CN113197919B - 鹿茸干细胞外泌体在制备改善或治疗骨关节炎和延缓细胞衰老的产品中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了鹿茸干细胞外泌体在制备改善或治疗骨关节炎和延缓细胞衰老的产品中的应用。本发明具体地公开了一种鹿茸来源的干细胞外泌体在制备预防、改善或治疗个体的骨关节炎的产品中的应用以及在制备延缓细胞衰老的产品中的应用。本发明鹿茸干细胞外泌体具有稳定的治疗效果，能够抑制或降低炎性因子的表达；增强关节炎小鼠的握力、恢复运动功能；增强关节区的骨密度、进而增强骨骼结构的机械能力、改善骨关节炎的症状；减轻关节区软骨损伤；有效促进软骨细胞的生长及分化、缓解软组织的破坏和损伤；从而有效地改善和治疗骨关节炎，并具有延缓体人间充质干细胞衰老的作用，不管是在骨关节炎治疗领域还是在化妆品领域，都具有广泛的应用前景。

Description

鹿茸干细胞外泌体在制备改善或治疗骨关节炎和延缓细胞衰 老的产品中的应用

技术领域

本发明涉及生物医药领域，具体地涉及鹿茸干细胞外泌体在制备改善或治疗骨关节炎和延缓细胞衰老的产品中的应用。

背景技术

干细胞耗竭是机体衰老的主要驱动因素之一，由此衍生出了干细胞移植治疗衰老相关疾病的方式。骨关节炎(osteoarthritis，OA)是一种常见的衰老相关疾病，其发病率随年龄增长而逐渐增加。伴随着衰老，关节内的多种细胞，如软骨细胞、滑膜细胞、间充质干细胞等均发生细胞衰老及功能退化。其中，间充质干细胞的衰老被认为是骨关节炎发病的重要诱因之一。间充质干细胞(Mesenchymal stem cells，MSCs)是存在于多种组织器官中具有多项分化潜能的成体干细胞，因其具有很好的免疫调节能力和较低的成瘤性，是干细胞移植领域使用较多的一种细胞类型。然而，较低的移植后存活率和存活时间严重限制了细胞移植在临床中的应用。随着研究深入，人们逐渐认识到间充质干细胞通过旁分泌产生的众多因子在细胞治疗中发挥了主要作用。外泌体(exosome)这一具有双层膜结构，包含众多蛋白、核酸，由细胞分泌并在细胞间交流中发挥重要作用的囊泡结构由此受到了研究者的关注。外泌体具有易于收集、易于存储和运输、质量可控、更易标准化等优点，当被移植到动物模型中时可以发挥类似间充质干细胞移植的治疗作用。然而，细胞分泌出的外泌体成分并不是一成不变的，而是会随着细胞状态等因素发生改变。当体外培养的间充质干细胞发生衰老或者干细胞捐赠者年龄较大时，由此而来的外泌体也会发生相应的功能降低。因此，寻找一种可大量稳定提供具有治疗作用的外泌体的细胞，是外泌体移植领域实现重大突破的关键问题。

鹿茸在传统中药中应用历史悠久，具有补益精血、增强筋骨的功效。鹿茸浸出物也被用来进行相关疾病的治疗。鹿茸干细胞(Antler stem cells，ASCs)是来自鹿茸骨膜的间充质干细胞，具有间充质干细胞的特征。研究发现来自鹿茸干细胞的条件培养基能够促进大鼠的皮肤损伤修复，提示鹿茸干细胞分泌因子的治疗作用。我们在前期工作中也发现，鹿茸干细胞在体外培养条件下具有更强的增殖能力，相对于一般间充质干细胞能连续传代至15代左右，鹿茸干细胞能传至55代而保持稳定的增殖能力。因此，鹿茸干细胞将有可能为治疗性外泌体提供稳定的来源，进一步探索鹿茸干细胞外泌体对衰老相关疾病的治疗机制和作用，研究和开发有效治疗骨关节炎的药物或产品具有重要的意义且具有强大的市场潜力。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是如何利用鹿茸干细胞外泌体来改善骨关节炎损伤及延缓人源间充质干细胞的衰老。所要解决的技术问题不限于如所描述的技术主题，本领域技术人员通过以下描述可以清楚地理解本文未提及的其它技术主题。

