CN109777770B - 一种外泌体及其制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

一种外泌体及其制备方法与应用，涉及外泌体医药领域。针对如何解决术后认知功能障碍的问题，本发明从鹿茸组织中分离获得间充质干细胞；经培养后，收集细胞培养液，经分离提取鹿茸间充质干细胞来源的外泌体。经证实，能够减轻CPB大鼠神经功能损伤、氧化应激反应，对CPB大鼠神经元凋亡具有保护作用，还可以通过TLR2/TLR4信号通路缓解CPB大鼠POCD。本发明可用于制备改善或治疗认知功能障碍药物。

Description

一种外泌体及其制备方法与应用

技术领域

本发明涉及外泌体医药领域，具体涉及一种外泌体及其制备方法与应用。

背景技术

随着体外循环(cardiopulmonary bypass，CPB)技术、麻醉技术的迅猛发展，后中枢神经系统并发症引起的死亡率却有所上升，术后认知功能障碍(post operativecognitive dysfunction，POCD)是体外循环心脏手术的严重并发症，而CPB引发的炎症反应则是促发POCD的主要因素。因此如何预防和治疗CPB心脏手术促发的POCD已成为困扰心脏外科发展的一个难题。

目前在治疗疾病上所使用的间充质干细胞均来源于人的不同组织，如，骨髓，脐带和脂肪。但是，目前研究表明此三种类型的细胞在治疗老年神经退行性疾病上均不具有专一性。另外，这三种干细胞组织来源不广泛，无法保证样品的同一性。

发明内容

针对如何解决术后认知功能障碍的问题，本发明提供了一种外泌体，所述外泌体为鹿茸间充质干细胞来源的外泌体。

本发明还提供了一种外泌体的制备方法，包括如下步骤：

1)鹿茸间充质干细胞的原代分离和培养：将鹿茸组织经预处理后，获取间充质区，分离获得间充质干细胞；

2)鹿茸间充质干细胞外泌体的提取：将步骤1)中获得的间充质干细胞经培养后，收集细胞培养液，经分离提取得到外泌体。

进一步地限定，步骤1)所述鹿茸组织为新鲜鹿茸的尖部组织。

进一步地限定，步骤1)所述预处理是指将鹿茸组织去除残血，纵向切成4半，依次经75％的酒精溶液、磷酸缓冲盐溶液PBS清洗；将清洗后的鹿茸剥离真皮层，然后经磷酸缓冲盐溶液PBS清洗后，用含10％胎牛血清和双抗的高糖培养基清洗；所述双抗是指终浓度为100U/mL青霉素和终浓度为100μg/mL链霉素。

进一步地限定，步骤1)所述间充质干细胞的分离方法为：

①鹿茸间充质干细胞的原代分离：将预处理后的间充质区切碎成沫状放入到含有双抗的低糖培养基里，加入磷酸缓冲盐溶液PBS或低糖培养基，1000×g离心8min，离心弃上清，然后用磷酸缓冲盐溶液PBS清洗沉淀，获得鹿茸间充质区组织团；所述双抗是指终浓度为100U/mL的青霉素和终浓度为100μg/mL链霉素；

②鹿茸间充质干细胞的消化：向鹿茸间充质区组织团加入组织团体积4到5倍的终浓度为0.075g/mL胶原酶I溶液，37℃，消化3-6h；

③铺板：加入磷酸缓冲盐溶液PBS或者低糖培养基中止消化，然后离心，弃上清，用磷酸缓冲盐溶液PBS清洗沉淀后弃废液，用含有10％胎牛血清的DMEM/F12培养基悬浮沉淀，然后铺板，每2天换液，鹿茸间充质干细胞培养达到融合度达到80％即可。

进一步地限定，步骤2)所述间充质干细胞采用胰酶消化法体外培养。

进一步地限定，步骤2)所述体外培养，方法如下：将鹿茸间充质干细胞加入到含有10％无外泌体胎牛血清DMEM/F12培养基中，在37℃和5％CO₂条件下，培养48h，收集含鹿间充质干细胞外泌体的粗液。

进一步地限定，步骤2)所述分离提取的方法如下：以200mL含鹿茸间充质干细胞外泌体的粗液计，将含鹿茸间充质干细胞外泌体的粗液经300×g离心10min，取上清；再经2,000×g离心10min，取上清；然后经10000×g离心30min，取上清，用0.22μm滤器进行过滤；获得的滤液经120,000×g离心90min，然后将离心获得的上清缓慢吸出，当上清与管底距离0.5cm时加入1mL PBS，进行吹打，再次将吹打形成的混合液经120,000×g离心90min，弃去上清，向离心管中加入100mL PBS，静置10min，0.22μm滤器进行过滤，获得鹿茸间充质干细胞来源的外泌体。

