾ヌクレオチドの例は、当業者にとって周知であり、多くが、Ambion、Sigma、Jena Bioscience、およびTriLinkなどから市販されている。
cDNAのその合成の間の標識化とは対照的に、miRNAを標識することに対する問題点は、すでに存在する分子をどのように標識するのか、ということである。本発明は、リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチド二または三リン酸を、miRNA、小さなRNA分子へのその付加のための基質として使用することが可能な酵素の使用に関係する。さらに、特定の態様において、それは、miRNAの3'末端に付加される、修飾リボヌクレオチド二または三リン酸の使用に関する。酵素の源は限定的ではない。酵素に対する源の例は、酵母、グラム陰性細菌、例えば大腸菌、乳酸連鎖球菌、および羊痘ウイルスを含む。
そのようなヌクレオチドを付加することが可能な酵素は、ポリ(A)ポリメラーゼ、末端トランスフェラーゼ、およびポリヌクレオチドホスホリラーゼを含むが、それらに限定されない。本発明の特定の態様において、リガーゼは、標識を付加するために使用される酵素としては意図されず、代わりに、非リガーゼ酵素が使用される。
ポリ(A)ポリメラーゼは、植物からヒトまでの多くの生物体からクローニングされている。それは、RNAへのホモポリマートラクトの付加を触媒することが示されている（Martin et al., RNA, 4(2):226-30, 1998）。
末端トランスフェラーゼは、核酸の3'末端へのヌクレオチドの付加を触媒する。
ポリヌクレオチドホスホリラーゼは、プライマーの必要性をともなわずに、ヌクレオチド二リン酸を重合し得る。
3. 標識
miRNAまたはmiRNAプローブ上の標識は、比色（蛍光を含む可視およびUVスペクトルを含む）、発光、酵素、または陽電子放出（放射性を含む）であり得る。標識は、直接的または間接的に検出され得る。放射性標識は、125I、32P、33P、および35Sを含む。酵素標識の例は、アルカリホスファターゼ、ルシフェラーゼ、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、およびβ-ガラクトシダーゼを含む。標識は、例えば、緑蛍光タンパク質およびフィコエリスリンなどの、発光特性を有するタンパク質であってもよい。
複合体としての使用に対して意図される比色および蛍光標識は、Alexa Fluor色素、BODIPY FLなどのBODIPY色素；カスケードブルー；カスケードイエロー（Cascade Yellow）；7-アミノ-4-メチルクマリン、アミノクマリン、およびヒドロキシクマリンなどの、クマリンおよびその誘導体；Cy3およびCy5などの、シアニン色素；エオシンおよびエリトロシン；イソチオシアン酸フルオレセインなどの、フルオレセインおよびその誘導体；Quantum Dye(商標)などの、ランタニドイオンの大環状キレート；マリーナブルー（Marina Blue）；オレゴングリーン；ローダミンレッド、テトラメチルローダミン、およびローダミン6Gなどの、ローダミン色素；テキサスレッド；チアゾールオレンジ-エチジウムへテロダイマーなどの、蛍光エネルギー移動色素；ならびにTOTABを含むが、それらに限定されない。
色素の特定の例は、上で同定されるものおよび以下を含むが、それらに限定されない：Alexa Fluor 350、Alexa Fluor 405、Alexa Fluor 430、Alexa Fluor 488、Alexa Fluor 500、Alexa Fluor 514、Alexa Fluor 532、Alexa Fluor 546、Alexa Fluor 555、Alexa Fluor 568、Alexa Fluor 594、Alexa Fluor 610、Alexa Fluor 633、Alexa Fluor 647、Alexa Fluor 660、Alexa Fluor 680、Alexa Fluor 700、およびAlexa Fluor 750；BODIPY 493/503、BODIPY 530/550、BODIPY 558/568、BODIPY 564/570、BODIPY 576/589、BODIPY 581/591、BODIPY 630/650、BODIPY 650/655、BODIPY FL、BODIPY R6G、BODIPY TMR、およびBODIPY-TRなどの、アミン反応性BODIPY色素；Cy3、Cy5、6-FAM、イソチオシアン酸フルオレセイン、HEX、6-JOE、オレゴングリーン488、オレゴングリーン500、オレゴングリーン514、パシフィックブルー、REG、ローダミングリーン、ローダミンレッド、レノグラフィン、ROX、SYPRO、TAMRA、2',4',5',7'-テトラブロモスルホンフルオレセイン、ならびにTET。
蛍光標識リボヌクレオチドの特定の例は、Molecular Probesから利用でき、これらは、Alexa Fluor 488-5-UTP、フルオレセイン-12-UTP、BODIPY FL-14-UTP、BODIPY TMR-14-UTP、テトラメチルローダミン-6-UTP、Alexa Fluor 546-14-UTP、テキサスレッド-5-UTP、およびBODIPY TR-14-UTPを含む。その他の蛍光リボヌクレオチドは、Cy3-UTPおよびCy5-UTPなど、Amersham Biosciencesから利用できる。
蛍光標識デオキシリボヌクレオチドの例は、ジニトロフェニル(DNP)-11-dUTP、カスケードブルー-7-dUTP、Alexa Fluor 488-5-dUTP、フルオレセイン-12-dUTP、オレゴングリーン488-5-dUTP、BODIPY FL-14-dUTP、ローダミングリーン-5-dUTP、Alexa Fluor 532-5-dUTP、BODIPY TMR-14-dUTP、テトラメチルローダミン-6-dUTP、Alexa Fluor 546-14-dUTP、Alexa Fluor 568-5-dUTP、テキサスレッド-12-dUTP、テキサスレッド-5-dUTP、BODIPY TR-14-dUTP、Alexa Fluor 594-5-dUTP、BODIPY 630/650-14-dUTP、BODIPY 650/655-14-dUTP；Alexa Fluor 488-7-OBEA-dCTP、Alexa Fluor 546-16-OBEA-dCTP、Alexa Fluor 594-7-OBEA-dCTP、Alexa Fluor 647-12-OBEA-dCTPを含む。
核酸が、二つの異なる標識で標識され得ることが意図される。さらに、蛍光共鳴エネルギー移動（FRET）が、本発明の方法において使用され得る（例えば、Klostermeier et al., 2002；Emptage, 2001；Didenko, 2001、参照により各々組み入れられる）。
または、標識は、それ自体、検出可能でない場合もあるが、間接的に検出可能であってもよく、または標的核酸の単離もしくは分離を可能とし得る。例えば、標識は、ビオチン、ジゴキシゲニン、多価陽イオン、キレート剤群、およびその他のリガンドであってもよく、抗体に対するリガンドを含み得ると考えられる。
4. 可視化技術
標識核酸を可視化するまたは検出するための多くの技術が、簡単に利用できる。Stanley T. Crooke, 2000による参照は、そのような技術の議論を有し（6章）、参照により組み入れられる。そのような技術は、顕微鏡法、アレイ、蛍光光度法、ライトサイクラーまたはその他のリアルタイムPCRマシン、FACS分析、シンチレーションカウンター、ホスホイメージャー、ガイガーカウンター、MRI、CAT、抗体に基づく検出方法（ウェスタン、免疫蛍光法、免疫組織化学）、組織化学技術、HPLC（Griffey et al., 1997）、分光法、キャピラリーゲル電気泳動（Cummins et al., 1996）、分光法；質量分析；放射線技術；および物質収支技術を含む。
二つまたはそれ以上の差別的に色付けされる標識が使用される場合、dsRNAを特徴付けるために、蛍光共鳴エネルギー移動（FRET）技術が使用され得る。さらに、当業者は、標識核酸を可視化、同定、および特徴付けする手法を十分承知しており、従って、そのようなプロトコールは、本発明の一部として使用され得る。使用され得るツールの例は、蛍光顕微鏡法、BioAnalyzer、プレートリーダー、Storm（Molecular Dynamics）、アレイスキャナ、FACS（蛍光活性化細胞ソーター）、または蛍光分子を励起しかつ検出する能力を有する任意の機器も含む。
C. アレイ調製
本発明は、複数のmiRNA分子または前駆体miRNA分子と完全にまたはほぼ相補的または同一であり、空間的に離れた組織体における支持体材料上に置かれる核酸分子（プローブ）の秩序マクロアレイまたはマイクロアレイであるmiRNAアレイとともに使用され得る。マクロアレイは、典型的には、プローブがスポットされているニトロセルロースまたはナイロンのシートである。マイクロアレイは、10,000までの核酸分子が、典型的には1〜4平方センチメートルの領域に取り付けられ得るように、核酸プローブをより密に置く。マイクロアレイは、例えば、遺伝子、オリゴヌクレオチドなどの核酸分子を基質上にスポットすることによって、または基質上でインサイチューでオリゴヌクレオチド配列を加工することによって、加工され得る。スポットされたまたは加工された核酸分子は、平方センチメートルあたり約30までの、またはそれより高い、例えば、平方センチメートルあたり約100までの、またはさらに1000の非同一核酸分子の高密度マトリクスパターンにおいて適用され得る。マイクロアレイは、典型的には、フィルターアレイのニトロセルロースに基づく材料とは対照的に、固体支持体としてコーティングされたガラスを使用する。miRNA相補的核酸試料の秩序アレイを有することにより、各々の試料の位置を追跡することができ、元の試料にリンクさせることができる。複数の相異なる核酸プローブが固体支持体の表面に安定して結合される様々な異なるアレイデバイスが、当業者にとって公知である。アレイに対する有用な基質は、ナイロン、ガラス、およびシリコンを含む。そのようなアレイは、平均プローブ長、プローブの配列または型、例えば共有または非共有などのプローブとアレイ表面との間の結合の性質、および同様のものを含む、多くの異なる方式において変化し得る。
マイクロアレイを調製するための代表的な方法および装置は、例えば
Figure 2008519606
において記載されている；これらの開示は、参照により本明細書にすべて組み入れられる。
アレイが、それらが100以上の異なるプローブを含むような、高密度アレイであり得ることが意図される。それらが、1000、16,000、65,000、250,000、もしくは1,000,000、またはそれより多くの異なるプローブを含み得ることが意図される。プローブは、一つまたは複数の異なる生物体における標的に向けられ得る。オリゴヌクレオチドプローブは、いくつかの態様において、長さが5〜50、5〜45、10〜40、または15〜40ヌクレオチドの範囲である。特定の態様において、オリゴヌクレオチドプローブは、長さが20〜25ヌクレオチドである。
アレイにおける各々の異なるプローブ配列の場所および配列は、概して公知である。さらに、多数の異なるプローブは、1cm2あたり約60、100、600、1000、5,000、10,000、40,000、100,000、または400,000の異なるオリゴヌクレオチドプローブよりも概して高いプローブ密度を有する高密度アレイを提供する、比較的小さなエリアを占め得る。アレイの表面エリアは、約1、1.6、2、3、4、5、6、7、8、9、または10cm2以下であり得る。
さらに、当業者は、アレイを使用して生成されるデータを簡単に分析し得ると考えられる。そのようなプロトコールは、上で開示され、かつ国際公開公報第9743450号；国際公開公報第03023058号；国際公開公報第03022421号；国際公開公報第03029485号；国際公開公報第03067217号；国際公開公報第03066906号；国際公開公報第03076928号；国際公開公報第03093810号；国際公開公報第03100448A1号において見出される情報を含み、そのすべてが参照により具体的に組み入れられる。
D. 試料調製
多種多様な試料のmiRNAが、本明細書において記載されるアッセイを使用して分析され得ることが意図される。内因性miRNAが、いくつかの態様による使用に対して意図されるが、組換えmiRNA−内因性miRNAまたは前駆体miRNAと相補的または同一である核酸を含む−は、本明細書において記載されるように取り扱われかつ分析されてもよい。試料は、生物学的試料であってもよく、その場合は、それらは、血液、組織、器官、精液、唾液、涙液、その他の体液、毛嚢、皮膚、または生物学的細胞を含むもしくは構成する任意の試料由来であり得る。または、試料は、生物学的試料でない場合もあるが、細胞を含まない反応混合物（一つまたは複数の生物学的酵素を含み得る）などの、化学的混合物であり得る。
E. ハイブリダイゼーション
アレイを調製し、試料におけるmiRNAを標識した後、標的核酸の集団は、ハイブリダイゼーション条件下でアレイと接触させ、そのような条件は、行われる特定のアッセイを考慮して、特異性の最適なレベルを提供するために、望ましいように調整され得る。適したハイブリダイゼーション条件は、当業者にとって周知であり、Sambrook et al., 1989および国際公開公報第95/21944号において概説される。多くの態様において特に関心対象であるのは、ハイブリダイゼーションの間のストリンジェントな条件の使用である。ストリンジェントな条件は、当業者にとって公知である。
単一のアレイが、複数の試料に接触され得ることが、具体的に意図される。試料は、試料を識別するために、異なる標識で標識され得る。例えば、単一のアレイは、Cy3で標識された腫瘍組織試料、およびCy5で標識された正常組織試料に接触され得る。アレイ上のプローブに対応する特定のmiRNAに対する試料間の差は、簡単に解明されかつ定量され得る。
アレイの小さな表面エリアは、温度調節および塩含有量などの、均一なハイブリダイゼーション条件を可能にする。さらに、高密度アレイによって占められる小さなエリアにより、ハイブリダイゼーションは、極めて少ない液容積（例えば、約5、10、25、50、60、70、80、90、100μl以下、またはそこに導き出せる任意の範囲の容積を含む、約250μl以下）において実施され得る。少ない容積において、ハイブリダイゼーションは、非常に迅速に進行され得る。
F. 差次的発現分析
アレイは、2つの試料間の差を検出するために使用され得る。これは、診断目的に対して使用されてもよい。具体的に意図される適用は、正常である試料からおよび正常ではない試料からのmiRNA間の差または2つの異なって処置された試料間の差を、同定するかつ/または定量することを含む。miRNAは、特定の疾患または病態の影響を受けやすいと考えられている試料とその疾患または病態の影響を受けやすくないまたは耐性があると考えられている試料との間で比較されてもよい。正常ではない試料は、疾患もしくは病態の表現型形質を示すもの、またはその疾患もしくは病態に関して正常ではないと考えられているものである。それは、その疾患または病態に関して正常である細胞と比較され得る。表現型形質は、構成要素が遺伝的であるまたは遺伝的であり得るまたは遺伝的でない可能性もある、疾患または病態の症状を含むかまたはそれらへの罹病性（susceptibility）を含む。
G. 疾患とのつながりを有するmiRNAを同定するための細胞アッセイ
具体的に意図される適用は、それら自身が疾患の一部であるまたはそうでなければ特定の疾患状態と関連し得ると考えられる細胞プロセスに寄与するmiRNAを同定することを含む。miRNA機能は、特定の疾患または病態の影響を受けやすいと考えられている試料とその疾患または病態の影響を受けやすくないまたは耐性があると考えられている試料との間で比較されてもよい。本発明のRNA分子は、前のセクションにおいて議論された疾患もしくは病態のいずれかを処置する、または前のセクションにおいて議論された細胞経路のいずれかをモジュレートするために使用され得ることが具体的に意図される。
具体的に意図される適用は、それら自身が疾患の一部であるまたはそうでなければ特定の疾患状態と関連し得ると考えられる細胞プロセスに寄与するmiRNAを同定することを含む。miRNA機能は、特定の疾患または病態の影響を受けやすいと考えられている試料とその疾患または病態の影響を受けやすくないまたは耐性があると考えられている試料との間で比較されてもよい。
AIDS、自己免疫疾患（関節リウマチ、多発性硬化症、糖尿病-インシュリン依存性および非依存性、全身性紅斑性狼瘡、およびグレーブス病）；癌（例えば、悪性、良性、転移性、前癌状態）；心臓血管疾患（心疾患または冠動脈疾患、脳卒中-虚血性および出血性、ならびにリウマチ性心疾患）；神経系の疾患；および病原性微生物体による感染（水虫、水疱瘡、風邪、下痢性疾患、インフルエンザ、性器ヘルペス、マラリア、癌性髄膜炎、肺炎、静脈洞炎、皮膚疾患、連鎖球菌性咽頭炎、結核、尿路感染症、膣感染症、ウイルス性肝炎）；炎症（アレルギー、喘息）；プリオン病（例えば、CJD、クールー、GSS、FFI）。
さらに、miRNAは、以下の疾患、病態、および障害に関して評価され得る：腹部癒着；肛門膿瘍；脳膿瘍；扁桃周囲膿瘍；アブサンス発作；アカラシア；座瘡；聴神経腫；後天性免疫不全症候群（AIDS）；先端線維性軟疣；光線性角化症；肺腺癌；ADHD；成人発症型糖尿病；航空性耳炎；そばかす；加齢性難聴；加齢性黄斑変性症；加齢性視力変化（老眼）；広場恐怖症；アルコール離脱；アルコール依存症；アレルゲン免疫療法；アレルギー性鼻炎；アレルギー；脱毛症（円形、遺伝型、および外傷性）；高山病；アルツハイマー病；黒内障性家族性小児白痴；弱視（Amblyopia）；無月経；アミロイドーシス；筋萎縮性側索硬化症（ALS）；アナフィラキシー；アンドロゲン性脱毛症；貧血（再生不良性、溶血性、悪性、および鎌状赤血球）；狭心症；クモ状血管腫；血管形成術；強直性脊椎炎；拒食症；無排卵性出血；抗生物質起因性下痢；抗リン脂質抗体症候群；非社会性人格障害；肛門裂、瘻、痔、肛門掻痒、狭窄；不安障害（全般性、強迫性障害、パニック障害、恐怖症、および心的外傷後ストレス障害）；大動脈瘤；大動脈弓症候群；虫垂炎；心不整脈；高安動脈炎；関節炎疾患（硬直性脊椎炎、痛風、感染性、若年性、変形性関節症、偽痛風、乾癬性関節炎、およびリウマチ性）；石綿肺症；上行性胆管炎；乾皮性湿疹；喘息；乱視；無症候性細菌尿；フリードライヒ失調症；アテローム性動脈硬化症；水虫；アトピー性皮膚炎；心房性細動；萎縮性膣炎；注意欠陥多動性障害；自閉症；自己免疫疾患（セリアック病、クローン病、真性糖尿病1型（インシュリン依存性；若年発症型）、真性糖尿病2型（非インシュリン依存性；成人発症型）、グレーブス病、甲状腺機能亢進症、免疫性血小板減少性紫斑病、狼瘡、重症筋無力症、結節性多発性動脈炎、関節リウマチ、強皮症、高安動脈炎、および潰瘍性大腸炎）；B12欠乏症；細菌性赤痢；細菌性胃腸炎；細菌性膣炎；亀頭炎；遺伝型禿頭症；白癬性毛瘡（Barber's Itch）；気圧性中耳炎；気圧障害；バルトリン腺嚢腫；基底細胞癌；夜尿症；褥瘡；ベーチェット症候群；ベル麻痺；減圧病；良性前立腺過形成；胆管疾患；胆石疝痛；生検；双極性障害；膀胱病態（感染症；間質性膀胱炎；脱；尿道炎；尿失禁；尿路感染症）；眼瞼炎；眼瞼下垂；枯死卵；摩擦水疱(Friction Blisters)；高血圧；せつ（Boils）；骨疾患および病態（骨粗鬆症；パジェット病）；骨イチゴ腫（Bone Yaws）；境界性人格障害；ボーンホルム病；ボツリヌス中毒症；腸閉塞症；徐脈；気管支炎；過食症；腱膜瘤；滑液包炎；クロストリジウム・ディフィシレ（C. Difficile）大腸炎；踵骨骨端炎；ピロリン酸カルシウム沈着症；カンピロバクター感染症；癌；カンジダ症；一酸化炭素中毒；癰；心不整脈（心房性細動、徐脈）；心筋症；手根管症候群；白内障；蜂巣炎；中心性漿液性網膜症；脳性麻痺；大脳黄斑変性症；耳垢詰まり（Cerumen Impaction）；子宮頚管炎、ナボット嚢胞、頚管ポリープ、頚管疣贅；霰粒腫；水疱瘡；クラミジア感染症；褐色斑；胆管炎；胆嚢炎；コレステリン腫；軟骨軟化症；舞踏病；脈絡膜メラノーマ；慢性気管支炎；慢性疲労症候群；慢性肝炎；慢性白血病；慢性閉塞性肺疾患；慢性中耳炎；肝硬変；群発性頭痛；コーガン症候群；風邪；胆石疝痛；偽膜性大腸炎、潰瘍性大腸炎、肺虚脱；鎖骨骨折；昏睡；複合性局所疼痛症候群；鬱血性心不全；結膜炎；便秘；接触性皮膚炎；転換性障害；COPD；角膜剥離、角膜炎；うおのめ（Corns）；冠動脈疾患；クロイツフェルト・ヤコブ病；内斜視；クループ；潜在睾丸；嚢胞性線維症；間質性膀胱炎；膀胱脱；嚢胞；サイトメガロ・ウイルス感染；涙嚢炎；ふけ；減圧症；褥瘡性潰瘍；精神錯乱；妄想性障害；認知症；抑鬱障害（双極性障害、気分変調、大鬱病、躁鬱病、産後抑鬱症）；皮膚炎；皮膚線維腫；皮膚筋炎；網膜剥離（Detached Retina）；発達性股関節形成不全；鼻中隔彎曲症；流行性胸膜痛（Devil's Grip）；糖尿病（妊娠性糖尿病；1型糖尿病（インシュリン依存性；若年性）；2型糖尿病（非インシュリン依存性；成人発症型）；低血糖症、ケトアシドーシス、腎症、神経症、網膜症）抗生物質起因性下痢；二重視；椎間板ヘルニア；水晶体脱臼；股関節脱臼（発達性）；憩室炎；憩室症；めまい；ドエルダーランド（Doerderland's）膣炎；複視；ダウン症候群；うなだれた眼瞼；乾皮症；太陽で痛んだ皮膚；乾性眼症候群；水かき足；家族性自律神経失調症；不正子宮出血；失読症；性交疼痛症；気分変調性障害；排尿障害；摂食障害（拒食症、過食症）；子癇；湿疹；浮腫；肺気腫；脳炎；遺糞症；末期腎疾患；心内膜炎；子宮内膜症；眼内炎；内視鏡；前立腺肥大；遺尿症；流行性良性乾性胸膜炎；精巣上体炎；喉頭蓋炎；癲癇；鼻出血；勃起不全；伝染性紅斑；食道炎；食道アカラシア；食道炎；本態性高血圧症；本態性振戦；ユーイング肉腫；家族性自律神経失調症；遠視（Farsightedness）；熱性発作；便失禁；発熱；発熱誘導性（Fever-Induced）発作；類線維腫；線維筋痛；第5病；糸状疣贅；扁平疣贅；鼓腸；インフルエンザ；焦点性発作；食物アレルギー；食中毒；前肢神経腫；脆弱性X症候群；摩擦発疹；フリードライヒ失調症；凍傷；真菌感染症（水虫、脳膿瘍、感染性関節炎、いんきんたむし、爪甲真菌症、輪癬（Ringworm）、スイマー耳炎、股部白癬、爪白癬、癜風）；フルンケル；胆石；ガルドネレラ膣炎；胃炎；腓腹筋挫傷（Gastrocnemius Strain）；胃腸炎；逆流性食道炎；胃腸アメーバ症；全般性不安障害；全般性気圧障害；性器ヘルペス；性器疣贅；GERD;性腺外胚細胞腫瘍；巨細胞性動脈炎；ランブル鞭毛虫症；緑内障；糸球体腎炎；グルテン過敏性腸疾患；GM2ガングリオシドーシス；淋病；痛風；大発作；グレーブス病；グレーブス眼病；ギラン・バレー症候群；槌状足指症；花粉症；頭痛；難聴；心臓発作；日射病；踵骨骨棘；鶏眼；クモ状ヘマンジオーマ；血腫；血尿；ヘモクロマトーシス；溶血性貧血；血友病；出血性脳卒中；クモ膜下出血脳卒中；痔核；A型肝炎；B型肝炎；C型肝炎；遺伝型禿頭症；ヘルニア；椎間板ヘルニア；高血圧；高コレステロール；多毛症；ヒスチオサイトーシスX；HIV/AIDS；麦粒腫；ヒトパピローマウイルス（HPV）；ハンチントン病；胞状奇胎；水頭症；活動過剰；高コレステロール血症；過角化症；遠視（Hyperopia）；高血圧症；高眼圧症；二次性高血圧症；高血圧性網膜症；高熱；甲状腺機能亢進症；心気症；低血糖症；上皮小体機能低下症；甲状腺機能低下症；IBS；ICD；魚鱗癬；免疫性血小板減少性紫斑病；膿痂疹；インポテンス；失禁；小児ガングリオシドリピドーシス；感染性関節炎；感染性単核球症；不妊症；炎症性大腸炎；鼠径ヘルニア；不眠症；大脳半球間出血；趾間神経腫；中足骨間神経腫；間欠性跛行；間質性膀胱炎；腸閉塞；鉄欠乏症；過敏性腸症候群；若年性関節炎；カポジ肉腫；川崎症候群；ケロイド；角膜炎；光線性角化症；内耳炎；乳糖不耐症；ラクナ脳卒中；ランゲルハンス細胞組織球増加症；喉頭炎；喉頭気管炎；外側上顆炎；ラテックスアレルギー；弱視（Lazy Eye）；鉛中毒；間欠性跛行；下肢静止不能症候群；過労性脛部痛；下肢緊張；白内障；水晶体脱臼；白血病；シラミ；慢性単純性苔癬；肝硬変；肝炎；肝斑；開口障害；ルー・ゲーリック病；全身性紅斑性狼瘡；ライム病；リンパ水腫；リンパ腫；黄斑変性症；吸収不良症候群；マラリア；男性型禿頭症；悪性高体温症；躁鬱病；マルファン症候群；乳様突起炎；麻疹（Measles）；メッケル憩室；黒皮症；メニエール病；髄膜炎；閉経；知的障害；フェニルケトン尿症；片頭痛；流産；僧帽弁逸脱；排卵痛；奇胎妊娠；伝染性軟属腫；単核球症；モートン神経腫；モザイク疣贅；運動性チック；粘膜皮膚リンパ節症候群；多発性硬化症；流行性耳下腺炎；筋ジストロフィー；骨格筋障害（線維筋痛、巨細胞性動脈炎、痛風、感染性関節炎、筋ジストロフィー、筋炎、変形性関節症、骨粗鬆症、骨のパジェット病、リウマチ性多発筋痛、偽痛風、反射性交感神経性ジストロフィー、関節リウマチ、強皮症、全身性紅斑性狼瘡、腱炎）；重症筋無力症；心筋梗塞；心筋炎；近視；筋炎；爪?疽；爪甲離床症；爪甲真菌症；爪周囲炎；爪下血腫；ナルコレプシー；鼻ポリープ；吐き気；近眼；針生検；腎摘出術；腎芽細胞腫；腎結石症；糖尿病性腎症；球後視神経炎；神経芽細胞腫；神経筋障害；神経症；ギラン・バレー症候群；球後；母斑；火炎状母斑；単純性母斑；夜尿；非熱帯性スプルー；肥満；強迫性障害；職業性難聴；高眼圧症；眼酒さ（Ocular Rosacea）；爪甲離床症；爪甲真菌症；緑内障；球後視神経炎；視神経腫脹；眼窩骨折；精巣炎；オズグッド・シュラッター病；変形性関節症；骨粗鬆症；骨肉腫；外耳炎；中耳炎；慢性中耳炎；耳硬化症；中毒性難聴；骨盤内炎症性疾患；多嚢胞性卵巣症候群；膀胱痛（Painful-Bladder）症候群；膵炎；パニック障害；乳頭浮腫；嵌頓包茎；パーキンソン病；爪周囲炎；部分発作；PCL損傷；有茎性疣贅；骨盤弛緩；嵌頓包茎；ペイロニー病；消化性潰瘍；鼓膜穿孔；心膜炎；閉経期；末梢血管疾患；扁桃周囲膿瘍；遷延性植物状態；人格障害；小発作；ペイロニー病；咽頭炎；咽頭癌；フェニルケトン尿症；包茎；恐怖症；光過敏性；色素異常症（褐色斑、黒皮症、白斑）；痔疾；伝染性結膜炎；薔薇色粃糠疹；PKU；ペスト；足底筋膜炎；足底疣贅；足底緊張；胸膜炎；胸膜痛；PMS；塵肺症；肺全摘術；肺炎；気胸；鉛中毒；ポリオ；灰白髄炎；結節性多発性動脈炎；多発性軟骨炎；リウマチ性多発筋痛；多発性筋炎；大腸ポリープ；鼻ポリープ；声帯ポリープ；ポートワイン母斑；ポリオ後症候群；感染後血小板減少症；産後抑鬱症；子癇前症；妊娠高血圧症；月経前症候群；床ずれ；原発性硬化性胆管炎；脱；前立腺肥大；急性前立腺炎；慢性前立腺炎；肛門掻痒；偽痛風；乾癬；乾癬性関節炎；下垂症；脈なし病；腎盂腎炎；四頭筋緊張；化膿性扁桃腺炎；皮疹；レイノー現象；直腸掻痒；直腸ヘルニア；反射性交感神経性ジストロフィー；腎不全；呼吸器疾患；呼吸器合胞体ウイルス；網膜剥離（Retinal Detachment）；網膜色素変性症；網膜症；球後視神経炎；ライ症候群；横紋筋肉腫；関節リウマチ；アレルギー性鼻炎；ウイルス性鼻炎（風邪）；ライリー・デイ症候群；輪癬；ロッキー山発疹熱；酒さ；はしか；流行性耳下腺炎；唾液腺障害；サーモンパッチ；サルコイドーシス；疥癬；猩紅熱；瘢痕；統合失調症；統合失調症性人格障害；坐骨神経痛；強膜炎；強皮症；側弯症；皮脂嚢胞；脂漏症；脂漏性角化症；二次性高血圧症；発作；性的不全；性感染症；細菌性赤痢；帯状疱疹；唾液腺炎；唾液腺症；唾石症；鎌状赤血球貧血；鉄沈着症；珪肺症；洞（Sinus）癌；シェーグレン症候群；睡眠障害；天然痘；社会不安障害；日光黒子；身体表現性障害（心気症、身体化障害）；夢遊病；痙攣性結腸；クモ状静脈；二分脊椎；脊髄損傷；自然流産；鬱滞性皮膚炎；斜視；連鎖球菌性咽頭炎；連鎖球菌毒素性ショック症候群；脳卒中；クモ膜下出血；一過性脳虚血発作；吃音；爪下血腫；太陽アレルギー；太陽で痛んだ皮膚；シルベスト病（Sylvest's Disease）；全身性紅斑性狼瘡；全身性硬化症；頻脈；高安動脈炎；テイ・サックス病；涙管感染症；休止期脱毛；側頭動脈炎；腱炎；テニス肘；緊張性頭痛；睾丸捻転；停留睾丸；破傷風；血小板減少症；静脈血栓症；血栓性脳卒中；白癬；耳鳴；扁桃炎；捻転；妊娠中毒症；連鎖球菌毒素性ショック症候群；トキソプラズマ症；トリコモナス症；三叉神経痛（疼痛性チック）；結核；胼胝症；潰瘍；尿道炎；尿路障害および病態；ウロリニアシス（Uroliniasis）；蕁麻疹；子宮障害；子宮脱；ブドウ膜炎；膣炎；細菌性（ガルドネレラ）膣炎；水痘；食道静脈瘤；静脈瘤；血管障害（高血圧症、間欠性跛行、末梢血管疾患、結節性多発性動脈炎、レイノー現象、高安動脈炎、静脈血栓症、血管炎、ウェゲナー肉芽腫症）；静脈炎；静脈瘤；目眩；前庭神経鞘腫；ウイルス性鼻炎；ビタミンB12欠乏症；白斑；声帯チック；声帯障害；尋常性疣贅；性器疣贅；足底疣贅；脳水腫；外耳道の耳垢詰まり；食道膜；ウェルホーフ病；しわ；ペスト菌感染。そのような疾患は、miRNAに対応する本発明の核酸を使用して診断または処置され得ることが意図される。
