CN112190592B - miRNA在制备防治骨关节炎药物的应用、miRNA高表达的外泌体和应用 - Google Patents

miRNA在制备防治骨关节炎药物的应用、miRNA高表达的外泌体和应用 Download PDF

Info

Publication number
CN112190592B
CN112190592B CN202010863064.XA CN202010863064A CN112190592B CN 112190592 B CN112190592 B CN 112190592B CN 202010863064 A CN202010863064 A CN 202010863064A CN 112190592 B CN112190592 B CN 112190592B
Authority
CN
China
Prior art keywords
artificial sequence
mir
application
mirna
exosome
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202010863064.XA
Other languages
English (en)
Other versions
CN112190592A (zh
Inventor
郝跃峰
杨兴
周静
许檬磊
耿德春
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Suzhou Municipal Hospital North District
Original Assignee
Suzhou Municipal Hospital North District
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Suzhou Municipal Hospital North District filed Critical Suzhou Municipal Hospital North District
Priority to CN202010863064.XA priority Critical patent/CN112190592B/zh
Publication of CN112190592A publication Critical patent/CN112190592A/zh
Priority to US17/347,867 priority patent/US20220062346A1/en
Application granted granted Critical
Publication of CN112190592B publication Critical patent/CN112190592B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/28—Bone marrow; Haematopoietic stem cells; Mesenchymal stem cells of any origin, e.g. adipose-derived stem cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
    • C12N5/0662—Stem cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
    • C12N5/0662—Stem cells
    • C12N5/0668—Mesenchymal stem cells from other natural sources
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/14—Type of nucleic acid interfering N.A.
    • C12N2310/141—MicroRNAs, miRNAs
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2320/00—Applications; Uses
    • C12N2320/30—Special therapeutic applications
    • C12N2320/32—Special delivery means, e.g. tissue-specific

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明涉及miRNA及外泌体领域，特别是涉及miRNA在制备防治骨关节炎药物的应用、miRNA高表达的外泌体和应用。本发明提供了一种miR‑155‑5p在制备预防和/或治疗骨关节炎的药物中的应用，所述miR‑155‑5p的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。本发明提供的应用能够有效提高miR‑155‑5p的表达，miR‑155‑5p通过靶向Runx2，可促进软骨细胞增殖、迁移、细胞外基质分泌并抑制细胞凋亡，进而起到预防或治疗骨关节炎的效果。

