CN105748501B - 一种miRNA‑182抑制剂及其在制备防治心脏移植免疫排斥反应药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种miRNA‑182抑制剂，该抑制剂的序列如下：5’‑CGGUGUGAGUUCUACCAUUGCCAAA‑3’，其中每个核苷酸被2’‑OMe修饰，5’端的前两个碱基和3’端的前4个碱基被磷硫酰键修饰，且3’端修饰有胆固醇基团。本发明的miRNA‑182抑制剂可应用于制备防治心脏移植免疫排斥反应的药物。本发明提供的miRNA‑182的特异靶向抑制剂通过在心脏移植术后靶向抑制miRNA‑182的表达，可有益于降低同种异体免疫反应和延长移植物的存活，其可为制备预防心脏移植物失功和保护心脏移植物功能的药物提供基础。

Description

一种miRNA-182抑制剂及其在制备防治心脏移植免疫排斥反 应药物中的应用

技术领域

本发明涉及医学生物工程领域，具体涉及一种miRNA-182抑制剂及其在制备防治心脏移植免疫排斥反应药物中的应用。

背景技术

心脏移植是治疗各种终末期心脏疾病的有效手段。随着新型免疫抑制剂的使用，急性排斥的发生率降低，但其仍然是造成心脏移植术后1年内受者死亡的主要因素。急性细胞排斥(acute cellular rejection，ACR)常发于术后3-6个月或偶发于术后任何时期，由T细胞介导引发淋巴细胞和巨噬细胞浸润移植物，不仅造成短期移植物损伤，且参与心脏移植物血管病变(cardiac allograft vasculopathy，CAV)。CAV造成动脉内膜层同心性增厚和血管腔弥散性变窄，是慢性排斥(Chronic rejection)的重要体现形式，其术后5年发病率达33％，严重影响移植物的长期存活。目前临床上对CAV尚无有效的治疗手段，因此早期诊断和预防CAV的发生是降低慢性排斥风险和延长心脏移植物存活时间的重要环节。

心脏移植物肥大(cardiac allograft hypertrophy)是CAV发生的重要预后指标，其病理表现为早期心肌细胞肥大和后期纤维化、胶原沉积，成为影响移植物功能的重要临床并发症。并且研究表明，早期诊断和干预心肌细胞肥大可能有益于降低CAV的发生，继而提高移植物的长期存活。

MicroRNA(miRNA)是真核生物中广泛存在的一种长约22个核苷酸的非编码小RNA分子，其通过与靶信使RNA(mRNA)的3’非翻译区(3’-UTR)结合，可在转录后水平调节靶基因的表达。miRNA对细胞发育、分化、增殖和凋亡至关重要。并且在不同种系间，miRNA在结构和功能上高度保守。在器官移植中，miRNA对T细胞和B细胞介导的排斥反应、树突状细胞功能以及调节性T细胞活性起到重要的调节作用。miRNA通过调控与移植排斥、耐受诱导或移植术后感染相关基因的表达，影响移植物的长期存活。最近，有临床研究表明，miRNA的差异表达与心脏移植、肾移植术后的移植物排斥相关。并且针对miR-122的特异性抑制药物miravirsen(SPC3649)已被用于治疗丙型肝炎。

miRNA-182位于人类7号染色体和小鼠6号染色体上，其在miRNA-183-miRNA-96-miRNA-182miRNA家族中表达量最高。研究发现，急性细胞排斥发生时miRNA-182在心脏移植物中的表达量升高8倍，在浸润淋巴细胞中的表达量升高7倍，在血浆中的表达量升高8倍。此外，在混合淋巴细胞反应(MLR)中miRNA-182的表达与T细胞的增殖呈现正相关。结合已有报道，miRNA-182受白细胞介素-2(IL-2)诱导，可促进活化的辅助型T细胞克隆扩增，提示miRNA-182在同种异体免疫反应中可能影响T细胞的功能。有研究表明，miRNA-182可间接影响低氧诱导因子-1α(HIF-1α)的表达。由于HIF-1α的表达是心脏移植物应对缺血再灌注损伤(IRI)的重要机制，提示miRNA-182参与了影响心脏移植物的功能。

