CN115487203A - miRNA-142a-5p在制备干预或治疗视网膜色素变性的药物中的应用 - Google Patents

miRNA-142a-5p在制备干预或治疗视网膜色素变性的药物中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种miRNA‑142a‑5p在制备干预或治疗视网膜色素变性的生物药物中的应用，旨在解决视网膜色素变性病变难以干预治疗的技术问题。本发明研究发现miRNA‑142a‑5p直接参与rd1小鼠视网膜色素变性的过程，下调miRNA‑142a‑5p的表达能明显延缓视网膜色素变性的病理过程，其为逆转视网膜色素变性提供了表观遗传学潜在的精准治疗靶点；进一步构建获得敲减miRNA‑142a‑5p的scAAV病毒载体，其用于视网膜下腔注射，能够显著延缓视网膜色素变性过程。

Description

miRNA-142a-5p在制备干预或治疗视网膜色素变性的药物中 的应用
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及一种miRNA-142a-5p在制备干预或治疗视网膜色素变性的药物中的应用。
背景技术
视觉是人类感受外界信息的主要途径之一，视网膜在视觉形成过程中扮演着重要的角色。视网膜主要由感光细胞、双极细胞、水平细胞、神经节细胞、无长突细胞、Müller细胞和小胶质细胞等组成。视网膜感光细胞将光能转化为膜电位变化，从而改变神经递质（谷氨酸）的释放，将信号经双极细胞、神经节细胞传递至大脑皮质的视觉中枢形成视觉，Müller细胞和小胶质细胞主要维持视网膜代谢和稳态的平衡。
视网膜色素变性（Retinitis pigmentosa，RP）是一种以视网膜感光细胞功能丧失为主要特征的遗传性致盲性眼病，全球发病率为1/3000。RP主要是由基因突变引起的，磷酸二酯酶 β亚单位（Phosphodiesteraseβ subunit，PDE6B）是其突变基因之一。其遗传方式主要包括常染色体隐性遗传、常染色体显性遗传和X连锁隐性遗传。RP患者首先出现的症状是夜盲，随后中心视力丧失，最终失明，患者多在40岁之前发病。临床上，一部分患儿因先天性常染色体隐性遗传，出生时或出生后一年内视网膜视锥和视杆细胞迅速出现进行性变性，导致严重的视功能丧失，为导致儿童先天性盲目的主要疾病之一，发病率占10～20%。在典型的RP中，视杆细胞先发生变性，视杆细胞死亡后引起视网膜中氧含量增加，产生大量氧自由基，从而导致视锥细胞氧化损伤最终死亡，继之造成视网膜色素上皮细胞死亡。另外视杆细胞可以产生视杆源性的视锥细胞活力因子（Rod-derived cone viability factor，RdCVF），而RdCVF介导的葡萄糖摄取刺激有氧糖酵解促进视锥细胞存活。视杆细胞变性死亡后，视网膜中RdCVF分泌减少加快视锥细胞的死亡进程。RP引起的失明给患者的生活造成了诸多困惑和痛苦，迄今为止，临床上尚未找到有效的治疗方法。
公开于该背景技术部分的信息仅用于加深对本公开的背景技术的理解，而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成本领域技术人员所公知的现有技术。
发明内容
miRNA是长度约为21-25nt的内源性非编码小RNA分子，由高等真核生物基因组编码产生，在动物中普遍表达，其表达具有时序性和组织特异性，并能精细地调控基因的表达。miRNA在维持视网膜细胞稳态、细胞功能和生存中发挥着重要的作用。miRNA的生物合成包括以下几个过程：①特定基因在RNA聚合酶Ⅱ的催化作用下，转录产生miRNA的初级前体（Primary miRNA，Pri-miRNA），随后被RNA聚合酶Ⅲ（RNA polymerase III，RnaseⅢ）Drosha和双链RNA结合蛋白DGCR8加工成miRNA前体（Precursor miRNA， Pre-miRNA）；②随后转运蛋白Exportin5将pre-miRNA从细胞质转运到细胞核中；③在细胞质中，Dicer酶将pre-miRNA进一步加工，产生miRNA/miRNA*双链分子，加工后的miRNA通过参与合成RNA诱导沉默复合体（RNA-induced silencing complex，RISC）发挥作用，其沉默基因的方式有两种：一是抑制mRNA的翻译；二是降解mRNA。miRNA不参与编码蛋白质，是基因表达的重要调节因子，通过与靶mRNA互补来发挥沉默基因表达的作用。