为解决上述技术问题，本发明首先提供了外泌体或其衍生品在制备预防、改善或治疗关节炎的产品中的应用，所述外泌体为鹿茸干细胞来源的外泌体。

进一步地，所述鹿茸干细胞可为鹿茸组织经预处理后获得的间充质干细胞。

所述外泌体具有延缓人源间充质干细胞衰老的作用。

上述应用中，所述外泌体衍生品包括对所述外泌体进行修饰加工或内容物纯化而获得的产品。

所述内容物为外泌体内容物，可为蛋白质、脂质或核酸。

进一步地，所述人源间充质干细胞可为体外培养的人源间充质干细胞。

进一步地，所述外泌体可以抑制或降低炎性因子的表达。

所述炎性因子可为参与炎症反应的各种细胞因子，具体可为IL-8、IL-1β、IFN-α、CCL20、CCL2或TNF-α。

上述应用中，所述关节炎可为骨关节炎。

上述应用中，所述关节炎可为继发性骨关节炎。

上述应用中，所述预防、改善或治疗关节炎的产品具有下述至少任一种功能：

B1.增强动物握力；

B2.增强动物关节区骨密度；

B3.减轻动物关节区软骨损伤；

B4.提高动物关节软骨再生能力；

B5.使动物关节区P16阳性细胞减少；

B6.使动物关节区Ki67阳性细胞增加。

所述动物可为哺乳动物，如人或鼠。

进一步地，所述预防、改善或治疗关节炎的产品可为药物或关节腔移植材料。

进一步地，所述药物可采用注射方式给药。

进一步地，所述注射方式为关节腔局部注射。

进一步地，所述注射剂量为1×10⁸个/10μl，注射体积为10微升。

进一步地，所述注射时长为8周，频率为每周1次。

本发明还提供了一种外泌体在制备延缓细胞衰老的产品中的应用，所述外泌体为鹿茸干细胞来源的外泌体。

上述应用中，所述细胞可为人源间充质干细胞。

上述应用中，所述延缓细胞衰老包括下述至少一种：

1)使细胞的单克隆形成能力增加；

2)使细胞周期S期细胞比例增加；

3)使Ki67阳性细胞比例增加；

4)SA-β-Gal染色阳性细胞比例减少；

5)使IL-8、IL-1β、IFN-α、CCL20、CCL2或TNF-α的表达水平降低。

进一步地，所述延缓细胞衰老的产品可为药物或化妆品。

进一步地，所述药物可以是用于治疗烧伤、烫伤、皮肤溃疡，再生健康皮肤的药物，但不限于此。

进一步地，所述化妆品可为精华液、眼霜、爽肤水、凝胶、面膜、护手霜，但不限于此。

本发明通过利用鹿茸干细胞外泌体对小鼠骨关节炎模型的干预以及体外培养条件下人源间充质干细胞的干预实验，证实了鹿茸干细胞来源的外泌体能够明显改善小鼠骨关节炎损伤及延缓人源间充质干细胞复制性衰老。所述鹿茸干细胞在人源间充质干细胞干预中作为添加剂，在关节炎治疗中作为关节腔移植材料。鹿茸干细胞外泌体的干预为延缓细胞衰老和骨关节炎的治疗提供了新的思路和理想移植材料，对于发展干细胞为基础的无细胞治疗具有重要意义。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

(1)为关节炎改善和治疗提供稳定来源的外泌体，所述外泌体的治疗效果更稳定。

(2)本发明的鹿茸干细胞外泌体能调控炎症反应，抑制或降低炎性因子的表达，使IL-8、IL-1β、IFN-α、CCL20、CCL2或TNF-α等炎性因子表达量显著下降，从而达到很好的抗炎效果。