转录因子Forkhead box protein O1(FOXO1)调控细胞的增殖、凋亡、代谢、DNA修复和血管生成，并且对T细胞、B细胞等免疫细胞介导的免疫稳态起关键调节作用。研究发现通过双荧光酶素报告系统确认Foxo1是miRNA-182的靶基因，并且随着心脏移植物中miRNA-182的表达量升高，FOXO1的蛋白水平在心肌细胞和浸润CD3+T细胞中相应降低，提示miRNA-182通过调控FOXO1，在不同细胞类型中可能发挥不同的生物学功能。虽然研究发现在肿瘤细胞中Foxo1也受miRNA-9，miRNA-27和miRNA-153的调控，但miRNA表达图谱显示心脏移植术后只有miRNA-182呈显著性差异表达，提示miRNA-182表达升高是器官移植术后FOXO1蛋白水平下调的关键调控因子。FOXO1在淋巴细胞中表达下调，可导致浸润淋巴细胞数量增多；FOXO1在心肌细胞中表达可降低钙调磷酸酶(calcineurinphosphatase)活性，其表达下调可导致心肌细胞肥大，提示miRNA-182是急性细胞排斥与心脏移植物肥大的重要关联因素。因此，研究并靶向干预miRNA-182对于降低同种异体免疫反应和延长移植物的存活有重要的意义。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的缺点，提供一种miRNA-182抑制剂，该抑制剂可用于制备防治心脏移植免疫排斥反应药物中。

本发明的目的通过以下技术方案来实现：一种miRNA-182抑制剂，所述抑制剂的序列如下：

5’-CGGUGUGAGUUCUACCAUUGCCAAA-3’，其中每个核苷酸被2’-OMe修饰，5’端的前两个碱基和3’端的前4个碱基被磷硫酰键修饰，且3’端修饰有胆固醇基团。

miRNA-182抑制剂在制备防治心脏移植免疫排斥反应药物中的应用。

miRNA-182抑制剂用于制备预防心脏移植物失功和保护心脏移植物功能的药物。

miRNA-182抑制剂通过抑制或降低miRNA-182表达达到保护心脏移植物功能和延长心脏移植物的存活时间。

本发明的核酸序列被2’-OMe和磷硫酰键修饰的作用是为了提高合成分子对核糖核酸酶的抵抗性，达到可以稳定的竞争性抑制目的分子miRNA-182的作用。3’端修饰有胆固醇基团用于促进细胞对miRNA-182抑制剂的吸收作用，延长其在血清中的半衰期。

本发明具有以下优点：本发明提供的miRNA-182的特异靶向抑制剂通过在心脏移植术后靶向抑制miRNA-182的表达，可有益于降低同种异体免疫反应和延长移植物的存活，本发明通过实验证明在正常条件下，对照组同种异体小鼠(BALB/c→C57BL/6)移植模型的移植心脏存活时间不超过7天，而使用了本发明的miRNA-182抑制剂后移植心脏存活时间达到13天以上，其可为制备预防心脏移植物失功和保护心脏移植物功能的药物提供基础。