发明人通过进一步地研究发现，miRNA-142a-5p能够直接参与rd1小鼠视网膜色素变性的过程，敲低miRNA-142a-5p的表达，显著增加rd1小鼠视网膜外核层的厚度，明显延缓rd1小鼠视网膜色素变性的病理过程，增加视网膜的视功能，miRNA-142a-5p为逆转视网膜色素变性提供了表观遗传学潜在的精准治疗靶点。
由此，本申请公开了将miRNA-142a-5p或其片段应用于干预或治疗视网膜色素变性的药物的制备。
根据本公开的另一个方面，提供一种干预或治疗视网膜色素变性的生物制剂，其为能抑制或下调miRNA-142a-5p表达的载体。
在本公开的一些实施例中，所述载体含有mmu-miRNA-142a-5p或其片段。
根据本公开的另一个方面，提供一种用于治疗视网膜色素变性的载体的制备方法，包括如下步骤：
（1）将mmu-miRNA-142a-5p片段克隆到H13782 pscAAV-U6-shRNA-CMV-EGFP-tWPA腺相关病毒载体中，形成重组表达质粒；
（2）将所述重组表达质粒和pAAV-RC共转染进AAV-293细胞，然后从被转染的AAV-293细胞中回收AAV病毒颗粒，再经离心、浓缩、纯化，得到目的AAV病毒颗粒；包装病毒血清为AAV2/5。
在本公开的一些实施例中，所述mmu-miRNA-142a-5p片段序列为：CAUAAAGUAGAAAGCACUACU。
本申请实施例中提供的一个或多个技术方案，至少具有如下任一技术效果或优点：
1. 研究发现miRNA-142a-5p直接参与rd1小鼠视网膜色素变性的病理过程，下调视网膜内miRNA-142a-5p的表达，能明显延缓视网膜色素变性过程，其为逆转视网膜色素变性提供了表观遗传学潜在的精准治疗靶点。
2. 构建获得敲减miRNA-142a-5p的scAAV病毒载体，用于视网膜下腔注射，能够延缓视网膜色素变性的病理过程。
附图说明
图1为本申请一实施例的 rd1小鼠不同日龄及相应正常对照组的视网膜组织HE染色：A为正常对照组小鼠视网膜全周图；B为正常对照组小鼠视网膜分层标记和结构组成；C为不同日龄（P8-P35）的rd1小鼠和相应正常对照组小鼠视网膜组织学变化；D为不同日龄rd1小鼠组及相应正常对照组的视网膜ONL厚度统计学分析；不同日龄rd1小鼠组和对照组小鼠分别与各自前一日龄比较，双因素方差分析，**** P < 0.0001；线段表示两组相互比较，非配对t检验，# P < 0.05，#### P < 0.0001。
图2为本申请一实施例的视网膜电图检测结果：A-B为rd1小鼠和正常对照组小鼠不同时间点暗适应3.0 最大混合反应和暗适应0.01反应ERG；C-D为rd1小鼠和正常对照组小鼠不同时间点暗适应3.0 最大混合反应a波、b波振幅统计图； E为rd1小鼠和正常对照组小鼠不同时间点暗适应0.01 反应b波振幅统计图；不同日龄rd1小鼠组和正常对照组小鼠分别与各自前一日龄比较，双因素方差分析，**** P< 0.0001；线段表示两组相互比较，非配对t检验，# P < 0.05，#### P < 0.0001。
图3为本申请一实施例的rd1小鼠TUNEL细胞凋亡检测结果：rd1小鼠出生第6、8、10、12、14、16、18、21天的rd1小鼠视网膜组织切片TUNEL染色。蓝色为DAPI染色；绿色为TUNEL阳性染色。
图4为本申请一实施例的视觉行为学-黑白箱行为学改变：A为rd1小鼠和正常对照组小鼠不同时间点在黑白箱内观测10 min后的轨迹图及密度图；B为各组小鼠在白箱中停留时间与在黑箱中停留时间百分比；C为各组小鼠从黑箱到白箱次数统计图；不同日龄rd1小鼠组和正常对照组小鼠分别与各自前一日龄比较，双因素方差分析，**** P < 0.0001；线段表示两组相互比较，非配对t检验，# P < 0.05，#### P < 0.0001。
图5为本申请一实施例的小鼠旷场视觉行为学改变：A为rd1小鼠和正常对照组小鼠不同时间点在旷场内观测10 min后的轨迹图及密度图；B为总活动距离统计图；C为中心区域停留时间占总活动时间的百分比的统计图；D为进入中心区域次数统计图；不同日龄rd1小鼠组和正常对照组小鼠分别与各自前一日龄比较，双因素方差分析，**** P <0.0001；线段表示两组相互比较，非配对t检验，# P < 0.05，#### P < 0.0001。
图6 为本申请一实施例的各样本间的Pearson相关性分析及聚类分析：A为样本聚类热图；B为各样本间的Pearson相关性分析。