Description

miRNA在制备防治骨关节炎药物的应用、miRNA高表达的外泌 体和应用
技术领域
本发明涉及miRNA及外泌体领域，特别是涉及miR-155-5p在防治骨关节炎中的应用、miR-155-5p高表达的滑膜间充质干细胞来源的外泌体及其应用。
背景技术
骨关节炎(OA)是最常见的关节疾病之一，已成为老年人致残的主要原因。研究发现，创伤、机械负荷异常、缺乏营养、遗传倾向等多种因素可导致骨关节炎的发生。目前，骨关节炎的治疗仍有许多困难需要克服，因为大多数治疗骨关节炎的药物只能缓解关节疼痛，关节损伤尚未得到改善。
骨关节炎的发生主要与关节组织中软骨细胞数量减少、细胞凋亡增加和细胞外基质代谢紊乱有关。从骨关节炎的发病机制来看，探索治疗骨关节炎的方法一直是研究者探索新的治疗和预防方法的基础。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供了miRNA在制备防治骨关节炎药物的应用、miRNA高表达的外泌体和应用。本发明提供的miR-155-5p在制备防治骨关节炎药物中的应用为骨关节炎的防治提供了更为方便、可靠的新解决方案。
为了实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：
本发明提供了miR-155-5p在制备预防和/或治疗骨关节炎的药物中的应用，所述miR-155-5p的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
本发明提供了miR-155-5p在制备促进细胞增殖、迁移、抑制细胞凋亡和调节细胞外基质分泌的骨关节炎药物中的应用，所述miR-155-5p的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
本发明提供了miR-155-5p在制备通过靶向Runx2，促进细胞增殖、迁移、抑制细胞凋亡和调节细胞外基质分泌的骨关节炎药物中的应用，所述miR-155-5p的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
本发明提供了一种miR-155-5p高表达的滑膜间充质干细胞来源的外泌体，其特征在于，所述miR-155-5p高表达的滑膜间充质干细胞来源的外泌体过表达miR-155-5p。
本发明提供了一种上述miR-155-5p高表达的滑膜间充质干细胞来源的外泌体在制备预防和/或治疗骨关节炎药物中的应用。
本发明提供的miR-155-5p在防治骨关节炎中的应用能够有效提高miR-155-5p的表达，miR-155-5p通过靶向Runx2，可促进软骨细胞增殖、迁移、细胞外基质分泌并抑制细胞凋亡。由实施例可知，miR-155-5p高表达的滑膜间充质干细胞来源的外泌体能够减轻骨关节炎损伤并促进软骨再生。
附图说明
图1为滑膜间充质干细胞(SMSC)的图片；
图2为纯化的外泌体的图片，其中箭头指向的即为外泌体；
图3为外泌体已被软骨细胞内化的图片；
图4为miRNA-155-5p等在滑膜组织中表达的图片；
图5为miR-155-5p等在SMSC外泌体中表达的图片；
图6为SMSC-155-5p外泌体抑制软骨细胞凋亡的图片；
图7为SMSC-155-5p外泌体减轻软骨细胞退变的图片；
图8为软骨细胞迁移及软骨细胞迁移率的图片；其中左边为软骨细胞迁移的图片，其中右边的图片为迁移率的统计图片；
图9为CCK-8检测结果的图片；
图10为OARSI评分的图片；
图11为miR-155-5p抑制凋亡的蛋白质印记分析结果的图片；
图12为miR-155-5p增加OA软骨细胞ECM分泌的蛋白质印迹分析结果的图片。
具体实施方式
本发明提供了miR-155-5p在制备预防和/或治疗骨关节炎的药物中的应用，所述miR-155-5p的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示：CTGTTAATGCTAATCGTGATAGGGGTTTTTGCCTCCAACTGACTC CTACATATTAGCATTAACAG。
本发明还提供了所述miR-155-5p在制备促进细胞增殖、迁移、抑制细胞凋亡和调节细胞外基质分泌的骨关节炎药物中的应用，所述miR-155-5p的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
本发明还提供了所述miR-155-5p在制备通过靶向Runx2，促进细胞增殖、迁移、抑制细胞凋亡和调节细胞外基质分泌的骨关节炎药物中的应用，所述miR-155-5p的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。Runx2负责软骨细胞的增殖和分化，miR-155-5p和Runx2具有结合位点，miR-155-5p能够靶向结合并负向调节Runx2的表达，从而起到预防和/或治疗骨关节炎的效果。
本发明还提供了一种miR-155-5p高表达的滑膜间充质干细胞来源的外泌体，所述miR-155-5p高表达的滑膜间充质干细胞来源的外泌体过表达miR-155-5p。在本发明中，与滑膜间充质干细胞-外泌体(SMSC-Exos)中miR-155-5p的表达相比，本发明所述miR-155-5p高表达的滑膜间充质干细胞来源的外泌体(SMSC-155-5p-Exos)中miRC-155-5p的表达优选增加67倍。用SMSC-155-5p-Exos处理的软骨细胞中miR-155-5p的表达比未使用SMSC-155-5p-Exos处理的软骨细胞中的表达能够增加近40倍。
在本发明中，所述SMSC-155-5p-Exos的制备方法为常规制备方法，优选包括：从骨关节炎(Osteoarthritis，OA)全膝关节置换术患者的膝关节软骨中提取滑膜组织，剔除脂肪和部分结缔组织，剪碎后加入含有胶原酶Ⅱ、20％胎牛血清(FBS)的DMEM培养基，CO2培养箱中消化过夜；将细胞沉淀悬浮接种于60mm培养皿，24h后换液除去不贴壁细胞。每3天换液1次。在细胞生长至80％融合时传代，将细胞在37℃和5％二氧化碳的条件下，置于含有10％胎牛血清(FBS)、25μg/ml抗坏血酸2-磷酸和1％青霉素链霉素的DMEM培养基中培养，得到滑膜间充质干细胞(SMSC)。用