本発明の方法および組成物によって評価、診断、および/または処置され得る癌は、膀胱、血液、骨、骨髄、脳、乳房、結腸、食道、消化管、歯肉、頭部、腎臓、肝臓、肺、鼻咽頭、頚部、卵巣、前立腺、皮膚、胃、精巣、舌、または子宮からの癌細胞を含む。加えて、癌は、具体的に、以下の組織型であり得るが、それらに限定されない：悪性新生物；癌腫；未分化癌；巨細胞および紡錘細胞癌；小細胞癌；乳頭癌；扁平上皮癌；リンパ上皮癌；基底細胞癌；毛基質（pilomatrix）癌；移行上皮癌；乳頭状移行上皮癌；腺癌；悪性ガストリノーマ；胆管癌；肝細胞癌；混合型（combined）肝細胞癌および胆管癌；索状腺癌；腺様嚢胞癌；腺腫性ポリープにおける腺癌；家族性大腸ポリポージス腺癌；固形癌；悪性カルチノイド腫瘍；ブランキオロ（Branchiolo）-歯槽腺癌；乳頭腺癌；嫌色素性細胞癌；好酸性癌；好酸性腺癌；好塩基性癌；透明細胞腺癌；顆粒細胞癌；濾胞状腺癌；乳頭および濾胞状腺癌；被嚢性硬化性癌；副腎皮質癌；類内膜癌；皮膚付属器癌；アポクリン腺癌；脂腺癌；耳垢腺癌；粘液性類表皮癌；嚢胞腺癌；乳頭状嚢胞腺癌；乳頭状漿液性嚢胞腺癌；ムチン性嚢胞腺癌；粘液腺癌；印環細胞癌；浸潤性導管癌；髄様癌；小葉癌；炎症性乳癌；乳房パジェット病；腺房細胞癌；腺扁平上皮癌；扁平上皮化生を伴う腺癌；悪性胸腺腫；悪性卵巣間質腫瘍；悪性卵胞膜細胞腫；悪性顆粒膜細胞腫；悪性男性ホルモン産生細胞腫；セルトリ細胞癌；悪性ライディッヒ細胞腫；悪性脂質細胞（lipid cell）腫；悪性傍神経節腫；悪性乳房外傍神経節腫；褐色細胞腫；血管球血管肉腫；悪性メラノーマ；メラニン欠乏性メラノーマ；表在拡大型メラノーマ；巨大色素性母斑における悪性メラノーマ；類上皮細胞メラノーマ；悪性青色母斑；肉腫；線維肉腫；悪性線維性組織球腫；粘液肉腫；脂肪肉腫；平滑筋肉腫；横紋筋肉腫；胎児性横紋筋肉腫；胞巣状横紋筋肉腫；間質肉腫；悪性混合腫瘍；ミュラー管混合腫瘍；腎芽細胞腫；肝芽腫；癌肉腫；悪性間葉腫；悪性ブレンナー腫瘍；悪性葉状腫瘍；滑膜肉腫；悪性中皮腫；未分化胚細胞腫；胎生期癌；悪性奇形腫；悪性卵巣甲状腺腫；絨毛癌；悪性中腎腫；血管肉腫；悪性血管内皮腫；カポジ肉腫；悪性血管外皮腫；リンパ管肉腫；骨肉腫；傍骨性骨肉腫；軟骨肉腫；悪性軟骨芽細胞腫；間葉性軟骨肉腫；骨巨細胞腫；ユーイング肉腫；悪性歯原性腫瘍；エナメル上皮肉腫；悪性エナメル上皮腫；エナメル上皮線維肉腫；悪性松果体腫；脊索腫；悪性グリオーマ；上衣腫；星状細胞腫；原形質性星状細胞腫；線維性星状細胞腫；星状芽細胞腫；膠芽細胞腫；希突起膠腫；希突起膠芽腫；原始神経外胚葉腫瘍；小脳肉腫；神経節芽細胞腫；神経芽細胞腫；網膜芽細胞腫；嗅神経原性腫瘍；悪性髄膜腫；神経線維肉腫；悪性神経鞘腫；悪性顆粒細胞腫；悪性リンパ腫；ホジキン病；ホジキンリンパ腫；傍肉芽腫；悪性小リンパ球性リンパ腫；悪性びまん性大細胞リンパ腫；悪性濾胞性リンパ腫；菌状息肉腫；その他の特定の非ホジキンリンパ腫；悪性組織球増殖症；多発性骨髄腫；肥満細胞肉腫；免疫増殖性小腸疾患；白血病；リンパ性白血病；形質細胞性白血病；赤白血病；リンパ肉腫細胞性白血病；骨髄性白血病；好塩基球性白血病；好酸球性白血病；単球性白血病；肥満細胞白血病；巨核芽球性白血病；骨髄肉腫；および有毛細胞白血病。さらに、miRNAは、化生、異形成、および過形成などの、前癌状態において評価され得る。
本発明が、前癌状態と癌との間、または原発腫瘍と転移腫瘍との間などの、疾患のステージ間の差を評価または診断するために使用され得ることが、具体的に意図される。
異なる治療薬物の効力は、本発明に従ってmiRNAによって変更される。そのような治療薬物は、化学療法薬を含むがそれらに限定されない。「化学療法剤」は、癌の処置において投与される化合物または組成物を暗示するために使用される。これらの薬剤または薬物は、例えば、それらが細胞周期に影響を及ぼすかどうか、およびどのステージで影響を及ぼすのかなど、細胞内の活性のそれらの様式によってカテゴリー化される。または、薬剤は、DNAを直接的に架橋する、DNAに介在する、または核酸合成に影響を及ぼすことによって染色体および分裂異常を誘導するそれらの能力に基づいて特徴付けされ得る。ほとんどの化学療法剤は、以下のカテゴリーに収まる：アルキル化剤、代謝拮抗物質、抗腫瘍抗生物質、分裂阻害剤、およびニトロソウレア。
化学療法剤の例は、チオテパおよびシクロスホスファミドなどのアルキル化剤；ブスルファン、インプロスルファン、およびピポスルファンなどのスルホン酸アルキル；ベンゾドーパ、カルボクオン、メツレドーパ（meturedopa）、およびウレドーパなどのアジリジン；アルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホロアミド、トリエチレンチオホスホロアミド、およびトリメチロロメラミン（trimethylolomelanine）を含むエチレンイミンおよびメチラメラミン；アセトゲニン（特にブラタシンおよびブラタシノン）；カンプトテシン（合成類似体トポテカンを含む）；ブリオスタチン；カリスタチン；CC-1065（そのアドゼレシン、カルゼレシン、およびビゼレシン合成類似体を含む）；クリプトフィシン（特にクリプトフィシン1およびクリプトフィシン8）；ドラスタチン；デュオカルマイシン（合成類似体、KW-2189およびCB1-TM1を含む）；エルテロビン（eleutherobin）；パンクラチスタチン；サルコジクチン（sarcodictyin）；スポンジスタチン；クロラムブシル、クロルナファジン、クロロホスファミド、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、塩酸メクロレタミンオキシド、メルファラン、ノベンビチン（novembichin）、フェネステリン（phenesterine）、プレドニムスチン、トロホスファミド、ウラシルマスタードなどのナイトロジェンマスタード；カルムスチン、クロロゾトシン、ホテムスチン、ロムスチン、ニムスチン、およびラニムスチンなどのニトロソウレア；エンジイン抗生物質などの抗生物質（例えば、カリケアマイシン、特にカリケアマイシンガンマ1IおよびカリケアマイシンオメガI1；ダインマイシン（dynemicin）Aを含むダインマイシン；クロドロネートなどのビスホスホネート；エスペラマイシン；ならびにネオカルジノスタチンクロモフォアおよび関連色素タンパク質エンジイン抗生物質クロモフォア、アクラシノマイシン、アクチノマイシン、オーソラルナイシン（authrarnycin）、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カラビシン、カルミノマイシン、カルジノフィリン、クロモマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン、6-ジアゾ-5-オキソ-L-ノルロイシン、ドキソルビシン（モルホリノ-ドキソルビシン、シアノモルホリノ-ドキソルビシン、2-ピロリノ-ドキソルビシン、およびデオキシドキソルビシンを含む）、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マルセロマイシン（marcellomycin）、マイトマイシンCなどのマイトマイシン、マイコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン（potfiromycin）、プロマイシン、ケラマイシン（quelamycin）、ロドルビシン、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメックス、ジノスタチン、ゾルビシン；メトトレキサートおよび5-フルオロウラシル（5-FU）などの代謝拮抗物質；デノプテリン、メトトレキサート、プテロプテリン、トリメトレキサートなどの葉酸類似体；フルダラビン、6-メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニンなどのプリン類似体；アンシタビン、アザシチジン、6-アザウリジン、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン、フロキシウリジンなどのピリミジン類似体；カルステロン、プロピオン酸ドロモスタノロン（dromostanolone）、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトンなどのアンドロゲン；アミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタンなどの抗副腎剤；フロリン酸（frolinic acid）などの葉酸補充薬；アセグラトン；アルドホスファミドグリコシド；アミノレブリン酸；エニルウラシル；アムサクリン；ベストラブシル（bestrabucil）；ビサントレン；エダトラキサート（edatraxate）；デホファミン（defofamine）；デメコルシン；ジアジクオン（diaziquone）；エルホルミチン（elformithine）；酢酸エリプチニウム（elliptinium）；エポチロン；エトグルシド；硝酸ガリウム；ヒドロキシウレア；レンチナン；ロニダイニン（lonidainine）；メイタンシンおよびアンサマイトシンなどのメイタンシノイド；ミトグアゾン；ミトキサントロン；モピダンモール（mopidanmol）；ニトラエリン（nitraerine）；ペントスタチン；フェナメット（phenamet）；ピラルビシン；ロソキサントロン；ポドフィリン酸；2-エチルヒドラジド；プロカルバジン；PSKポリサッカライド複合体）；ラゾキサン；リゾキシン；シゾフィラン；スピロゲルマニウム；テヌアゾン酸；トリアジクオン；2,2',2''-トリクロロトリエチルアミン；トリコテッセン（trichothecene）（特にT-2毒素、ベラクリンA、ロリジンA、およびアングイジン（anguidine））；ウレタン；ビンデシン；ダカルバジン；マンノムスチン；ミトブロニトール；ミトラクトール；ピポブロマン；ガサイトシン（gacytosine）；アラビノシド（「Ara-C」）；シクロホスファミド；チオテパ；タキソイド、例えば、パクリタキセルおよびドキセタキセル；クロランブシル；ゲムシタビン；6-チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキサート；シスプラチン、オキサリプラチン、およびカルボプラチンなどの白金配位錯体；ビンブラスチン；白金；エトポシド（VP-16）；イホスファミド；ミトキサントロン；ビンクリスチン；ビノレルビン；ノバントロン；テニポシド；エダトレキサート；ダウノマイシン；アミノプテリン；ゼローダ；イバンドロネート；イリノテカン（例えば、CPT-11）；トポイソメラーゼ阻害剤RFS 2000；ジフルオロメチルオルニチン（DMFO）；レチノイン酸などのレチノイド；カペシタビン；および上記のいずれかの薬学的に許容される塩、酸、または誘導体を含む。
この定義には、例えばタモキシフェン、ラロキシフェン、ドロロキシフェン、4-ヒドロキシタモキシフェン、トリオキシフェン、ケオキシフェン（keoxifene）、LY117018、オナプリストン、およびトレミフェンを含む抗エストロゲンおよび選択的エストロゲン受容体モジュレーター（SERM）などの、腫瘍に対するホルモン作用を調節するまたは阻害するように作用する抗ホルモン剤；例えば、4(5)-イミダゾール、アミノグルテチミド、酢酸メゲストロール、エキセメスタン、ホルメスタニー（formestanie）、ファドロゾール、ボロゾール、レトロゾール、およびアナストラゾールなどの副腎におけるエストロゲン産生を調節する酵素アロマターゼを阻害するアロマターゼ阻害剤；ならびにフルタミド、ニルタミド、ビカルタミド、ロイプロリド、およびゴセレリンなどの抗アンドロゲン；ならびにトロキサシタビン（troxacitabine）（1,3-ジオキソランヌクレオシドシトシン類似体）；アンチセンスオリゴヌクレオチド、例えば、PKC-α、Ralf、およびH-Rasなどの、特に異常な細胞増殖に関与するシグナル伝達経路における遺伝子の発現を阻害するもの；VEGF発現阻害剤およびHER2発現阻害剤などのリボザイム；遺伝子治療ワクチンなどのワクチン、ならびに上記のいずれかの薬学的に許容される塩、酸、または誘導体も含まれる。認可された指示をともなう米国FDA認可癌薬物のリストは、accessdata.fda.gov/scripts/cder/onctools/druglist.cfmにおけるワールドワイドウェブ上で見出され得る。さらに、特定の経路の活性における差を有する試料も比較され得ることが意図される。そのような細胞経路は、以下を含むが、それらに限定されない：サイクリックAMP、タンパク質キナーゼA、Gタンパク質共役受容体、アデニリルシクラーゼ、L-セレクチン、E-セレクチン、PECAM、VCAM-1、α-アクチニン、パキシリン、カドヘリン、AKT、インテグリン-α、インテグリン-β、RAF-1、ERK、PI-3キナーゼ、ビンキュリン、マトリクス・メタロプロテイナーゼ、Rho GTP分解酵素、p85、トレフォイル因子、プロフィリン、FAK、MAPキナーゼ、Ras、カベオリン、カルパイン-1、カルパイン-2、上皮成長因子受容体、ICAM-1、ICAM-2、コフィリン、アクチン、ゲルゾリン、RhoA、RAC1、ミオシン軽鎖キナーゼ、血小板由来成長因子受容体、もしくはエズリンに関連するものを含むがそれらに限定されない、任意の接着もしくは運動性経路；AKT、Fasリガンド、NFκB、カスパーゼ-9、PI3キナーゼ、カスパーゼ-3、カスパーゼ-7、ICAD、CAD、EndoG、グランザイムB、Bad、Bax、Bid、Bak、APAF-1、シトクロムC、p53、ATM、Bcl-2、PARP、Chk1、Chk2、p21、c-Jun、p73、Rad51、Mdm2、Rad50、c-Abl、BRCA-1、パーフォリン、カスパーゼ-4、カスパーゼ-8、カスパーゼ-6、カスパーゼ-1、カスパーゼ-2、カスパーゼ-10、Rho、Junキナーゼ、Junキナーゼキナーゼ、Rip2、ラミン-A、ラミン-B1、ラミン-B2、Fas受容体、H2O2、グランザイムA、NADPHオキシダーゼ、HMG2、CD4、CD28、CD3、TRADD、IKK、FADD、GADD45、DR3死受容体、DR4/5死受容体、FLIP、APO-3、GRB2、SHC、ERK、MEK、RAF-1、サイクリックAMP、タンパク質キナーゼA、E2F、網膜芽細胞腫タンパク質、Smac/Diablo、ACH受容体、14-3-3、FAK、SODD、TNF受容体、RIP、サイクリン-D1、PCNA、Bcl-XL、PIP2、PIP3、PTEN、ATM、Cdc2、タンパク質キナーゼC、カルシニューリン、IKKα、IKKβ、IKKγ、SOS-1、c-FOS、Traf-1、Traf-2、IκBβ、もしくはプロテアソームに関連するものを含むがそれらに限定されない、任意のアポトーシス経路；タンパク質キナーゼA、一酸化窒素、カベオリン-1、アクチン、カルシウム、タンパク質キナーゼC、Cdc2、サイクリンB、Cdc25、GRB2、SRCタンパク質キナーゼ、ADP-リボシル化因子（ARF）、ホスホリパーゼD、AKAP95、p68、オーロラB、CDK1、Eg7、ヒストンH3、PKAc、CD80、PI3キナーゼ、WASP、Arp2、Arp3、p16、p34、p20、PP2A、アンジオテンシン、アンジオテンシン変換酵素、プロテアーゼ活性化型受容体-1、プロテアーゼ活性化型受容体-4、Ras、RAF-1、PLCβ、PLCγ、COX-1、Gタンパク質共役受容体、ホスホリパーゼA2、IP3、SUMO1、SUMO2/3、ユビキチン、Ran、Ran-GAP、Ran-GEF、p53、グルココルチコイド、グルココルチコイド受容体、SWI/SNF複合体の構成要素、RanBP1、RanBP2、インポーチン、エクスポーチン、RCC1、CD40、CD40リガンド、p38、IKKα、IKKβ、NFκB、TRAF2、TRAF3、TRAF5、TRAF6、IL-4、IL-4受容体、CDK5、AP-1転写因子、CD45、CD4、T細胞受容体、MAPキナーゼ、神経成長因子、神経成長因子受容体、c-Jun、c-Fos、Junキナーゼ、GRB2、SOS-1、ERK-1、ERK、JAK2、STAT4、IL-12、IL-12受容体、一酸化窒素シンターゼ、TYK2、IFNγ、エラスターゼ、IL-8、エピセリン、IL-2、IL-2受容体、CD28、SMAD3、SMAD4、TGFβ、もしくはTGFβ受容体に関連するものを含むがそれらに限定されない、任意の細胞活性化経路；TNF、SRCタンパク質キナーゼ、Cdc2、サイクリンB、Grb2、Sos-1、SHC、p68、オーロラキナーゼ、タンパク質キナーゼA、タンパク質キナーゼC、Eg7、p53、サイクリン、サイクリン依存性キナーゼ、神経成長因子、上皮成長因子、網膜芽細胞腫タンパク質、ATF-2、ATM、ATR、AKT、CHK1、CHK2、14-3-3、WEE1、CDC25、CDC6、起点認識複合体タンパク質、p15、p16、p27、p21、ABL、c-ABL、SMAD、ユビキチン、SUMO、熱ショックタンパク質、Wnt、GSK-3、アンジオテンシン、p73任意PPAR、TGFα、TGFβ、p300、MDM2、GADD45、Notch、cdc34、BRCA-1、BRCA-2、SKP1、プロテアソーム、CUL1、E2F、p107、ステロイドホルモン、ステロイドホルモン受容体、IκBα、IκBβ、Sin3A、熱ショックタンパク質、Ras、Rho、ERK、IKK、PI3キナーゼ、Bcl-2、Bax、PCNA、MAPキナーゼ、ダイニン、RhoA、PKAc、サイクリンAMP、FAK、PIP2、PIP3、インテグリン、トロンボポエチン、Fas、Fasリガンド、PLK3、MEK、JAK、STAT、アセチルコリン、パキシリン、カルシニューリン、p38、インポーチン、エクスポーチン、Ran、Rad50、Rad51、DNAポリメラーゼ、RNAポリメラーゼ、Ran-GAP、Ran-GEF、NuMA、Tpx2、RCC1、ソニックヘッジホッグ、Crm1、パッチド（Ptc-1）、MPF、CaMキナーゼ、チューブリン、アクチン、動原体関連タンパク質、セントロメア結合タンパク質、テロメラーゼ、TERT、PP2A、c-MYC、インシュリン、T細胞受容体、B細胞受容体、CBP、IKB、NFκB、RAC1、RAF1、EPO、ジアシルグリセロール、c-Jun、c-Fos、Junキナーゼ、低酸素誘導因子、GATA4、β-カテニン、α-カテニン、カルシウム、アレスチン、スルビビン、カスパーゼ、プロカスパーゼ、CREB、CREM、カドヘリン、PECAM、コルチコステロイド、コロニー刺激因子、カルパイン、アデニリルシクラーゼ、成長因子、一酸化窒素、膜貫通受容体、レチノイド、Gタンパク質、イオンチャネル、転写活性化因子、転写共活性化因子、転写リプレッサー、インターロイキン、ビタミン、インターフェロン、転写コリプレッサー、核孔、窒素、毒、タンパク質分解、もしくはリン酸化に関連するものを含むがそれらに限定されない、任意の細胞周期調節、シグナル伝達、もしくは分化経路；または、アミノ酸の生合成、脂肪酸の酸化、神経伝達物質およびその他の細胞シグナル伝達分子の生合成、ポリアミンの生合成、脂質およびスフィンゴ脂質の生合成、アミノ酸および栄養素の異化、ヌクレオチド合成、エイコサノイド、電子伝達反応、ER関連分解、解糖、線維素溶解、ケトン体の形成、ファゴソームの形成、コレステロール代謝、食物摂取の調節、エネルギーホメオスタシス、プロトロンビン活性化、ラクトースおよびその他の糖の合成、多剤耐性、ホスファチジルコリンの生合成、プロテアソーム、アミロイド前駆体タンパク質、Rab GTP分解酵素、デンプン合成、グリコシル化、ホスホグリセリドの合成、ビタミン、クエン酸回路、IGF-1受容体、尿素回路、小胞輸送、もしくはサルベージ経路に関連するものを含むがそれらに限定されない、任意の代謝経路。本発明の核酸分子が、上記の経路または因子のいずれかに関して、診断および治療方法において使用され得ることがさらに意図される。したがって、本発明のいくつかの態様において、合成miRNA、非合成核酸、またはmiRNA阻害剤が、上記の経路または因子の一つまたは複数を阻害する、排除する、活性化する、誘導する、増加させる、またはそうでなければモジュレートすることが、本発明の一部として意図される。核酸は、上に記載される経路のいずれかに対するそのmiRNAの関係に基づく疾患または病態を診断するために使用され得る。
表現型形質は、寿命、外見（例えば、禿頭症、肥満）、体力、スピード、忍耐力、繁殖力、および特定の薬物または治療的処置に対する影響の受け易さまたは受容力などの特徴も含む。表現型形質に影響を及ぼす合成miRNAまたはmiRNA阻害剤は、治療的開発に対する介入ポイントを提供し得る。
H. その他のアッセイ
アレイおよびマイクロアレイの使用に加えて、多くの異なるアッセイが、miRNA、それらの活性、およびそれらの効果を分析するために使用され得ることが意図される。そのようなアッセイは、RT-PCR、インサイチューハイブリダイゼーション、ハイブリダイゼーション保護アッセイ（HPA）（GenProbe）、分岐DNA（bDNA）アッセイ（Chiron）、ローリングサイクル増幅（RCA）、単一分子ハイブリダイゼーション検出（US Genomics）、インベーダーアッセイ（ThirdWave Technologies）、およびBridge Litigationアッセイ（Genaco）を含むが、それらに限定されない。そのような方法は、アレイとの関連で、ならびに診断的アッセイとの関連で使用され得ることが意図される。
III. 治療的および診断的適用
表現型形質に影響を及ぼす合成miRNAまたはmiRNA阻害剤は、治療的適用ならびに診断的適用に対する介入ポイントを提供する（特定のmiRNAの存在または非存在に対するスクリーニングによって）。本発明のRNA分子は、前のセクションにおいて議論された疾患または病態のいずれかを処置するために使用され得ることが具体的に意図される。さらに、上に記載される方法のいずれかは、本発明の治療的および診断的局面に対して使用されてもよい。例えば、miRNAを検出するまたはそれらに対してスクリーニングすることに関する方法は、診断的関連において使用されてもよい。
治療的適用において、本発明の合成miRNAまたはmiRNA阻害剤の有効量は、動物内に存在している場合もありまたは存在していない場合もある細胞に投与される。いくつかの態様において、本発明の合成miRNAまたはRNA阻害剤の治療的有効量は、疾患または病態の処置のために個体に投与される。本明細書において使用されるような「有効量」という用語は、投与される細胞または組織における望ましい生理学的変化を引き起こすために必要である本発明の分子の量として定義される。本明細書において使用されるような「治療的有効量」という用語は、疾患または病態に対して望ましい効果を達成する本発明の分子の量として定義される。当業者は、多くの場合において、分子が治療法を提供しない場合もあるが、少なくとも一つの症状の緩和または改善などの部分的な利益を提供し得ることを簡単に認識する。いくつかの態様において、ある利益を有する生理学的変化も、治療的に有益であると考えられる。したがって、いくつかの態様において、生理学的変化を提供する分子の量は、「有効量」または「治療的有効量」と考えられる。
いくつかの態様において、分子は、別の動物からのものとは対照的に、特定の動物からのmiRNA配列に対応する配列を有する。したがって、いくつかの態様において、ヒト配列が、本発明のRNA分子において利用される。
A. 投与および製剤の様式