图7 为本申请一实施例的差异性miRNA的聚类分析：A为出生第9天的rd1小鼠组和正常对照组间差异表达miRNA聚类热图；B为出生第14天的rd1小鼠组和正常对照组间差异表达miRNA聚类热图；C为出生第14天的rd1小鼠组和出生第9天的rd1小鼠组间差异表达miRNA聚类热图。
图8为本申请一实施例的差异miRNA靶基因GO富集柱状图：A-B分别为出生第9天rd1小鼠和正常对照组相比上调miRNA和下调miRNA的靶标基因的GO富集柱状图；C-D分别为出生第14天rd1小鼠和正常对照组相比上调miRNA和下调miRNA的靶标基因的GO富集柱状图；E-F分别为出生第9、14天rd1小鼠相比上调miRNA和下调miRNA的靶标基因的GO富集柱状图。
图9为本申请一实施例的RP相关的差异miRNA的潜在靶标基因。
图10为本申请一实施例的视网膜变性相关的差异miRNA的验证：A-C和D-F分别为出生第14天和第9天的rd1小鼠视网膜中miRNA-142a-5p、miRNA-653-5p和miRNA-25-3p的表达水平统计图；G-I和J-L分别为出生第14天和第9天的rd1小鼠视网膜中miRNA-223-3p、miRNA-124-3p和miRNA-351-3p的表达水平统计图；与正常对照组（C57BL/6J）相比，非配对t检验，* P < 0.05，***P < 0.001。
图11为本申请一实施例的载体图谱：H13782为插入目的基因前的空载体图谱，Y18294为插入目的基因mmu-miRNA-142a-5p后的全载体图谱。
图12 为本申请一实施例的腺相关病毒转染位置确认和转染情况：A和C分别显示视网膜下腔注射后EGFP在视网膜全周的表达情况；B和D分别显示EGFP在视网膜外核层局部的表达部位。
图13为本申请一实施例的敲低miRNA-142a-5p延缓rd1小鼠视网膜色素变性过程：A为miRNA-142a-5p病毒载体视网膜下腔注射rd1小鼠视网膜外核层明显增厚；B为q-PCR检测结果miRNA-142a-5p病毒注射与注射空载病毒注射组相比，miRNA-142a-5p表达水平明显降低为85%；C-D为miRNA-142a-5p病毒注射组比空载病毒注射组相比，ERG具有显著性统计学差异。
具体实施方式
以下实施例中所述涉及的主要实验材料及实验方法：
1. 实验动物
动物处理和动物实验是根据ARVO眼科和视力研究中使用动物的声明进行的，符合我国《实验动物管理条例》，并获得郑州大学生命科学动物伦理审查委员会批准（伦理号ZZUIRB2021-076）。SPF级健康成年C57BL/6J小鼠购自北京维通利华公司，SPF级健康成年rd1小鼠购自美国杰克逊实验室（Jackson Laboratory），在SPF级动物房饲养繁殖， 温度在22-24℃，湿度在40-50%，每天保持12h光照和12h黑暗循环。以下实验研究，使用rd1同类近交系小鼠与同鼠龄的C57BL/6J小鼠作为正常对照组进行研究，不分雌雄。
2. 视网膜电图检测（Electroretinogram，ERG）
需要检测实验组与对照组的小鼠置放暗室，暗适应至少6小时，实验小鼠建档命名。异氟烷诱导小鼠麻醉，小鼠双眼各滴一滴复方托吡卡胺滴眼液进行扩瞳。将小鼠口鼻对着通有气态异氟烷的装置持续麻醉。将参考电极插在小鼠下眼睑下方脸颊处，尽量靠近下眼睑。将接地电极插在小鼠尾根部皮下，将两个环形电极分别放置在小鼠角膜处，双眼滴加玻璃酸钠滴眼液保持角膜湿润。球形闪光刺激器进行检测，在生物波平稳且没有正弦波干扰的情况下检测暗适应3.0最大混合反应、暗适应0.01反应和暗适应10.0反应。各个时间点分别检测3只小鼠，并进行统计学分析。
3. 黑白箱视觉行为检测
小鼠昼伏夜出，偏爱阴暗安静的环境，小鼠虽具有探索欲望且胆小，黑白箱检测中，将小鼠眼睛背对黑白箱中间的小门放入白箱中，视力良好的小鼠会快速找到门，进入黑箱并长时间待在黑箱中。视力受损的小鼠找门的速度慢，因此在白箱中待的时间长，由于分不清白箱和黑箱的区别，它们穿梭于黑白箱之间的次数也会增多。实验步骤：
（1）提前2h将小鼠放入操作间适应光线环境。实验过程中保持室内安静，光线稳定。
（2）打开Topscan Version 3.0软件，新建实验并进行设置。根据黑白箱实验装置区域设置观察区，设置实验条件，把小鼠在黑箱中的活动和在白箱中的活动作为两个事件进行观察。