Figure BDA0002648818940000031
2000转染试剂在100nM浓度下培养SMSC并转染miR-155-5p模拟物，得到转染SMSC。对转染SMSC进行分离和浓缩处理得到SMSC-155-5p-Exos。
本发明提供了上述miR-155-5p高表达的滑膜间充质干细胞来源的外泌体在制备预防和/或治疗骨关节炎药物中的应用。SMSC-155-5p-Exos作为治疗OA的药物，方便且可靠。SMSC-155-5p-Exos的过表达能够减轻骨关节炎损伤并促进软骨再生，能够作为一种新型的治疗OA的治疗工具。
在本发明中，滑膜间充质干细胞(SMSC)如图1所示；纯化的外泌体如图2所示；外泌体已被软骨细胞内化的图片如图3所示。
为了进一步说明本发明，下面结合附图和实施例对本发明提供的miRNA在制备防治骨关节炎药物的应用、miRNA高表达的外泌体和应用进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
从骨关节炎全膝关节置换术患者的膝关节软骨中提取软骨组织，用胶原酶Ⅱ对软骨组织进行提取得到原代软骨细胞，将软骨细胞在37℃和5％二氧化碳的条件下，置于含有10％胎牛血清(FBS)、25μg/ml抗坏血酸2-磷酸和1％青霉素链霉素的DMEM培养基中培养，得到OA软骨细胞。用
Figure BDA0002648818940000041
2000转染试剂在100nM浓度下培养OA软骨细胞并转染miR-155-5p模拟物，得到转染软骨细胞。在SMSC中转染miR-155-5p模拟物，然后分离浓缩得到SMSC-155-5p-Exos。
分离浓缩的方法为：用不含血清的DMEM培养基培养转染软骨细胞，得到培养上清液；将所述培养上清液进行第一离心处理(离心力为1000r/min)后得到第一上清液，对第一上清进行第二离心处理(离心力为3000r/min)得到第二上清液；对第二上清液使用100kd超滤管进行超滤浓缩处理，得到超滤液；对超滤液进行第三离心处理(离心力为10000r/min)得到第三上清液，用0.22μm的过滤器对第三上清液进行过滤除菌处理，得到浓缩液；对浓缩液进行第四离心处理(离心力为100000r/min)得到，弃上清液即得SMSC-155-5p-Exos。
对比例1
人滑膜来源的间充质干细胞(Synovial mesenchymal stem cells，SMSCs)在含有10％FBS的DMEM培养基中孵育。在体外培养3d后，分离和浓缩细胞外泌体，分离提取外泌体的方法和实施例1的方法相同。所提取的滑膜间充质干细胞来源的外泌体(SMSC-Exos)具有相似大小的颗粒，平均大小为100nm，模态密度为1.0～1.2g/ml，外泌体相关标记包括CD63和CD81。
应用例1
取20只特异性无病原(SPF)BALB/C小鼠经5天适应性喂养后，随机分为4组：
1.正常组：不加冷水刺激，5只小鼠10个膝关节，n＝10；
2.OA组；将小鼠置于4℃冷水刺激2小时，每天2次，冷水刺激20天后关节腔注射生理盐水，连续注射2周，每天1次，制备OA小鼠模型；5只小鼠10个膝关节，n＝10；
3.OA+SMSC外泌体组：使用OA组相同的方法制备OA小鼠模型并给予关节腔注射对比例1提供的SMSC-Exos(30μL；1011外泌体颗粒/mL)连续注射2周，每天1次；5只小鼠10个膝关节，n＝10；
4.OA+SMSC-155-5p外泌体组：使用OA组相同的方法制备OA小鼠模型并给予关节腔注射实施例1提供的SMSC-155-5p-Exos(30μL；1011个外体颗粒/mL)连续注射2周，每天1次；5只小鼠10个膝关节，n＝10。
OA组、OA+SMSC外泌体组和OA+SMSC-155-5p外泌体组向小鼠关节腔注射生理盐水或外泌体2周后，取关节组织进行相关指标检测。
应用例2
取滑膜组织和SMSC-外泌体，根据说明书使用TRIzol试剂(购自Invitrogen)提取总RNA。利用人microRNAqRT-PCR检测试剂盒对miR-7a、miR-206、miR-320a、miR-155-5p等(GenScript；南京)进行了miRNAs的cDNA逆转录和qRT-PCR检测。miRNAs的序列(SEQ ID NO:2～43)见表1。用
Figure BDA0002648818940000051
Top Green qPCR SuperMix(TransgenBiotech)进行RT-PCR，GAPDH作为结果的内参标准。结果见图4和图5。其中图4为miRNA-155-5p等在滑膜组织中表达的图片，图5为miR-155-5p等在SMSC外泌体中相对表达量的柱状示意图。
表1 RT-PCR引物序列(SEQ ID NO:2～43)
Figure BDA0002648818940000061
由图4和5可知，miR-155-5p的表达量显著高于miR-7a、miR-206、miR-320a的表达量。
应用例3
用含有1％磷酸酶抑制剂、0.5％PMSF和0.1％蛋白酶抑制剂的裂解缓冲液(BC-WB-018；Biochannel，南京)从人软骨细胞中提取蛋白质。将煮沸的蛋白质(30μg)加入SDS-PAGE，转移到PVDF膜(Millipore，加利福尼亚州，美国)。抗Runx2(ab76956)、Caspase 3(ab13847)、Bax(ab32503)、Bcl-2(ab59348)、CoII(ab34712)、SOX9(ab3967)和GAPDH(SantaCruz Biotechnology，sc-137179)的抗体。按照制造商的说明书，用稀释比为1:1000的一抗在4℃下孵育过夜。然后，在室温下将膜与二抗(ab97091)孵育2小时，并用超信号West-Pico化学发光底物(Thermo-Fisher-Scientific)检测蛋白质。检测结果见图6和7。图6为SMSC-155-5p外泌体抑制软骨细胞凋亡的图片，图7为SMSC-155-5p外泌体减轻软骨细胞退变的图片。由图6和7可知miR-155-5p高表达的滑膜间充质干细胞来源的外泌体能够显著抑制软骨细胞的凋亡并减轻软骨细胞的退变。
应用例4