本发明还提供了上述方法制备获得的外泌体在制备改善或治疗认知功能障碍药物中的应用。

进一步地限定，所述认知功能障碍包括术后认知功能障碍或因老年神经退行性疾病引起的认知功能障碍。

有益效果

鹿茸是鹿的附属器官，每年都可以再生，是哺乳动物唯一可以完全再生的器官，且锯口处不会留下疤痕。鹿茸间充质干细胞更是具有抗炎、促进组织愈合、神经、血管、皮肤修复和再生等功能。与其他类型干细胞相比，非常具有专一性，来源非常广泛，并可以人为控制其生长时间和发育阶段，能够保证细胞来源组织的同一性。

本发明通过实验证明鹿茸间充质干细胞的外泌体具有如下活性：

1)减轻CPB大鼠神经功能损伤；

2)改善CPB大鼠脑损伤；

3)抑制CPB大鼠炎症和氧化应激反应；

4)改善CPB大鼠神经元凋亡；

5)通过TLR2/TLR4信号通路缓解CPB大鼠POCD。

综上，鹿茸间充质干细胞来源的外泌体具有解决术后认知功能障碍因老年神经退行性疾病引起的认知功能障碍的作用，可用于制备改善或治疗认知功能障碍药物。

附图说明

图1鹿茸间充质干细胞的培养及外泌体的鉴定，其中，A：培养3天后鹿茸间充质干细胞图；B：培养7天后鹿茸间充质干细胞图；C：P5代鹿茸间充质干细胞图；D：鹿茸间充质干细胞外泌体粒径分布情况；E：鹿茸间充质干细胞外泌体电镜结果；F：鹿茸间充质干细胞外泌体表面标记蛋白鉴定，其中AMSCs为鹿茸间充质细胞，Exosome为外泌体，Supernatant代表细胞培养基上清；

图2鹿茸间充质干细胞外泌体对体外循环大鼠的神经损伤的抑制作用。其中，A：CPB大鼠神经功能评分；B：找到平台潜伏期；C：大鼠的游泳距离和时间；*表示P＜0.05；

图3鹿茸间充质干细胞外泌体对CPB大鼠脑损伤的改善。其中，A：HE染色结果(Scale bar＝50μm)；B：ELISA方法检测脑损伤标记物；*代表P＜0.05；

图4鹿茸间充质干细胞外泌体对CPB大鼠的氧化应激反应的抑制作用。其中，A：ELISA检测炎症因子；B：ELISA检测氧化应激因子；*表示P＜0.05；

图5鹿茸间充质干细胞外泌体对CPB大鼠神经元细胞凋亡的抑制作用。其中，A：TUNEL检测各组神经凋亡；B：通过Western blot检测凋亡相关蛋白表达情况；*表示P＜0.05，Merge代表合并后的图像；

图6鹿茸间充质干细胞外泌体对由CPB导致的POCD的改善。其中，A：通过Westernblot检测各组脑部海马区中TLR2,TLR4,MyD88和NF-KB表达情况；B：通过qRT-PCR检测各组脑部海马区中TLR2,TLR4,MyD88和NF-KB表达情况；C：通过免疫荧光方法检测各组脑部海马区中TLR2,TLR4,MyD88和NF-KB表达情况；(Scale bar＝50μm)；*表示(P＜0.05)，Merge代表合并后的图像。