附图说明

图1为小鼠腹腔异位心脏移植后的小鼠心脏移植物生存率曲线示意图；

图2为HE染色方法观察小鼠心脏移植物的结果示意图；

图3为荧光定量PCR检测小鼠体内组织中miRNA-182表达的结果示意图；

图4为Western blot的方法检测小鼠心脏移植物中FOXO1表达的结果示意图。

具体实施方式

下面结合附图及实施例对本发明做进一步的描述，本发明的保护范围不局限于以下所述。

实施例1：通过小鼠异位心脏移植模型检测miRNA-182抑制剂对移植心脏存活时间的影响

1.合成本发明的miRNA-182抑制剂

将5'-O-(4,4-二甲氧基三苯甲基)-2'-O-甲基胞苷-3'-(2-氰基乙基-N,N-二异丙基)(5'-O-(4,4'-dimethoxytrityl)-2’-O-methyl-3'-O-(2-cyanoethyl-N,N-diisopropyl))修饰的RNA亚磷酰胺单体A、G、C、U，使用DNA合成仪对本发明miRNA-182抑制剂(示意图中简称Skm-182)进行化学合成，miRNA-182抑制剂的RNA序列为5’-CGGUGUGAGUUCUACCAUUGCCAAA-3’。在控孔玻璃固相载体(controlled-pore glass solidsupport)中进行RNA与胆固醇基团的连接修饰。在miRNA-182抑制剂的合成过程中，指定位置的磷硫酰键的修饰是通过亚磷酸盐和苯乙酰二硫化物(PADS)的氧化反应完成的。在控孔玻璃固相载体中对miRNA-182抑制剂进行切落和脱保护后，合成的miRNA-182抑制剂使用反相高效液相色谱法进行纯化。纯化后的miRNA-182抑制剂经冻干后保存于-80℃备用。

2.合成miRNA-182抑制剂的阴性对照化合物

设计一段miRNA-182抑制剂的阴性对照序列，该RNA序列为5’-AGUCAGUGAGAACGUUUGCAUAUGC-3’。其中每个核苷酸被2’-OMe修饰，5’端的前两个碱基和3’端的前4个碱基被磷硫酰键修饰，且3’端修饰有胆固醇基团。该阴性对照化合物的合成过程与miRNA-182抑制剂的制备方法相同。本发明中，该阴性对照化合物命名为Skm-negative(示意图中简称Control)。

3.构建小鼠异位心脏移植模型

构建小鼠异位心脏移植模型，以Balb/c小鼠作为供者，以C57BL/6小鼠作为受者(Balb/c→C57BL/6)，该模型为经典的急性细胞排斥心脏移植模型。在非干预条件下，该模型的心脏移植物在移植术后的5-7天发生急性细胞排斥并停止跳动。

建模步骤：将供者(Balb/c小鼠)用异氟醚麻醉，沿肋弓下缘剪开皮肤和腹膜，经下腔静脉注入含肝素钠(10U/ml)的生理盐水，并剪开腹主动脉和下腔静脉，暴露胸腔，用冰冷的生理盐水降温心脏。用7-0丝线分别结扎并切断上、下腔静脉，剪断主动脉和肺动脉分叉近端处，靠近肺门处用7-0丝线成束结扎肺门血管。取出供心，经升主动脉注入生理盐水直至心脏颜色均一变浅，置于4℃生理盐水中备用。受者(C57BL/6小鼠)用异氟醚麻醉，沿腹中线切开皮肤和腹膜，用湿润棉签牵引小肠肠管，以湿润纱布覆盖保护。钝性分离显露肾动脉以下的主动脉和下腔静脉，用两枚血管夹阻断主动脉和下腔静脉血流，于主动脉中央处进针并用含肝素钠的生理盐水轻轻冲洗血液，由针孔进入显微手术剪，向上纵行剪开血管，长度与供体心脏升主动脉直径一致。将供心置于受者腹腔，用10-0无损伤缝线将升主动脉和腹主动脉行端-侧吻合。同法，用11-0无损伤缝线将肺动脉和下腔静脉行端-侧吻合。吻合确切后松开血管夹，用棉签按压吻合口以达到止血目的。待移植心脏复跳良好后，将小肠等器官恢复原位。关腹前腹腔内滴入1ml生理盐水补充血容量，用3-0可吸收缝线连续缝合关闭腹腔。术后将小鼠移至热光源下促进苏醒。

4.动物实验分组

设立对照组(示意图中简称Control)，移植受者于手术第-1、0、1、3、5天接受80mg/kg/天的阴性对照化合物腹膜腔注射治疗。设立实验组(示意图中简称Skm-182)，移植受者于手术第-1、0、1、3、5天接受80mg/kg/天的miRNA-182抑制剂腹膜腔注射治疗。对照组和实验组移植小鼠的数量分别为3例和6例，采用腹部触摸法监测心脏移植物的状态。