使用Transwell系统检测软骨细胞的迁移。将5×104个OA软骨细胞置入24孔transwell板(美国纽约州康宁市)的上腔。然后分别将对照组(无添加)、0.5％FBS和1％PS的500μL DMEM；SMSC外泌体、0.5％FBS和1％PS的500μL DMEM；SMSC-155-5p外泌体、0.5％FBS和1％PS的500μL DMEM；SMSC-155-5p外泌体+miR-155-5p抑制剂、0.5％FBS和1％PS的500μL DMEM加入下腔培养16h，然后用4％多聚甲醛固定上腔细胞20min，用0.5％苏木素伊红染色10min。删除未迁移到下表面的单元格后。以双盲法计算并评估各孔的细胞迁移率，结果见图8。图8左边为软骨细胞迁移的图片，右边的图片为迁移率的统计图片。由图8可知，本发明提供的SMSC-155-5p外泌体能够有效促进软骨细胞迁移。
应用例5
用CCK-8检测试剂盒检测人的软骨细胞增殖。用对照组(无添加)，SMSC外泌体，SMSC-155-5p外泌体，SMSC-155-5p外泌体+miR-155-5p抑制剂分别刺激人软骨细胞。6h后，将转染细胞接种于96孔板中，于37℃下5％CO2中孵育指定时间。每一份样品均分为三份进行分析。在0h、24h、48h、72h和96h测定细胞存活率。在450nm的多扫描GO微板阅读器(ThermoFisher Scientific，马萨诸塞州沃尔瑟姆，美国)上检测每个孔的光密度(OD)，检测结果如图9所示。图9为CCK-8检测结果的图片。由图9可知SMSC-155-5p-Exos能够有效提高人软骨细胞的存活率。
应用例6
取应用例1中1～4组的小鼠软骨组织用10％中性福尔马林(Sigma)固定过夜，用30％(v/v)缓冲甲酸脱钙。脱钙后，将样品脱水并包埋在石蜡中。5μm厚度连续切片，免疫组化检测CoII软骨基质蛋白、P65凋亡蛋白。随机取免疫组织化学照片，由2名三盲病理学家进行鉴定，并利用OARSI评分进行评分，OARSI评分结果见图10。
由图10可知，SMSC-155-5p-Exos对OA的预防作用比SMSC-Exos的更好。
应用例7
根据实施例1提供的制备方法，用
Figure BDA0002648818940000081
2000转染试剂在100nM浓度下培养OA软骨细胞并分别转染miR-7a模拟物、miR-206模拟物和miR-320a模拟物。并检测上述模拟物、空白对照组和实施例1转染后得到的软骨细胞，观察软骨细胞退变的变化，检测结果见图11、图12。图11为miR-155-5p抑制凋亡的蛋白质印记分析结果的图片，图12为miR-155-5p增加OA软骨细胞ECM分泌的蛋白质印迹分析结果的图片。由图11和图12可知，实施例1能够起到防止软骨细胞退化的技术效果。
由上述应用例可知，本发明提供的miRNA在制备防治骨关节炎药物的应用、miRNA高表达的外泌体和应用和应用能够减轻骨关节炎损伤并促进软骨再生，起到治疗和预防骨关节炎的技术效果。
虽然本发明已以较佳的实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可以做各种改动和修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
序列表
<110> 苏州市立医院（北区）
<120> miRNA在制备防治骨关节炎药物的应用、miRNA高表达的外泌体和应用
<160> 43
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 65
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ctgttaatgc taatcgtgat aggggttttt gcctccaact gactcctaca tattagcatt 60
aacag 65
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
aatcgccgta cccctacga 19
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gccctatatg agctcctgt 19
<210> 4
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
tacccgttgg ctccaggt 18
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
ccggtggttt tgtgacatcc 20
<210> 6
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
gctaagctta ctggttag 18
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
ccctcggtat ttacgccggt 20
<210> 8
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
gactaagcgc ctttcgta 18
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
aacgatggac gcccgtatcc 20
<210> 10
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
atgcctcgtt catcaagaa 19
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
tagtccccta acacattaag 20
<210> 12
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
attgcccccc gcaggacct 19
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
tgcgcttgaa acccgccagg 20
<210> 14
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