具体实施方式

本发明所使用的试剂、试剂盒、仪器、设备等如无特殊说明，均可通过商业化途径购买获得。

本发明中所涉及的RNA提取、PCR扩增、Western blot等实验或检测方法如无特殊说明均为本领域常规的实验方法，或参照相应的试剂盒或产品说明书进行。

其中：

10％胎牛血清是指胎牛血清在相应培养基中的体积分数为10％；

75％酒精溶液是指体积分数为75％的酒精溶液；

5％CO₂是指培养箱中CO₂体积分数为5％；

高糖培养基：购买自康宁，货号10-017-CVR；

低糖培养基：购买自GIBCO，货号11885-084；

10％胎牛血清：购买自BI，货号04-001-1A；

10％无外泌体胎牛血清：购买自Viva Cell Biocsiences，货号Y181113；

DMEM/F12:购买自康宁，货号10-092-CVR；

1％盐酸酒精：75％酒精99mL加浓盐酸1mL配制而成；

SPF级SD雄性大鼠：购买自辽宁长生生物有限公司。

CPB：体外循环。术前实验动物禁食6h，戊巴比妥钠30mg/kg腹腔注射麻醉，待大鼠翻正反射消失后固定于手术台上，气管插管，连接小动物呼吸机，持续监测心电图、血氧饱和度和体温。左股动脉穿刺置管，连接动脉套件后测实时动脉压；左股静脉留置针，持续泵注胶体；尾动脉留置针管，CPB灌注备用；右颈内静脉置管引流。循环预充液共配置15mL，由6mL羟乙基淀粉、1mL肝素(含量250IU/kg)、1ml(质量分数)5％碳酸氢钠溶液、1mL(体积分数)20％甘露醇溶液、1mL呋塞米。给予6mL预充液组成各管道连接并固定。CPB过程中实时调节流量，维持贮血器中血液量1～2ml，体外循环流量不小于80mL/kg﹒min，CPB 1h后，恢复机械通气。红细胞比容(Hct)达0.25以上，逐步减流量并停机。依次拔除心脏内各管道，持续机械通气，缓慢输注贮血器中的余血。待大鼠恢复自主呼吸后拔出气管插管。

SOD：超氧化物歧化酶。

MDA：丙二醛。

GSH：谷胱甘肽。

NO：一氧化氮。

PBS：磷酸缓冲液，购买自康宁，货号R21-031-CVD。

实施例1.鹿茸间充质干细胞来源的外泌体制备方法。

1.鹿茸间充质干细胞的原代分离和培养：将鹿茸组织经预处理后，获取间充质区，分离获得间充质干细胞。方法如下：

预处理：在春末夏初时，采集新鲜鹿茸。首先，将锯下来的鹿茸里面的血液挤出，然后用锡纸包裹起来，再用棉花包裹，放到有冰盒的泡沫箱里。切取鹿茸尖部组织大约5cm长，然后挤血，然后切成4半(纵向)，随后用75％酒精洗3遍，每次2分钟，最后用PBS洗3遍。然后，将处理好的鹿茸放到超净台里剥离真皮层，然后用PBS洗3遍，用含10％胎牛血清和双抗(终浓度为100U/mL青霉素和终浓度为100μg/mL链霉素)的高糖培养基洗3遍，分离获得间充质区。

然后分离间充质干细胞，具体方法如下：

①鹿茸间充质干细胞的原代分离：将预处理后的间充质区放入含有双抗的低糖培养基里(终浓度为100U/mL的青霉素和终浓度为100μg/mL链霉素)，切碎成2cm³大小沫状，然后放到50mL离心管里，用PBS或低糖培养基加到30mL，离心1000×g 8min，离心弃上清，然后PBS清洗沉淀3遍，获得鹿茸间充质区组织团。

②鹿茸间充质干细胞的消化

PBS清洗后离心弃上清，向鹿茸间充质区组织团加入大约为组织团体积的4到5倍的终浓度为0.075g/ml胶原酶I溶液，消化3到6h，37℃观察，期间30min摇晃一次。

③铺板：加入PBS或者低糖培养基中止消化，然后离心，弃上清，用磷酸缓冲盐溶液PBS清洗沉淀后1000×g离心5min,弃去废液,重复清洗3次，用含有10％胎牛血清的DMEM/F12培养基悬浮沉淀，然后铺板，每2天换液，待显微镜下观察，鹿茸间充质干细胞培养达到融合度达到80％冻存即可。

2.鹿茸间充质干细胞外泌体的提取：将步骤1)中获得的间充质干细胞经培养后，收集细胞培养液，经分离提取得到外泌体。方法如下：

①鹿茸间充质干细胞(AMSCs)培养

采用胰酶消化法体外培养鹿茸间充质干细胞：每175cm²培养瓶用5mL磷酸缓冲盐溶液PBS清洗5秒，5mL质量分数0.25％胰酶于37℃培养箱中消化2分钟，使用5mL10％胎牛血清DMEM/F12培养基终止消化。