3.实验结果

图1所示为术后小鼠心脏移植物生存率曲线，通过腹部触摸的方法，观察到其中一只对照组小鼠的心脏移植物在第6天停止跳动，另外两只对照组小鼠的心脏移植物在移植后第7天停止跳动，与非干预条件下该小鼠心脏移植模型的报道结果相符。而全部实验组小鼠的心脏移植物在第7天均可触摸到规律有力的跳动，除去实验组中的三只小鼠在术后第7天进行处死取材和相关实验，剩余的三只实验组小鼠的心脏移植物分别在第13天、15天和16天停止跳动，证明了本发明中的miRNA-182抑制剂可有效延长小鼠心脏移植物的存活时间。

实施例2：用HE染色的方法观察心脏移植物的病理变化

1.实验方法：1)于移植术后第7天，将对照组和实验组中的各3只受者小鼠处死，获取移植心脏组织块，用10％中性福尔马林固定12-24小时后，常规石蜡包埋，用徕卡切片机4μm切片。2)切片用二甲苯脱蜡，经各级乙醇至水洗。脱蜡步骤为：二甲苯(I)5min→二甲苯(Ⅱ)5min→100％乙醇2min→95％的乙醇1min→80％乙醇1min→75％乙醇1min→蒸馏水洗2min。3)Harris苏木精液染色5min，自来水冲洗1min。4)盐酸乙醇液分化30s。5)自来水浸泡15min或温水(约50℃)5min。6)置伊红水溶液2min。7)常规脱水，透明，封片。步骤为：95％乙醇(I)min→95％乙醇(Ⅱ)1min→100％乙醇(I)1min→100％乙醇(Ⅱ)1min→二甲苯石碳酸(3：1)1min→二甲苯(I)1min→二甲苯(Ⅱ)1min→中性树脂封固→显微镜下观察并照相。

2.实验结果：如图2所示，HE染色结果可见对照组小鼠心脏移植物中血管及其周边大量淋巴细胞浸润，形态较差，而经miRNA-182抑制剂处理后的实验组小鼠心脏移植物中淋巴细胞浸润明显减少，形态维持较好，证实了本发明miRNA-182抑制剂可有效降低同种异体免疫反应和保护心脏移植物组织形态。

实施例3：用荧光定量PCR的方法检测小鼠体内组织中miRNA-182的表达变化

1.提取心脏移植物、脾脏、肝和PBMC中的总miRNA

移植术后第7天，将对照组和实验组中的各3只受者小鼠处死，分别取出部分心脏移植物、脾脏、肝组织。同时用含EDTA抗凝剂EP管分别收集小鼠全血，用于提取外周血单个核细胞(PBMC)。然后分别提取心脏移植物、脾脏、肝和PBMC中的总miRNA。

(1)PBMC及其miRNA的提取

PBMC分离采用Ficoll密度梯度离心法。先将2ml淋巴细胞分离液加到15ml离心管中，将1ml血液和1ml的1640培养基混合均匀，缓慢加入到淋巴细胞分离液的上层，用离心机2000rpm离心20分钟，自然降速。离心完毕用巴斯吸管吸取中间白膜层到新的15ml离心管中，然后加入10mlPBS，2000rpm离心6min，弃上清，将底部离心下来的PBMC转移到新的1.5mlEP管中，然后使用试剂盒mirVana miRNA Isolation Kit进行操作提取总miRNA(购自Ambion公司)。

(2)心脏移植物、脾脏、肝的总miRNA提取

把组织块剪碎于冰冷条件下进行匀浆。使用试剂盒mirVana miRNA IsolationKit进行操作提取总miRNA(购自Ambion公司)。

2.反转录

将提取的心脏移植物、脾脏、肝脏和PBMC的miRNA-182进行反转录，使用AppliedBiosystems公司的MicroRNA Assays试剂盒来进行操作，首先按表1加入以下体积加入相关试剂和样品。

表1：反转录加入的试剂及用量

然后按表2条件在PCR仪器中进行反应，4℃表示反应完成。.