（3）命名实验动物，将小鼠眼睛背对着黑白箱中间的门放入白箱中心，迅速点击录像键进行录像，记录十分钟后自动停止，在此过程中对小鼠在黑白箱中的行为指标进行统计分析。
（4）将实验小鼠放回鼠笼，用酒精清洁黑箱与白箱，点击“另存为”然后给下一只实验小鼠命名建档，重复（3）的实验步骤进行下面的实验。
（5）统计学分析：统计学分析采用GraphPad Prism 7.0软件处理。实验数据均以均值±标准差（Mean ± SD）呈现，用Student's t-test或Two-way ANOVA等统计学方法对两组或多组数据间的差异进行比较（* P＜ 0.05；** P ＜ 0.01；*** P ＜ 0.001）。
4. 旷场视觉行为检测
小鼠偏好边缘区域，比较安全，但探索欲望驱使它去中心区域探索。视力良好的小鼠会迅速从中间到边缘区，并长时间在边缘区活动，由于探索欲小鼠进入中间区的次数比较多，但每次停留时间都很短。视力障碍的小鼠到边缘区后会一直待在边缘区，探索欲望下降，活动量显著下降。实验步骤：
（1）提前2小时将小鼠放入操作间适应光线环境。实验过程中保持室内安静，光线稳定。
（2）打开Topscan Version 3.0软件，新建实验并进行设置。根据旷场实验装置设置观察区，将实验小鼠在中心区域活动、在边缘区域活动以及在整个旷场装置内的活动作为3个事件进行观察。
（3）给实验小鼠建档命名，将小鼠放入旷场中心，迅速点击录像键进行录像，记录十分钟，在此过程中对实验小鼠在旷场装置内的行为指标进行记录分析。
（4）结束后将实验小鼠放回鼠笼，用酒精清洁旷场，点击“另存为”给下一只实验小鼠建档，重复实验步骤（3）进行下面的实验。
（5）统计学分析：统计学分析采用GraphPad Prism 7.0软件处理。实验数据均以均值±标准差（Mean ± SD）呈现，用Student's t-test或Two-way ANOVA等统计学方法对两组或多组数据间的差异进行比较（* P＜ 0.05；** P ＜ 0.01；*** P ＜ 0.001）。
5. 视网膜组织石蜡切片和HE染色
实验组rd1小鼠和对照组C57BL/6J小鼠进行异氟烷气体麻醉后，取出眼球置放眼球固定液固定48小时以上。将固定好的眼球沿着角膜巩膜缘剪掉角膜，除去晶体和虹膜。将视杯放入全自动脱水机中，依次经过梯度酒精脱水，二甲苯透明，石蜡浸蜡，包埋、4μm厚切片、烤片、脱蜡、HE染色和中性树脂封片，显微镜下40倍镜中在距离视神经200μm处拍照，用仪器自带软件对视网膜外核层厚度进行测量，并进行统计学分析。
6. TUNEL细胞凋亡检测
按照上述方法制作视网膜组织石蜡切片、浸蜡，包埋、4μm厚切片、烤片、脱蜡等步骤，用滤纸吸去石蜡切片上的多余水分，每个视网膜上滴加20μL不含DNase的蛋白酶K（20μg/mL），室温条件下孵育30min，用PBS洗3遍，每遍5min。将TdT酶和荧光标记液按1:9配制TUNEL工作液，在每个视网膜上滴加20μL，将处理过的石蜡切片放在保湿盒中，一起放入烘箱避光孵育60min，再用PBS洗3遍，每遍5min，每个视网膜组织切片滴加15μL DAPI进行染色，室温下避光孵育3min，PBS洗3遍，每遍5min，然后放纯水中浸泡10min，用滤纸吸取石蜡切片中的多余水分，每个视网膜组织滴加一滴抗荧光淬灭剂封片，在盖玻片四角滴指甲油固定，荧光显微镜下拍照。
7. miRNA-测序
（1）miRNA测序样品采集：用浸有异氟烷棉球放置小鼠鼻孔处充分麻醉后，快速取出小鼠视网膜放入液氮中速冻10～15分钟，再转移到-80℃暂时储存，待所有样本获取后，干冰运输到武汉康测科技有限公司进行测序。
（2）miRNA-seq建库、测序和分析：提取视网膜样本Total RNA，评估Total RNA 样品的质量和完整性，RNA样品逆转录成cDNA片段并进行扩增，同时在逆转录产物经PCR扩增出来的分子均被带上相同的UMI（Unique Molecular Identifier）标签，构建miRNA-seq文库，Illumina Hiseq X-10 PE150上机测序
（3）生物信息学分析：对原始数据进行处理获得优化数据和数据质控，进行样品间相关性分析检测实验数据检测样本选择的合理性，评估样品间表达模式可靠性。进行差异表达miRNA的分布分析；差异miRNA靶基因预测；进行GO富集分析；利用KEGG pathway数据库寻找差异miRNA靶标基因显著富集的通路，筛选与研究目的相关的信号通路。
8. Real-Time qPCR