(3)本发明的鹿茸干细胞外泌体可显著改善和缓解骨关节炎模型小鼠的相关症状，如增强小鼠的握力，恢复其运动功能；增强小鼠关节区的骨密度，进而增强骨骼结构的机械能力，改善骨关节炎的症状；减轻小鼠关节区软骨损伤；有效促进软骨细胞的生长及分化，缓解软组织的破坏和损伤。因此，本发明的鹿茸干细胞外泌体可以有效地改善或治疗骨关节炎，具有明显的改善和治疗骨关节炎作用。

(4)本发明的鹿茸干细胞外泌体还具有延缓体人源间充质干细胞衰老的作用，既可利用干细胞的分化和增殖的功能，又避免了伦理的限制，不管是在医疗界还是在美妆界，都具有广泛的应用前景。

附图说明

图中所标注Sham组为假手术对照组。所标注OA+Veh为治疗对照组，仅给予外泌体重悬所用等体积磷酸盐缓冲液治疗。所标注OA+Exo组为外泌体治疗组。所述治疗是指将10⁸个鹿茸干细胞外泌体重悬在10微升磷酸盐缓冲液中，用注射器注射到关节腔内。

图1为实施例1中的鹿茸干细胞外泌体NTA鉴定和透射电镜鉴定结果。

图2为实施例2中人源间充质干细胞的单克隆形成能力检测结果。Veh表示溶剂对照处理组，Exo表示外泌体处理组。左起第一和第二张图片是晚代(P12)人源间充质干细胞hPMSC(组织来源)，左起第三和第四张图片是晚代(P12)人源间充质干细胞hMSC(胚胎干细胞来源)。

图3为实施例2中人源MSC的细胞周期检测结果。Veh表示溶剂对照处理组，Exo表示外泌体处理组。

图4为实施例2中人源MSC的Ki67免疫荧光染色和统计结果。

图5为实施例2中人源MSC的SA-β-gal染色结果。

图6为实施例2中人源MSC的RT-qPCR检测结果。

图7为实施例2中人源MSC的WB检测结果。

图8为实施例2中人源MSC的异染色质相关蛋白LAP2和HP1α免疫荧光染色结果。

图9为实施例3中小鼠抓力测试结果。

图10为实施例3中小鼠microCT检测及骨密度统计结果。

图11为实施例3中小鼠骨关节番红固绿染色结果。

图12为实施例3中小鼠关节切片P16和Ki67的免疫组化染色结果。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

如无特殊说明，细胞培养环境均为37℃、5％CO₂。

下述实施例中的小鼠为维通利华公司产品。

下述实施例中的磷酸盐缓冲液是DPBS缓冲液，配制方法如下：购自lifetechnologies公司的DPBS粉末(货号：21600-069)溶解于去离子水中，定容为1L即成10×DPBS存储液。使用时按照存储液:去离子水＝1:10的比例稀释。

下述实施例中的鹿茸干细胞按照下述文献的方法制备：Hengxing Ba，DataoWang，Weiyao Wu，Hongmei Sun，Chunyi Li.Single-cell transcriptome provides novelinsights into antler stem cells，a cell type capable of mammalian organregeneration.Funct Integr Genomics.2019；19(4):555-564。

下述实施例中的人源间充质干细胞为晚代人源间充质干细胞，具体为人源间充质干细胞经过体外传代培养12代得到的人源间充质干细胞。人源间充质干细胞为两种，一种是组织(牙龈)分离得到的人源间充质干细胞(hPMSC)，另一种是由胚胎干细胞诱导分化而来的人源间充质干细胞(hMSC)。hMSC和hPMSC的制备方法参照文献：Chuqian Liang，Zunpeng Liu，Moshi Song，Wei Li，Zeming Wu，Zehua Wang，Qiaoran Wang，Si Wang，Kaowen Yan，Liang Sun，Tomoaki Hishida，Yanning Cai，Juan Carlos IzpisuaBelmonte，Pedro Guillen，Piu Chan，Qi Zhou，Weiqi Zhang，Jing Qu，Guang-HuiLiu.Stabilization of heterochromatin by CLOCK promotes stem cell rejuvenationand cartilage regeneration.Cell Res.2021；31(2):187-205。