显微镜下可看到正常状态下的鹿茸间充质干细胞培养3天后，细胞形态均匀，大部分呈长梭形、少数呈三角形或多角形，胞质均匀透明(图1中A所示)，细胞培养7d后长至融合，融合后的细胞呈单层排列(图1中B所示)。细胞在5代(即P5)内，细胞形态均匀，排列紧密，呈梭形，少数呈三角形或多角形。传5代后，部分细胞形态有所改变，主要表现为细胞伸展变得扁平，细胞突起增多，细胞排列不紧密(图1中C所示)。

②外泌体的提取

将AMSCs接种于含有10％无外泌体胎牛血清DMEM/F12培养基中，培养在175cm²细胞培养瓶中，在37℃和体积分数5％CO₂环境的培养箱中，当细胞在培养瓶中培养48小时后，收集细胞上清(即含鹿茸间充质干细胞外泌体的粗液)。

取200ml含鹿茸间充质干细胞外泌体的粗液，300×g离心10min，取上清；2000×g离心10min，取上清；10000×g离心30min，取上清；上清用0.22μm滤器进行过滤；上清(获得的滤液)在超速离心机中120000×g离心90min；将超速离心管中的上清缓慢吸出，当上清与管低距离0.5cm时候加入1mLPBS将管底仔细进行吹打。再次将吹打形成的混合液在超速离心机中120000×g离心90min，弃去上清，向离心管中加入100mLPBS，静置10min，0.22μm滤器进行过滤，获得鹿茸间充质干细胞来源的外泌体，保存在-80℃冰箱中。

鹿茸间充质干细胞(AMSCs)外泌体形态和表型的鉴定：

首先，利用Flow NanoAnalyzer model type N30仪器对外泌体的粒径进行测定，结果表明，外泌体的颗粒直径在50-150nm范围内，平均粒径为72.6nm(图1中D所示)。然后，使用透射电镜观察外泌体形态，大小不等，呈50-100nm左右具有脂质双分子层球体结构(图1中E所示)。最后，采用Western blotting方法检测外泌体表面标志物CD9和CD63的蛋白水平，结果表明，这两种标志物均可在鹿茸间充质干细胞外泌体中检测到(图1中F所示)。

实施例2.鹿茸间充质干细胞(AMSCs)外泌体在治疗认知功能障碍的作用。

以小鼠为实验对象，考察实施例1制备的鹿茸间充质干细胞(AMSCs)外泌体在治疗认知功能障碍中的作用。

一、实验动物与分组：

SPF级SD雄性大鼠40只，体重350～450g，将大鼠随机分为4组，每组10只，分别为：假手术组(Sham组)、CPB手术组(CPB组)、外泌体+CPB组(EXO组)和外泌体+TLR2/TLR4抑制剂组(TLR组)，除Sham组外，均通过CPB转流术制备CPB大鼠POCD模型。

CPB模型的制备：

术前实验动物禁食6h，戊巴比妥钠30mg/kg腹腔注射麻醉，待大鼠翻正反射消失后固定于手术台上，气管插管，连接小动物呼吸机，持续监测心电图、血氧饱和度和体温。左股动脉穿刺置管，连接动脉套件后测实时动脉压；左股静脉留置针，持续泵注胶体；尾动脉留置针管，CPB灌注备用；右颈内静脉置管引流。循环预充液共配置15mL，由6mL羟乙基淀粉、1mL肝素(含量250IU/kg)、1mL(质量分数)5％碳酸氢钠溶液、1mL(体积分数)20％甘露醇溶液、1mL呋塞米。给予6mL预充液组成各管道连接并固定。CPB过程中实时调节流量，维持贮血器中血液量1～2mL，体外循环流量不小于80mL/kg﹒min，CPB 1h后，恢复机械通气。红细胞比容(Hct)达0.25以上，逐步减流量并停机。依次拔除心脏内各管道，持续机械通气，缓慢输注贮血器中的余血。待大鼠恢复自主呼吸后拔出气管插管。