（1）提取视网膜总RNA：冰上快速获取实验组与对照组的视网膜样本，提取视网膜总RNA，并检测RNA浓度和纯度（A260/A280在1.8～2.0范围内，A260/A230在1.8～2.0范围内）调整RNA浓度为1μg/μL。
（2）茎环法反转录法合成cDNA：按照反转录试剂盒说明进行，具体反应体系见表1，具体反应条件见表2。
表1茎环法反转录反应体系
Figure DEST_PATH_IMAGE001
。
表2茎环法反转录反应条件
Figure 516201DEST_PATH_IMAGE002
。
检测cDNA浓度和纯度，要求A260/A280在1.8～2.0范围内，A260/A230在1.8～2.0范围内，cDNA浓度调整为1μg/μL后储存在-20℃待用。
（3）miRNA茎环法引物设计：其序列见表3，通用下游引物序列为AGTGCAGGGTCCGAGGTATT。
表3 茎环法引物序列
Figure DEST_PATH_IMAGE003
。
（4）Real-Time qPCR：根据具体miRNA引物的Tm值选择具体反应条件，设置反应体系（见表4），上机检测，用U6作为内参计算2-ΔΔCt值。
表4 Real-Time qPCR反应体系
Figure 136145DEST_PATH_IMAGE004
。
9. 腺相关病毒载体的制备
将携带有miRNA-142a-5p封闭序列的片段mmu-miRNA-142a-5p（序列为CAUAAAGUAGAAAGCACUACU），克隆到H13782 pscAAV-U6-shRNA-CMV-EGFP-tWPA腺相关病毒载体中形成重组表达载体pscAAV-U6-Decoy（mmu-miRNA-142a-5p）-CMV-EGFP-tWPA。对照病毒载体为pcscAAV-tCMV-EGFP-tWPA。
10. 视网膜下腔注射
（1）麻醉：实验小鼠为出生第8天，日龄偏小，采用气体麻醉的方式，用浸有异氟烷的棉球置于仔鼠鼻孔处约1分钟，麻醉时间不宜过长避免仔鼠死亡。待仔鼠麻醉后，实验眼滴复方托吡卡胺滴眼液扩瞳，再滴表面麻醉剂盐酸丙美卡因进行眼部麻醉。
（2）操作前准备：打开小鼠加热垫，待温度维持在37℃时，将深度麻醉仔鼠放在加热毯上。调节显微镜至最适观察状态。
（3 ）注射病毒准备：提前将病毒液融化置于冰上， 将Hamilton微量进样器用纯水抽吸50次以清洁内部腔体，一支Hamilton微量进样器抽目的病毒液1μL备用，另一支Hamilton微量进样器抽对照病毒液1μL备用。
（4）操作步骤：左手用眼科镊夹住颞上球结膜，固定住眼球，右手用胰岛素注射器针头在角巩膜缘外侧刺穿巩膜，再换用备有病毒液的Hamilton微量进样器，沿穿刺口进入视网膜下腔，缓慢匀速推注病毒液，推完病毒液后，停留数十秒，再慢慢拔出针头，巩膜切口自闭，观察病毒液未见反流。用妥布霉素地塞米松眼膏涂在创口处以防感染。及时将仔鼠放入保温箱内，并注意观察，待苏醒后放回母鼠身边。
共注射8只出生第8天的rd1小鼠，右眼视网膜下腔注射pscAAV-U6-Decoy（mmu-miRNA-142a-5p）-CMV-EGFP-tWPA病毒1μL，左眼作为对照，视网膜下腔注射pcscAAV-tCMV-EGFP-tWPA病毒1μL。
11. 冰冻切片制备及DAPI染色：
病毒载体注射后第10天进行以下实验：
（1）将小鼠气体麻醉充分后，眼科弯剪从结膜囊进入剪除眼球周围组织至眼球后端间断视神经取出眼球，浸泡在眼球固定液中，并移至显微镜下，在角巩膜缘处用30G针头扎一个孔，将眼球浸泡于眼球固定液中固定2小时。
（2）眼球固定2小时后，去除眼前节和晶体，将视杯放入30%蔗糖中脱水过夜。加少量OCT（optim alcutting tem perature）包埋剂于样品托上，将样品托置于冷台上，待OCT凝固后，将视杯固定于样品托上，再用OCT包埋剂包埋。待OCT完全凝固后进行眼杯切片，切片厚度设为10μm。
（3）将冰冻切片在室温下放10-15min，用PBS洗3遍，每遍5分钟。用吸水纸吸干组织周围的水，用免疫组笔划圈。每个视网膜组织加20μL的0.3%Triton破膜，室温下孵育15min。
（4）吸干组织上的0.3%Triton，在每个视网膜组织上加10μL DAPI染胞核，室温下孵育5min，PBS洗3遍，每遍5min，用抗荧光淬灭封片剂进行封片，40X荧光显微镜下拍照。
12. 统计学分析