本発明の核酸分子は、単独でまたは病態もしくは疾患の処置に対する薬学的組成物の形態で被験体に投与され得る。薬学的組成物は、薬学的に使用され得る調製へのタンパク質の加工を促進する一つまたは複数の生理学的に許容される担体、希釈剤、賦形剤、または補助剤を使用して従来的な様式で製剤化され得る。適切な製剤は、選ばれる投与のルートに依存する。
局所投与に対して、本発明のタンパク質は、当技術分野において周知なように、溶液、ゲル、軟膏、クリーム、懸濁液などとして製剤化され得る。全身製剤は、皮下、静脈内、筋内、髄腔内、または腹腔内注射などの注射による投与に対してデザインされるもの、ならびに経皮的、経粘膜的、吸入、経口、または肺投与に対してデザインされるものを含む。注射に対して、本発明の核酸は、水性溶液において、好ましくはハンクス溶液、リンガー溶液、または生理学的生理食塩水バッファーなどの生理学的適合性バッファーにおいて製剤化され得る。溶液は、懸濁化剤、安定化剤、および/または分散剤などの調剤薬剤を含み得る。または、核酸分子は、使用の前に、例えば滅菌ピロゲンフリー水などの適した媒体との構成に対する粉末形態であり得る。経粘膜的投与に対して、透過されるバリアに適当な浸透剤が、製剤において使用される。そのような浸透剤は、概して、当技術分野において公知である。経口投与に対して、核酸は、当技術分野において周知の薬学的に許容される担体と分子を組み合わせることによって簡単に製剤化され得る。そのような担体は、本発明の核酸が、処置される患者による経口摂取に対して、錠剤、ピル、糖衣錠、カプセル、液体、ゲル、シロップ、スラリー、懸濁液、および同様のものとして製剤化されることを可能にする。例えば、粉末、カプセル、および錠剤などの経口固体製剤に対して、適した賦形剤は、例えばラクトース、スクロース、マンニトール、およびソルビトールなどの糖などの充填剤；トウモロコシデンプン、小麦デンプン、米デンプン、ジャガイモデンプン、ゼラチン、トラガカントゴム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチル-セルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、および/またはポリビニルピロリドン（PVP）などのセルロース調製；造粒剤；ならびに結合剤を含む。望ましい場合、架橋ポリビニルピロリドン、寒天、またはアルギン酸もしくはアルギン酸ナトリウムなどのその塩などの崩壊剤が添加され得る。望ましい場合、固体剤形は、標準的な技術を使用して糖コーティングまたは腸溶コーティングされ得る。例えば懸濁液、エリキシル剤、および溶液などの経口液体調製に対して、適した担体、賦形剤、または希釈剤は、水、グリコール、オイル、アルコールなどを含む。付加的に、香料添加剤、保存剤、着色剤、および同様のものが、添加され得る。口腔投与に対して、分子は、従来的な様式で製剤化される錠剤、薬用キャンディーなどの形態を取り得る。吸入による投与に対して、本発明に従う使用に対する分子は、例えばジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロメタン、二酸化炭素、またはその他の適したガスなどの適したプロペラントの使用によって、加圧パックまたはネブライザーからのエアロゾルスプレーの形態で都合良く送達される。加圧エアロゾルの場合、投薬単位は、定量を送達するためのバルブを提供することによって決定され得る。インヘイラーまたはインサフレーターにおける使用に対するゼラチンのカプセルおよびカートリッジは、核酸の粉末混合およびラクトースまたはデンプンなどの適した粉末基剤を含んで製剤化され得る。RNA分子は、例えばココアバターまたはその他のグリセリドなどの従来的な坐薬基剤を含む、坐薬または滞留浣腸剤などの直腸または膣組成物において製剤化されてもよい。
前に記載された製剤に加えて、分子は、デポー調製物として製剤化されてもよい。そのような長く作用する製剤は、移植（例えば、皮下にまたは筋内に）または筋内注射によって投与され得る。したがって、例えば、分子は、適したポリマーもしくは疎水性材料（例えば、許容されるオイルにおける乳液として）またはイオン交換樹脂で、または例えば難溶性塩などの難溶性誘導体として、製剤化され得る。
または、その他の薬学的送達システムが使用され得る。リポソームおよび乳液は、本発明の核酸を送達するために使用され得る送達媒体の周知の例である。
本発明の核酸は、細胞取り込みを増加させるために、担体または脂質との組み合わせにおいて投与され得る。例えば、オリゴヌクレオチドは、陽イオン性脂質との組み合わせにおいて投与され得る。陽イオン性脂質の例は、リポフェクチン、DOTMA、DOPE、およびDOTAPを含むが、それらに限定されない。参照により具体的に組み入れられる国際公開公報第0071096号の刊行物は、遺伝子治療に対して有効に使用され得るDOTAP：コレステロールまたはコレステロール誘導体製剤などの異なる製剤を記載する。その他の開示も、ナノ粒子を含む異なる脂質またはリポソーム製剤および投与の方法を議論する；これらは、米国特許出願公開第20030203865号、第20020150626号、第20030032615号、および第20040048787号を含むがそれらに限定されず、それらが製剤ならびに核酸の投与および送達のその他の関連局面を開示する程度に参照により具体的に組み入れられる。粒子を形成するために使用される方法は、米国特許第5,844,107号、第5,877,302号、第6,008,336号、第6,077,835号、第5,972,901号、第6,200,801号、および第5,972,900号においても開示され、それらの局面に対して参照により組み入れられる。
核酸は、ポリ(L-リジン)などの陽イオン性アミンとの組み合わせにおいて投与してもよい。核酸は、トランスフェリンおよびコレステリルなどの化学的部分に接合し得る。加えて、オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドに特定の化学基を連結することによって特定の細胞小器官に対して標的にされ得る。例えば、オリゴヌクレオチドをマンノース残基の適したアレイに連結することによって、オリゴヌクレオチドは肝臓を標的にすると思われる。
付加的に、分子は、治療剤を含む固体ポリマーの半透性材料などの徐放システムを使用して送達され得る。様々な徐放材料が確立されており、当業者によって周知である。徐放カプセルは、それらの化学的性質に依存して、100日までにわたって数週間分子を放出し得る。キメラ分子の化学的性質および生物学的安定性に依存して、分子安定化に対する付加的な戦略が使用され得る。
核酸は、遊離酸もしくは塩基としてまたは薬学的に許容される塩として、上述の製剤のいずれかに含まれ得る。薬学的に許容される塩は、遊離塩基の生物学的活性を実質的に保持し、かつ無機酸との反応によって調製される塩である。薬学的塩は、対応する遊離塩基形態よりも、水性およびその他のプロトン性溶剤に可溶である傾向がある。
本発明の薬学的組成物は、薬学的に許容される担体に溶解または分散された一つまたは複数の合成miRNA分子またはmiRNA阻害剤の有効量を含む。「薬学的または薬理学的に許容される」という語句は、必要に応じて例えばヒトなどの動物に投与される場合に、不利なアレルギー性またはその他の厄介な反応を産生しない分子実体および組成物を指す。少なくとも一つのキメラポリペプチドまたは付加的な活性成分を含む薬学的組成物の調製は、参照により本明細書に組み入れられるRemington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. Mack Printing Company, 1990によって例示されるように、本開示に照らして当業者にとって公知であると思われる。さらに、動物（例えば、ヒト）投与に対して、調製が、FDA Office of Biological Standardsによって必要とされる滅菌性、発熱性、一般的な安全性、および純度標準に合うべきであることが理解されると思われる。
本明細書において使用されるように、「薬学的に許容される担体」は、当業者にとって公知であるように、任意のおよびすべての溶剤、分散媒質、コーティング剤、界面活性剤、抗酸化物質、保存剤（例えば、抗菌剤、抗真菌剤）、等張剤、吸収遅延剤、塩、保存剤、薬物、薬物安定剤、ゲル、結合剤、賦形剤、崩壊剤、潤滑剤、甘味剤、香料添加剤、色素、そのような材料およびその組み合わせを含む（例えば、参照により本明細書に組み入れられるRemington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. Mack Printing Company, 1990, pp. 1289-1329を参照されたい）。任意の従来的な担体が活性成分と適合性がない場合以外は、治療的または薬学的組成物におけるその使用が意図される。
キメラ分子は、それが固体、液体、またはエアロゾル形態で投与されるのかどうか、およびそれが注射などの投与のルートに対して滅菌である必要があるかどうかに依存して、異なる型の担体を含み得る。本発明は、当業者にとって公知であるように、静脈内、皮内、動脈内、腹腔内、病巣内、頭蓋内、関節内、前立腺内、胸膜内、気管内、鼻腔内、硝子体内、膣内、直腸内、局所的、腫瘍内、筋内、腹腔内、皮下、結膜下、膀胱内、粘膜、心膜内、臍帯内、眼内、経口、局所的、局部的、吸入（例えば、エアロゾル吸入）、注射、注入、継続的注入、標的細胞を直接的にバスする（bathing）限局性注入、カテーテルを介して、洗浄を介して、クリームにおいて、脂質組成物（例えば、リポソーム）において、またはその他の方法もしくは前述の任意の組み合わせで投与され得る（例えば、参照により本明細書に組み入れられるRemington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. Mack Printing Company, 1990を参照されたい）。
動物患者に投与される本発明の組成物の実際の投薬量は、体重、病態の重症度、処置される疾患の型、以前のまたは同時の治療的介入、患者の突発性疾患、および投与のルートなどの身体的および生理学的因子によって決定され得る。投与に対して責任のある医師は、任意の事象において、組成物における活性成分の濃度および個々の被験体に対する適当な用量を決定すると思われる。
特定の態様において、薬学的組成物は、例えば、少なくとも約0.1％の活性化合物を含み得る。その他の態様において、活性化合物は、例えば、単位の重量の約2％〜約75％、または約25％〜約60％、およびそこに導き出せる任意の範囲を含み得る。その他の非限定的な例において、用量は、投与あたり約1マイクログラム/kg/体重から、約5マイクログラム/kg/体重、約10マイクログラム/kg/体重、約50マイクログラム/kg/体重、約100マイクログラム/kg/体重、約200マイクログラム/kg/体重、約350マイクログラム/kg/体重、約500マイクログラム/kg/体重、約1ミリグラム/kg/体重、約5ミリグラム/kg/体重、約10ミリグラム/kg/体重、約50ミリグラム/kg/体重、約100ミリグラム/kg/体重、約200ミリグラム/kg/体重、約350ミリグラム/kg/体重、約500ミリグラム/kg/体重、約1000 mg/kg/体重まで、またはそれより多く、およびそこに導き出せる任意の範囲を含んでもよい。本明細書に列挙した数から導き出せる範囲の非限定的な例において、約5 mg/kg/体重〜約100 mg/kg/体重、約5 マイクログラム/kg/体重〜約500 ミリグラム/kg/体重などの範囲が、上に記載される数に基づいて投与され得る。
任意の場合において、組成物は、一つまたは複数の構成要素の酸化を遅らせるために様々な抗酸化物質を含み得る。付加的に、微生物体の作用の防止は、パラベン（例えば、メチルパラベン、プロピルパラベン）、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサール、またはその組み合わせを含むがそれらに限定されない、様々な抗菌および抗真菌剤などの保存剤によってもたらされ得る。
分子は、遊離塩基、中性、または塩形態で組成物に製剤化され得る。薬学的に許容される塩は、酸付加塩、例えば、タンパク性組成物の遊離アミノ基で形成されるもの、または例えば塩酸もしくはリン酸などの無機酸、酢酸、シュウ酸、酒石酸、もしくはマンデル酸などの有機酸で形成されるものを含む。遊離カルボキシル基で形成される塩は、例えばナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、もしくは水酸化第二鉄などの無機塩基；またはイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、もしくはプロカインなどの有機塩基に由来してもよい。
組成物が液体形態である態様において、担体は、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコールなど）、脂質（例えば、トリグリセリド、植物オイル、リポソーム）、およびその組み合わせを含むがそれらに限定されない、溶剤または分散媒質であり得る。適切な流動性は、例えばレシチンなどのコーティング剤の使用によって；例えば、液体ポリオールまたは脂質などの担体における分散による必要とされる粒子サイズの維持によって；例えば、ヒドロキシプロピルセルロースなどの界面活性剤の使用によって；またはそのような方法の組み合わせによって維持され得る。多くの場合において、例えば糖、塩化ナトリウム、またはその組み合わせなどの等張剤を含むことが好ましいと思われる。
その他の態様において、本発明において目薬、点鼻溶液またはスプレー、エアロゾルまたは吸入抗原が使用され得る。そのような組成物は、概して、標的組織型と適合性があるようにデザインされる。非限定的な例において、点鼻溶液は、通常、液滴またはスプレーにおいて鼻道に投与されるようにデザインされた水性溶液である。点鼻溶液は、それらが多くの点で鼻汁と類似であるように、正常な繊毛作用が維持されるように、調製される。したがって、好ましい態様において、水性点鼻溶液は、通常、等張である、または約5.5〜約6.5のpHを維持するためにわずかに緩衝される。加えて、必要とされる場合、点眼調製、薬物、または適当な薬物安定剤において使用されるものと同様の抗微生物保存剤が、製剤に含まれ得る。例えば、様々な市販の点鼻調製が公知であり、抗生物質または抗ヒスタミン剤などの薬物を含む。
特定の態様において、分子は、経口摂取などのルートによる投与に対して調製される。これらの態様において、固体組成物は、例えば、溶液、懸濁液、乳液、錠剤、ピル、カプセル（例えば、硬または軟殻ゼラチンカプセル）、徐放製剤、口腔組成物、トローチ、エリキシル剤、懸濁液、シロップ、ウエハース、またはその組み合わせを含み得る。経口組成物は、食事の食品に直接的に組み入れられ得る。経口投与に対する好ましい担体は、不活性希釈剤、同化可能食用担体、またはその組み合わせを含む。本発明のその他の局面において、経口組成物は、シロップまたはエリキシル剤として調製され得る。シロップまたはエリキシル剤は、例えば、少なくとも一つの活性剤、甘味剤、保存剤、香料添加剤、色素、保存剤、またはその組み合わせを含み得る。
特定の好ましい態様において、経口組成物は、一つまたは複数の結合剤、賦形剤、崩壊剤、潤滑剤、香料添加剤、およびその組み合わせを含み得る。特定の態様において、組成物は、以下の一つまたは複数を含み得る：例えばトラガカントゴム、アカシア、トウモロコシデンプン、ゼラチン、もしくはその組み合わせなどの結合剤；例えばリン酸二カルシウム、マンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウム、もしくはその組み合わせなどの賦形剤；例えば、トウモロコシデンプン、ジャガイモデンプン、アルギン酸、もしくはその組み合わせなどの崩壊剤；例えばステアリン酸マグネシウムなどの潤滑剤；例えば、スクロース、ラクトース、サッカリン、もしくはその組み合わせなどの甘味剤；例えばペパーミント、冬緑油、チェリー香味料、オレンジ香味料などの香料添加剤；または前述の組み合わせ。投薬単位形態がカプセルである場合、それは、上記の型の材料に加えて、液体担体などの担体を含み得る。様々なその他の材料は、コーティング剤として、またはそうでなければ投薬単位の物理的形態を改変するために存在し得る。例えば、錠剤、ピル、またはカプセルは、セラック、糖、または両方でコーティングされ得る。
組成物は、製造および保存の条件下で安定でなければならず、細菌および真菌などの微生物体の混入作用に対して保存されなければならない。内毒素混入は、例えば0.5 ng/mgタンパク質よりも少ない安全なレベルで最小に保たれるべきであることが高く評価されると思われる。
特定の態様において、注射可能な組成物の延長された吸収は、例えば、モノステアリン酸アルミニウム、ゼラチン、またはその組み合わせなどの吸収を遅延させる薬剤の組成物における使用によってもたらされ得る。
細胞への送達または輸送に関して上で議論される任意の態様は、このセクションにおいて議論される薬用化合物の送達を遂行することに対して使用されてもよい。
B. 有効な投薬量
本発明の分子は、概して、意図される目的を達成するのに有効な量において使用されると思われる。疾患病態を処置するまたは予防するための使用に対して、本発明の分子、またはその薬学的組成物は、治療的有効量において投与または適用される。治療的有効量は、処置される患者の症状を良くするもしくは予防するまたは生存を延長するのに有効な量である。治療的有効量の決定は、特に本明細書において提供される詳細な開示に照らして、十分に当業者の手腕内である。
全身投与に対して、治療的有効用量は、インビトロアッセイから初めに推定され得る。例えば、用量は、細胞培養において決定されるようなIC5を含む循環濃度範囲を達成するために動物モデルにおいて製剤化され得る。そのような情報は、ヒトにおける有用な用量をより正確に決定するために使用され得る。
初めの投薬量は、当技術分野において周知である技術を使用して、例えば動物モデルなどのインビボデータから推定されてもよい。当業者は、動物データに基づいてヒトへの投与を簡単に最適化し得ると考えられる。
投薬量の量および間隔は、治療的効果を維持するのに十分である分子の血漿レベルを提供するために個々に調整され得る。注射による投与に対する通常の患者投薬量は、約0.1〜5 mg/kg/日、好ましくは、約0.5〜1 mg/kg/日の範囲である。治療的に有効な血清レベルは、各々の日に複数用量を投与することによって達成され得る。
局部投与または選択的取り込みの場合、タンパク質の有効局部濃度は、血漿濃度に関連しないこともある。当業者は、必要以上の実験なしに、治療的に有効な局部投薬量を最適化できると思われる。
投与される分子の量は、当然、処置される被験体、被験体の重量、苦痛の重症度、投与の様式、および処方医師の判断に依存すると思われる。
治療は、症状が検出可能である場合、またはそれらが検出可能でない場合でも、間欠的に繰り返され得る。治療は、単独で、またはその他の薬物もしくは処置（手術を含む）との組み合わせにおいて提供され得る。
C. 毒性
好ましくは、本明細書において記載される分子の治療的有効用量は、実質的な毒性を引き起こすことなく治療的利益を提供すると思われる。
本明細書において記載される分子の毒性は、例えば、LD50（集団の50％に対して致死的な用量）またはLD100（集団の100％に対して致死的な用量）を決定することによって、細胞培養または実験動物における標準的な薬学的手順によって決定され得る。毒性と治療的効果の用量比は、治療指数である。高い治療指数を示すタンパク質が好ましい。これらの細胞培養アッセイおよび動物調査から得られるデータは、ヒトにおける使用に対して毒性ではない投薬量範囲を製剤化することにおいて使用され得る。本明細書において記載されるタンパク質の投薬量は、好ましくは、ほとんどまたは全く毒性をともなわない有効用量を含む循環濃度の範囲内にある。投薬量は、使用される剤形および利用される投与のルートに依存して、この範囲内で変化し得る。正確な製剤、投与のルート、および投薬量は、患者の病態を考慮して個々の医師によって選ばれ得る。（例えば、Fingl et al., 1975, In: The Pharmacological Basis of Therapeutics, Ch.1, p.1を参照されたい）。
D. ペンダント基
「ペンダント基」は、核酸に付着または接合し得る。ペンダント基は、核酸の細胞取り込みを増加し得る。ペンダント基は、核酸の任意の部分に連結され得るが、一般的には、オリゴヌクレオチド鎖の末端に連結される。ペンダント基の例は、以下を含むが、それらに限定されない：アクリジン誘導体（すなわち、2-メトキシ-6-クロロ-9-アミノアクリジン）；ソラレン誘導体、アジドフェナシル（azidophenacyl）、プロフラビン、およびアジドプロフラビンなどの架橋剤；人工エンドヌクレアーゼ；EDTA-Fe(II)、o-フェナントロリン-Cu(I)、およびポルフィリン-Fe(II)などの金属錯体；アルキル化部分；アミノ-1-ヘキサノールスタフィロコッカルヌクレアーゼおよびアルカリホスファターゼなどのヌクレアーゼ；末端トランスフェラーゼ；アブザイム；コレステリル部分；親油性担体；ペプチド複合体；長鎖アルコール；リン酸エステル；アミノ；メルカプト基；放射性マーカー；色素などの非放射性マーカー；ならびにポリリジンまたはその他のポリアミン。一つの例において、核酸は、炭水化物、硫酸化炭水化物、またはグリカンに接合する。
IV. キット
本明細書において記載される組成物の任意は、キットに含まれ得る。非限定的な例において、個々の合成miRNAは、キットに含まれる。キットは、合成miRNA送達の効果を制御するために使用され得る一つまたは複数の陰性対照合成miRNAをさらに含み得る。キットは、合成miRNAの二本鎖のハイブリダイゼーションを促進するための水およびハイブリダイゼーションバッファーをさらに含み得る。キットは、細胞への合成miRNAの送達を促進するための一つまたは複数のトランスフェクション試薬を含んでもよい。
別の非限定的な例において、複数の合成miRNAおよび/または複数のmiRNA阻害剤が、キットに含まれる。キットは、合成miRNAおよび/またはmiRNA阻害剤送達の効果を制御するために使用され得る一つまたは複数の陰性対照合成miRNAおよび/またはmiRNA阻害剤をさらに含み得る。キットは、細胞への送達を促進するための一つまたは複数のトランスフェクション試薬を含んでもよい。
キットの構成要素は、水性媒質において、または凍結乾燥形態で、包装され得る。キットの容器手段は、概して、構成要素を入れることができる、好ましくは適切に等分され得る、少なくとも一つのバイアル、テストチューブ、フラスコ、ボトル、シリンジ、またはその他の容器手段を含むと思われる。キットに複数の構成要素がある場合（標識化試薬および標識が一緒に包装され得る）、キットは、概して、付加的な構成要素を別個に入れることができる第二、第三、またはその他の付加的な容器も含むと思われる。しかしながら、構成要素の様々な組み合わせが、バイアルに含まれ得る。本発明のキットは、典型的には、委託販売のために厳重な管理下で、核酸を含むための手段、および任意のその他の試薬容器も含むと思われる。そのような容器は、望ましいバイアルが保持される注射または中空形成プラスチック容器を含み得る。
キットの構成要素が、一つおよび/または複数の液体溶液において提供される場合、液体溶液は水性溶液であり、滅菌水性溶液が特に好ましい。
しかしながら、キットの構成要素は、乾燥粉末として提供され得る。試薬および/または構成要素が、乾燥粉末として提供される場合、粉末は、適した溶剤の添加によって再構成され得る。溶剤は、別の容器手段において提供されてもよいことが想定される。
容器手段は、概して、核酸製剤を入れることができる、好ましくは適切に配分される、少なくとも一つのバイアル、テストチューブ、フラスコ、ボトル、シリンジ、および/またはその他の容器手段を含むと思われる。キットは、滅菌の、薬学的に許容されるバッファーおよび/またはその他の希釈剤を含むための第二の容器手段を含んでもよい。
本発明のキットは、典型的には、委託販売のために厳重な管理下で、例えば望ましいバイアルが保持される注射および/または中空形成プラスチック容器などの、バイアルを含むための手段も含むと思われる。
そのようなキットは、miRNAを保存するもしくは維持する、またはその分解から保護する構成要素を含んでもよい。そのような構成要素は、RNA分解酵素フリーであり得る、またはRNA分解酵素から保護し得る。そのようなキットは、概して、適した手段において、各々の個々の試薬または溶液に対する相異なる容器を含むと思われる。
キットは、キットに含まれない任意のその他の試薬の使用と同様に、キット構成要素を使用するための説明書も含むと思われる。説明書は、遂行され得る変形を含み得る。
本発明のキットは、以下の一つまたは複数を含んでもよい：合成miRNA、非合成miRNA、合成miRNAのライブラリー、miRNA阻害剤のライブラリー、非合成miRNAのライブラリー、合成miRNA、miRNA阻害剤、および/または非合成miRNAの組み合わせライブラリー、陰性対照合成miRNA、陰性対照miRNA阻害剤、陰性対照非合成miRNA、ヌクレアーゼフリー水；1.5 mlチューブなどのRNA分解酵素フリー容器；ハイブリダイゼーションバッファー；ならびにトランスフェクション試薬。
そのような試薬が、本発明のキットの態様であることが意図される。しかしながら、そのようなキットは、上で同定される特定の項目に限定されず、miRNAの操作または特徴付けのために使用される任意の試薬を含み得る。
実施例
以下の実施例は、本発明の好ましい態様を実証するために含まれる。以下の実施例において開示される技術は、本発明者らによって本発明の実施において良く機能することが発見された技術を示し、したがって、その実施に対して好ましい様式を構成すると考えられ得るということが、当業者によって高く評価されるべきである。しかしながら、当業者は、本開示に照らして、開示される特定の態様において多くの変化がなされ得ることを高く評価するべきであり、それでも、本発明の精神および範囲から逸脱することなく同様のまたは類似の結果を得るべきである。
他に特に指定されなければ、カタログ番号は、Ambion, Inc.(登録商標)、The RNA Companyからのその番号によって利用できる製品を指す。
実施例1
前駆体miRNA（レポーター）の活性を測定するためのアッセイ