EXO组，转流前30min给予提取的鹿茸间充质干细胞外泌体2.1mg/kg腹腔注射。

TLR组，转流前30min尾静脉注射TLR2抑制剂(T2.5)0.12mg/kg+TLR4抑制剂(TAK-242)(0.5mg/kg)。

二、实验内容：

下述各实验结果采用SPSS19.0(SPSS，Chicago，IL，USA)软件进行统计学分析，计量资料以均数±标准差

表示，两组间比较采用t检验分析，以P<0.05表示为差异有统计学意义。

(一)水迷宫

CPB转流术24h后，连续7天进行水迷宫测试，包括隐蔽站台试验和空间探索试验。隐蔽站台试验，将实验鼠从任意象限面向池壁放入水中，让其自由游泳90s来寻找隐藏的站台。记录其寻找池中隐僻平台的时间，即逃避潜伏期。如果达到90s仍未找到平台，则引导其于平台上，本次成绩计为90s。连续测试5天，前4天作为获得性训练，淘汰成绩为90s的大鼠，取第5天的测试成绩作为动物的空间学习记忆成绩。空间探索试验，隐蔽站台试验结束24h后，撤除站台。选相同入水点将大鼠放入水中，记录大鼠在60s内的游泳路径，记录鼠在原站台象限的停留时间和穿越原站台次数。记录大鼠运动轨迹并采用Morris水迷宫视频分析系统进行信息处理。

CPB转流术后7天水迷宫实验采集数据完毕后，将大鼠麻醉置管，经右境内静脉取血5ml，离心法分离出血清，-80℃保存待测；立即取双侧海马组织，一侧置于-80℃冰箱保存待测；另一侧置于福尔马林中浸泡。

(二)神经功能评分

CPB转流术1d、3d、7d后，应用Garcia评分量表检测实验动物的神经功能情况。

表1 Garcia评分标准

(三)HE染色(苏木精-伊红染色)

将福尔马林中固定的组织样本，分别置于70％、80％、90％、95％、100％不同浓度酒精中，二甲苯透明，浸蜡、包埋成蜡块，切片机器将其切成4μm切片而后脱蜡，苏木精染色5分钟，PBS清洗，1％盐酸酒精分化，伊红染液30秒，70％、80％、90％、95％、100％不同浓度酒精进行梯度酒精脱水、透明处理，中性树胶封片，光镜下观察各组组织的病理变化。

(四)Tunel染色

使用原位细胞死亡检测试剂盒(Roche Diagnostics，Mannheim，Germany)按照产品说明书操作：将石蜡包埋的海马组织的5μm切片脱蜡，通透并封闭。将切片用50μLTUNEL反应溶液处理，并在37℃的潮湿黑暗箱中温育60分钟。随后，将50μL streptavidin-HRP工作液加入切片中，在暗盒中再次孵育30分钟，DAPI染色细胞核荧光染色，随后进行常规脱水，脱色和固定。用显微镜检查切片并拍摄图像。对于每个捕获的图像，计数总核数和TUNEL阳性细胞核数，并且计算凋亡比例。

(五)ELISA检测

应用ELISA试剂盒检测大鼠血清中炎症因子IL-1β(CSB-E08055r，CUSABIO)、IL-6(SEA079Ra，USCN)、TNF-α(SEA133Si，USCN)、IL-10(SEA056Ra，USCN)，氧化应激指标SOD(SES134Hu，USCN)、MDA(CEA597Ge，USCN)、GSH(CEA294Ge，USCN)、NO(IS100，USCN)，脑损伤标记物S-100β(SEA567Ra，USCN)和NSE(SEA537Ra，USCN)的表达，操作步骤按说明书进行：将试剂盒平衡至室温后取出所需反应板，在相应反应板孔中先后加入100uL标准品和l00uL稀释后标本，将其轻轻摇晃30s，使之混和均匀，在室温中温育20min；洗板机清洗反应板，每孔中加入100ul血清样本，37℃温育2h；洗板，每孔加入l00uL HRP标记二抗，37℃温育30min；洗板，加显色液A和显色液B，各50uL，避光显色15min；加50uL终止液，酶标仪(EXL808，美国)读取450nmOD值；以OD值为纵坐标，以标准品浓度为横坐标，绘制标准曲线，并求出曲线方程和r值(相关系数)；根据曲线方程求出样品所对应的浓度值。

(六)免疫荧光

将海马组织蜡块切片脱蜡至水后，浸于(体积分数)3％过氧化氢溶液中15min后，PBS清洗切片，0.1M的枸橼酸钠溶液进行抗原修复；山羊血清封闭，37℃孵育30min，倾去血清，勿洗；加入TLR2(Abcam,ab16894)、TLR4(Abcam,ab22048)、MyD88(Abcam,ab28763)、NF-KB(Abcam,ab16502)抗体，4℃孵育过夜；PBS清洗切片，加入荧光标记的二抗，37℃孵育30min后，PBS清洗切片；加入DAPI染细胞核，室温孵育10min；PBS清洗，中性树脂封片，荧光显微镜下观察。