统计学分析采用GraphPad Prism 7.0软件处理。实验数据均以均值±标准差（Mean ± SD）呈现，用Student's t-test或Two-way ANOVA等统计学方法对两组或多组数据间的差异进行比较（* P＜ 0.05；** P ＜ 0.01）。
为了更好的理解本申请技术方案，下面将结合说明书附图以及具体的实施方式对上述技术方案进行详细的说明。
实施例一：视网膜色素变性动物模型的选择与评价
rd1小鼠是常用的研究视网膜色素变性的动物模型之一，其发病机制是5号染色体的Pde6b基因第7号外显子发生了无义突变。rd1小鼠视网膜变性发生早，病变严重，与先天性婴幼儿视网膜变性患者的发病进展类似。故而采用rd1小鼠作为研究对象，探索视网膜变性中的潜在机制，研究rd1小鼠的视网膜色素变性过程和特征，拟寻找新的治疗策略。
1. rd1小鼠视网膜组织学变化：
rd1小鼠出生第10天视网膜外核层厚度开始变薄，出生第12天rd1小鼠视网膜外核层平均厚度为40μm，对照组小鼠视网膜外核层平均厚度为59μm，两组相比具有统计学差异（P＜0.0001）。随出生时间推移，外核层逐渐变薄，rd1小鼠生第18天视网膜外核层厚度仅剩7.58μm，rd1小鼠外核层感光细胞间隙增大、外节变短，出生第35天视网膜外核层完全消失（图1C）。整个视网膜变性过程中，rd1小鼠出生第12天至第18天外核层变化最为明显与对照组相比具有统计学差异（P＜0.0001）（图1D）。以上结果表明，rd1小鼠视网膜变性形态学改变在出生后第10天左右开始，呈急性变化趋势，进行性加重，直至出生第28-35天视网膜外核层完全消失。
2. 视网膜电图（Electroretinogram，ERG）
实验小鼠经过6小时暗适应后，在气体异氟烷麻醉作用下，进行全视野视网膜电图检测。与相应时间点正常对照组小鼠相比，rd1小鼠出生后第18天暗适应3.0最大混合反应a波、b波及暗适应0.01反应的b波振幅显著降低（图2A-B），直至第28天和第35天暗适应3.0最大混合反应a波、b波及暗适应0.01反应的b波振幅降低至基线位置（图2C-E）。结果表明，rd1小鼠视网膜功能在出生后第18天已大幅度降低，第28天之后完全丧失。
3. TUNEL细胞凋亡检测结果
对出生第6、8、10、12、14、16、18、21天rd1小鼠视网膜石蜡切片进行TUNEL染色（图3所示），rd1小鼠视网膜外核层细胞在出生第8天开始出现TUNEL阳性细胞，第10天TUNEL阳性细胞数明显增多，第14天TUNEL阳性细胞数最多，第18天和第21天视网膜外核层仅剩一层，仍有TUNEL阳性细胞。结果表明，rd1小鼠视网膜外核层从出生第8天开始凋亡，并逐渐加重，第14天外核层感光细胞凋亡达高峰，随后外核层一直存在细胞凋亡现象。
4. 黑白箱视觉行为检测的改变
对出生第18天、第21天、第28天、第35天的rd1小鼠和对照组小鼠进行黑白箱行为学检测，采用双盲交叉的方式进行（图4A）。与不同时间点正常对照组小鼠相比，第18-35天的rd1小鼠在白箱中停留时间逐日显著延长（图4B），穿梭于黑白箱之间的次数也明显增多（图4C）。结果提示，出生第18～35天的rd1小鼠在行为学上表现出视觉功能受损逐日严重，与HE、ERG结果一致。
5. 旷场视觉行为学改变
采用双盲交叉的方式进行，对出生第18、21、28、35天的rd1小鼠和对照组小鼠进行旷场行为学检测（图5A），和不同时间点正常对照组小鼠相比，出生第28天、第35天的rd1小鼠总活动量显著减少（图5B），除出生第18天rd1小鼠外，其他各日龄rd1小鼠比相应对照组小鼠进出中心区的次数少（图5C），在中心区停留时间短（图5D）。
以上结果表明，rd1小鼠出生后第21天至第35天，其视觉行为学上均表现为视力下降，与HE、ERG结果一致。
实施例二：与视网膜色素变性相关性密切的miRNA筛选研究
1.全基因组miRNA表达水平相关性分析
用Pearson相关性分析评估各小鼠样本的全基因组miRNA表达水平相关性。每对实验组与对照组中，组与组间各样本间的相关系数R2 ≥ 0.85，组内各样本之间的相关系数R2 ≥ 0.85。
结果提示，每两组样本的全基因组miRNA表达模式几乎一致。对全基因组miRNA水平进行样本聚类分析（图6A-B），结果表明，每组的三个生物学样本重复性好。
2. 差异性miRNA的聚类分析
对差异显著的miRNA进行聚类分析，并以热图形式展示，如图7所示。红色代表高水平，蓝色代表低水平，表达量越高，红色越深，表达量越低，蓝色越深。以上结果表明，rd1小鼠视网膜色素变性早期、高峰期及变性过程中miRNA表达谱发生显著性的改变。