下述实施例采用Prism 8.0统计软件对数据进行处理，实验结果以平均值±标准误表示，两组间比较采用双尾t检验，多组间比较采用One-way ANOVA加Dunnett检验，P＜0.05(*)表示具有显著性差异，P＜0.01(**)表示具有极显著性差异，P＜0.001(***)表示具有极显著性差异。

实施例1鹿茸干细胞外泌体的提取和鉴定

1、鹿茸干细胞培养

由梅花鹿的鹿茸中分离出的鹿茸干细胞在培养皿中37℃，5％CO₂培养箱孵育培养，所用的培养基为MSC培养基，成分包含MEMα基础培养基(Thermo Fisher Scientific)，10％胎牛血清(Thermo Fisher Scientific)，1％青霉素/链霉素(Thermo FisherScientific)，0.1mM NEAAs(MSC Thermo Fisher Scientific)，1ng/mL FGF2(JointProtein Central。胎牛血清在配制培养基之前需在4℃进行100,000×g离心16个小时去除外泌体，取上清备用。

2、鹿茸干细胞外泌体的提取

鹿茸干细胞长至80％汇合度时，更换新鲜培养基，继续培养48小时后收集条件培养基用于外泌体纯化。条件培养基经300×g离心10分钟后收集上清液继续1500×g离心20分钟，收集上清液进行0.22微米滤膜过滤。过滤后的滤液在超高速离心机中100,000×g离心120分钟收集外泌体沉淀，沉淀经1ml磷酸盐缓冲液重悬后100,000×g再次离心120分钟。该沉淀即为纯化的鹿茸干细胞外泌体。用磷酸盐缓冲液重悬鹿茸干细胞外泌体得到外泌体悬浮液，-80℃保存。进行下述实验。

3、鹿茸干细胞外泌体的鉴定

鹿茸干细胞外泌体鉴定采用纳米颗粒示踪技术(Nanoparticle Tracking Analysis，NTA)和负染色透射电镜观察。NTA检测显示所获鹿茸干细胞外泌体直径在100nm左右，符合外泌体粒径范围，负染色透射电镜显示所获得的外泌体呈杯状或球形形态(图1)。

实施例2鹿茸干细胞外泌体延缓人源间充质干细胞复制性衰老进程

1、单克隆形成能力检测

选取晚代(P12)人源间充质干细胞hMSC(胚胎干细胞来源)和晚代(P12)人源间充质干细胞hPMSC(组织来源)进行单克隆形成能力检测实验。hMSC和hPMSC细胞分别以3000个每孔的密度接种于胶原预包被的12孔培养板中。设置磷酸盐缓冲液处理组和外泌体处理组对细胞进行处理，每组3个孔，隔天换液并加处理。磷酸盐缓冲液处理组(Veh)：细胞在MEMα+PBS(向1ml实施例1中的MEMα基础培养基加10微升磷酸盐缓冲液得到的液体培养基)中在37℃，5％CO₂条件下培养，隔天更换MEMα+PBS的新鲜培养基，直至实验结束。外泌体处理组(Exo)：细胞在MEMα+Exo(向1ml实施例1中的MEMα基础培养基加10微升含外泌体磷酸盐缓冲液得到的液体培养基，MEMα+Exo中的外泌体含量为1×10⁸个/ml。其中，含外泌体磷酸盐缓冲液是用磷酸盐缓冲液重悬实施例1中的纯化的鹿茸干细胞外泌体得到的液体)中，在37℃，5％CO₂条件下培养，隔天更换MEMα+Exo的新鲜培养基，直至实验结束。

2周后取出培养板，PFA固定后进行结晶紫染色，并用ImageJ软件分析细胞密度，以磷酸盐缓冲液处理组的细胞密度为1。磷酸盐缓冲液处理组和外泌体处理组对比发现鹿茸干细胞外泌体处理组细胞明显多于磷酸盐缓冲液处理组(图2)，说明鹿茸干细胞外泌体能够显著促进人源间充质干细胞的增殖。