一連のルシフェラーゼレポーターベクターは、細胞における合成miRNAの活性を測定するために作製された。レポーターベクターは、内因性miRNAの活性をモニターするために使用されていたプラスミドに基づいた（Tusch1論文）。手短に、CMV早期プロモーターの制御下でルシフェラーゼ遺伝子を有する哺乳動物発現ベクターが作製された。ルシフェラーゼコード配列の下流に、遺伝子の3'UTRにおいて、成熟miR-1-2、miR-10、miR-124、miR-19a、およびmiR-130と相補的な配列が付加された。レポーターベクターは、上に列挙した五つのmiRNAの一つを導入するようにデザインされた合成miRNAとともにHeLa細胞に共トランスフェクトされた。トランスフェクションは、200 ngのレポーターベクターを0.3、1、および3 pmolの各々の対応する合成miRNAと混合することに関連した。レポーター/miRNA混合物は、0.3μlのリポフェクタミン2000（Invitrogen）と混合され、5〜15分間インキュベートされた。およそ8,000細胞が、96ウェルプレートの個々のウェルで、各々のmiRNA/レポーター/トランスフェクション試薬複合体に添加された。HeLa細胞は、37℃および5％CO2で、10％ウシ胎児血清（GIBCO）で補われたD-MEM（GIBCO）において成長させた。トランスフェクションの24〜48時間後、細胞は、採取され、製造業者（Promega）によって記載されるようにルシフェラーゼアッセイを使用してアッセイされた。細胞集団におけるルシフェラーゼ発現のレベルは、同じレポーターだがベクターに対応しない配列を有する合成miRNAをトランスフェクトされた細胞と比較された。この非標的miRNAは、陰性対照miRNAと呼ばれた。
合成miRNAデザインの最終分析は、本発明者らの合成miRNAの活性および相補鎖の両方の活性を測定することに関連した。これらの調査に対して、本発明者らの合成miR-33およびlet-7b miRNAデザインの活性および相補鎖の両方と相補的な領域を含むルシフェラーゼ3'UTR配列を有するレポーターベクターが作製された。機能不全合成miRNAを共トランスフェクトされる場合、相補鎖によって標的にされる配列を有するレポーターは、合成miRNAの相補鎖が望ましい活性鎖に加えてまたは代わりにmiRNA経路に入るので、低下したルシフェラーゼ発現を示す。これらの実験に対して、共トランスフェクションおよびレポーター分析プロトコールは、上に記載されるものと同一である。
実施例2
前駆体miRNA（内因性遺伝子）の活性を測定するためのアッセイ
ルシフェラーゼレポーター構築物が、合成miRNAデザインを評価することにおいて極めて価値があったが、内因性遺伝子標的に対する合成miRNAの効果を測定することによってレポーター構築物の所見を検証することは重要であった。これらの調査に対して、let-7 miRNAをトランスフェクトされた細胞におけるRASおよびMYCの発現が、モニターするために選ばれた。RASおよびMYCの両方は、ヒトおよびC. エレガンスにおけるlet-7ファミリーの様々なメンバーによって下方制御される（係属中の刊行物）。miRNAに特異的なマイクロアレイシステムを使用して、本発明者らは、HepG2細胞が検出できないレベルのlet-7を発現することを見出した。本発明者らの合成miRNAの本発明者らの様々なデザインの活性をテストするために、合成let-7 miRNAが作製され、製造業者の提案に従ってsiPORT NeoFX（Ambion）を使用して24ウェルプレートにおいてHepG2細胞にトランスフェクトするために使用された。トランスフェクションの3日後、細胞は、製造業者の提案に従って、4％パラホルムアルデヒドで固定され、細胞核を特定するためにDAPIで染色され、かつMYCまたはRASに特異的なFITC接合抗体（US Biological）で染色された。合成let-7トランスフェクト細胞における標的タンパク質発現における相対的な低下は、MetaMorphソフトウェアを使用して、MYCおよびRASの染色強度を陰性対照miRNAをトランスフェクトされた細胞と比較することによって決定された。
本発明者らのlet-7アッセイの結果が、細胞において天然で観測される付加的なmiRNA相互作用によって検証され得ることを確実にするために、本発明者らは、検証された標的を有する二つの付加的なmiRNAに対するアッセイを作製した。最初に、リアルタイムPCR(商標)アッセイが、合成miR-196をトランスフェクトされた細胞におけるHOXB8 mRNAのレベルを測定するために開発された。miR-196は、細胞におけるHOXB8 mRNAの分解を誘導することが示されている。製造業者の説明書に従ってsiPORT NeoFXを使用して培養細胞にトランスフェクトされる場合、有効なmiR-196合成miRNAデザインは、HOXB8 mRNAのレベルを低下させる。
合成miR-1-2 miRNAの有効性をモニターするために、レポーターベクターが作製され、G6PD遺伝子の3'UTRが、ルシフェラーゼコード領域のすぐ下流に置かれた。miR-1-2とG6PD 3'UTRとの間の相互作用は、刊行されている（Lewis, 2003）。合成miR-1-2デザインは、レポーターベクターと共トランスフェクトされ、実施例1において記載されるようにアッセイされた。
実施例3
部分的に相補的なmiRNAの有効性
3つの一般的な配列デザインが、miRNA活性に対して比較された。「miRNAデザイン」と呼ばれる第一のものは、動物において見出された成熟miRNAと同一の活性鎖およびmiRNAの活性化に先行してmiRNAのプロセシングの間に細胞に存在することが予測されるヘアピン配列と同一である相補鎖を特徴とした（以下を参照されたい）。「ミスマッチデザイン」と呼ばれる第二のデザインは、ジヌクレオチド3'突出、および3'突出に先立つ最後の5ヌクレオチドにおける二つのミスマッチを有する相補鎖との、上記と同じ活性鎖のハイブリッドであった（以下を参照されたい）。「siRNAデザイン」と呼ばれる第三のデザインは、それが二本鎖分子（二つのポリヌクレオチド）のいずれかの末端で3'ジヌクレオチド突出を残すこと以外、完全に相補的である第二のRNAにハイブリダイズされる上記と同じ活性鎖を含んだ（以下を参照されたい）。以下の例は、ヒトmiRNAに関連するまたは対応する。
Figure 2008519606
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種々のmir-1-2、mmu-miR-10a-1、miR-19a、mir-124a-1、およびmir-130a合成miRNAは、実施例1において記載されるアッセイを使用して、適当なmiRNA標的部位を有するベクターにおけるレポーター遺伝子の発現を低下させるそれらのキャパシティに対してテストされた。すべての3つのデザインは、適当なレポーターベクターを同様に下方制御することが可能であった。
内因性遺伝子の発現に影響を及ぼすそれらの能力において、様々なmiRNAデザイン間の差があるかどうかを査定するために、以下の細胞がトランスフェクトされた：let-7合成miRNAの3つのデザインでHepG2細胞、miR-196合成miRNAの3つのデザインでA549細胞、ならびにG6PDレポーターベクターおよびmiR-1-2合成miRNAの3つのデザインでHeLa。レポーターベクターと同様に、すべての3つの合成miRNAデザインは、siRNAデザインが最も乏しく機能したことは注目すべきことであるが、標的遺伝子の発現を低下させることが可能であることがわかった。
3つの合成miRNAデザインの最終比較として、合成miRNAは、実施例1において記載される手順に従って、合成miRNAの相補鎖に対する標的部位を含むレポーターベクターと共トランスフェクトされた。このアッセイにおいて、siRNAデザインが、レポーターベクターに有意に影響を及ぼしたことは明白であり、miRNAの間違った鎖がmiRNA経路に入ったことを示す（図3）。相補鎖は、調査されているmiRNAの天然の標的ではない遺伝子の発現に影響し得ると考えられるので、siRNAデザインは、有効な合成miRNAに対して不適当である。
実施例4
化学的5'末端修飾合成miRNAの有効性
siRNAデザインは、それがmiRNA経路による相補鎖取り込みの高い率を示すことにおいて問題であることがわかったが、それは、それがハイブリダイズしやすく、かつ細胞に送達しやすいという利点を有した。これらの理由に対して、相補鎖取り込みにともなう問題を克服するための方式が探索された。siRNAデザインは、合成miRNAの5'末端における化学的修飾の効果をテストするために使用された。これらの調査に対して、いくつかの異なる相補鎖が、ユニークな5'末端をともなって合成された。一つは、5'末端における4つのデオキシリボースヌクレオチドを特徴とした；一つは、5'末端および5'NH2における4つのデオキシリボースヌクレオチドの組み合わせであった；一つは、5'NH2を有した；一つは、5'NHCOCH3を有した（以下を参照されたい）。
Figure 2008519606
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miR-33およびlet-7b合成miRNAは、実施例1において記載されるように、miR-33およびlet-7bの活性および相補鎖に対する標的部位を持つレポーターベクターと、それぞれHeLaおよびHepG2細胞に共トランスフェクトされた。活性および相補鎖特異的レポーターベクターからのルシフェラーゼ発現は、製造業者（Promega）のプロトコールに従って測定された。図3において示されるように、5'NH2および5'NHCOCH3を有する合成miRNAデザインは、非修飾合成miRNAに対して、より高い活性鎖活性を提供しかつ相補鎖活性を有意に低下させた。トランスフェクションに続いて見られる効果が、合成miRNAの活性鎖の活性に特異的であると思われるので、これは、合成miRNAに対して理想的である。さらに、5'修飾デザインの高い効力は、低い濃度がトランスフェクションに対して使用されることを可能にし、かつより多い量の核酸を細胞にトランスフェクトする場合にしばしば観測される毒性を低減すると思われる。
5'アミノ修飾が、合成miRNAの広範なセットに対する標準的なsiRNAデザインよりも優れていることを確認するために、両方の合成miRNAデザインの有効性が、miRNA標的部位を有するレポーターベクターを共トランスフェクトされた細胞において測定された。図4において見られるように、5'NH2は、再現性よく非修飾siRNAデザインよりも優れている。
実施例5
化学的内部修飾合成miRNAの有効性
siRNAデザインは、相補鎖内の内部ドメインにおける化学的修飾の効果をテストするためにも使用された。これらの調査に対して、2'O-Me修飾が、相補鎖の長さに沿って様々な場所に置かれた。以下に、化学的修飾相補鎖を有する一連の合成miRNAの例が提供される。
Figure 2008519606
注釈： 2'-O-Meである位置は、太字で示される。
上に記載されるデザインを有する合成miRNAは、miRNAおよび相補鎖活性に対してテストされた。興味深いことに、位置（Position）1および位置5における相補鎖修飾は、miRNA鎖の活性を変更することなく、相補鎖活性を有意に低下させた（図3）。
実施例6
細胞増殖に影響を与えるmiRNAに対する合成miRNAライブラリースクリーニング
癌の特質は、無制御細胞増殖である；細胞増殖アッセイは、一般的に、発癌における遺伝子の影響を調査するために研究者によって使用される。細胞増殖アッセイは、細胞増殖に影響を与えるmiRNAを同定するためにmiRNA阻害剤ライブラリーとともに使用された。
本発明者らは、製造業者の説明書に従って、siPORT NeoFX（Ambion）を使用して、15個の異なる合成miRNAをHeLa細胞に三連でトランスフェクトした（図6）。トランスフェクトHeLa細胞は、24時間間隔でAlamar Blue（BioSource International, Inc., CA）を使用して分析された。Alamar Blueは、細胞代謝によって低下する場合に、非蛍光青色を、容易に定量される蛍光赤形態に変える化合物である。低下するAlamar Blueの量は、細胞数と直接的に比例し、細胞増殖を査定するための迅速な方法を提供する。アッセイを行うために、Alamar Blue試薬は、10％最終濃度で組織培養培地に添加された。混合物は、成長条件において3〜6時間インキュベートされ、その後、蛍光が、Spectra Max(商標)GeminiXS(商標)（Molecular Devices, Sunnyvale, CA）を使用して定量された。合成miR-124およびmiR-106をトランスフェクトされた細胞は、陰性対照トランスフェクト試料ならびにその他の合成miRNAをトランスフェクトされた試料よりも有意に低い増殖を示した。
実施例7
細胞増殖に影響を与えるmiRNAに対するmiRNA阻害剤ライブラリースクリーニング
癌の特質は、無制御細胞増殖である。細胞増殖アッセイは、一般的に、発癌における遺伝子の影響を調査するために研究者によって使用される。細胞増殖アッセイは、細胞増殖に影響を与えるmiRNAを同定するために本発明者らのmiRNA阻害剤ライブラリーとともに使用された。
細胞には、細胞成長に関与するmiRNAを同定するために90個を超えるmiRNA阻害剤についてのライブラリーをトランスフェクトした。HeLa細胞（96ウェルプレートの8000細胞/ウェル）に、siPORT(商標)NeoFX(商標)（Ambion）を使用して、5 pmolのmiRNA阻害剤を三連でトランスフェクトした。培地はトランスフェクションの24時間後に交換した。トランスフェクションの72時間後、本発明者らは、4％パラホルムアルデヒドで細胞を固定し、0.1％TritonX 100で透過化し、かつ全細胞数を見るためにヨウ化プロピジウムで染色した。プレートは、TTP labtech Acumen Explorerを使用してスキャンされた。細胞数は、陰性対照miRNA阻害剤をトランスフェクトされた細胞に対してプロットされた（図7）。赤水平バーは、細胞増殖における正常変動をひとくくりにする（20％変動）。差込図：細胞増殖を増加させた（左矢印）または細胞増殖に影響を及ぼさなかった（右矢印）特定のmiRNA阻害剤は、スクリーニングの第二ラウンドにおいて使用された。HeLa細胞は、これらのmiRNA阻害剤をトランスフェクトされ、細胞は固定され、かつ特定のmiRNA機能に応じた細胞形態変化を可視化するために、b-アクチン抗体およびDAPIで染色された。細胞増殖を増加させるmiRNA阻害剤をトランスフェクトされた細胞は、正常形態（右差込図）に対して、細胞形態における際立った変更を示す（左差込図）。
HeLa細胞へのトランスフェクションの後に、細胞成長における有意な減少を引き起こす9個のmiRNA阻害剤（miR 31、150、187、125a、190、191、193、204、および218）の群が同定され、細胞成長における有意な増加を引き起こす2つのmiRNA阻害剤（miR 24およびmiR 21）が同定された（表4）。miRNA-31阻害も、相異なる細胞形態を引き起こした。100％の20％上および下の相対カットオフが、有意に変化したと考えられる遺伝子として選ばれた。これらの結果は、重要な細胞プロセスを調節する個々のヒトmiRNAの能力を実証する。さらに、観測された効果の多様性は、遺伝子発現のmiRNA媒介調節の細胞アウトカムの潜在的な複雑性を実証する。
（表４）細胞増殖に影響を及ぼすmiRNA
Figure 2008519606
実施例8
アポトーシスに影響を与えるmiRNAに対する合成miRNAライブラリースクリーニング
癌を含む多くの疾患は、プログラム細胞死、またはアポトーシスを起こすことの不可能性によって特徴付けられる。カスパーゼ3/7活性アッセイは、アポトーシスを調節することに関与するmiRNAを同定するために、合成miRNAのライブラリーとともに使用された。
18個の合成miRNAについてのライブラリーは、siPORT(商標)NeoFX(商標)（Ambion）を使用して、A549細胞（96ウェルプレートの8000細胞/ウェル）に三連でトランスフェクトするために使用された。培地を24時間後に交換し、細胞は、トランスフェクションの72時間後に細胞死を定性的に検査するために、顕微鏡下で視覚的に検査された。細胞は、以下のようにカスパーゼ3活性を測定することによって、アポトーシスに対して測定された：1）細胞は、PBSで1回洗浄され、-80℃で凍結された。2）細胞は、40μlの冷溶解バッファー（50 mM HEPES pH 7.2、40 mM NaCl、0.5％ NP40、0.5 mM EDTA）をウェルに添加することによって溶解され、4℃で20分間インキュベートされた。3）160μl ICEバッファー（50 mM HEPES pH 7.4、0.1％ CHAPS、0.1 mM EDTA、10％スクロース）＋20μM DEVDafc基質を含む5 mM DTTを添加する。4）400 ex、505 emで1時間における蛍光増加を測定する。
miR-1-2およびmiR-33合成miRNAをトランスフェクトされた細胞は、低下したカスパーゼ3/7活性を示し、miR-20をトランスフェクトされた細胞は、アポトーシスのより高いレベルを示した。これらの3つのmiRNAは、アポトーシスを制御することに関与する遺伝子を調節する可能性が高い。
実施例9
細胞生存率に影響を与えるmiRNAに対するスクリーニング
miRNA阻害剤は、細胞生存率に影響を与えるmiRNAを同定するためにも使用された。90個を超えるmiRNA阻害剤についてのライブラリーは、siPORT(商標)NeoFX(商標)（Ambion）を使用して、A549細胞（96ウェルプレートの8000細胞/ウェル）に三連でトランスフェクトするために使用された。培地を24時間後に交換し、細胞は、トランスフェクションの72時間後に細胞死を定性的に検査するために、顕微鏡下で視覚的に検査された。細胞は、トリプシン処理され、試薬におけるDNA結合色素の透過性に基づいて生存および非生存細胞間を識別するViaCount Flex試薬で染色された。細胞は、Guava PCA-96（Personal Cell Analysis）を使用して分析された。
21個のmiRNA阻害剤は、陰性対照miRNA阻害剤と生/死細胞の有意に異なる比を誘導した（図8）。12個は、細胞生存率を低下させ、9個は、細胞生存率を増加させた（表5）。興味深いことに、A549細胞における細胞生存率に影響を及ぼしたmiRNAおよびHeLa細胞における細胞増殖に影響を及ぼしたmiRNAにおいてほとんど重複がなく、異なる細胞は、異なって反応しmiRNA活性を低下させる、または細胞生存率および細胞増殖は、同じ細胞経路によって影響を受けないことを示唆する。
（表５）細胞生存率に影響を及ぼすmiRNA
Figure 2008519606
実施例10
アポトーシスに影響を与えるmiRNAに対するスクリーニング
アポトーシスは、発癌潜在性を有する細胞における死を誘導することによって癌を制御することを助ける天然の細胞プロセスである。多くの癌遺伝子は、アポトーシスの誘導を変更することによって機能する。アポトーシスに関与するmiRNAを同定するために、アポトーシスアッセイが、miRNA阻害剤ライブラリーとともに使用された。
90個を超えるmiRNA阻害剤についてのライブラリーを使用して、本発明者らは、アポトーシスに影響を及ぼすmiRNAをスクリーニングした。HeLa細胞（96ウェルプレートの8000細胞/ウェル）に、Ambion siPORT(商標)NeoFX(商標)を使用して、miRNA阻害剤（5 pmol）を三連でトランスフェクトした。培地をトランスフェクションの24時間後に交換し、トランスフェクションの72時間後に細胞を処理した。細胞は、以下のようにカスパーゼ3活性を測定することによって、アポトーシスに対して測定された：1）細胞は、PBSで1回洗浄され、-80℃で凍結された。2）細胞は、40μlの冷溶解バッファー（50 mM HEPES pH 7.2、40 mM NaCl、0.5％ NP40、0.5 mM EDTA）をウェルに添加することによって溶解され、4℃で20分間インキュベートされた。3）160μl ICEバッファー（50 mM HEPES pH 7.4、0.1％ CHAPS、0.1 mM EDTA、10％スクロース）＋20μM DEVDafc基質を含む5 mM DTTを添加する。4）400 ex、505 emで1時間における蛍光増加を測定する。
試料は、カスパーゼ3結果を正規化するための一般的なエステラーゼアッセイを使用して、細胞数に対しても分析された。FDA基質（アセトニトリルにおける0.4 mg/mlフルオレセインジアセテート（FDA））は、希釈バッファー（40 mM TrisCl pH 7.5、20 mM NaCl、0.5％ NP-40、0.02 mg/ml最終濃度）に1：19で希釈された。40μlバッファー（40 mM TrisCl pH 7.5、0.5％ NP-40）が、各々の試料ウェルに添加された。試料は、氷上で10分間インキュベートされた。160μlの希釈FDA基質が、各々のウェルに添加された。蛍光は、37℃で30分間測定された（ex=488、em=529）。時間にわたる蛍光増加の傾きは、プレートにおける細胞数の関数である。
正規化スクリーニングデータは、図9において表示される。アポトーシスに影響を及ぼすmiRNAは表6に列挙している。
（表６）アポトーシスに影響を及ぼすmiRNA
Figure 2008519606
実施例11
合成RNAを使用する発現分析
全体的な細胞プロセスまたは細胞経路に影響を与えるmiRNAを同定するために表現型アッセイを使用することに加えて、合成miRNAおよび/またはmiRNA阻害剤の収集は、遺伝子の発現を直接的に調節するmiRNAを同定するために使用され得る。G6PD遺伝子の3'UTRのすぐ上流にルシフェラーゼ遺伝子を有するプラスミドが作製された。A549細胞に、レポーターベクターおよび18個の異なる合成miRNAを共トランスフェクトした。トランスフェクションの24時間後、様々な細胞集団におけるルシフェラーゼ活性が測定された。興味深いことに、miR-1-2は、ルシフェラーゼ/G6PD遺伝子の発現を有意に低下させ、miRNAのこのファミリーが、G6PD遺伝子の発現を調節することを示す。同様の実験が、p53、BRCA1およびBRCA2、RAS、MYC、BCL-2、ならびにその他などの重要な遺伝子の発現を調節するmiRNAを同定するために使用され得る。
実施例12
発癌性miRNA-差次的発現および癌調節
前の実施例において示されるように、同じ癌患者からの腫瘍試料と正常隣接組織試料との間で差次的に発現される多くのmiRNAが同定されている。興味深いことに、異なる癌の間で差次的に発現されるmiRNAにおいて有意な重複があり、変更された場合に癌をもたらす細胞プロセスに影響を与えるmiRNAのコアセットがあることを示唆する。以下は、miRNA誤調節（mis-regulation）と癌との間の結び付きを開発することを目的とした実験を記載する。
肺癌におけるmiRNA発現
肺癌患者からの22個の腫瘍および正常隣接組織（NAT）試料が、上に記載されるmiRNAアレイシステムを使用して分析された。アレイは分析され、各々のmiRNAの相対発現が、各々の患者からの腫瘍と正常隣接組織との間で比較された。様々なmiRNAが、異なる患者にわたって腫瘍におけるそれらの相対発現に基づいてクラスター化された（図14）。6つのmiRNA（miR-126、30a、143、145、188、および331）は、70%より多くの患者の腫瘍において有意に低いレベルで発現された。2つのmiRNA（miR-21および200b）は、70%より多くの患者の腫瘍において有意に高いレベルで発現された。多くのこれらのmiRNAの差次的発現は、ノーザン分析によって検証された（図15）。
結腸癌におけるmiRNA発現
結腸癌患者からの25個の腫瘍およびNAT試料が、本発明者らのmiRNAアレイプロセスを使用して分析された。肺癌比較と同様に、様々なmiRNAが、異なる結腸癌患者にわたって腫瘍におけるそれらの相対発現に基づいてクラスター化された（図14）。5つのmiRNA（miR-143、145、195、130a、およびmiR-331）は、70%より多くの患者の腫瘍において有意に低いレベルで発現された。5つのmiRNA（miR-223、21、31、17、および106）は、70%より多くの患者の腫瘍において有意に高いレベルで発現された。
癌マーカーとしてのmiRNA
8つの異なるmiRNAが、本発明者らが分析した肺および結腸患者試料のほとんどに対して、腫瘍試料と正常隣接試料との間で差次的に発現されたことは興味深い（図16）。これらの同じmiRNAは、本発明者らが分析した乳房、胸腺、膀胱、膵臓、および前立腺癌患者において差次的に発現されることも見出され、これらのmiRNAは、変更された場合に癌をもたらす細胞プロセスを制御し得ることを示唆する。
癌遺伝子発現の調節因子としてのmiRNA
特定のmiRNAが、癌遺伝子の誤調節を介して癌に関与している可能性があるかどうかに取り組むために、本発明者らは、本発明者らのマイクロアレイ分析において同定されたmiRNAと有意な相同性を有する配列に対して、150個の周知の癌遺伝子の3'非翻訳領域（UTR）をスキャンした。潜在的標的部位は、2つの基準に基づいて選択された。
（1）miRNAの位置2〜9と癌遺伝子との間の完全相補性。このmiRNAコア配列は、miRNAの活性に不可欠であるとして同定されており、公知のmiRNA標的部位は、この部位において本質的に100％相補性を有する（Doench et al. 2004）。
（2）miRNA/mRNA相互作用の全体のTmコア配列に加えて、miRNAとmRNAとの間の全体の結合安定性が、miRNA活性の重要な指標であることが示されている（Doench et al., 2004）。
表8において見られるように、公知の癌遺伝子の3’UTRにおける潜在的標的部位は、腫瘍試料において日常的に差次的に発現されることが観測されたmiRNAの全てに対して同定された。興味深いことに、KRAS2、MYCL1、およびCBLは、miRNA調節における重要な因子として関与している協調miRNA結合を提供し得ると考えられる複数の予測miRNA結合部位を有する（Doench et al. 2003; Zeng et al., 2003）。表8に列挙する遺伝子の多くは、それらが過剰発現される場合に発癌性になり、したがって、miRNAの低下した発現は、一つまたは複数の癌遺伝子の上方制御をもたらす可能性があり、その後、発癌をもたらし得ることが想像できる。