3. 差异miRNA靶标基因的GO富集分析
根据P value值排名选择前20个最显著的GO Terms 绘制出GO富集分析图。横轴表示富集的显著性，纵轴代表富集到的GO Terms。如图8所示，富集到的差异miRNA的靶标基因参与生物调节、细胞内各种物质代谢等过程，结果表明这些差异miRNA可能通过调控靶标基因参与以上生物学过程，进而到影响rd1小鼠视网膜色素变性的过程。
4. 视网膜变性相关的差异表达的miRNA靶标基因预测
miRNA是通过结合mRNA下调其表达水平或抑制其翻译来发挥作用，这表明差异miRNA可能通过此机制参与rd1小鼠视网膜色素变性过程。因此，通过RNAhybrid和miRanda数据库预测miRNA-142a-5p、miRNA-223-3p、miRNA-25-3p和miRNA-653-5p的靶基因，如图9所示。miRNA-142a-5p的预测靶标包括Kitl、Kit、Bag4、Flt1、Efna5、Mcl1等，其中Bag4 和Mcl1参与抗凋亡反应，Kitl/Kit信号通路与视网膜疾病密切相关miRNA-25-3p的预测靶标包括Flt1、Xiap、Igf1r、Caspase9、Itgb3、Akt1等，其中Xiap和Caspase9与凋亡过程密切相关；miRNA-223-3p的预测靶标包括Cftr、Atp2b4、Atp2b1、Bdkrb2、Adcy1、Prkce等，其中Bdkrb2参与炎症反应，而Prkce是一种抗凋亡基因；miRNA-653-5p的预测靶标包括Pkia、Nedd4l、Pex7、Acaa1a、Acaa1b等，其中Nedd4l与自噬密切相关，这些差异miRNA的部分靶标基因参与的生物过程与RP紧密相关。
以上结果表明这些差异表达的miRNA可能通过调控上述靶基因在小鼠视网膜变性过程中发挥作用。
5. 验证miRNA在小鼠视网膜色素变性中的作用
根据上述差异表达的miRNA靶基因预测的结果，通过qPCR验证结果显示，miRNA-142a-5p、miRNA-223-3p、miRNA-25-3p和miRNA-653-5p的表达趋势与测序结果一致（图10所示）。在筛选出这4个最主要的与视网膜变性密切相关miRNA中，只有miRNA-142在P347S-Rhodopsin转基因小鼠、Δ307-rds小鼠、Rho-/-小鼠以及rd10-/-小鼠这四种视网膜变性小鼠模型中表达均不同程度的升高，且其靶基因包括Xiap、Birc3、Bcl2、Bcl2l2和Mcl1等抗凋亡基因。实验结果提示miRNA-142a-5p在rd1小鼠视网膜变性过程中发挥重要作用，miRNA-142a-5p的表达水平在rd1小鼠出生第9天略低于相应对照组，而在出生第14天表达水平显著升高（P＜0.0001），表明miRNA-142a-5p的表达水平是在rd1视网膜变性过程中逐渐升高，再结合生物信息学分析结果显示，miRNA-142a-5p直接参与rd1小鼠视网膜色素变性的过程。
实例三：miRNA-142a-5p腺相关病毒载体的构建
（1）质粒构建的信息：基因名称mmu-miRNA-142a-5p，基因库ID为MINMAT0000154。
表5 质粒构建信息
Figure 145821DEST_PATH_IMAGE006
。
（2）载体图谱：
图11所示为miRNA-142a-5p封闭序列的片段，mmu-mi142a-5p的序列CAUAAAGUAGAAAGCACUACU克隆到H13782 pscAAV-U6-shRNA-CMV-EGFP-tWPA腺相关病毒载体中，形成重组表达载体pscAAV-U6-Decoy（mmu-miRNA-142a-5p）-CMV-EGFP-tWPA。对照病毒载体为pcscAAV-tCMV-EGFP-tWPA。
（3）miRNA-142a-5p腺相关病毒构建与检测：
将构建成功的质粒进行腺相关病毒包装，将重组表达质粒和pAAV-RC（携带AAV复制和衣壳基因）共转染进AAV-293细胞（提供AAV复制和包装所需的反式作用因子），转染2～3天后重组AAV在包装细胞中组装完成。然后从被转染的AAV-293细胞中回收AAV病毒颗粒，离心、浓缩和纯化，获得目的AAV病毒颗粒；包装病毒血清为AAV2/5。
用qPCR进行滴度测定，pscAAV-U6-Decoy（mmu-miRNA-142a-5p）-CMV-EGFP-tWPA病毒平均滴度为2.52E+12，pcscAAV-tCMV-EGFP-tWPA病毒平均滴度为3.98E+12。本实验中使用的标准品滴度为2E+13v.g/ml，关于腺相关病毒载体滴度测定和标准曲线的具体信息，如表6-7所示。