2、细胞周期检测

将hMSC和hPMSC分别以1×10⁵个/孔的密度接种在胶原包被的12孔板中。分别给予磷酸盐缓冲液或外泌体处理，磷酸盐缓冲液处理组(Veh)：细胞在MEMα+PBS(向1ml实施例1中的MEMα基础培养基加10微升磷酸盐缓冲液得到的液体培养基)中在37℃，5％CO₂条件下培养，隔天更换MEMα+PBS的新鲜培养基，直至实验结束。外泌体处理组(Exo)：细胞在MEMα+Exo(向1ml实施例1中的MEMα基础培养基加10微升含外泌体磷酸盐缓冲液得到的液体培养基，MEMα+Exo中的外泌体含量为1×10⁸个/ml。其中，含外泌体磷酸盐缓冲液是用磷酸盐缓冲液重悬实施例1中的纯化的鹿茸干细胞外泌体得到的液体)中，在37℃，5％CO₂条件下培养，隔天更换MEMα+Exo的新鲜培养基，直至实验结束。

在细胞汇合度达到80％时用tryple消化并收集细胞，分别得到磷酸盐缓冲液处理组的供试细胞和外泌体处理组的供试细胞这两种供试细胞。将这两种供试细胞用预冷的70％乙醇重悬，放在-20℃冰箱中固定过夜，PI染色后流式细胞仪检测。用ImageJ分析细胞周期各阶段细胞比例。结果显示，外泌体处理组的细胞中S期细胞比例明显增加(图3)，说明鹿茸干细胞外泌体处理增加了人源间充质干细胞的增殖能力。

3、细胞增殖相关标记物Ki67免疫荧光染色

以磷酸盐缓冲液或外泌体处理的人源间充质干细胞为供试细胞。通过免疫荧光染色对比步骤2的磷酸盐缓冲液处理组的供试细胞和外泌体处理组的供试细胞中Ki67阳性细胞比例(抗人Ki67抗体，abcam，货号：ab16667)。结果显示外泌体处理使人源间充质干细胞中Ki67阳性细胞比例明显增加(图4)，说明作为细胞分裂标记的Ki67蛋白质的表达增加了，鹿茸干细胞外泌体促进了人源间充质干细胞的增殖能力。

4、SA-β-Gal染色观察细胞衰老状况

SA-β-gal是衰老细胞的特征性分子标志物，是检测细胞衰老的“金标准”。β-半乳糖苷酶染色是一种基于衰老时SA-β-Gal(senescence-associated beta-galact osidase)活性水平上调而对衰老细胞或组织进行染色检测的方法。即细胞发生衰老时，SA-β-Gal的活性水平上调，可将X-Gal催化生成深蓝色产物，从而与未衰老细胞区分。以磷酸盐缓冲液或外泌体处理的人源间充质干细胞为供试细胞。对步骤2的磷酸盐缓冲液处理组的供试细胞和外泌体处理组的供试细胞进行SA-β-Gal染色，然后拍照并统计SA-β-Gal阳性细胞比例。结果显示，外泌体处理明显降低了细胞中SA-β-Gal阳性细胞比例(图5)，说明鹿茸干细胞外泌体的干预可延缓人源间充质干细胞的衰老。

5、衰老相关分子标志物检测

以磷酸盐缓冲液或外泌体处理的人源间充质干细胞为供试细胞。

1)RT-qPCR检测步骤2的磷酸盐缓冲液处理组的供试细胞和外泌体处理组的供试细胞中炎性因子IL-8、IL-1β、IFN-α、CCL20、CCL2或TNF-α的表达。结果提示外泌体处理降低了人源间充质干细胞中的炎性因子的表达(图6)，所用PCR检测引物见表1：

表1RT-qPCR检测供试细胞中炎性因子引物列表

2)P16和P21的western blot检测

P21、P16是调控细胞衰老的关键分子。收集步骤2的磷酸盐缓冲液处理组的供试细胞和外泌体处理组的供试细胞并提取蛋白，通过western blot检测细胞中P16和P21蛋白质表达水平。结果显示，外泌体处理显著降低了细胞中P16和P21蛋白表达水平(图7)。使用抗体信息见表2：