(七)Western blot法

分别将外泌体和海马组织匀浆后，加入预冷的RIPA(Thermo,89900)裂解液，冰上裂解30min，收集上清液，使用BCA(Thermo,23225)蛋白定量试剂盒对收集的蛋白液进行浓度测定，SDS-PAGE电泳蛋白后进行转膜，在外泌体组织中加入CD9(Abcam,ab92726)、CD63(Abcam,ab59479)，海马组织中加入TLR2、TLR4、MyD88、NF-KB，Bc12(Abcam,ab59348)，Bax(Abcam,ab32503)、pro-Caspase3(Abcam,ab32150)和cleaved Caspase3(Abcam,ab49822)一抗，4℃孵育过夜，PBS清洗PVDF膜后，加二抗，室温孵育2小时后，ECL发光试剂盒显色，凝胶成像系统成像，Quantity One软件读取灰度值。

(八)PCR检测

取冰冻的脑组织，加入Trizol(Invitrogen,15596026)溶液中，按照Trizol试剂操作说明书进行分离提取组织和细胞中的总RNA，反转录合成第一链cDNA(Thermo,K1622)后，按照qRT-PCR(Qiagen,204057)法检测TLR2、TLR4、MyD88、NF-KB反应参照试剂盒操作说明书配制，引物序列详见表2，由上海生工生物公司进行合成。反应条件为预变性:95℃30s；PCR反应:95℃5s,60℃20s，循环40次；融解曲线分析:95℃1s,65℃15s,95℃5s。反应结束后确认扩增曲线和融解曲线。

表2 定量PCR引物序列

三、实验结果

1.外泌体能够减轻CPB大鼠神经功能损伤

CPB能够引起POCD为代表的神经、精神障碍性表现，给予CPB大鼠注射外泌体，观察神经功能评分及空间学习记忆能力的改变。建立的CPB大鼠神经功能评分为2.7±0.6，与Sham组相比显著下降(P＜0.05)，在给予外泌体后，神经功能评分有所提升至8.5±2.1(vs.CPB组，P＜0.05)，TLR组神经功能评分与CPB组相似(P>0.05)(图2中A所示)。水迷宫能够反映大鼠认知功能，通过隐藏平台训练试验和空间探索实验对个组大鼠认知功能进行检测，结果在隐藏平台训练试验中,CPB组大鼠找到平台的潜伏期较Sham组而言明显延长(P<0.05)；而与CPB组相比，EXO组大鼠找到平台的潜伏期明显缩短(P<0.05)，相反，TLR组大鼠找到平台的潜伏期则与CPB组相近(P>0.05)(图2中B所示)。

在空间探索实验中,CPB组大鼠与Sham组大鼠相比，在目标象限的游泳距离和停留时间明显减少(P<0.05)；EXO组大鼠比CPB组大鼠在目标象限的游泳距离和停留时间明显增加(P<0.05)，而TLR组大鼠在目标象限的游泳距离和停留时间与CPB组大鼠相近(P>0.05)(图2中C所示)。提示鹿茸间充质干细胞外泌体能够减轻CPB大鼠神经功能损伤。

2.外泌体能够改善CPB大鼠脑损伤

CPB可以导致大鼠POCD的产生，在体外循环检测水迷宫后取脑组织，通过HE观察其组织病理学变化(图3中A所示)。结果表明：CPB大鼠海马损伤严重，细胞分散，细胞间隙逐渐扩大，细胞和血管增生逐渐增多，组织结构紊乱，排列不规则。相比CPB组，外泌体细胞排列整齐，细胞带不完整，TLR组损伤情况与CPB组相似，细胞分布不均匀，细胞稀疏，胞质内不均匀空泡逐渐增多。

结果说明，体外循环大鼠海马组织损伤严重，给予鹿茸充质干细胞来源的外泌体可改善海马组织损伤。为了验证CPB大鼠海马损伤程度，通过ELISA检测脑损伤标志物(图3中B所示)。结果表明,在CPB组中血清NSE和S-100β浓度相比于Sham组显著增加(P<0.05)，外泌体组中血清NSE和S-100β浓度显著低于CPB组(P<0.05)，但是，在TLR和CPB组中血清NSE和S-100-β浓度基本没有差异(P>0.05)。