（表８）癌関連miRNAおよびそれらの推定癌遺伝子標的
Figure 2008519606
実施例13
癌遺伝子発現に対するmiRNAの効果の測定
miRNA標的部位予測を確認することは、様々な手法でなされ得る。ショウジョウバエおよびC. エレガンスにおいて、遺伝的アプローチが適用されており、miRNAおよび推定miRNA標的部位における突然変異が作られ、類似の表現型を引き起こすことが示されている（Ha et al., 1996; Vella et al., 2004）。哺乳動物細胞において、遺伝的アプローチははるかに難しいが、レポーター構築物は、推定標的遺伝子の3'UTRが、推定miRNA結合部位における突然変異を含むレポーターベクター対照に対して不均衡なレベルで細胞において調節されることを示すために使用されている（Lewis et al. 2003）。加えて、ベクターおよびオリゴヌクレオチドは、推定標的遺伝子の内因性レベルに対する効果を決定するために、細胞においてmiRNAを導入するまたは阻害するために使用されている（Lewis et al., 2003; Kiriakidou et al. 2004）。後者のアプローチは、miRNA標的部位予測を認証するために行われている。
細胞にmiRNAを導入するため、または細胞におけるmiRNAの活性を阻害するために、それぞれ、哺乳動物細胞にトランスフェクトされ得る合成miRNAおよびmiRNA阻害剤が開発されている。参照により本明細書に組み入れられる、USN 60/627,171を参照されたい。let-7bに対応する合成miRNAおよびmiRNA阻害剤は、標的部位予測が正しいかどうかを決定するために使用された。これらの実験において、検出できないレベルのmiRNAを発現する培養細胞は、siPORT(商標)NeoFX(商標)トランスフェクション試薬（Ambion）を使用して、合成miRNAをトランスフェクトされた。免疫蛍光アッセイは、トランスフェクト細胞におけるRASおよびC-MYCに対して使用された。両方の癌遺伝子からのタンパク質は、陰性対照miRNA（Ambion）をトランスフェクトされた細胞よりも、合成miRNAをトランスフェクトされた細胞において、だいたい3倍低いレベルで発現された。相互実験において、高いレベルのmiRNAを天然に発現する細胞が、let-7 miRNA阻害剤をトランスフェクトされた。予期されたように、両方の癌遺伝子からのタンパク質は、陰性対照阻害剤（Ambion）をトランスフェクトされた細胞においてよりも、miRNA阻害剤をトランスフェクトされた細胞においてより高かった。これらの結果は、miRNAが、2つの癌遺伝子の発現を調節するというモデルと一致する。これらのデータは、主要なmiRNAの誤調節が、一つまたは複数の癌遺伝子の発現を調節することができないことによって、癌進行に関与し得ることを示唆する。
実施例14
狼瘡におけるmiRNA
全身性紅斑性狼瘡（SLE；狼瘡）は、最終的には免疫複合体媒介標的器官不全をもたらす慢性炎症性自己免疫疾患である。それは、CD4+ Tヘルパー細胞の過剰な活性化およびCD8+ T細胞毒性活性の抑制によって特徴付けられ、天然抗体および病原性自己抗体の過剰産生をもたらす。最近、いくつかのヒストン修飾が、狼瘡患者から単離された末梢血単核細胞（PBMC）において報告された。狼瘡の診断は、主に、症状がとても広く変化し、それらが頻繁に出たり止んだりするので、かつ疾患が、とても多くのその他の障害を模倣するので、今もなお頻繁に間違いである。さらに、診断は、使用される特定の治療を示さない。治療法がないので、狼瘡の今日の処置は、今もなお、主として症状緩和に合わせられ、診断には合わせられない。高特異性および感度を有する診断的アッセイは、非常に重要であると考えられる。
試料は、16人の個人、臨床的に検証された狼瘡を有する8人ならびに狼瘡患者と年齢および性差を合致させた8人の非狼瘡患者から分析された。これらの試料からの全RNAは、上に記載されるガラスファイバーフィルター法を使用して単離された。全RNAは、miRNAを回収するために、チューブ電気泳動によって分画された。miRNAは、上に記載される二段階蛍光標識化プロセスを使用して、Cy3またはCy5で蛍光標識された。標識miRNAは、上に記載されるようなガラススライド上にアレイされたmiRNAプローブにハイブリダイズさせた。ハイブリダイズしたmiRNAからのシグナルは、GenePix 4000Bスキャナ（Axon）を使用して定量され、狼瘡および正常試料シグナルが、差次的に発現されるmiRNAを同定するために比較された。各々のアレイ実験は、再現アレイを含んだ。
14個のmiRNAは、合致試料に対して狼瘡試料のすべてにおいて差次的に発現された。miR-301、miR-199、miR-95、miR-105、mu-miR-290、miR-215、miR-188、miR-186、miR-211、miR-331、およびmiR-137は、対応する正常試料よりも狼瘡試料において50％低くまたはそれより低く発現された。miR-21、miR-223、およびmiR-342は、対応する正常試料よりも狼瘡試料において50％高くまたはそれより高く発現された。miRNAのいくつかは、狼瘡試料と正常試料との間で10倍も差次的に発現された。これらのmiRNAは、治療的開発の診断的アッセイに対する標的を示す。
実施例15
miRNAおよびプリオン病
主におよびおそらく単独で単一のタンパク質からなるプリオンと呼ばれる新規の感染性粒子は、認知および運動機能の致命的な減退をもたらす感染性海綿状脳症の群の、可能性が高い原因物質である。証拠は、関与するタンパク質が、偏在性の組織分布を有する正常形態からの誤った折り畳みによって病原性状態に達することを示す。
二つの細胞に基づくプリオンモデルシステムを使用して、プロセスに関連し得ると考えられるmiRNAの同定が追求された。一つのモデルシステムは、二つの細胞株を含み、そのうちの一つはプリオン形成の影響を受けやすく、もう一つはそうではない。第二のモデルシステムは、プリオンに感染している前および後の細胞に関与する。プリオン感受性細胞、プリオン非感受性細胞、およびプリオン感染細胞からの全RNAが、上に記載されるガラスファイバーフィルター法を使用して単離された。全RNAは、miRNAを回収するために、チューブ電気泳動によって分画された。miRNAは、上に記載される二段階蛍光標識化プロセスを使用して、Cy3またはCy5で蛍光標識された。標識miRNAは、上に記載されるようなガラススライド上にアレイされたmiRNAプローブにハイブリダイズさせた。ハイブリダイズしたmiRNAからのシグナルは、GenePix 4000Bスキャナ（Axon）を使用して定量され、試料の各々からのシグナルが、差次的に発現されるmiRNAを同定するために比較された。
図13において見られるように、10個のmiRNAは、プリオン耐性、非感染細胞に対して、プリオン感受性およびプリオン感染細胞の両方において、有意に上方制御または下方制御された。両方のモデルシステムに対する複数の生物学的反復におけるアレイが、これらの結果を確認した。それらの発現プロファイルに基づいて、miR-95、135a、7、9、27a、130a、16、26a、および24は、プリオン感染に直接的または間接的に関与する可能性が高く、プリオン病に対する診断または治療標的を示し得ると考えられる。
実施例16
脳卒中関連miRNA
脳卒中は、ヒトにおける死および永久的障害の主要な原因である。それらは、脳の領域への血流が閉塞される場合に生じ、脳組織の死を引き起こし得る。脳卒中の二つの主な型がある：虚血性および出血性。虚血性脳卒中は、血液を脳へ供給する動脈における閉塞によって引き起こされ、血流の欠乏（虚血）を引き起こす。出血性脳卒中は、脳において破裂した血管の出血（出血）によって引き起こされる。脳卒中に関与するmiRNAを理解することにより、検出および/または処置が強化され得ると考えられる。
マウスが、脳への酸素流を低下させることによって「プレコンディショニング」される脳卒中モデルシステムが使用された（Kitagawa, 1991）。6匹のマウスの等価セットが使用された;3匹はプレコンディショニングされ、3匹は非処置であった。プレコンディショニングの24時間後、マウスは屠殺された。これらの試料からの全RNAは、上に記載されるガラスファイバーフィルター法を使用して単離された。全RNAは、miRNAを回収するために、チューブ電気泳動によって分画された。miRNAは、上に記載される二段階蛍光標識化プロセスを使用して、Cy3またはCy5で蛍光標識された。標識miRNAは、上に記載されるようなガラススライド上にアレイされたmiRNAプローブにハイブリダイズさせた。ハイブリダイズしたmiRNAからのシグナルは、GenePix 4000Bスキャナ（Axon）を使用して定量され、プレコンディショニング試料シグナルおよび正常試料シグナルが、差次的に発現されるmiRNAを同定するために比較された。
プレコンディショニング動物（P1、P2、およびP4と標識される）のmiRNAプロファイルの分析は、3匹の非処置動物に対してすべての3匹のプレコンディショニング動物において有意に異なるレベルで発現される10個のmiRNAを明らかにした（図14）。これらのmiRNAは、虚血性プレコンディショニングに起因し、脳卒中診断、予防、または処置に対する潜在的標的を示す。
実施例16
様々な細胞型における細胞増殖および細胞生存率に影響を与えるmiRNAに対する合成miRNAライブラリースクリーニング
癌の特質は、無制御細胞増殖である；細胞増殖アッセイは、一般的に、発癌における遺伝子の影響を調査するために研究者によって使用される。細胞増殖アッセイは、細胞増殖に影響を与えるmiRNAを同定するためにmiRNA阻害剤ライブラリーとともに使用された。
HeLa（ヒト卵巣癌）およびA549（ヒト肺癌）細胞に、製造業者の説明書に従ってsiPORT NeoFX（Ambion）を使用して、150個の合成miRNAを三連でトランスフェクトした。150個は以下の通りである。
Figure 2008519606
合成miRNAは、活性鎖および相補鎖からなる二本鎖核酸分子であった。活性鎖は、対応する成熟miRNAと同一である配列を含んだ。相補鎖は、成熟miRNA配列の関連領域と100％相補的である配列を含んだが、1）成熟miRNA配列と相補的なその3'末端上で（活性鎖の5'末端において）二つのヌクレオチドを欠く、かつ2）活性鎖に対してその5'末端上でジヌクレオチド突出を有する。言い換えると、二つの鎖は、各々の鎖が他方の鎖に対してジヌクレオチド5'突出を有すること以外、他方の配列と完全に相補的であった。同じ種類の合成miRNAが、実施例17〜20に対して同様に使用された。任意の例外は、以下に記載される。表において示されるmiRNAは、提供される合成配列に対応するmiRNAを同定する。
Jurkat細胞（ヒト白血病細胞）および初代ヒトT細胞に、合成miRNAの同じセットを、製造業者の説明書に従ってsiPorter-96（Ambion）を使用して三連で電気穿孔した。すべての細胞は、ViacountアッセイでPCA-96（Guava）を使用してトランスフェクションの72時間後に生存および非生存細胞に対して分析された。生存細胞数は、アッセイのポイントにおけるウェルにおける生細胞の数である。以下の表において提供される数は、陰性対照トランスフェクト細胞に対するmiRNAトランスフェクト細胞の細胞生存率％を産出するために、陰性対照合成miRNAをトランスフェクトされたウェルにおける生存細胞の数で除算され100を乗算された、特定のmiRNAをトランスフェクトされたウェルにおける生存細胞の平均数と等しい。
有意性は、陰性対照トランスフェクト試料の平均値に基づいて定められた。陰性対照と有意に異なったmiRNAは、陰性対照データの少なくとも2標準偏差上または下であることに基づいて「有意」とみなされた。
miRNA-325である場合、配列は5'-ccuaguagguguccaguaagugu-3'である。
（表９）HeLa細胞の細胞生存率を有意に低下させるmiRNA
Figure 2008519606
（表１０）HeLa細胞の生存細胞数を有意に低下させるmiRNA
Figure 2008519606
（表１１）HeLa細胞の生存細胞数を有意の増加させるmiRNA
Figure 2008519606
（表１２）A549細胞の細胞生存率を有意に低下させるmiRNA
Figure 2008519606
（表１３）A549細胞の生存細胞数を有意に低下させるmiRNA
Figure 2008519606
（表１４）A549における生存細胞数を有意に増加させるmiRNA
Figure 2008519606
（表１５）Jurkat細胞の細胞生存率を有意に低下させるmiRNA
Figure 2008519606
（表１６）Jurkat細胞における細胞生存率を有意に増加させるmiRNA
Figure 2008519606
（表１７）初代T細胞における細胞生存率を有意に低下させるmiRNA
Figure 2008519606
（表１８）初代T細胞の細胞生存率を有意に増加させるmiRNA
Figure 2008519606
一つの細胞型に影響を及ぼすmiRNAが、しばしばその他の細胞型に影響を及ぼすことができないことに留意することは興味深い。これは、活性のある細胞プロセスが、異なる細胞型間で変化するという事実による可能性が高い。これは、miRNAに基づく治療薬の潜在性を考慮する場合に極めて重要であり得る。異常（疾患）細胞は、異なる細胞プロセスが二つの細胞型において活性があるという事実により、正常細胞と異なる。正常および異常細胞に対する差次的な効果を有するmiRNAを同定することは、それらが全体的に送達されかつ疾患細胞のみに対して効果を有することが予期され得ると考えられるので、理想的であると考えられる。細胞生存率データが白血病（癌性T細胞）細胞および初代T細胞に対して比較された場合、let-7a、let-7b、およびmiR-10bすべてが、白血病細胞における生存細胞のパーセンテージを有意に低下させるが、対応する正常T細胞に対する効果を本質的に有しないことが示された。これらのmiRNAは白血病薬物の候補である。
実施例17
ERK活性化に影響を与えるmiRNAに対する合成miRNAライブラリースクリーニング
癌細胞が増殖するためには、それらは、細胞分裂周期を制御する機構およびプログラム細胞死（アポトーシス）のプロセスの両方を妨害しなければならない。これは、Rasなどの特定のプロト癌遺伝子またはp53などの腫瘍サプレッサーの突然変異によって頻繁に達成される。膜関連GTP分解酵素のRasファミリーは、Raf>MEK>ERK MAPキナーゼシグナル伝達経路などの多くの細胞質シグナル伝達経路の活性化によって、細胞の内部にシグナルを伝達する。Ras/Raf/MEK/ERK経路の調節障害（disregulation）は、癌発病機序において主要な役割を果たす（Meijer）。
ERK活性化に影響を及ぼすmiRNAを同定するために、HeLa細胞に、96ウェルプレートフォーマットにおいて150個の異なる合成miRNAをトランスフェクトした。トランスフェクションに先行して、HeLa細胞は、接着細胞を移すためにトリプシン処理され、正常成長培地において105細胞/mLまで希釈された。9.5μlのOptimem I培地における0.5μlのsiPORT NeoFXが細胞に添加され、室温で10分間インキュベートされた（各々の試料に対して10μL）。miRNAは、10μlの希釈siPORT NeoFXで再水和された。試料は、37℃でインキュベートされ、次いで、トランスフェクト試料は、トランスフェクションの72時間後に評価された。
ERK活性化に対する対照は、ERKリン酸化の検出に対してウェルからリン酸源を奪うことによって行われた。37℃までの100μlの血清フリー培地（DMEM）が、ウェルごとに添加され、細胞は、基本的なリン酸化レベルを得るために、37℃で4時間インキュベートされた。陽性対照ウェルに対して、血清フリー培地がウェルから吸引され、100μlの100 ng/mL EGFが、37℃で7.5分間細胞をインキュベートする前に添加された。
すべてのウェルからの培地は、吸引によって除去され、細胞は、振盪することなく室温で20分間、1×PBSにおける150μlの3.7％ホルムアルデヒドにおいて即座に固定された。固定溶液は、適当な廃液容器に除去された。固定細胞は、1×PBSで3回洗浄された。次いで、ウェルは、室温で振盪しながら、洗浄ごとに5分間、0.1％TritonX-100を含む200μlの1×PBSで3回洗浄された。
細胞は、各々のウェルへの150μlのLi-COR Odysseyブロッキングバッファーの添加によってブロックされた。溶液は、細胞を引き離すことを避けるために、ウェルの側面の下でピペッティングすることによって注意深く除かれた。ブロッキングは、ローテーター上で中程度に振盪しながら、室温で90分間であり、二つの一次抗体が、Odysseyブロッキングバッファーを含むチューブに添加された。一次抗体は、室温で穏やかに振盪しながら2時間インキュベートされた（Phosho-ERK（ウサギ、1：100希釈；Cell Signaling Technology 9101）、全ERK2（マウス；1：75希釈；Santa Cruz Biotechnology SC-1647））。ウェルは、多めの量のバッファーを使用して、穏やかに振盪しながら室温で5分間1×PBS＋0.1％Tween-20で3回洗浄された。蛍光標識二次抗体は、Odysseyブロッキングバッファーに希釈された（ヤギ抗ウサギAlexa Fluor 680（1：200希釈；Molecular Probes）、ヤギ抗マウスIRDye 800CW（1：800希釈；Rockland Immunochemicals））。抗体溶液は、よく混合され、50μlの二次抗体溶液が、各々のウェルに添加された。抗体溶液は、室温で穏やかに振盪しながら60分間インキュベートされた。プレートは、多めの量のバッファーを使用して、穏やかに振盪しながら室温で5分間1×PBS＋0.1％Tween-20で3回洗浄された。最後の洗浄の後、洗浄溶液は、ウェルから完全に除去された。プレートは、Odyssey赤外イメージングシステム（Alexa Fluor 680抗体に対して700 nm検出およびIRDye 800CW抗体に対して800 nm検出）でスキャンされた。陰性対照トランスフェクト細胞は、100％ erk活性化を産出する（活性erkのバックグラウンドレベルを意味する）。細胞に本発明者らのmiRNAのいくつかをトランスフェクトすることにより、活性erkのレベルが変更される。
（表１９）ERKを活性化するmiRNA
Figure 2008519606
実施例18
アポトーシスに影響を与えるmiRNAに対するスクリーニング
アポトーシスは、発癌潜在性を有する細胞における死を誘導することによって癌を制御することを助ける天然の細胞プロセスである。多くの癌遺伝子は、アポトーシスの誘導を変更することによって機能する。アポトーシスに関与するmiRNAを同定するために、アポトーシスアッセイが、miRNA阻害剤ライブラリーとともに使用された。
HeLa細胞（96ウェルプレートの8000細胞/ウェル）に、Ambion siPORT(商標)NeoFX(商標)を使用して、150個よりも多くの合成miRNA（上に記載される）（3 pmol）を三連でトランスフェクトした。培地をトランスフェクションの24時間後に交換し、細胞は、トランスフェクションの72時間後に処理された。細胞は、以下のようにカスパーゼ3活性を測定することによって、アポトーシスに対して測定された：1）細胞は、PBSで1回洗浄され、-80℃で凍結された。2）細胞は、40μlの冷溶解バッファー（50 mM HEPES pH 7.2、40 mM NaCl、0.5％ NP40、0.5 mM EDTA）をウェルに添加することによって溶解され、4℃で20分間インキュベートされた。3）160μl ICEバッファー（50 mM HEPES pH 7.4、0.1％ CHAPS、0.1 mM EDTA、10％スクロース）＋20μM DEVDafc基質を含む5 mM DTTを添加する。4）400 ex、505 emで1時間における蛍光増加を測定する。
試料は、カスパーゼ3結果を正規化するための一般的なエステラーゼアッセイを使用して、細胞数に対しても分析された。FDA基質（アセトニトリルにおける0.4 mg/mlフルオレセインジアセテート（FDA））は、希釈バッファー（40 mM TrisCl pH 7.5、20 mM NaCl、0.5％ NP-40、0.02 mg/ml最終濃度）に1：19で希釈された。40μlバッファー（40 mM TrisCl pH 7.5、0.5％ NP-40）が、各々の試料ウェルに添加された。試料は、氷上で10分インキュベートされた。160μlの希釈FDA基質が、各々のウェルに添加された。蛍光は、37℃で30分間測定された（ex=488、em=529）。時間にわたる蛍光増加の傾きは、プレートにおける細胞数の関数である。
アポトーシスに影響を及ぼすmiRNAは以下の表に列挙している。これらのmiRNAは、アポトーシスをもたらす経路を明らかに調節する。これらのmiRNAの誤調節は、細胞がアポトーシスを起こすように誘導し得る、または細胞がアポトーシスを起こさないようにし得ると考えられる。アポトーシスシグナル伝達経路を克服した癌（またはその他の疾患）細胞またはアポトーシスを時期尚早に誘導したパーキンソン病（またはその他の疾患）細胞においてこれらのmiRNAを誘導するまたは阻害することは、その疾患を処置するために使用され得ると考えられる。
（表２０）アポトーシス細胞のパーセンテージを有意に増加させるmiRNA
Figure 2008519606
（表２１）アポトーシス細胞のパーセンテージを有意に減少させるmiRNA
Figure 2008519606
実施例19
hTert発現に影響を与えるmiRNAに対する合成miRNAライブラリースクリーニング
テロメラーゼは、テロメアを追加することによって染色体の末端を維持する、タンパク質およびRNAの複合体である。稀な例外はあるものの、最終分化細胞は、活性テロメラーゼを欠く。例外の一つは、癌細胞である。ヒト癌試料の90％よりも多くは、活性テロメラーゼを有する（Dong et al. 2005において概説される）。hTert遺伝子は、テロメラーゼの触媒ドメインをコードする。hTertの発現は、細胞におけるテロメラーゼ活性と相関し、それがテロメラーゼ活性に対する良い代理であるようにする。テロメラーゼ陰性細胞におけるhTert mRNA発現をモニターするためのRT-PCRに基づくアッセイが開発されており、テロメラーゼの調節に関与するmiRNAを同定するために使用されている。テロメラーゼ活性を調節するmiRNAは、癌治療薬に対する介入ポイントを示す。
BJ細胞は、hTer mRNAおよびテロメラーゼ活性を欠く正常ヒト包皮線維芽細胞である。BJ細胞は、トリプシン処理され、正常成長培地において13,000細胞/mlに希釈された。0.3μlのリポフェクタミン2000薬剤は、40μlのOPTI-MEMに希釈され、5分間インキュベートされた。希釈トランスフェクション試薬は、150個の合成miRNA（上に記載される）ならびに二つの異なる陰性対照合成miRNAを含む96ウェルプレートのウェルに添加された。各々のウェルは、異なる合成miRNAを収容した。合成miRNAおよびトランスフェクション薬剤は、室温で15分間インキュベートされ、次いで、200μl（2,600細胞）が、脂質/miRNA複合体の上面に添加された。細胞は、インキュベーターに置かれ、RNAは、72時間後に単離された。RNAは、RNAqueous(商標)-MagMAX96 Total RNA Isolationキット（カタログ番号1830）標準プロトコール（ウェルにおける細胞を溶解する）を使用して、各々のウェルにおける細胞から単離された。逆転写は、11μlの全RNA（20〜100 ng/μl）を1μlのランダムデカマーに添加することによってRETROscript反応を使用してなされ、3分間70℃水浴においてインキュベートされ、次いで、氷上に置かれる。次に、Nucフリー水3.8μl、10×逆転写バッファー2.0μl、2.5 mM dNTP 2.0μl、RNA分解酵素阻害剤タンパク質（40U/μl）、0.1μl MMLV-RT（100U/μl）を含む8μlのカクテル、1時間42℃で、次いで、10分間92℃でインキュベートされた。
リアルタイムPCR反応は、試料の各々においてhTert mRNAおよび18S rRNAを定量するために組み立てられた。PCRチューブに、ヌクレアーゼフリー水、10×Complete PCRバッファー/SYBR、25mM MgCl2、2.5mM dNTP、50× ROX、18SまたはhTert特異的プライマー（順方行および逆方行の混合3μM）、様々な試料からのcDNA、およびSuper taqポリメラーゼ。反応は、5分間95℃に加熱され、次いで、95℃15秒間、60℃30秒間、72℃30秒間の40サイクルに供した。増幅産物は、ABI 7600（Applied Biosystems）を使用してモニターされた。BJ細胞は、普通は、hTertプライマーで増幅産物を産出することができない。hTert PCR産物を産出したmiRNAトランスフェクト試料は、試料におけるhTertの量に寄与した可能性がある細胞が有意に多くはないことを確実にするために、18S rRNAレベルに対しても分析された。
hTert mRNAは、以下に列挙したmiRNAの各々の二連のトランスフェクションにおいて検出された。これらのmiRNAは、おそらく、hTert遺伝子の発現を調節する経路に影響を及ぼす。これらのmiRNAのいずれかの過剰発現は、テロメラーゼを活性化することによって癌に寄与し得ると考えられる。癌細胞におけるこれらのmiRNAの活性を調節することにより、それらの形質転換が限定されかつ発癌が克服され得ると考えられる。
（表２２）
Figure 2008519606
実施例20
細胞周期に影響を与えるmiRNAに対する合成miRNAライブラリースクリーニング
成人ヒトの体は、約50〜100兆の細胞からなる。毎日、これらの細胞の数10億は、死んで除去される数10億の細胞を置換するために2つに分裂する。平均生存期間の経過において、これは、天文学的数の細胞分裂になり、そのうちのほとんどが、完全に順調に進む。しかしながら、エラーが生じ、それらが修正されない場合、それらは、癌をもたらし得る。細胞成長および分裂は、普通、抑制と均衡の複雑なシステムによって制御される。しかし、時折、細胞は、野性的に増殖を開始し、何度も分裂し、その成長に対するすべての正常規制を拒否する。それは、癌の最も一般的な形態の始まりである。