表2western blot检测抗体信息

3)免疫荧光检测细胞中异染色质蛋白LAP2和HP1α水平

步骤2的磷酸盐缓冲液处理组的供试细胞和外泌体处理组的供试细胞通过免疫荧光检测LAP2和HP1α表达情况，结果显示，外泌体处理使细胞中LAP2和HP1α表达水平极显著升高(图8)，说明鹿茸干细胞外泌体干预可以有效地稳定异染色质、延缓人源间充质干细胞的衰老。免疫荧光检测使用抗体情况如下：

表3免疫荧光检测抗体信息

实施例3鹿茸干细胞外泌体对骨关节炎的治疗作用

用C57BL/6J小鼠按照文献的方法建立小鼠骨关节炎模型。构建方法：“XiaoqingRen，Boqiang Hu，Moshi Song，Zhichao Ding，Yujiao Dang，Zunpeng Liu，Weiqi Zhang，Qianzhao Ji，Ruotong Ren，Jianjian Ding，Piu Chan，Changtao Jiang，Keqiong Ye，JingQu，Fuchou Tang，Guang-Hui Liu.Maintenance of Nucleolar Homeostasis by CBX4Alleviates Senescence and Osteoarthritis.Cell Rep.2019；26(13):3643-3656.”

体重20～25g，8周龄的骨关节炎模型小鼠随机分为三组，Sham组、OA+Veh组和OA+Exo组，每组15只。Sham组为假手术对照组。

术后一周，OA+Veh组和OA+Exo组开始向关节腔注射磷酸盐缓冲液或外泌体进行干预，干预间隔为每周一次，时长8周。8周后开始各项指标检测。OA+Veh组为治疗对照组，即每只小鼠仅给予关节腔内注射10微升外泌体重悬所用的PBS。OA+Exo组为外泌体治疗组，即每只小鼠关节腔内注射10微升实施例1的外泌体悬浮液，外泌体的注射剂量为1×10⁸个外泌体颗粒/只关节。

1、骨关节炎小鼠的握力检测

小鼠关节损伤会造成握力降低。我们通过握力检测实验发现OA+Veh组小鼠的握力明显低于Sham组小鼠，OA+Exo组小鼠的握力较OA+Veh组有明显提升(图9)，说明鹿茸干细胞外泌体可以明显改善和恢复骨关节炎小鼠的运动能力。

2、micro-CT检测小鼠关节骨密度

利用micro-CT(PE公司)检测观察小鼠关节的微结构，检测小鼠关节处的骨密度。OA+Veh组小鼠关节处出现了明显的损伤性空洞，骨密度降低，OA+Exo组小鼠关节骨损伤明显减轻，骨密度增加(图10)，说明鹿茸干细胞外泌体可以增强骨骼结构的机械能力，改善骨关节炎的症状。