表6 pscAAV-U6-Decoy(mmu-miR-142a-5p)-CMV-EGFP-tWPA
Figure DEST_PATH_IMAGE007
。
表7 pcscAAV-tCMV-EGFP-tWPA
Figure 591495DEST_PATH_IMAGE008
。
实施例四：miRNA-142a-5p的干预功能与应用
（1）选择miRNA-142a-5p干预治疗和观察效果的时间窗：
为了验证miRNA-142a-5p是否参与rd1小鼠视网膜色素变性的过程，将敲低rd1小鼠视网膜中的miRNA-142a-5p，观察干预后rd1小鼠视网膜外核层的改变。从前期实验结果可见rd1小鼠视网膜外核层从出生第8天开始凋亡，所以本部分实验将在rd1小鼠出生第8天敲低miRNA-142a-5p表达，因为视网膜外核层在出生后第18天仅剩一层感光细胞，据此选择在rd1小鼠出生第8天视网膜外核层开始出现凋亡细胞，进行miRNA-142a-5p干预治疗，在出生第18天视网膜外核层仅存一层外核层时，故选择rd1出生第8天作为miRNA-142a-5p视网膜下腔注射的起点，第18天作为观察miRNA-142a-5p干预效果的时间点。
（2）腺相关病毒转染位置确认和转染情况
在rd1小鼠出生后第8天视网膜下腔注射敲减miRNA-142a-5p的scAAV病毒载体，用荧光显微镜观察绿色荧光蛋白EGFP在视网膜中的表达，如图12所示，EGFP在视网膜内广泛表达，其表达大部分位于视网膜外核层。
（3）敲低miRNA-142a-5p延缓rd1小鼠视网膜色素变性的过程
观察敲低miRNA-142a-5p后，rd1小鼠视网膜外核层出现明显改变（图13A所示），与AAV-control组相比，视网膜下腔注射携带miRNA-142a-5p目的病毒的rd1小鼠视网膜外核层厚度比空载病毒注射组增厚15.97μm，视网膜外核层显著增厚（P＜0.001）。图13B病毒载体注射后，q-PCR检测结果显示miRNA-142a-5p目的病毒载体注射后与注射空载病毒组相比，miRNA-142a-5p表达水平明显降低约为85%，具有显著的统计学差异（****P < 0.0001）。图13C-D视网膜电图检测显示，miRNA-142a-5p目的病毒注射组，比空载病毒注射组相比，ERG具有显著性统计学差异。上述研究结果表明，抑制miRNA-142a-5p的表达，明显延缓rd1小鼠视网膜色素变性的病理过程。
尽管已描述了本发明的一些优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例做出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。
显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本申请权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。

Claims (6)

1.miRNA-142a-5p或其片段在制备干预或治疗视网膜色素变性的药物中的应用。
2.一种干预或治疗视网膜色素变性的生物制剂，其特征在于，含有抑制或下调视网膜内miRNA-142a-5p表达的载体。
3.根据权利要求2所述的生物制剂，其特征在于，所述载体含有mmu-miRNA-142a-5p或其片段。
4.根据权利要求3所述的生物制剂，其特征在于，所述mmu-miRNA-142a-5p片段序列为：CAUAAAGUAGAAAGCACUACU。
5.根据权利要求2所述的生物制剂，其特征在于，所述载体经由以下步骤制得：
（1）将mmu-miRNA-142a-5p片段克隆到H13782 pscAAV-U6-shRNA-CMV-EGFP-tWPA腺相关病毒载体中，形成重组表达质粒；
（2）将所述重组表达质粒和pAAV-RC共转染进AAV-293细胞，然后从被转染的AAV-293细胞中回收AAV病毒颗粒，再经离心、浓缩、纯化，得到目的AAV病毒颗粒。
6.根据权利要求5所述的生物制剂，其特征在于，所述mmu-miRNA-142a-5p片段序列为：CAUAAAGUAGAAAGCACUACU。
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