本発明者らは、製造業者の説明書に従ってリポフェクタミン2000（Invitrogen）を使用して、4,000のBJ細胞/ウェルに46個の合成miRNAを三連でトランスフェクトした。
Figure 2008519606
トランスフェクションの24時間後、各々のウェルからのBJ細胞の半分は、新鮮な培地に移された。トランスフェクションの72時間後、細胞は、2％の最終濃度で4％パラホルムアルデヒドで固定された。固定細胞は、ヨウ化プロピジウム（TTP LabTechプロトコール）で染色され、TTP LabTech細胞スキャナを使用して査定された。ヨウ化プロピジウムは、DNAを染色し、細胞における相対DNA含有量は、細胞周期におけるその位置に対応する。細胞スキャナは、各々の細胞におけるヨウ化プロピジウム染色を測定し、細胞周期におけるその位置を定めた。細胞周期の各々のステージにおける細胞のパーセンテージが計算され、陰性対照合成miRNAをトランスフェクトされた細胞と比較された。各々のステージにおける細胞における相対変化は、使用された各々のmiRNAに対して計算された。細胞周期の特定のステージから前へまたは後ろへの有意なシフトを誘導した合成miRNAは、以下に列挙している。これらは、細胞周期における主要なポイントを調節しかつ癌関連治療的開発に対する主要な介入ポイントを提示するmiRNAを示す。
（表２３）細胞周期のG1期におけるBJ細胞のパーセンテージを有意に低下させるmiRNA
Figure 2008519606
（表２４）細胞周期のG1期におけるBJ細胞のパーセンテージを有意に増加させるmiRNA
Figure 2008519606
（表２５）細胞周期のS期におけるBJ細胞のパーセンテージを有意に低下させるmiRNA
Figure 2008519606
（表２６）細胞周期のS期におけるBJ細胞のパーセンテージを有意に増加させるmiRNA
Figure 2008519606
（表２６）細胞周期のG2/M期におけるBJ細胞のパーセンテージを有意に低下させるmiRNA
Figure 2008519606
（表２７）細胞周期のG2/M期におけるBJ細胞のパーセンテージを有意に増加させるmiRNA
Figure 2008519606
（表２８）2×よりも多くのDNA量を有するBJ細胞のパーセンテージを有意に増加させるmiRNA
Figure 2008519606
実施例21
細胞増殖に影響を与えるmiRNAに対する合成miRNAライブラリースクリーニング
細胞増殖アッセイは、肺、乳房、前立腺、皮膚、子宮頚、T細胞、および包皮組織からのものを含む広範な範囲の細胞における細胞増殖に影響を与えるmiRNAを同定するために、本発明者らの合成miRNAライブラリーとともに使用された。
子宮頚（HeLa）、肺（A549、CRL-5826、およびHTB-57）、乳房（MCF12AおよびBT549）、前立腺（22Rv1）、T細胞（Jurkatおよび初代正常）、および皮膚（TE354T、TE353SK、およびBJ）細胞に、本発明者らのライブラリーにおける150個よりも多くの合成miRNAの各々を三連でトランスフェクトした。Jarkatおよび初代T細胞を除いて、各々の細胞型に、96ウェルプレートのおよそ8000細胞/ウェルのプレート密度で、siPORT(商標)NeoFX(商標)（Ambion）を使用して、合成miRNAライブラリーにおけるmiRNAの各々の5ピコモルをトランスフェクトした。Jarkatおよび初代T細胞は、およそ50,000細胞/ウェルの割合で、合成miRNAの各々の500ピコモルと混合された。培地はトランスフェクションの24時間後に交換した。トランスフェクションの72時間後、細胞数は、三つの方法の一つによって推定された。
（1）Alamar blueが、各々のウェルに添加され、96ウェルプレートは、プレートリーダーを使用して分析された。Alamar blueは、細胞における代謝酵素に対する基質であり、反応産物は蛍光である。各々のウェルにおける蛍光は、各々のウェルにおける細胞の全数と相関する。
（2）DNAと相互作用する場合に蛍光する色素であるViaCount Flex試薬（Guava）が、各々のウェルに添加され、蛍光は、製造業者の説明書に従って、Guava PCA-96を使用して定量された。
（3）DNAと相互作用する場合に蛍光する色素であるヨウ化プロピジウムが、各々のウェルに添加され、ウェルにおける細胞の全数は、製造業者の説明書に従って、TTP LabTech細胞スキャナを使用して、染色DNAのユニーク部位を計数することによって推定された。
細胞増殖に対する各々のmiRNAの影響は、各々のウェルの細胞数読み取り値を、陰性対照（NC）miRNAをトランスフェクトされたウェルに対する平均細胞数読み取り値で除算することによって査定された。
図15A〜Cにおいて提示されるのは、分析した様々な細胞型の増殖を有意に低下させた合成miRNAである。これらのmiRNAは、治療薬、診断法、興味深い研究特性を有する細胞株の作製、および分化の誘導に対して使用され得る分子を示す。
miRNAのおよそ10％は、少なくとも4つの異なる細胞型に対して細胞増殖を有意に低下させた。これらのmiRNA（以下の表において高い順に提示される）は、以下に提供され、本発明の方法および組成物において遂行され得る。
（表２９）一般的な抗増殖miRNA
Figure 2008519606
合成miRNAライブラリースクリーニングにおいて使用された細胞の中には、乳房、皮膚、およびT細胞からの癌および非癌細胞の合致ペアが含まれる。興味深いことに、多くの合成miRNAは、細胞ペアにおける増殖に差次的に影響を及ぼした（以下の表を参照されたい）。
（表３０）
Figure 2008519606
図16において提示されるのは、分析された様々な細胞型の増殖を有意の増加させる合成miRNAである。
実施例22
細胞増殖に影響を与えるmiRNAを同定するmiRNA阻害剤ライブラリースクリーニング
細胞増殖アッセイは、肺、乳房、前立腺、皮膚、子宮頚、T細胞、および包皮組織からのものを含む広範な範囲の細胞における細胞増殖に影響を与えるmiRNAを同定するために、本発明者らの合成miRNAライブラリーとともに使用された。
乳房（MCF12A）、前立腺（22Rv1）、肺（A549）、および皮膚（TE354T）細胞に、本発明者らのライブラリーにおける150個よりも多くのmiRNA阻害剤の各々を三連でトランスフェクトした。各々の細胞型に、96ウェルプレートのおよそ8000細胞/ウェルのプレート密度で、siPORT(商標)NeoFX(商標)（Ambion）を使用して、ライブラリーにおけるmiRNA阻害剤の各々の10ピコモルをトランスフェクトした。トランスフェクションの72時間後、細胞数は、三つの方法の一つによって推定された。
（1）Alamar blueが、各々のウェルに添加され、96ウェルプレートは、プレートリーダーを使用して分析された。Alamar blueは、細胞における代謝酵素に対する基質であり、反応産物は蛍光である。各々のウェルにおける蛍光は、各々のウェルにおける細胞の全数と相関する。
（2）DNAと相互作用する場合に蛍光する色素であるViaCount Flex試薬（Guava）が、各々のウェルに添加され、蛍光は、製造業者の説明書に従って、Guava PCA-96を使用して定量された。
（3）DNAと相互作用する場合に蛍光する色素であるヨウ化プロピジウムが、各々のウェルに添加され、ウェルにおける細胞の全数は、製造業者の説明書に従って、TTP LabTech細胞スキャナを使用して、染色DNAのユニーク部位を計数することによって推定された。
細胞増殖に対する各々のmiRNA阻害剤の影響は、各々のウェルの細胞数読み取り値を、陰性対照（NC）miRNAをトランスフェクトされたウェルに対する平均細胞数読み取り値で除算することによって査定された。
図17において提示されるのは、阻害が、分析した様々な細胞型の増殖を有意に低下させたmiRNAである。これらのmiRNAは、治療薬、診断法、興味深い研究特性を有する細胞株の作製、および分化の誘導に対して使用され得る分子を示す。
図18において提示されるのは、分析された様々な細胞型の増殖を有意に増加させるmiRNA阻害剤である。これらのmiRNAは、治療薬、診断法、興味深い研究特性を有する細胞株の作製、および分化の誘導に対して使用され得る分子を示す。
実施例23
細胞生存率に影響を与えるmiRNAに対する合成miRNAライブラリースクリーニング
ほとんどのヒト疾患に対する基礎は、それらが普通にすること以外の方式において機能するような、一つまたは複数の細胞の破壊である。例えば、癌は、単一の細胞の不死化および形質転換とともに始まり、次いで腫瘍を形成するために繰り返し分裂する。疾患細胞の生存率を低下させる化合物は、癌およびその他の疾患を有する患者を処置するために日常的に使用される。
子宮頚（HeLa）、肺（A549）、およびT細胞（Jurkatおよび初代正常）に、本発明者らのライブラリーにおける150個よりも多くの合成miRNAの各々を三連でトランスフェクトした。Jarkatおよび初代T細胞を除いて、各々の細胞型に、96ウェルプレートのおよそ8000細胞/ウェルのプレート密度で、siPORT(商標)NeoFX(商標)（Ambion）を使用して、合成miRNAライブラリーにおけるmiRNAの各々の5ピコモルをトランスフェクトした。Jarkatおよび初代T細胞は、およそ50,000細胞/ウェルの割合で、合成miRNAの各々の500ピコモルと混合された。HeLaおよびA549細胞に対して、培地はトランスフェクションの24時間後に交換した。トランスフェクションの72時間後、細胞生存率は、二つの方法の一つによって推定された。
（1）死細胞にのみ入ることができ、かつDNAと相互作用する場合に蛍光する色素を含むViaCount Flex試薬（Guava）が、各々のウェルに添加され、蛍光は、製造業者の説明書に従って、Guava PCA-96を使用して定量された。生存細胞のパーセンテージは、試料における非死および非アポトーシス細胞の数を、ウェルにおける細胞の全数で除算し100を乗算することによって測定された。
（2）DNAと相互作用する場合に蛍光する色素であるヨウ化プロピジウムが、各々のウェルに添加された。各々の細胞は、細胞死またはアポトーシスと一致する染色パターンを有する細胞を検出するために、製造業者の説明書に従って、TTP LabTech細胞スキャナを使用して分析された。生存細胞のパーセンテージは、試料における非死および非アポトーシス細胞の数を、ウェルにおける細胞の全数で除算し100を乗算することによって測定された。
図19において提示されるのは、分析された様々な細胞型において生存率を有意に減少または増加させる合成miRNAである。T細胞の白血病形態および正常形態を示すJurkatおよび初代T細胞の生存率の比較では、let-7、miR-10、miR-101、miR-17-3p、miR-19、およびmiR-34aは、正常T細胞に影響を及ぼすことなく、白血病細胞の生存率を高度に低下させた。
実施例24
アポトーシスに影響を与えるmiRNAに対する合成miRNAライブラリースクリーニング
アポトーシスに関与するmiRNAを同定するために、アポトーシスアッセイが、miRNA阻害剤ライブラリーとともに使用された。
ウェルあたりおよそ8000個の子宮頚（HeLa）、前立腺（22Rv1）、T細胞（Jurkat）、および皮膚（TE354T）細胞に、siPORT(商標)NeoFX(商標)（Ambion）を使用して、本発明者らのライブラリーにおける150個よりも多くの合成miRNAの各々を三連でトランスフェクトした。培地を24時間後に交換し、細胞は、トランスフェクションの72時間後に、細胞死を定性的に検査するために顕微鏡下で視覚的に検査された。細胞は、以下のようにカスパーゼ3活性を測定することによって、アポトーシスに対して測定された。1）細胞は、PBSで1回洗浄され、-80℃で凍結された。2）細胞は、40μlの冷溶解バッファー（50 mM HEPES pH 7.2、40 mM NaCl、0.5％ NP40、0.5 mM EDTA）をウェルに添加することによって溶解され、4℃で20分間インキュベートされた。3）160μl ICEバッファー（50 mM HEPES pH 7.4、0.1％ CHAPS、0.1 mM EDTA、10％スクロース）＋20μM DEVDafc基質を含む5 mM DTTを添加する。4）400 ex、505 emで1時間における蛍光増加を測定する。試料は、カスパーゼ3の結果を正規化するための一般的なエステラーゼアッセイを使用して、細胞数に対しても分析された。FDA基質（アセトニトリルにおける0.4 mg/mlフルオレセインジアセテート（FDA））は、希釈バッファー（40 mM TrisCl pH 7.5、20 mM NaCl、0.5％ NP-40、0.02 mg/ml最終濃度）に1：19で希釈された。40μlバッファー（40 mM TrisCl pH 7.5、0.5％ NP-40）が、各々の試料ウェルに添加された。試料は、氷上で10分間インキュベートされた。160μlの希釈FDA基質が、各々のウェルに添加された。蛍光は、37℃で30分間測定された（ex=488、em=529）。時間にわたる蛍光増加の傾きは、プレートにおける細胞数の関数である。
アポトーシスに対する各々のmiRNAの影響は、各々のウェルのカスパーゼ3読み取り値を陰性対照（NC）miRNAをトランスフェクトされたウェルに対する平均カスパーゼ3読み取り値で除算することによって査定された。
図20において見られるように、多くの異なるmiRNAは、分析された4つの細胞型においてアポトーシスを増加または減少させることができた。いくつかのmiRNA（miR-126、miR-26a、miR-1、miR-149、およびlet-7g）は、複数の細胞型においてアポトーシスに影響を及ぼし、それらが、複数の細胞型において共通である遺伝子を介してアポトーシスを調節することを示唆する。
実施例25
形質転換を誘導するmiRNAに対する合成miRNAライブラリースクリーニング
形質転換は、混雑した環境に置かれる場合に分裂を停止する細胞の天然の応答を克服するので、腫瘍形成に必要である。形質転換に関与するmiRNAを同定するために、NIH3T3細胞を特徴とする形質転換アッセイが、合成miRNAライブラリーとともに使用された。NIH 3T3細胞は、軟寒天に置かれる場合、コロニーを形成するキャパシティを欠くので、形質転換アッセイにおいて使用される。形質転換を阻害する細胞プロセスのモジュレーションは、NIH3T3細胞が軟寒天に置かれる場合にコロニーを形成し始めるように誘導するので、簡単に検出され得る。
およそ8000個のNIH 3T3細胞に、siPORT(商標)NeoFX(商標)（Ambion）を使用して、本発明者らのライブラリーにおける150個よりも多くの合成miRNAの各々を二連でトランスフェクトした。培地を24時間後に交換し、細胞は、軟寒天を含む24ウェルディッシュに移された。軟寒天は、移動性を限定し、細胞分裂に続いて姉妹細胞が接触したままでなければならないことを確実にする。その他の細胞との密接な接触は、典型的には、NIH 3T3細胞が分裂を停止するように誘導する。各々のウェルにおける細胞の全数は、495 nmにおける吸光度読み取り値を取ることによって測定された。各々のウェルに対する吸光度読み取り値は、形質転換におけるパーセント変化を得るために、陰性対照miRNAをトランスフェクトされた細胞に対する平均吸光度読み取り値によって除算され100を乗算された。初めのスクリーニングは、陰性対照をトランスフェクトされた細胞に対して形質転換を増加させたmiRNAとして、miR-10、miR-23、miR-24、miR-198、miR-192、およびmiR-199を明らかにした。初めの候補による実験の繰り返しは、以下に示されるような以下のヒットを産出した。
（表３１）
Figure 2008519606
実施例26
治療化合物の効力に影響を及ぼすmiRNA
多くの化合物は、患者の転帰に肯定的に影響を及ぼすそれらのキャパシティに対して、臨床試験においてテストされている。いくつかの場合において、これらの化合物は、FDAによって整えられた標準に合い、それらは治療薬となる。残念ながら、ほとんどの治療薬は、100％有効ではない。治療化合物の活性を強化することは、医療産業内での有意な機会を提供する。治療薬を強化するために使用される二つの最も一般的な方法は、化合物の化学的構造を改変することまたは複数の治療化合物を同時に使用することである。癌細胞の生存率を有意に低下させることが公知である化合物を添加する前にmiRNAを導入することが有益であるかどうかが評価された。導入された抗癌化合物の一つは、少なくとも二つの異なる受容体に結合し、主として癌細胞において細胞死を誘導するためのアポトーシス経路を活性化するTRAILであった。合成miRNAとの組み合わせにおいてテストされた第二の化合物は、細胞内のDNA損傷の修復を低下させることによって癌および正常細胞のアポトーシス経路を同様に活性化するトポイソメラーゼII阻害剤であるエトポシドであった。
ウェルあたりおよそ8000個の子宮頚（HeLa）および肺（A549、HTB-57、およびCRL-5826）細胞に、siPORT(商標)NeoFX(商標)（Ambion）を使用して、本発明者らのライブラリーからの合成miRNAを三連でトランスフェクトした。培地を24時間後に交換し、エトポシドおよびTRAILは、48時間後におよそ25μMの最終濃度で導入された。細胞は、トランスフェクションの64時間後に、細胞死を定性的に検査するために顕微鏡下で視覚的に検査された。
細胞は、以下のようにカスパーゼ3活性を測定することによって、アポトーシスに対して測定された。1）細胞は、PBSで1回洗浄され、-80℃で凍結された。2）細胞は、40μlの冷溶解バッファー（50 mM HEPES pH 7.2、40 mM NaCl、0.5％ NP40、0.5 mM EDTA）をウェルに添加することによって溶解され、4℃で20分間インキュベートされた。3）160μl ICEバッファー（50 mM HEPES pH 7.4、0.1％ CHAPS、0.1 mM EDTA、10％スクロース）＋20μM DEVDafc基質を含む5 mM DTTを添加する。4）400 ex、505 emで1時間における蛍光増加を測定する。試料は、カスパーゼ3結果を正規化するための一般的なエステラーゼアッセイを使用して、細胞数に対しても分析された。FDA基質（アセトニトリルにおける0.4 mg/mlフルオレセインジアセテート（FDA））は、希釈バッファー（40 mM TrisCl pH 7.5、20 mM NaCl、0.5％ NP-40、0.02 mg/ml最終濃度）に1：19で希釈された。40μlバッファー（40 mM TrisCl pH 7.5、0.5％ NP-40）が、各々の試料ウェルに添加された。試料は、氷上で10分間インキュベートされた。160μlの希釈FDA基質が、各々のウェルに添加された。蛍光は、37℃で30分間測定された（ex=488、em=529）。時間にわたる蛍光増加の傾きは、プレートにおける細胞数の関数である。
TRAILで処置された細胞は、各々のウェルにalamar blueを添加し、プレートリーダーを使用して蛍光を分析することによって、細胞生存率に対して査定された。alamer blueは、細胞における代謝酵素に対する基質であり、反応産物は蛍光である。各々のウェルにおける蛍光は、各々のウェルにおける細胞の全数と相関する。
処置に対する各々のmiRNAの効果は、miRNAをトランスフェクトされかつTRAILまたはエトポシドで処置された細胞のカスパーゼ3またはalamar blue読み取り値を、miRNAのみをトランスフェクトされた細胞に対する同じ読み取り値で除算することによって測定された。次いで、各々のmiRNAに対するカスパーゼ3活性またはalamar blue染色における変化は、各々のmiRNAと治療化合物との組み合わせによって誘導された相対効果を計算するために、二つの陰性対照miRNAに対して観測された差で除算され、100を乗算された。これらの値は、図Gにおいて％NCとして列挙される。
図21において示されるように、多くのmiRNAは、処置された癌細胞において細胞死を誘導する二つの治療化合物のキャパシティを有意に増加させた。興味深いことに、mir-292-3p、mir-132、mir-124、およびmir-28はすべて、TRAILおよびエトポシドの両方との組み合わせにおいて極めて良く正常に機能した。
実施例27
細胞周期に影響を及ぼすmiRNAに対する合成miRNAライブラリースクリーニング
成人ヒトの体は、約50〜100兆の細胞からなる。毎日、これらの細胞の数10億は、死んで除去される数10億の細胞を置換するために2つに分裂する。平均生存期間の経過において、これは、天文学的数の細胞分裂になり、そのうちのほとんどが、完全に順調に進む。しかしながら、エラーが生じ、それらが修正されない場合、それらは、癌をもたらし得る。細胞成長および分裂は、普通、抑制と均衡の複雑なシステムによって制御される。しかし、時折、細胞は、野性的に増殖を開始し、何度も分裂し、その成長に対するすべての正常規制を拒否する。それは、癌の最も一般的な形態の始まりである。
ウェルあたりおよそ8000個の子宮頚（HeLa）および4000個の皮膚（BJ）細胞に、本発明者らのライブラリーにおける150個よりも多くの合成miRNAの各々を三連でトランスフェクトした。製造業者の説明書に従って、HeLa細胞には、siPORT(商標)NeoFX(商標)（Ambion）を使用してトランスフェクトし、BJ細胞には、リポフェクタミン2000（Invitrogen）を使用してトランスフェクトした。トランスフェクションの24時間後、各々のウェルからの細胞の半分は、新鮮な培地に移された。トランスフェクションの72時間後、細胞は、2％の最終濃度で4％パラホルムアルデヒドで固定された。固定細胞は、ヨウ化プロピジウム（TTP LabTechプロトコール）で染色され、TTP LabTech細胞スキャナを使用して査定された。ヨウ化プロピジウムは、DNAを染色し、細胞における相対DNA含有量は、細胞周期におけるその位置に対応する。細胞スキャナは、各々の細胞におけるヨウ化プロピジウム染色を測定し、細胞周期におけるその位置を定めた。細胞周期の各々のステージにおける細胞のパーセンテージが計算され、陰性対照合成miRNAをトランスフェクトされた細胞と比較された。各々のステージにおける細胞における相対変化は、使用された各々のmiRNAに対して計算された。細胞周期の特定のステージから前へまたは後ろへの有意なシフトを誘導した合成miRNAは、以下に列挙している。これらは、細胞周期における主要なポイントを調節しかつ癌関連治療的開発に対する主要な介入ポイントを提示するmiRNAを示す。
図22において見られるように、多くの異なるmiRNAは、分析された二つの細胞型における細胞周期の様々なステージにおける細胞のパーセンテージを有意に変更した。
実施例28
ERK活性に影響を与えるmiRNAに対する合成miRNAライブラリースクリーニング
発明者ら：これは実施例17と同じか？
癌細胞が増殖するためには、それらは、細胞分裂周期を制御する機構およびプログラム細胞死（アポトーシス）のプロセスの両方を妨害しなければならない。これは、Rasなどの特定のプロト癌遺伝子またはp53などの腫瘍サプレッサーの突然変異によって頻繁に達成される。膜関連GTP分解酵素のRasファミリーは、Raf>MEK>ERK MAPキナーゼシグナル伝達経路などの多くの細胞質シグナル伝達経路の活性化によって、細胞の内部にシグナルを伝達する。Ras/Raf/MEK/ERK経路の調節障害は、癌発病機序において主要な役割を果たす（Meijer et al.において概説される）。
ERK活性化に影響を及ぼすmiRNAを同定するために、HeLa細胞に、96ウェルプレートフォーマットにおいて160個の異なる合成miRNAをトランスフェクトした。トランスフェクションに先行して、HeLa細胞は、接着細胞を移すためにトリプシン処理され、正常成長培地において105細胞/mLまで希釈された。9.5μlのOptimem I培地における0.5μlのsiPort NeoFXが細胞に添加され、室温で10分間インキュベートされた（各々の試料に対して10μL）。miRNAは、10μlの希釈siPORT NeoFXで再水和された。試料は、37℃でインキュベートされ、次いで、トランスフェクト試料は、トランスフェクションの72時間後に評価された。
ERK活性化に対する対照は、ERKリン酸化の検出に対してウェルからリン酸源を奪うことによって行われた。37℃までの100μlの血清フリー培地（DMEM）が、ウェルごとに添加され、細胞は、基本的なリン酸化レベルを得るために、37℃で4時間インキュベートされた。陽性対照ウェルに対して、血清フリー培地がウェルから吸引され、100μlの100 ng/mL EGFが、37℃で7.5分間細胞をインキュベートする前に添加された。
すべてのウェルからの培地は、吸引によって除去され、細胞は、振盪することなく室温で20分間、1×PBSにおける150μlの3.7％ホルムアルデヒドにおいて即座に固定された。固定溶液は、適当な廃液容器に除去された。固定細胞は、1×PBSで3回洗浄された。次いで、ウェルは、室温で振盪しながら、洗浄ごとに5分間、0.1％TritonX-100を含む200μlの1×PBSで3回洗浄された。