3.鹿茸间充质细胞外泌体能够抑制CPB大鼠炎症和氧化应激反应

CPB引起的炎症反应是引起POCD的主要原因。研究发现POCD是一种典型的中枢神经系统功能障碍，其发生、发展和结局与炎症反应密切相关。采用ELISA法检测大鼠血清中的炎症因子和氧化应激因子，结果表明，与sham组相比，CPB组中IL-1β,IL-6和TNF-α显著升高，IL-10显著下降(P<0.05)，此结果说明CPB能够导致大鼠的炎症反应。

在外泌体处理组中IL-1β,IL-6和TNF-α水平显著低于CPB组(P<0.05)，IL-10显著高于CPB组(P<0.05)(图4中A所示)，此结果说明鹿茸间充质外泌体能够抑制CPB大鼠的炎症反应。另外，在CPB组的血清中的SOD和NO浓度显著低于Sham组，而MDA显著升高(P<0.05)。而外泌体组中SOD和NO浓度显著高于CPB组，而MDA显著降低(P<0.05)(图4中B所示)，此结果说明鹿茸间充质外泌体能够减轻CPB大鼠的氧化应激反应。

4.鹿茸间充质细胞外泌体能够改善CPB大鼠神经元凋亡

研究表明POCD可引起脑神经元凋亡，采用TUNEL方法检测脑组织神经元凋亡(图5中A所示)，以及采用Western blot方法检测凋亡相关蛋白表达(图5中B所示)。TUNEL结果显示，与Sham组相比，CPB组阳性细胞数量明显增加(P<0.05)。另外，EXO组海马区中阳性细胞数量明显低于CPB组(P<0.05)，而TLR组中海马区阳性细胞数量明显多于EXO组(P<0.05)。说明鹿茸间充质干细胞外泌体对CPB大鼠神经元凋亡具有保护作用。

同样，Western Blot结果显示，与Sham组相比，CPB组中Bcl-2表达明显下降，Bax明显升高(P<0.05)；与CPB组相比，外泌体组中Bcl-2表达明显升高，Bax明显下降(P<0.05)；而与外泌体组相比，TLR组Bcl-2表达明显下降，Bax明显升高(P<0.05)。此外，CPB组中pro-caspase-3表达明显下降，cleaved caspase-3表达显著上升(vs.Sham，p＜0.05)；EXO组的pro-caspase-3表达显著升高，而cleaved caspase3表达显著下降(vs.CPB，P＜0.05)；TLR组的pro-caspase-3表达显著下降，而cleaved caspase3表达显著升高(vs.EXO，P＜0.05)。此结果表明，鹿茸间充质细胞外泌体可以抑制CPB大鼠的神经元凋亡、防止神经元变性。

5.鹿茸间充质细胞外泌体对CPB大鼠TLR2/TLR4信号通路相关蛋白表达的影响TLR2/TLR4信号通路

Toll样受体作为跨膜信号受体的一种，在CPB大鼠的炎症反应和免疫反应中发挥着重要作用。因此，采用Western blot检测各组大鼠海马组织中TLR2、TLR4、MyD88和NF-KB的表达水平(图6中A所示)。结果显示，CPB组海马区TLR2、TLR4、MyD88、NF-KB水平明显高于假手术组(P＜0.05)；而在外泌体组海马区的TLR2、TLR4、MyD88、NF-KB水平明显低于CPB组(P＜0.05)(图6中A所示)。以上结果说明鹿茸间充质干细胞外泌体可以逆转CPB大鼠TLR2/TLR4信号通路相关蛋白的表达，此结果通过免疫荧光进一步被证实(图6中B所示)。以上结果表明，鹿茸间充质干细胞外泌体可以通过TLR2/TLR4信号通路缓解CPB大鼠POCD。

6.鹿茸间充质细胞来源外泌体通过TLR2/TLR4信号通路改善CPB致大鼠POCD

通过抑制TLR2/TLR4信号通路来阐明鹿茸间充质干细胞外泌体能够改善CPB大鼠的POCD作用机制。使用Western blot(图6中A所示)、qRT-PCR(图6中B所示)和免疫荧光(图6中C所示)检测各组海马的TLR2、TLR4、MyD88和NF-KB。结果表明外泌体组中TLR2、TLR4、MyD88和NF-KB均显著低于CPB组(P＜0.05)；而TLR组中的TLR2、TLR4、MyD88和NF-KB也均显著低于CPB组(P＜0.05)。另外，qRT-PCR结果显示，TLR2、TLR4、MyD88和NF-KB mRNA的表达变化也表现出上述变化。最终，免疫荧光进一步证实了这一结果。可见，鹿茸间充质干细胞外泌体可以通过TLR2/TLR4信号通路缓解CPB大鼠POCD。