3、小鼠关节的软骨组织染色

小鼠骨关节炎的表型之一是关节处软骨细胞的减少。在实验终点(注射后的第9周)处死小鼠，取膝关节进行软骨的石蜡切片染色。

(1)取膝关节，将肌肉和脂肪剥离干净。

(2)用4％多聚甲醛固定72小时。

(3)用甲酸脱钙液进行脱钙处理，时间为7天。

(4)脱钙完全后，进行脱水，石蜡包埋，切片(切片厚度为5μm)。

(5)对切片进行脱蜡，复水。

(6)用铁苏木素(中杉金桥，ZLI-9610)染色8分钟，流水冲洗2分钟。

(7)用0.02％快绿(Sigma，S2255)染色8分钟，1％醋酸快速漂洗15秒。

(8)用0.1％番红O(Sigma，F7252)染色5分钟。

(9)脱水，封片，镜下观察。

结果显示，OA+Veh组小鼠关节中软骨损伤，OARIS评分较高。OA+Exo组的软骨损伤比OA+Veh组明显减轻(图11)，说明鹿茸干细胞外泌体可有效减轻小鼠关节区的软骨损伤。OARIS的评分参照文献：Jiangyi Wu，Liang Kuang，Cheng Chen，Junjun Yang，Wei-NanZeng，Tao Li，Hao Chen，Shu Huang，Zhenlan Fu，Jiamiao Li，Renfeng Liu，Zhenhong Ni，Lin Chen，Liu Yang.miR-100-5p-abundant exosomes derived from infrapatellar fatpad MSCs protect articular cartilage and ameliorate gait abnormalities viainhibition of mTOR in osteoarthritis.Biomaterials.2019；206:87-100.。具体评分如下：0＝正常软骨；0.5＝无结构变化的藏红O损失；1＝无软骨丢失的小纤维；2＝垂直裂缝向下延伸至表层正下方的层和一些表层损失；3＝垂直裂缝/钙化软骨侵蚀，延伸至<25％的关节面；4＝垂直裂缝/钙化软骨侵蚀，延伸至关节面的25-50％；5＝垂直裂缝/钙化软骨侵蚀，延伸至关节面的50-75％；6＝垂直裂缝/钙化软骨侵蚀，延伸超过关节面75％。

4、小鼠关节中P16和Ki67染色

骨关节炎的发病机制是关节软骨的磨损及损伤后修复能力减弱，与关节软骨衰老和再生能力减弱密切相关。p16是重要的细胞周期调控因子，p16的高表达对关节软骨细胞的老化和骨关节炎的病理过程有推助作用。Ki67反应细胞增殖情况，Ki67的表达与细胞增殖活性密切相关。Ki67的高表达说明细胞增殖活跃。

免疫组化检测模型小鼠关节中Ki67阳性细胞比例和P16阳性细胞比例，从而检测软骨细胞中的细胞增殖和细胞凋亡情况。使用抗体信息如表4：

表4免疫组化检测抗体信息

结果显示，OA+Veh组小鼠关节中Ki67阳性细胞比例明显减少，P16阳性细胞明显增加，而经过外泌体治疗的OA+Exo组与OA+Veh组相比，Ki67阳性细胞比例明显增加，说明鹿茸干细胞外泌体能够有效促进软骨细胞的生长及分化，缓解软组织的破坏和损伤。而P16阳性细胞明显减少，说明鹿茸干细胞外泌体能够降低P16的表达，抑制骨关节炎软骨细胞的过度凋亡(图12)。

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

Claims (3)

1.外泌体在制备改善或治疗骨关节炎的药物中的应用，所述外泌体为鹿茸干细胞来源的外泌体；

所述外泌体的制备方法如下：

由梅花鹿的鹿茸中分离出的鹿茸干细胞在培养皿中37℃，5% CO₂培养箱孵育培养，所用的培养基为MSC培养基，成分包含MEMα基础培养基、10％胎牛血清、1％青霉素/链霉素、0.1mM NEAAs、1 ng/mL FGF2；所述胎牛血清在配制培养基之前需在4℃进行100,000×g离心16个小时去除外泌体，取上清备用；

鹿茸干细胞长至80%汇合度时，更换新鲜培养基，继续培养48小时后收集条件培养基用于外泌体纯化；条件培养基经300×g离心10分钟后收集上清液继续1500×g离心20分钟，收集上清液进行0.22微米滤膜过滤；过滤后的滤液在超高速离心机中100,000×g离心120分钟收集外泌体沉淀，沉淀经1ml磷酸盐缓冲液重悬后100,000×g再次离心120分钟；该沉淀即为纯化的鹿茸干细胞外泌体。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述关节炎为继发性骨关节炎。

3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述改善或治疗骨关节炎的药物具有下述至少任一种功能：

B1.增强动物握力；

B2.增强动物关节区骨密度；

B3.减轻动物关节区软骨损伤；

B4.提高动物关节软骨再生能力；

B5.使动物关节区P16阳性细胞减少；

B6.使动物关节区Ki67阳性细胞增加。

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