aattttgacc cgcaaggcc 19
<210> 15
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
tccaacgtag ctgtcctgct t 21
<210> 16
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
aaaagttccc gccctgtata 20
<210> 17
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
tgggctagca cccttcggac t 21
<210> 18
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
cccccgaggt tgccgaaatt 20
<210> 19
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
ttgaacaaat tggtccctta c 21
<210> 20
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
ccctccctaa ggttatttgc a 21
<210> 21
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
aatccggctc acccaattct g 21
<210> 22
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
gttccagccc ggcacaatcg 20
<210> 23
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
taagacgctt tcccggcgtg t 21
<210> 24
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
gacccgtggc ttaactgcca 20
<210> 25
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
tgggtcctgg ccccggattt c 21
<210> 26
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
taatacaggc cgggtcaaga 20
<210> 27
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
acggttcggt acccctatac g 21
<210> 28
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
gagactactg ctgtgggtaa g 21
<210> 29
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
cctttgttct taacccagtg a 21
<210> 30
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
ctcccaacgg tggcctcaat g 21
<210> 31
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 31
tggccagaat tccctgcagt a 21
<210> 32
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 32
tgggccacat cccggctgcg a 21
<210> 33
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 33
acccgtgaac tggccagcct a 21
<210> 34
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 34
tgttgcaccc ccagagcatt g 21
<210> 35
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 35
aaagctcccc ggacgttagt a 21
<210> 36
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 36
agaccgggga attgtgaggc c 21
<210> 37
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 37
tccttaaagg caccctcctg g 21
<210> 38
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 38
ttgcggccgt cccttacgat c 21
<210> 39
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 39
cgtgccctgg gcgtggtacc g 21
<210> 40
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 40
gttaagtgcg ttaagacccg t 21
<210> 41
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 41
cttgcccaac tcctccgtaa tg 22
<210> 42
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 42
tcggtaaccc gtgcgtgatt a 21
<210> 43
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 43
cggttgcctt caagcctgaa c 21