細胞は、各々のウェルへの150μlのLi-COR Odysseyブロッキングバッファーの添加によってブロックされた。溶液は、細胞を引き離すことを避けるために、ウェルの側面の下でピペッティングすることによって注意深く除かれた。ブロッキングは、ローテーター上で中程度に振盪しながら、室温で90分間であり、二つの一次抗体が、Odysseyブロッキングバッファーを含むチューブに添加された。一次抗体は、室温で穏やかに振盪しながら2時間インキュベートされた（Phosho-ERK（ウサギ、1：100希釈；Cell Signaling Technology 9101）、全ERK2（マウス；1：75希釈；Santa Cruz Biotechnology SC-1647））。ウェルは、多めの量のバッファーを使用して、穏やかに振盪しながら室温で5分間1×PBS＋0.1％Tween-20で3回洗浄された。蛍光標識二次抗体は、Odysseyブロッキングバッファーに希釈された（ヤギ抗ウサギAlexa Fluor 680（1：200希釈；Molecular Probes）、ヤギ抗マウスIRDye 800CW（1：800希釈；Rockland Immunochemicals））。抗体溶液は、よく混合され、50μlの二次抗体溶液が、各々のウェルに添加された。抗体溶液は、室温で穏やかに振盪しながら60分間インキュベートされた。プレートは、多めの量のバッファーを使用して、穏やかに振盪しながら室温で5分間1×PBS＋0.1％Tween-20で3回洗浄された。最後の洗浄の後、洗浄溶液は、ウェルから完全に除去された。プレートは、Odyssey赤外イメージングシステム（Alexa Fluor 680抗体に対して700 nm検出およびIRDye 800CW抗体に対して800 nm検出）でスキャンされた。
（表３２）ERKを活性化するmiRNA
Figure 2008519606
実施例29
hTert発現に影響を与えるmiRNAに対する合成miRNAライブラリースクリーニング
テロメラーゼは、テロメアを追加することによって染色体の末端を維持する、タンパク質およびRNAの複合体である。稀な例外はあるものの、最終分化細胞は、活性テロメラーゼを欠く。例外の一つは、癌細胞である。ヒト癌試料の90％よりも多くは、活性テロメラーゼを有する（Dong et al. 2005において概説される）。hTert遺伝子は、テロメラーゼの触媒ドメインをコードする。hTertの発現は、細胞におけるテロメラーゼ活性と相関し、それがテロメラーゼ活性に対する良い代理であるようにする。本発明者らは、テロメラーゼの調節に関与するmiRNAを同定するために、テロメラーゼ陰性細胞におけるhTert mRNA発現をモニターするためのRT-PCRに基づくアッセイを開発しかつ使用した。テロメラーゼ活性を調節するmiRNAは、癌治療薬に対する介入ポイントを示す。
BJ細胞は、hTer mRNAおよびテロメラーゼ活性を欠く正常包皮線維芽細胞である。BJ細胞は、トリプシン処理され、正常成長培地において13,000細胞/mlに希釈された。0.3μlのリポフェクタミン2000薬剤は、40μlのOPTI-MEMに希釈され、5分間インキュベートされた。希釈トランスフェクション試薬は、151個の合成miRNAならびに二つの異なる陰性対照合成miRNAを含む96ウェルプレートのウェルに添加された。各々のウェルは、異なる合成miRNAを収容した。合成miRNAおよびトランスフェクション薬剤は、室温で15分間インキュベートされ、次いで、200μl（2,600細胞）が、脂質/miRNA複合体の上面に添加された。細胞は、インキュベーターに置かれ、RNAは、72時間後に単離された。RNAは、RNAqueous(商標)-MagMAX96 Total RNA Isolationキット（カタログ番号1830）標準プロトコール（ウェルにおける細胞を溶解する）を使用して、各々のウェルにおける細胞から単離された。逆転写は、11μlの全RNA（20〜100 ng/μl）を1μlのランダムデカマーに添加することによってRETROscript反応を使用してなされ、3分間70℃水浴においてインキュベートされ、次いで、氷上に置かれる。次に、Nucフリー水3.8μl、10×逆転写バッファー2.0μl、2.5 mM dNTP 2.0μl、RNA分解酵素阻害剤タンパク質（40U/μl）、0.1μl MMLV-RT（100U/μl）を含む8μlのカクテル、1時間42℃で、次いで、10分間92℃でインキュベートされた。
リアルタイムPCR反応は、試料の各々においてhTert mRNAおよび18S rRNAを定量するために組み立てられた。PCRチューブに、ヌクレアーゼフリー水、10×Complete PCRバッファー/SYBR、25 mM MgCl2、2.5 mM dNTP、50×ROX、18SまたはhTert特異的プライマー（順方行および逆方行の混合3μM）、様々な試料からのcDNA、およびSuper taqポリメラーゼが置かれた。反応は、5分間95℃に加熱され、次いで、95℃15秒間、60℃30秒間、72℃30秒間の40サイクルに供した。増幅産物は、ABI 7600（Applied Biosystems）を使用してモニターされた。BJ細胞は、普通は、hTertプライマーで増幅産物を産出することができない。hTert PCR産物を産出したmiRNAトランスフェクト試料は、試料におけるhTertの量に寄与した可能性がある細胞が有意に多くはないことを確実にするために、18S rRNAレベルに対しても分析された。
hTert mRNAは、以下に列挙したmiRNAの各々の二連のトランスフェクションにおいて検出された。これらのmiRNAは、おそらく、hTert遺伝子の発現を調節する経路に影響を及ぼす。これらのmiRNAのいずれかの過剰発現は、テロメラーゼを活性化することによって癌に寄与し得ると考えられる。癌細胞におけるこれらのmiRNAの活性を調節することにより、それらの形質転換が限定されかつ発癌が克服され得ると考えられる。
（表３３）hTert miRNA活性化因子
Figure 2008519606
テロメラーゼ活性スクリーニングは、キナーゼ、ホスファターゼ、GPCR、転写因子、および種々のその他の遺伝子を標的にする一連のsiRNAを使用して繰り返された。siRNAで以下の遺伝子を標的にすることにより、増加したhTert発現が引き起こされた。興味深いことに、これらの遺伝子の多くは、本発明者らがhTert調節因子であることを見出したmiRNAに対する標的であることが予測される（以下の表を参照されたい）。
（表３４）hTert遺伝子活性化因子
Figure 2008519606
実施例30
機能に対するmiRNA一次配列の効果
多くのmiRNAは、それらの一次配列に基づいて、その他と非常に密接に関連するように見える。例えば、let-7aは、let-7遺伝子ファミリーのメンバーであり、ヒトゲノム内に7つのユニーク遺伝子を含む。let-7遺伝子は、わずか1つのヌクレオチドおよび4つものヌクレオチドによって変化するmiRNAをコードする。本発明者らの合成miRNAおよびmiRNA阻害剤ライブラリーにおいて、本発明者らは、5つの異なるヒトlet-7 miRNAを有する。これらのmiRNAは、様々な異なる細胞プロセスに関与するmiRNAを同定するためにデザインされたスクリーニングにおいて、多くの異なる細胞型において使用されている。スクリーニングの多くにおいて、様々なlet-7 miRNAは、類似の表現型を生成する。図223は、let-7ファミリーメンバーのすべてが類似の応答を産出する二つの例を提供する。対照的に、様々なlet-7ファミリーmiRNAが有意に異なる結果を産出するいくつかのスクリーニングがある（図23）。
実施例31
炎症に影響を与えるmiRNAに対する合成miRNAライブラリースクリーニング
炎症は、傷害または感染に対する体の天然の保護応答である。それは、組織修復を始めるまたは侵襲性病原体を攻撃する生物学的経路を過度刺激するようにデザインされる。この応答は、炎症誘発性および抗炎症性遺伝子ならびにそれらのタンパク質の繊細なバランスである。炎症性応答が、とても長く維持される場合、それは、組織破壊、器官不全、または関節リウマチ、乾癬、喘息、炎症性腸疾患（クローン病および関連病態）、多発性硬化症、冠状動脈閉塞性肺疾患（COPD）、アレルギー性鼻炎（花粉症）、および心臓血管疾患などの炎症性疾患をもたらし得る。
Stat3は、それが、細胞分裂、アポトーシスの誘導および抑制、ならびに細胞運動性に対して必要とされる遺伝子を刺激する重要な転写因子であることが公知であるので、熱心な科学的調査の対象である。抗アポトーシスタンパク質Bcl-xl、Mcl-1、およびBcl-2、増殖関連タンパク質サイクリンD1およびMyc、ならびに血管新生誘発（pro-angiogenic）因子VEGFをコードするものを含む多くのSTAT3標的遺伝子が公知である。炎症性疾患乾癬は、損傷によって特徴付けられ、高レベルの活性化Stat3を発現する表皮性ケラチノサイトを含む。Stat3は、最近、抗炎症性調節因子として重要な役割を果たすことも発見されている。正常マウスにおいて、免疫システムは、細菌性タンパク質負荷に応じて初めに上方制御され、全身性炎症を作り出し、開始因子の下方制御が後に続く。Stat3-βに対する欠失突然変異を有するマウスは、細菌性タンパク質負荷後の初期炎症性反応を下方制御する能力を欠き、動物の独自の組織に不可逆的な損傷をもたらし、最終的には動物死をもたらす。
stat3応答アッセイは、細胞炎症性応答を調節するmiRNAを同定するために使用された。Stat1応答エレメントの3つのコピーによって調節されるルシフェラーゼレポーター構築物の染色体組込みを含む、Panomicsの安定Stat3-ルシフェラーゼレポーター細胞株が、この目的のために使用された。化学薬剤ホルボール-12-ミリステート13アセテート（PMA）は、曝露された細胞において炎症性応答を誘導することが公知であり、この実験において炎症を刺激するために使用された。これらの細胞に、96ウェルプレートのおよそ6000細胞/ウェルのプレート密度で、siPORT(商標)NeoFX(商標)（Ambion）を使用して、本発明者らのライブラリーにおける206よりも多くの合成miRNAの各々を三連でトランスフェクトした。培地はトランスフェクションの24時間後に交換し、トランスフェクションの67時間後に開始して6時間、100nM PMAに曝露した。細胞は、前に記載されるようにalamarBlueによって全細胞数における変化に対してアッセイされ、最終的には、初めのトランスフェクションの72時間後に採取された。ルシフェラーゼアッセイは、手順に対するStat3応答性を測定するために、すべての細胞溶解物に対して行われた。データは、alamar Blueデータを使用して全細胞数に対して正規化され、同じ手順を経験した陰性対照miRNAをトランスフェクトされた細胞と比較された。
以下のmiRNAは、Stat3を刺激するPMAの能力を低下させることができた。
Figure 2008519606
本明細書において開示されかつ特許請求される組成物および方法のすべては、本開示に照らして、必要以上の実験なしに、作られかつ施行され得る。本発明の組成物および方法が、態様の観点から記載されているが、変形が、本発明の概念、精神、および範囲を逸脱することなく本明細書において記載される、組成物および方法に、ならびに方法の段階または一連の段階において適用され得ることが当業者にとって明白であると思われる。より具体的には、化学的および生理学的の両方に関連する特定の薬剤が、本明細書において記載される薬剤に置換され得るが、同じまたは類似の結果が達成されることは明白であると思われる。当業者にとって明白なすべてのそのような類似の置換および改変は、添付の特許請求の範囲によって定義されるように、本発明の精神、範囲、および概念の範囲内であると考えられる。
参考文献
以下の参考文献は、それらが本明細書において議論される論題および主題に関する程度に、参照により具体的に組み入れられる。
Figure 2008519606
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miRNA発現および活性化の概観。miRNAは、1000ヌクレオチドもの長さであり得るより長いRNA分子の一部として転写される（Lee, 2002）。RNAは、核において、dsRNA特異的リボヌクレアーゼDroshaによって、70〜100ヌクレオチドのヘアピンRNAにプロセスされる（Lee 2003）（図1）。ヘアピンRNAは、細胞質に輸送され、Dicerと呼ばれる第二の二本鎖特異的リボヌクレアーゼによって分解される。結果として生じる19〜23merのmiRNAは、RNA干渉に関与するRNA誘導サイレンシング複合体（RISC）と類似のまたは同一の複合体によって結合される（Hutvagner 2002）。複合体結合一本鎖miRNAは、miRNAと有意にしかし完全ではなく相補的な配列を有するmRNAに結合する。完全に理解されていないがmRNA分解には関与しないメカニズムにより、結合mRNAは翻訳されず、対応する遺伝子の低下した発現を引き起こす。 細胞にmiRNAを導入するための方法。細胞にmiRNAを導入するための3つの基本的な方法がある。第一に、miRNAをコードする配列の上流にプロモーターを持つDNAを細胞に導入し、これは、成熟miRNAを含むRNA分子を産生するように転写される。miRNA誘導遺伝子調節に対するタンパク質複合体によるプロセシングおよび取り込みは、miRNAの活性化を引き起こす。この方法は、細胞へのDNA構築物の非効率な導入に見舞われる。第二の方法において、鎖の一つが活性miRNAと同一であるsiRNA様dsRNA分子を細胞に導入し、これは、miRNA活性化に対するタンパク質複合体によって取り込まれる。この方法は、効率的な送達を提供するが、しばしば意図されない相補的RNA分子の取り込みを提供する。本明細書において記載される第三の方法は、合成miRNA構築物の活性鎖の取り込みおよび活性化を助けるために、相補鎖を修飾することに関する。 本発明の合成miRNAにおける活性鎖の選択的取り込み。miR-33もしくはlet-7または前述のsiRNAの相補鎖に対する標的部位の制御下でルシフェラーゼを有するレポーターベクター。トランスフェクションの24時間後にルシフェラーゼアッセイが続く合成miRNAおよびレポーターベクターの共トランスフェクションは、トランスフェクション後に活性化されるmiRNAを明らかにした。 様々なmiRNAに対する合成miRNA活性。siRNAおよびプレ-miR（5'アミン）デザインを有する合成miRNAを調製し、3および10 nM最終濃度でHeLa細胞にトランスフェクトした。合成miRNAは、成熟miRNAに対する標的部位を持つレポーターベクターと共トランスフェクトした。共トランスフェクト細胞におけるルシフェラーゼレポーターの発現を、トランスフェクションの24時間後に測定し、陰性対照合成miRNAを共トランスフェクトされた細胞に対するレポーター発現として図に示した。 細胞型にわたるおよび天然標的に対する合成miRNA活性。合成miRNAは、デザインが堅固であることを確実にするために適切な鎖活性化および細胞型特異性に対してテストした。4つの異なる細胞型に、合成miRNAを共トランスフェクトし、活性および相補鎖鎖活性化を関連付けた。パネルAは、異なる細胞型が、合成miRNAに同様に応答することを示す。次いで、4つの異なる合成miRNAを様々な細胞型にトランスフェクトし、miRNAの天然標的の発現レベルを測定した（パネルB）。 合成miRNAまたはmiRNA阻害剤のライブラリーを用いたスクリーニングに対する概略図。合成miRNAおよび/またはmiRNA阻害剤を、マイクロタイタープレートのウェルに分配する。トランスフェクション試薬および次いで細胞を、各々のウェルに添加する。トランスフェクション後しばらくして、試料を、表現型について評価する。陰性対照に対して有意な変化を誘導するmiRNAを、さらなる調査に対して選択する。 細胞増殖に影響を及ぼすmiRNAに対するスクリーニング。96ウェルプレートにおいて、8,000個のHeLa細胞に、Ambion siPORT Neo-FXを使用してmiRNA阻害剤（5 pmol）を三連で逆トランスフェクトした。トランスフェクションの72時間後、細胞を、4％パラホルムアルデヒドで固定し、0.1％TritonX 100で透過化し、かつ全細胞数を見るためにヨウ化プロピジウムで染色した。プレートは、TTP labtech Acumen Explorerを使用してスキャンした。mir 31について阻害された細胞における形態変化。HeLa細胞に抗mir31をトランスフェクトし、細胞を固定し、かつmir-31マイクロRNA機能に対する阻害に応じた細胞形態変化を可視化するために抗βアクチン抗体およびDAPIで染色した。 A549細胞における細胞増殖に影響を及ぼすmiRNAに対するスクリーニング。miRNAに対するスクリーニングは、A549細胞における細胞生存率に関連した。96ウェルプレートにおいて、8,000個のA549細胞に、Ambion siPORT Neo-FXを使用してmiRNA阻害剤（5 pmol）を三連で逆トランスフェクトした。トランスフェクションの72時間後、細胞をトリプシン処理し、Guava細胞計数機器を使用して計数した。細胞数をグラフ化し、gap阻害剤に対して正規化した。この図において、「mir1d」は、mir-1-2を指す。 HeLa細胞におけるアポトーシスに影響を及ぼすmiRNAに対するスクリーニング。HeLaにおけるカスパーゼ活性に対するmiRNA阻害剤の効果。96ウェルプレートにおいて、8,000個のHeLa細胞に、Ambion siPORT Neo-FXを使用してmiRNA阻害剤（5 pmol）を三連で逆トランスフェクトした。トランスフェクションの72時間後、細胞を、カスパーゼ活性アッセイを使用して分析し、エステラーゼ活性アッセイに基づいて正規化した。この図において、「mir1d」は、mir-1-2を指す。 肺および結腸癌患者におけるmiRNA発現。腫瘍対正常隣接組織のmiRNA発現プロファイルを、肺および結腸癌患者に対して比較した。miRNAは、行（row）において提供する；患者は、列（column）において提示する。ヒートマップ（heat map）における緑は、正常隣接組織試料に対して腫瘍試料において下方制御されるmiRNAを示し、赤は、正常隣接組織試料に対して腫瘍試料において上方制御されるmiRNAを示す。 肺癌患者におけるmiRNAアレイ発現結果の検証。2人の肺癌患者からの全RNA試料は、ノーザン分析を使用してmiR-16、miR-21、miR-143、miR-145、およびlet-7の発現に対して分析した。グラフは、アレイ分析およびノーザンホスホイメージャー分析からの各々のmiRNAの相対存在量（腫瘍：NATの比）を示す。 いくつかのmiRNAは、複数の癌型において差次的に発現される。様々な型の癌を有する患者からの腫瘍および正常隣接組織を比較するmiRNAアレイ分析を、癌において差次的に発現されるmiRNAを同定するために使用した。所与のmiRNAの上方制御または下方制御を示す患者のパーセンテージを、各々の癌型に対して計算した。試料型にわたって最もしばしば差次的に発現された8つを提示する。 感染対非感染および感受性対非感受性の両方の間で1.5倍よりも大きな発現変化を有するmiRNAを示す。右側にあるのは、各々のモデルの2アレイからの結果のクラスターである。 非処置マウスに対して3匹のプレコンディショニングマウスにおいて差次的に発現されたmiRNA。 A〜C：細胞増殖を減少させる合成miRNA。A：BT549およびMCF12A（乳房）、HeLa（子宮頚）、ならびに22 Rv1（前立腺）細胞を、細胞増殖について評価した。B：TE354TおよびTE353SK（皮膚）、BJ（皮膚）、ならびにA549（肺）細胞を、細胞増殖について検査した。C：CRL5826およびHTB-57（肺）、Jurkat（T細胞）、ならびに初代T細胞を、細胞増殖について評価した。 細胞増殖を増加させる合成miRNA。HeLa（子宮頚）、22 Rv1（前立腺）、TE354TおよびTE353SK（皮膚）、BJ（皮膚）、A549（肺）、Jurkat（T細胞）、初代T細胞、CRL5826およびHTB-57（肺）細胞を、細胞増殖について評価した。 細胞増殖を低下させるmiRNA阻害剤。22 Rv1（前立腺）、TE354T（皮膚）、MCF12a（乳房）、およびA549（肺）細胞を、細胞増殖について評価した。 細胞増殖を増加させるmiRNA阻害剤。22 Rv1（前立腺）、TE354T（皮膚）、MCF12a（乳房）、およびA549（肺）細胞を、細胞増殖について評価した。 細胞生存率に影響を及ぼすmiRNA。Jurkat（T細胞）、初代T細胞、HeLa（子宮頚）、およびA549（肺）細胞を、細胞生存率における増加および減少について評価した。 アポトーシスに影響を及ぼすmiRNA。22 Rv1（前立腺）、TE354T（皮膚）、Jurkat（T細胞）、およびHeLa（子宮頚）細胞を、アポトーシスにおける増加および減少について評価した。 治療薬の存在下で細胞生存率に影響を及ぼすmiRNA。A549（肺）細胞を、TRAILまたはエトポシドの存在下および非存在下で細胞生存率における増加および減少について評価した。HTB-57およびCRL5826（肺）ならびにHeLa（子宮頚）細胞を、エトポシドの非存在下および存在下で細胞生存率における低下について評価した。 細胞周期に影響を及ぼすmiRNA。BJ（皮膚）およびHeLa（子宮頚）細胞を、細胞周期の特定の期（G1、S、G2/M、DNA複製）における細胞の数における増加または減少について評価した。 類似の配列を有するmiRNAの表現型。関連配列および細胞増殖に対するそれらの効果の比較。 hTert調節に関連する遺伝子およびそれらの発現をモジュレートすることが予測されるmiRNA配列。

Claims (101)

  1. a）5'から3'までの配列が成熟miRNA配列と同一であるmiRNA領域、および
    b）5'から3'までの配列がmiRNA配列と60％〜100％相補的である相補領域
    を含む、長さが17〜125残基の合成RNA分子。
  2. i）RNA分子の5'末端におけるヌクレオチドのリン酸もしくはヒドロキシルに対する置換基；
    ii）相補領域の最初もしくは最後の1〜6残基における一つもしくは複数の糖修飾；または
    iii）相補領域の3'末端の最後の1〜5残基における一つもしくは複数のヌクレオチドとmiRNA領域の対応するヌクレオチドとの間の非相補性
    の一つまたは複数をさらに含む、請求項1記載のRNA分子。
  3. RNA分子の5'末端におけるヌクレオチドのリン酸またはヒドロキシルに対する置換基を含む、請求項2記載のRNA分子。
  4. 置換基が、ビオチン、アミン基、低級アルキルアミン基、アセチル基、2'酸素-メチル（2'O-Me）、酸素を有する4,4'-ジメトキシトリチル（DMTO）、フルオレセイン、チオール、またはアクリジンである、請求項3記載のRNA分子。
  5. RNA分子の5'末端におけるヌクレオチドのリン酸が置換されている、請求項3記載のRNA分子。
  6. RNA分子の5'末端におけるヌクレオチドのヒドロキシルが置換されている、請求項3記載のRNA分子。
  7. 相補領域の最初または最後の1〜6残基における一つまたは複数の糖修飾を含む、請求項2記載のRNA分子。
  8. 糖修飾が2'O-Me修飾である、請求項7記載のRNA分子。
  9. 相補領域の最初の1〜6残基における一つまたは複数の糖修飾を含む、請求項7記載のRNA分子。
  10. 相補領域の最後の1〜6残基における一つまたは複数の糖修飾を含む、請求項7記載のRNA分子。
  11. 相補領域の最初または最後の2〜4残基における一つまたは複数の糖修飾を含む、請求項7記載のRNA分子。
  12. 相補領域の3'末端の最後の1〜5残基における一つまたは複数のヌクレオチドとmiRNA領域の対応するヌクレオチドとの間の非相補性を含む、請求項2記載のRNA分子。
  13. 相補領域において少なくとも2つのヌクレオチドによる非相補性がある、請求項12記載のRNA分子。
  14. i）、ii）、またはiii）のうちの少なくとも2つを含む、請求項2記載のRNA分子。
  15. i）、ii）、およびiii）を含む、請求項14記載のRNA分子。
  16. RNA分子が、単一ポリヌクレオチドである、請求項1記載のRNA分子。
  17. miRNA領域と相補領域との間にリンカー領域をさらに含む、請求項16記載のRNA分子。
  18. リンカー領域が3〜30残基の長さである、請求項17記載のRNA分子。
  19. RNA分子が二本鎖である、請求項1記載のRNA分子。
  20. 請求項1記載の10個以上の異なるRNA分子のライブラリー。
  21. 各々のmiRNA阻害分子が、成熟miRNAの5'〜3'配列と少なくとも90％相補的な5'〜3'配列を含み、かつ約17〜25ヌクレオチド長である、10個以上の異なるmiRNA阻害分子のライブラリー。
  22. miRNA阻害分子が、分子の5'末端におけるヌクレオチドのリン酸またはヒドロキシルに対する置換基を有する、請求項21記載のライブラリー。
  23. 置換基が、アミン基、低級アルキルアミン基、アセチル基、または2'O-Meである、請求項22記載のライブラリー。
  24. miRNA阻害分子の5'末端におけるヌクレオチドのリン酸が置換されている、請求項22記載のライブラリー。
  25. miRNA阻害分子の5'末端におけるヌクレオチドのヒドロキシルが置換されている、請求項22記載のライブラリー。
  26. miRNA阻害剤がDNAを含む、請求項21記載のライブラリー。
  27. a）一つまたは複数の細胞に請求項1記載のRNA分子を導入する段階；
    b）RNA分子を有する細胞の一つまたは複数の特徴を、RNA分子を有しない細胞と比較する段階
    を含む、細胞におけるmiRNA活性または機能を特徴付ける方法。
  28. 少なくとも5つのRNA分子が、異なる細胞に導入される、請求項27記載の方法。
  29. RNA分子の存在に対して細胞をアッセイする段階をさらに含む、請求項27記載の方法。
  30. RNA分子を合成する段階をさらに含む、請求項27記載の方法。
  31. RNA分子が、
    i）RNA分子の5'末端におけるヌクレオチドのリン酸もしくはヒドロキシルに対する置換基；
    ii）相補領域の最初もしくは最後の1〜6残基における一つもしくは複数の糖修飾；または
    iii）相補領域の3'末端の最後の1〜5残基における一つもしくは複数のヌクレオチドとmiRNA領域の対応するヌクレオチドとの間の非相補性
    の一つまたは複数をさらに含む、請求項30記載の方法。
  32. RNA分子が、RNA分子の5'末端におけるヌクレオチドのリン酸またはヒドロキシルに対する置換基を含む、請求項31記載の方法。
  33. 置換基が、ビオチン、アミン基、低級アルキルアミン基、アセチル基、2'O-Me、DMTO、フルオレセイン、チオール、またはアクリジンである、請求項32記載の方法。
  34. RNA分子の5'末端におけるヌクレオチドのリン酸が置換されている、請求項32記載の方法。