核苷酸序列表

<110> 中国农业科学院特产研究所

<120> 一种外泌体及其制备方法与应用

<130>

<160> 10

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> TLR2上游引物

<400> 1

cggaggtcat ctcaggaagg 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> TLR2下游引物

<400> 2

gatcagcaga gtggcaatag 20

<210> 3

<211> 18

<212> DNA

<213> TLR4上游引物

<400> 3

aagggcttct actcagag 18

<210> 4

<211> 18

<212> DNA

<213> TLR4下游引物

<400> 4

aggacccaca tgggcact 18

<210> 5

<211> 18

<212> DNA

<213> MyD88上游引物

<400> 5

gtagccagcc tctgaaac 18

<210> 6

<211> 18

<212> DNA

<213> MyD88下游引物

<400> 6

agccaggatg atgtctac 18

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> NF-KB上游引物

<400> 7

tttcaaaagt ggcattgctt 20

<210> 8

<211> 18

<212> DNA

<213> NF-KB下游引物

<400> 8

ttaagctgta aaatcaca 18

<210> 9

<211> 17

<212> DNA

<213> GAPDH上游引物

<400> 9

gtcatcaacg ggaaacc 17

<210> 10

<211> 17

<212> DNA

<213> GAPDH下游引物

<400> 10

catggagaag gctgggg 17

Claims (3)

1.一种外泌体在制备改善或治疗认知功能障碍药物中的应用，其特征在于，所述外泌体的制备方法包括如下步骤：

1）鹿茸间充质干细胞的原代分离和培养：将鹿茸组织经预处理后，获取间充质区，分离获得间充质干细胞；所述鹿茸组织为新鲜鹿茸的尖部组织；

所述预处理是指将鹿茸组织去除残血，纵向切成4半，依次经75%酒精溶液、磷酸缓冲盐溶液PBS清洗；将清洗后的鹿茸剥离真皮层，然后经磷酸缓冲盐溶液PBS清洗后，用含10%胎牛血清和双抗的高糖培养基清洗；所述双抗是指终浓度为100U/mL青霉素和终浓度为100µg/mL链霉素；

所述间充质干细胞的分离方法为：

①鹿茸间充质干细胞的原代分离：将预处理后的间充质区切碎成沫状放入到含有双抗的低糖培养基里，加入磷酸缓冲盐溶液PBS或低糖培养基，1000×g离心8min，离心弃上清，然后用磷酸缓冲盐溶液PBS清洗沉淀，获得鹿茸间充质区组织团；所述双抗是指终浓度为100U/mL的青霉素和终浓度为100µg/mL链霉素；

②鹿茸间充质干细胞的消化：向鹿茸间充质区组织团加入组织团体积4到5倍的终浓度为0.075g/mL胶原酶I溶液，37℃，消化3-6h；

③铺板：加入磷酸缓冲盐溶液PBS或者低糖培养基中止消化，然后离心，弃上清，用磷酸缓冲盐溶液PBS清洗沉淀后弃废液，用含有10%胎牛血清的DMEM/F12培养基悬浮沉淀，然后铺板，每2天换液，鹿茸间充质干细胞培养达到融合度达到80%即可；

2）鹿茸间充质干细胞外泌体的提取：将步骤1）中获得的间充质干细胞经培养后，收集细胞培养液，经分离提取得到外泌体；

所述间充质干细胞采用胰酶消化法体外培养，具体是将鹿茸间充质干细胞加入到含有10%无外泌体胎牛血清DMEM/F12培养基中，在37℃和5%CO2条件下，培养48h，收集含鹿茸间充质干细胞外泌体的粗液。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，步骤2）所述分离提取的方法如下：以200mL含鹿茸间充质干细胞外泌体的粗液计，将含鹿茸间充质干细胞外泌体的粗液经300×g离心10min，取上清；再经2,000×g离心10min，取上清；然后经10000×g离心30min，取上清，用0.22µm滤器进行过滤；获得的滤液经120,000×g离心90min，然后将离心获得的上清缓慢吸出，当上清与管底距离0.5cm时加入1mLPBS，进行吹打，再次将吹打形成的混合液经120,000×g离心90min，弃去上清，向离心管中加入100mLPBS，静置10min，0.22µm滤器进行过滤，获得鹿茸间充质干细胞来源的外泌体。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述认知功能障碍包括术后认知功能障碍或因老年神经退行性疾病引起的认知功能障碍。

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