Claims (1)

1.miR-155-5p高表达的滑膜间充质干细胞来源的外泌体在制备预防和/或治疗骨关节炎药物中的应用；
所述miR-155-5p高表达的滑膜间充质干细胞来源的外泌体过表达miR-155-5p；
所述miR-155-5p的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
CN202010863064.XA 2020-08-25 2020-08-25 miRNA在制备防治骨关节炎药物的应用、miRNA高表达的外泌体和应用 Active CN112190592B (zh)

Priority Applications (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010863064.XA CN112190592B (zh) 2020-08-25 2020-08-25 miRNA在制备防治骨关节炎药物的应用、miRNA高表达的外泌体和应用
US17/347,867 US20220062346A1 (en) 2020-08-25 2021-06-15 USE OF miRNA IN PREPARATION OF A DRUG FOR PREVENTING AND TREATING OSTEOARTHRITIS, AN EXOSOME HIGHLY EXPRESSING miRNA AND USE THEREOF

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010863064.XA CN112190592B (zh) 2020-08-25 2020-08-25 miRNA在制备防治骨关节炎药物的应用、miRNA高表达的外泌体和应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN112190592A CN112190592A (zh) 2021-01-08
CN112190592B true CN112190592B (zh) 2022-03-11

Family

ID=74005020

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202010863064.XA Active CN112190592B (zh) 2020-08-25 2020-08-25 miRNA在制备防治骨关节炎药物的应用、miRNA高表达的外泌体和应用

Country Status (2)

Country Link
US (1) US20220062346A1 (zh)
CN (1) CN112190592B (zh)

Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113265459B (zh) * 2021-05-28 2022-05-17 沈阳体育学院 miRNA-601作为分子标记物在诊断和治疗骨关节炎中的应用
CN114404370B (zh) * 2021-12-13 2023-03-14 苏州市立医院 纳米脂肪功能化的可注射超润滑微球及其制备方法与应用
CN115896012A (zh) * 2022-08-31 2023-04-04 同济大学 携带miRNA抑制物的外泌体及其在制备治疗骨关节炎药物方面的应用
CN116286662A (zh) * 2023-02-24 2023-06-23 同济大学 同时携带miR-155-5p抑制物和miR-19b-3p的外泌体、其制备方法和应用
CN117821577B (zh) * 2023-10-19 2024-08-23 长沙干细胞与再生医学工业技术研究院有限公司 一种有效治疗卵巢功能减退的羊膜间充质干细胞的筛选方法

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108699603A (zh) * 2015-12-10 2018-10-23 维也纳自然资源与生命科学大学 用于诊断和治疗骨折和骨病的组合物和方法
WO2019016799A1 (en) * 2017-07-16 2019-01-24 Ramot At Tel-Aviv University Ltd. SECRETEOME OF HUMAN MUCOSAL MUCOSAL STEM CELLS
CN109666629A (zh) * 2017-10-13 2019-04-23 上海睿泰生物科技股份有限公司 人多能干细胞来源的外泌体、基于该外泌体的制剂及用途
CN110564852A (zh) * 2019-08-06 2019-12-13 中国医学科学院血液病医院(中国医学科学院血液学研究所) 与人类多发性骨髓瘤相关的miRNAs表达图谱模型、构建方法及应用

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DK2302055T3 (da) * 2004-11-12 2014-10-13 Asuragen Inc Fremgangsmåder og sammensætninger involverende miRNA og miRNA-inhibitormolekyler
WO2015007871A2 (en) * 2013-07-17 2015-01-22 Ospedale San Raffaele S.R.L. Micrornas and autoimmune-immune mediated inflammatory disease

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108699603A (zh) * 2015-12-10 2018-10-23 维也纳自然资源与生命科学大学 用于诊断和治疗骨折和骨病的组合物和方法
WO2019016799A1 (en) * 2017-07-16 2019-01-24 Ramot At Tel-Aviv University Ltd. SECRETEOME OF HUMAN MUCOSAL MUCOSAL STEM CELLS
CN109666629A (zh) * 2017-10-13 2019-04-23 上海睿泰生物科技股份有限公司 人多能干细胞来源的外泌体、基于该外泌体的制剂及用途
CN110564852A (zh) * 2019-08-06 2019-12-13 中国医学科学院血液病医院(中国医学科学院血液学研究所) 与人类多发性骨髓瘤相关的miRNAs表达图谱模型、构建方法及应用