  35. RNA分子の5'末端におけるヌクレオチドのヒドロキシルが置換されている、請求項32記載の方法。
  36. RNA分子が、相補領域の最初または最後の1〜6残基における一つまたは複数の糖修飾を含む、請求項31記載の方法。
  37. 糖修飾が2'O-Me修飾である、請求項36記載の方法。
  38. RNA分子が、相補領域の最初の1〜6残基における一つまたは複数の糖修飾を含む、請求項36記載の方法。
  39. RNA分子が、相補領域の最後の1〜6残基における一つまたは複数の糖修飾を含む、請求項36記載の方法。
  40. RNA分子が、相補領域の最初または最後の2〜4残基における一つまたは複数の糖修飾を含む、請求項36記載の方法。
  41. RNA分子が、相補領域の3'末端の最後の1〜5残基における一つまたは複数のヌクレオチドとmiRNA領域の対応するヌクレオチドとの間の非相補性を含む、請求項31記載の方法。
  42. 相補領域において少なくとも2つのヌクレオチドによる非相補性がある、請求項41記載の方法。
  43. RNA分子が、i）、ii）、またはiii）のうちの少なくとも2つを含む、請求項31記載の方法。
  44. RNA分子が、i）、ii）、およびiii）を含む、請求項43記載の方法。
  45. RNA分子が単一ポリヌクレオチドである、請求項27記載の方法。
  46. RNA分子が、miRNA領域と相補領域との間にリンカー領域をさらに含む、請求項45記載の方法。
  47. リンカー領域が3〜30残基の長さである、請求項46記載の方法。
  48. RNA分子が、2つのポリヌクレオチドからなる、請求項27記載の方法。
  49. RNA分子が、リン酸カルシウムトランスフェクション、脂質トランスフェクション、電気穿孔法、マイクロインジェクション、またはインジェクションによって細胞に導入される、請求項27記載の方法。
  50. a）成熟miRNAの5'〜3'配列と少なくとも90％相補的な5'〜3'配列を含み、17〜25ヌクレオチド長であるmiRNA阻害剤を、細胞に導入する段階
    を含む、細胞から一つまたは複数のmiRNAの活性を低下させるまたは消失させる方法。
  51. b）miRNA阻害剤を有する細胞の一つまたは複数の特徴を、miRNA阻害剤を有しない細胞と比較する段階
    をさらに含む、請求項50記載の方法。
  52. 成熟miRNAの発現に対して細胞をアッセイする段階をさらに含む、請求項50記載の方法。
  53. miRNA阻害剤を合成する段階をさらに含む、請求項50記載の方法。
  54. miRNA阻害剤が、
    i）miRNA阻害剤の5'末端におけるヌクレオチドのリン酸もしくはヒドロキシルに対する置換基；または
    ii）一つもしくは複数の糖修飾
    の一つまたは複数をさらに含む、請求項51記載の方法。
  55. miRNA阻害剤が、miRNA阻害剤の5'末端におけるヌクレオチドのリン酸またはヒドロキシルに対する置換基を含む、請求項54記載の方法。
  56. 置換基が、ビオチン、アミン基、低級アルキルアミン基、アセチル基、2'O-Me、DMTO、フルオレセイン、チオール、またはアクリジンである、請求項55記載の方法。
  57. miRNA阻害剤の5'末端におけるヌクレオチドのリン酸が置換されている、請求項55記載の方法。
  58. miRNA阻害剤の5'末端におけるヌクレオチドのヒドロキシルが置換されている、請求項55記載の方法。
  59. miRNA阻害剤が、最初または最後の1〜6残基における一つまたは複数の糖修飾を含む、請求項54記載の方法。
  60. 糖修飾が2'O-Me修飾である、請求項59記載の方法。
  61. miRNA阻害剤が、相補領域の最初の1〜6残基における一つまたは複数の糖修飾を含む、請求項59記載の方法。
  62. miRNA阻害剤が、相補領域の最後の1〜6残基における一つまたは複数の糖修飾を含む、請求項59記載の方法。
  63. miRNA阻害剤が、相補領域の最初または最後の2〜4残基における一つまたは複数の糖修飾を含む、請求項59記載の方法。
  64. miRNA阻害剤が、i）およびii）の両方を含む、請求項54記載の方法。
  65. miRNA阻害剤が単一ポリヌクレオチドである、請求項50記載の方法。
  66. miRNA阻害剤が、リン酸カルシウムトランスフェクション、脂質トランスフェクション、電気穿孔法、マイクロインジェクション、またはインジェクションによって細胞に導入される、請求項50記載の方法。
  67. 少なくとも一つの
    i）mir-31、mir-92、mir-99a、mir-100、mir-125a、mir-129、mir-130a、mir-150、mir-187、miR-190、miR-191、miR-193、miR 204、mir-210、mir-211、mir-212、mir-213、mir-215、mir-216、mir-217、miR 218、mir-224、mir-292、mir-294、mir-320、mir-324、mir-325、mir-326、mir-330、mir-331、mir-338、mir-341、mir-369、およびmir-370からなる群より選択される成熟miRNAの5'〜3'配列と少なくとも90％相補的な5'〜3'配列を含み、17〜25ヌクレオチド長であるmiRNA阻害分子；または
    ii）5'から3'までの配列が成熟miRNA配列と同一であるmiRNA領域、および5'から3'までの配列が、miR-15a、miR-16、miR 21、miR 24、miR-96、miR-101、miR-105、miR-124、miR-126、miR-142、miR-147、miR-192、miR-194、miR-206、miR-215、もしくはmiR-346からなる群より選択される成熟miRNAと60％〜100％相補的である相補領域を含む、長さが17〜125残基の合成miRNA分子
    の有効量を細胞に導入する段階を含む、細胞における細胞増殖を低下させるまたは阻害するための方法。
  68. 細胞増殖を低下させるまたは阻害することを必要とするような細胞または細胞を有する患者を同定する段階をさらに含む、請求項67記載の方法。
  69. 少なくとも一つの
    i）let7a-1、Let-7a、Let-7b、let7b-1、let7c、let7d、Let-7g、mir-9、mir-10a、mir-10b、mir-15a、mir-16、mir-21、mir-23a、mir-23b、mir-24、mir-25、mir-92、mir-95、mir-133a、mir-133a-2、mir-133b、mir-142、mir-152、mir-153、mir-155、mir-181a、mir-182、mir-183、mir-184、mir-186、mir-187、mir-191、mir-193、mir-194、mir-196、mir-199a-1、mir-200b、mir-204、mir-206、mir-211、mir-222、mir-223、mir-298、mir-328、mir-342、mir-371、およびmir-412からなる群より選択される成熟miRNAの5'〜3'配列と少なくとも90％相補的な5'〜3'配列を含み、17〜25ヌクレオチド長であるmiRNA阻害分子；または
    ii）5'から3'までの配列が成熟miRNA配列と同一であるmiRNA領域、および5'から3'までの配列が、Let-7a、Let-7b、Let-7c、Let-7d、Let-7g、miR-7、mir-9、miR-10a、miR-10b、miR-15a、miR-18、miR-19a、miR-17-3p、miR-20、miR-23b、mir-25、miR-26a、miR-26a、mir-30e-5p、mir-31、mir-32、mir-92、mir-93、miR-100、miR-125a、miR-125b、miR-126、mir-127、miR-128、miR-129、mir-130a、mir-135、mir-138、mir-139、miR-140、mir-141、mir-143、mir-145、mir-146、miR-150、mir-154、mir-155、mir-181a、miR-182、mir-186、miR-187、miR-188、mir-190、mir-191、mir-193、mir-194、mir-196、mir-197、mir-198、mir-199、mir-201、mir-204、mir-216、mir-218、miR-223、mir-293、miR-291-3p、miR-294、miR-295、miR-322、mir-333、mir-335、mir-338、mir-341、mir-350、mir-369、miR-373、mir-410、およびmir-412からなる群より選択されるmiRNA配列と60％〜100％相補的である相補領域を含む、長さが17〜125残基の合成miRNA分子
    の有効量を細胞に導入する段階を含む、細胞における細胞増殖を誘導するまたは増加させるための方法。
  70. 細胞増殖を誘導するまたは増加させることを必要とするような細胞または細胞を有する患者を同定する段階をさらに含む、請求項69記載の方法。
  71. 少なくとも一つの
    i）miR-107、miR-133、miR-137、miR-152、miR-155、miR-181a、miR-191、miR-203、およびmiR-215からなる群より選択される成熟miRNAの5'〜3'配列と少なくとも90％相補的な5'〜3'配列を含み、17〜25ヌクレオチド長であるmiRNA阻害分子；または
    ii）5'から3'までの配列が成熟miRNA配列と同一であるmiRNA領域、および5'から3'までの配列が、let-7a、let-7b、mir-1、mir-7、miR-10b、miR-17-3p、miR-19a、mir-23、mir-24、mir-27a、miR-29a、miR-30a-3p、mir-31、mir-32、miR-34a、miR-101、miR-107、miR-108、miR-122、mir-124、miR-133a、miR-134、miR-135、miR-139、mir-140、miR-141、miR-145、mir-150、mir-192、mir-193、mir-195、mir-206、mir-208、mir-210、mir-210、mir-292-3p、mir-293、mir-297、mir-299、mir-329、mir-337、mir-337、mir-345、mir-346、およびmir-409からなる群より選択されるmiRNA配列と60％〜100％相補的である相補領域を含む、長さが17〜125残基の合成miRNA分子
    の有効量を一つまたは複数の細胞に導入する段階を含む、細胞生存率を低下させるための方法。
  72. 細胞生存率を低下させることを必要とするような細胞または細胞を有する患者を同定する段階をさらに含む、請求項71記載の方法。
  73. 少なくとも一つの
    i）miR-7、miR-19a、miR-23、miR-24、miR-27a、miR-31、miR-32、miR-134、miR-140、miR-150、miR-192、およびmiR-193からなる群より選択される成熟miRNAの5'〜3'配列と少なくとも90％相補的な5'〜3'配列を含み、17〜25ヌクレオチド長であるmiRNA阻害分子；または
    ii）5'から3'までの配列が成熟miRNA配列と同一であるmiRNA領域、および5'から3'までの配列が、let-7a、let-7b、let-7c、let-7d、let-7g、miR-10a、miR-10b、miR-15a、miR-17-3p、miR-18、miR-19a、miR-20、mir-23a、mir-23b、mir-24、miR-25、miR-26a、mir-32、miR-107、miR-125a、miR-126、mir-128、miR-129、miR-133、miR-137、mir-139、miR-143、miR-152、miR-155、miR-181a、miR-182、miR-191、miR-203、miR-215、およびmir-331からなる群より選択されるmiRNA配列と60％〜100％相補的である相補領域を含む、長さが17〜125残基の合成miRNA分子
    の有効量を一つまたは複数の細胞に導入する段階を含む、細胞生存率を増加させるための方法。
  74. 細胞生存率を増加させることを必要とするような細胞または細胞を有する患者を同定する段階をさらに含む、請求項73記載の方法。
  75. 少なくとも一つの
    i）miR-31およびmiR-214からなる群より選択される成熟miRNAの5'〜3'配列と少なくとも90％相補的な5'〜3'配列を含み、17〜25ヌクレオチド長であるmiRNA阻害分子；または
    ii）5'から3'までの配列が成熟miRNA配列と同一であるmiRNA領域、および5'から3'までの配列が、let-7b、let-7g、mir-1、mir-1d、mir-7、mir-10a、miR-10b、miR-17-3p、miR-19a、miR-28、miR-28、miR-28、miR-29a、miR-32、miR-34a、miR-122、mir-148、mir-149、mir-154、mir-184、mir-186、mir-188、mir-192、mir-195、mir-196、mir-199a、mir-204、mir-208、mir-210、mir-211、mir-212、mir-214、mir-215、mir-216、mir-217、mir-218、mir-293、mir-296、mir-299、mir-321、mir-328、およびmir-344からなる群より選択されるmiRNA配列と60％〜100％相補的である相補領域を含む、長さが17〜125残基の合成miRNA分子
    の有効量を細胞に導入する段階を含む、細胞におけるアポトーシスを誘導するための方法。
  76. アポトーシスを誘導することを必要とするような細胞または細胞を有する患者を同定する段階をさらに含む、請求項75記載の方法。
  77. 少なくとも一つの
    i）miR-7、miR-1d、miR-148、miR-195、miR-196、miR-199a、miR-204、miR-210、miR-211、miR-212、miR-215、miR-216、miR-218、miR-296、およびmiR-321からなる群より選択される成熟miRNAの5'〜3'配列と少なくとも90％相補的な5'〜3'配列を含み、17〜25ヌクレオチド長であるmiRNA阻害分子；または
    ii）5'から3'までの配列が成熟miRNA配列と同一であるmiRNA領域、および5'から3'までの配列が、Let-7b、mir-21、mir-23b、mir-25、miR-26a、mir-28、mir-29a、mir-31、miR-32、mir-30a-3p、mir-34a、mir-96、miR-98、mir-100、mir-101、mir-105、mir-108、miR-125b、miR-126、mir-126、mir-128、mir-137、miR-143、miR-155、mir-207、mir-214、mir-216、mir-223、mir-292-3p、mir-328、mir-335、mir-340、mir-341、mir-367、mir-368、mir-380-3p、およびmir-410からなる群より選択されるmiRNA配列と60％〜100％相補的である相補領域を含む、長さが17〜125残基の合成miRNA分子
    の有効量を細胞に導入する段階を含む、細胞におけるアポトーシスを阻害するための方法。
  78. アポトーシスを阻害することを必要とするような細胞または細胞を有する患者を同定する段階をさらに含む、請求項77記載の方法。
  79. miR-21、miR-126、miR-143、miR-145、miR-188、miR-200b、miR-219、またはmiR-331に対応する一つまたは複数の合成miRNA分子および/またはmiRNA阻害剤の有効量を被験体に投与する段階を含む、被験体における癌を処置するための方法。
  80. 癌が乳癌であり、被験体は1）miR-21、miR-15a、miR-16、miR-24、および/もしくはmiR-25に対応する一つもしくは複数のmiRNA阻害剤、ならびに/または2）miR-99、miR-100、miR-205、miR-197、miR-126、miR-143、miR-145、および/もしくはmiR-321に対応する一つもしくは複数のmiRNAを投与される、請求項79記載の方法。
  81. 癌が結腸癌であり、被験体は1）miR-21、miR-106、miR-189、miR-200b、miR-223、miR-224、miR-31、および/もしくはmiR-17に対応する一つもしくは複数のmiRNA阻害剤；ならびに/または2）miR-145、miR-143、miR-133、miR-342、miR-125a、miR-195、miR-30a、miR-10a、miR-130、miR-130a、miR-192、miR-194、miR-215、miR-144、miR-23、miR-26a、miR-126、miR-199a、miR-188、miR-331、および/もしくはmiR-21に対応する一つもしくは複数のmiRNAを投与される、請求項79記載の方法。
  82. 癌が甲状腺癌であり、被験体は1）miR-21、miR-125、miR-24、miR-200b、miR-29b、miR-221、miR-222、miR-224、miR-10a、および/もしくはmiR-183に対応する一つもしくは複数のmiRNA阻害剤；ならびに/または2）miR-145、miR-22、miR-331、miR-126、miR-30a、miR-199a、miR-223、および/もしくはmiR-321に対応する一つもしくは複数のmiRNAを投与される、請求項79記載の方法。
  83. 癌が肺癌であり、被験体は1）miR-223、miR-106、miR-21、miR-200b、miR-321、miR-182、miR-183、miR-17、および/もしくはmiR-205に対応する一つもしくは複数のmiRNA阻害剤；ならびに/または2）miR-130a、miR-145、miR-126、miR-331、miR-342、miR-143、Let-7、miR-30a、miR-16、miR-26a、miR-125a、miR-29b、miR-24、miR-328、miR-201、miR-195、miR-22、miR-181a、miR-331、および/もしくはmiR-321に対応する一つもしくは複数のmiRNAを投与される、請求項79記載の方法。
  84. let-7、miR-10a、miR-16、miR-17、miR-21、miR-22、miR-23、miR-24、miR-26a、miR-29b、miR-30a、miR-106、miR-125a、miR-126、miR-130、miR130a、miR-133、miR-143、miR-144、miR-145、miR-181a、miR-182、miR-183、miR-188、miR-189、miR-219、miR-192、miR-194、miR-195、miR-199a、miR-200b、miR-201、miR-205、miR-215、miR-223、miR-224、miR-321、miR-328、miR-331、またはmiR-342に対応する一つまたは複数の合成miRNA分子および/またはmiRNA阻害剤の有効量を被験体に投与する段階を含む、被験体における癌を処置するための方法。
  85. 癌治療薬と、癌治療薬の効力を改善するかまたは非癌細胞を保護する少なくとも一つのmiRNA分子の有効量とを患者に投与する段階を含む、患者における癌を処置する方法。
  86. miRNA分子が、癌治療薬の効力を強化し、かつambi- miR-7100、mir-28、mir-101、mir-124、mir-125a、mir-126、mir-132、mir-136、mir-147、mir-155、mir-182、mir-186、mir-202、mir-206、mir-216、mir-221、mir-224、mir-291、mir-292-3p、mir-297、mir-302、mir-337、mir-372、mir-373、およびmir-376bからなる群より選択される、請求項85記載の方法。
  87. miRNA分子が、癌治療薬から非癌細胞を保護し、かつmir-16、mir-24、mir-30a-3p、mir-125b、mir-152、mir-194、mir-197、mir-214、およびmir-331からなる群より選択される、請求項85記載の方法。
  88. 1）miR-21、miR-223、および/もしくはmir-342発現に対応する一つもしくは複数のmiRNA阻害剤；ならびに/または
    2）miR-95、miR-105、miR-137、miR-186、miR-188、miR-199、miR-211、miR-215、mu-miR-290、miR-301、および/もしくはmiR-331に対応する一つもしくは複数のmiRNA
    の有効量を被験体に投与する段階を含む、被験体における狼瘡を処置するための方法。
  89. 1）miR-7、miR-9-as、miR-16、miR-24、miR-26A、miR-27A、miR-130A、および/もしくはmiR-239発現に対応する一つもしくは複数のmiRNA阻害剤；ならびに/または
    2）miR-95および/もしくはmiR-135Aに対応する一つもしくは複数のmiRNA
    の有効量を被験体に投与する段階を含む、被験体におけるプリオン病を処置するための方法。
  90. 1）miR-28、miR-30A、miR-31、miR-138、miR-139、miR-140、miR-291-5P、および/もしくはmiR-298発現に対応する一つもしくは複数のmiRNA阻害剤；ならびに/または
    2）Let7F-2および/もしくはmiR-16に対応する一つもしくは複数のmiRNA
    の有効量を被験体に投与する段階を含む、被験体における虚血を予防するまたは処置するための方法。
  91. mir-192、mir-198、およびmir-199からなる群より選択される少なくとも一つのmiRNAの有効量を細胞に投与する段階を含む、細胞における形質転換を誘導するための方法。
  92. 細胞の内部にある場合にlet-7、miR-19a、miR-25、miR-96、miR-125a、miR-134、miR-148、miR-152、miR-206、miR-207、miR-210、miR-212、miR-216、miR-217、miR-218、miR-223、mu-miR-294、mu-miR-295、miR-301、miR-328、mu-miR-329、miR-339、miR-370、またはmiR-372の成熟miRNAにプロセスされることが可能な一つまたは複数の核酸の有効量を、細胞に提供するまたは導入する段階を含む、細胞におけるERKを活性化するための方法。
  93. 細胞の内部にある場合にmiR-15a、miR-16、miR-21、mir-24、miR-26a、miR-92、miR-105、miR-125a、miR-125b、miR-128、mir-147、miR-195、miR-207、miR-224、mu-miR-295、mir-301、miR-337、mir-368、またはmir-371の成熟miRNAにプロセスされることが可能な一つまたは複数の核酸の有効量を、細胞に導入する段階を含む、細胞におけるhTertを活性化するための方法。
  94. a）細胞に候補miRNAを細胞に導入する段階；
    b）miRNAを欠く細胞と比較して、hTertの発現または活性における低下が、hTert活性化遺伝子産物の潜在的な阻害剤としてmiRNAを同定する、細胞におけるhTert発現またはhTert活性のレベルをアッセイする段階
    を含む、hTert活性化遺伝子産物を阻害するmiRNAを同定するための方法。
  95. 候補miRNAの配列が、hTert活性化遺伝子産物を阻害する能力に対してあらかじめ評価された、請求項94記載の方法。
  96. hTert活性化遺伝子産物が、ACOX1、AKT1、APAF1、COX-5B、COX6、COX7B、CPOX、DUOX2、GPX1、GPX2、GPX4、LPO、MAPK1、MAPK4、MTCO1、NOX3、NOX5、PAOX、PPOX、PRKCA、PRKCD、およびTNFRSF6からなる群より選択される、請求項87.7記載の方法。
  97. miR-26a、miR-147、mir-195、およびmir-368からなる群より選択されるmiRNAの有効量を細胞に提供する段階を含む、細胞におけるhTertを阻害するための方法。
  98. mir-93、mir-100、mir-134、mir-99a、mir-103、mir-128、mir-129、mir-181b、mir-193、mir-197、mir-212、mir-218、mir-219、mir-302、mir-323、mir-324-3p、mir-325、mir-330、mir-331、mir-340、mmu-mir-350、mir-425、mir-491、mir-518f、およびmir-520a*からなる群より選択されるmiRNAの有効量を細胞に提供する段階を含む、細胞におけるStat3の刺激を阻害するための方法。
  99. 適した容器に少なくとも5つの請求項1記載のRNA分子を含む、miRNA分子を評価するためのキット。
  100. 適した容器に少なくとも5つのmiRNA阻害分子を含み、各々のmiRNA阻害分子は、成熟miRNAの5'〜3'配列と少なくとも90％相補的な5'〜3'配列を含み、かつ17〜25ヌクレオチド長である、miRNA分子を評価するためのキット。
  101. 適した容器に、
    a）5'から3'までの配列が成熟miRNA配列と同一であるmiRNA領域、および5'から3'までの配列がmiRNA配列と60％〜100％相補的である相補領域を含む、長さが17〜125残基の少なくとも一つの合成miRNA分子；ならびに
    b）成熟miRNAの5'〜3'配列と少なくとも90％相補的な5'〜3'配列を含む、17〜25ヌクレオチド長の少なくとも一つのmiRNA阻害剤
    を含む、キット。
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