表2：反转录反应条件

Step Type	Time(min)	Temperature(℃)
			HOLD	30	16
HOLD	30	42
			HOLD	5	85
HOLD	∞	4

3.荧光定量PCR反应

对上述步骤获得的反转录样品进行miRNA-182的荧光定量PCR检测，首先按表3中的体积加入相关试剂和样品。

表3：荧光定量PCR反应加入的试剂及用量

然后按表4的条件在荧光定量PCR仪器中进行反应。

表4：荧光定量PCR反应条件

4.实验结果

如图3所示，通过2^-ΔΔCt法进行分析，结果显示miRNA-182在实验组小鼠的心脏移植物、PBMC、脾脏和肝脏中的表达相比对照组均受到显著抑制，因此证实本发明的miRNA-182抑制剂可特异地抑制小鼠体内miRNA-182分子的表达水平。

实施例4：用Western blot的方法检测心脏移植物中FOXO1的表达

1.实验方法：首先取实验组和对照组小鼠的移植心脏部分组织块，将少量组织块置于1～2ml匀浆器中球状部位，用干净的剪刀将组织块尽量剪碎。加入200μl裂解液(含1mMPMSF和10ul的蛋白酶抑制剂，裂解液购自Invitrogen公司，蛋白酶抑制剂购自Sigma公司)，将匀浆器置于冰上进行匀浆，重复匀浆数次使组织尽量碾碎。冰上静置20min后，将裂解液移至1.5ml离心管中，然后在4℃下13000rpm离心15min，取上清分装于1.5ml离心管中。使用紫外分光光度计测定上清液中的蛋白浓度后，计算含50μg蛋白的溶液体积为上样量。将样品加入到SDS-PAGE凝胶中进行电泳，随后将SDS-PAGE凝胶中的蛋白样品电转至硝酸纤维素膜(PVDF)上。将膜移至含有5％BSA封闭液的平皿中室温封闭1h，TBST洗涤数次，将兔抗小鼠FOXO1和β-Actin一抗(FOXO1购自Cell signaling公司，β-Actin购自Sigma公司)用TBST稀释至工作浓度，加入到PVDF膜上室温孵育2h，TBST洗涤数次，将HRP标记的羊抗兔二抗(购自Abcam公司)用TBST稀释至工作浓度，加入到PVDF膜上室温孵育1h，TBST洗涤数次。然后加入BeyoECL Plus等ECL类试剂进行化学发光反应，最后将膜放置到荧光成像仪上进行检测和照相。

2.实验结果：现有研究已经证实FOXO1是miRNA-182下游调控的靶基因，心脏移植后，随着移植物中miRNA-182的表达量升高，FOXO1的蛋白水平在移植物心肌细胞中也会随之降低。本实施例的Western blot结果如图4所示，相比对照组，接受本发明miRNA-182抑制剂治疗后的小鼠心脏移植物中FOXO1的表达量相比对照组显著升高，进一步证实了本发明的miRNA-182抑制剂对心脏移植物具有一定的保护作用。

Claims (1)

1.miRNA-182抑制剂在制备预防心脏移植物失功和保护心脏移植物功能的药物中的应用，其特征在于，所述抑制剂的序列如下：

5’-CGGUGUGAGUUCUACCAUUGCCAAA-3’，其中每个核苷酸被2’-OMe修饰，提高合成分子对核糖核酸酶的抵抗性，5’端的前两个碱基和3’端的前4个碱基间的磷酸二酯键进行磷硫酰化修饰，用于促进细胞对miRNA-182抑制剂的吸收作用，且3’端修饰有胆固醇基团；所述miRNA-182抑制剂通过抑制或降低miRNA-182表达达到保护心脏移植物功能和延长心脏移植物的存活时间；所述miRNA-182抑制剂可有效降低同种异体免疫反应和保护心脏移植物组织形态。