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
miR-146a-5p expression is upregulated by the CXCR4 antagonist TN14003 and attenuates SDF-1-induced cartilage degradation;DI JIA等;《MOLECULAR MEDICINE REPORTS》;20190321;第2019卷(第19期);全文 *
MiR-155-5p improves knee osteoarthritis rats through SOCS1-STAT3 signaling pathway;Xifeng ZHANG等;《Panminerva Medica》;20200124;第63卷(第1期);标题 *
Synovial Fluid Exosomal MicroRNA Profiling of Osteoarthritis Patients and Identification of Synoviocyte-Chondrocyte Communication Pathway;Joseph Withrow等;《Annual Meeting Poster No. 1350》;20161231;第1、3段 *
Xifeng ZHANG等.MiR-155-5p improves knee osteoarthritis rats through SOCS1-STAT3 signaling pathway.《Panminerva Medica》.2020,第63卷(第1期), *

Also Published As

Publication number Publication date
US20220062346A1 (en) 2022-03-03
CN112190592A (zh) 2021-01-08

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN112190592B (zh) miRNA在制备防治骨关节炎药物的应用、miRNA高表达的外泌体和应用
KR102176845B1 (ko) 유도된 엑소좀을 포함하는 피부 재생 및 상처 치유용 조성물
KR101480362B1 (ko) Ｎｏｄ２의 아고니스트를 처리한 줄기세포 또는 그 배양물을 포함하는 면역질환 또는 염증질환의 예방 또는 치료용 약학조성물
KR102144593B1 (ko) 인간줄기세포 유래 엑소좀을 포함하는 세포 배양용 무혈청 배지 조성물
CN106929474B (zh) 一种m2巨噬细胞诱导剂
CN113197919B (zh) 鹿茸干细胞外泌体在制备改善或治疗骨关节炎和延缓细胞衰老的产品中的应用
CN113215094A (zh) 逆转2型糖尿病胰岛β细胞去分化的间充质干细胞外泌体及其制备方法和应用
JP2024116197A (ja) Ｍａｓｔ４遺伝子を利用した細胞外基質生産用組成物及びその製造方法
Sun et al. IL‐7 enhances the differentiation of adipose‐derived stem cells toward lymphatic endothelial cells through AKT signaling
CN113174363A (zh) 用于促进iPSC分化为胰岛素分泌细胞的混合物及其制备方法
KR102141095B1 (ko) Mmp2 유전자 발현 및 콜라겐 분해를 억제하는 조성물을 제조하기 위한 미모사 추출물의 용도
EP4070824A1 (en) Marine scaffolds for human tissue generation
CN114703126A (zh) 肌肉干细胞分离提取及新型水解物培养体系及其应用
CN113265437A (zh) 一种促进mc3t3-e1细胞增殖分化的海参蛋白肽的制备方法及应用
WO2020061500A1 (en) Use of chloroplasts for oxygen production in cell cultures
CN111286490A (zh) 构建肿瘤微环境体外模型的方法、由此构建的模型及用途
Xiong et al. Interferon‐γ Stimulates Interleukin‐27 Derived from Dendritic Cells to Regulate Th9 Differentiation through STAT1/3 Pathway
Zheng et al. Inhibition of miR‐let‐7i Induces DC Immature Cells and Improves Skin Graft Tolerance
KR20200001370A (ko) 지방줄기세포배양용 배지 조성물 제조방법, 지방줄기세포배양용 배지 조성물 제조방법과 줄기세포 유효성분 3저 추출법을 이용한 줄기세포파쇄추출물(쉘드줄기세포) 제조방법, 이를 이용한 항관절염 치료용 조성물, 이를 이용한 염증억제 효과를 갖는 조성물 및 세포재생 효과를 갖는 조성물
CN112458095B (zh) 调控ADSCs成骨分化及组织再生LMO3基因及其应用
Spector et al. Proliferation of macrophages in inflammation
KR102551398B1 (ko) 유자 추출물을 포함하는 줄기세포 유래 엑소좀 생성 촉진용 조성물
CN115991737B (zh) 活性肽在制备促进脐带造血干细胞增殖的药物或培养基中的应用
US20110223138A1 (en) Mesenchymal stem cells that express increased amounts of anti-apoptotic proteins
KR102094733B1 (ko) 닭 골수 유래 골·연골전구세포 배양액을 유효성분으로 포함하는 연골 분화 유도용 조성물

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant