CN111568915A - miRNA-182、miRNA-188和miRNA-199a的抑制剂的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物医药技术领域，具体公开了miRNA‑182、miRNA‑188和miRNA‑199a的抑制剂的应用。本发明明确了miRNA抑制剂AM‑182/188/199a对AD的治疗作用，具体表现为改善AD小鼠海马区神经元功能及其突起的可塑性、减少Aβ的形成，并提高了AD小鼠的学习记忆能力，为AD的临床治疗提供新的防治手段，也为制备治疗AD的药物提供了新的思路。

Description

miRNA-182、miRNA-188和miRNA-199a的抑制剂的应用

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，具体是miRNA-182、miRNA-188和miRNA-199a的抑制剂的应用。

背景技术

阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)是一种以学习记忆损害为表征的神经退行性疾病，患者脑中发生着β-淀粉样蛋白和过度磷酸化的tau蛋白的堆积，乙酰胆碱神经递质的减少，炎症和氧化应激等细胞和分子变化。其中细胞外斑块中β-淀粉样蛋白(Aβ)的堆积和过度磷酸化的tau蛋白导致细胞内神经原纤维缠结是AD最典型的病理特征。对于阿尔茨海默症各种治疗方式已经研发并推进至AD患者的晚期临床试验，但截至目前，在大型III期试验中，仍然没有任何一种药物被证明是有效的。AD药物开发失败率为99％；AD疾病缓解疗法的发展失败率为100％。因此，寻找有效的预防或治疗的药物，是当今AD研究的主要目标。

miRNA是一类由22个核苷酸构成的RNA分子，该分子与特定mRNA的3'UTR区互补配对互补配对后，miRNA就会阻挡核糖体与mRNA的结合，因此抑制了mRNA转录成蛋白质的翻译过程，进而广泛作用于发育、肿瘤、炎症等各个生物学过程。研究发现非编码RNA广泛影响人类疾病的方方方面，包括导致痴呆等的神经退行性疾病。越来越多的证据显示miRNA在AD、帕金森病和中风等神经退行性疾病中存在着失调。目前AD研究方向也转向了非编码RNA家族成员在AD的发病机制和临床发展中的新作用。因此寻找并验证此类非编码RNA在AD中的作用具有巨大的临床价值，有希望成为治疗AD的候选新药。

发明内容

本发明提供如下技术方案：

miRNA-182、miRNA-188和miRNA-199a的抑制剂中的一种或多种在制备治疗AD药物中的应用。

在进一步的方案中：所述miRNA-182的抑制剂为Anti-miRmiRNA-182 inhibitors，miRNA-188的抑制剂为Anti-miRmiRNA-188 inhibitors，miRNA-199a的抑制剂为Anti-miRmiRNA-199a inhibitors。

在进一步的方案中：所述药物为注射制剂。

本发明的有益效果如下：

本发明明确了miRNA抑制剂(AM-182/188/199a)对AD的治疗作用，具体表现为通过改善AD小鼠海马区神经元功能及其突起的可塑性、减少Aβ的形成，并提高了AD小鼠的学习记忆能力，为AD的临床治疗提供新的防治手段，也为制备治疗AD的药物提供了新的思路。

附图说明

图1为1、4、7月龄AD模型鼠海马中miRNA-182、188、199a的表达情况,其中A对应miRNA-182、B对应miRNA-188、C对应miRNA-199a。

图2为NC组与AM组小鼠水迷宫实验结果。

图3为NC组与AM组小鼠条件恐惧实验结果。

图4为NC组与AM组小鼠海马区的MAP2免疫荧光结果。

图5为NC组与AM组小鼠海马区的GAP43免疫荧光结果。

图6为Thoflavin-T染色NC组与AM组小鼠海马区的Aβ斑块情况。

具体实施方式

一、AD模型鼠中特异性上调的miRNA的检测与确定

1、取材海马、皮质

动物颈椎脱臼处死，取出脑组织。将脑组织用4℃的盐水进行冲洗，之后用吸水纸拭干。取出左、右两侧海马及大脑皮质，再用4℃的盐水进行冲洗，之后用吸水纸拭干，并进行编号。

2、RNA抽提及检测

3、第一链cDNA反转录

1)第一链cDNA反转录时所用到的，针对U6及其他miRNA所设计的特异性引物(Primer Premier 5.0软件设计)，引物序列如表1：

表1引物名称及序列

2)在冰浴的nuclease-free PCR管中加入以下试剂，如表2：

表2 PCR反应体系

3)轻轻混匀后离心3～5s，反应混合物在65℃温浴5min后，冰浴2min，然后离心3～5s。

4)将试管冰浴，再加入下列试剂，如表3：

表3反应体系

5)轻轻混匀后离心3～5s。

6)在在PCR仪上按照下列条件进行反转录反应：

25℃-----10min孵育

50℃-----30min cDNA合成

85℃-----5min置于冰上放置，终止反应

72℃-----1min

4℃------forever

7)将上述溶液-20℃保存。

4、制备标准品

4.1、PCR反应体系，如表4：

表4 PCR反应体系

4.2、PCR反应条件如下：

95℃-----3min

72℃-----8min

4℃------forever

4.3、PCR电泳

1.5％琼脂糖凝胶，1×TAE，150V，100mA，20min电泳观察。

4.4、PCR回收，步骤如下：

1)准备工作：将水浴锅调至55℃；

2)割下目标片段的胶块，称重；

3)加入胶块重量3-6倍的Buffer B2，50℃水浴5-10分钟溶胶；

4)对于<500bp的片段，加入1/3Buffer B2体积的异丙醇；

5)将溶胶液移入吸附柱中，8,000×g离心30秒，倒掉收集管中液体；

6)加入500μl Wash Solution，9,000×g离心30秒，倒掉收集管中液体；

7)重复步骤6一次；

8)空吸附柱于9,000×g离心1分钟。

将吸附柱放入一个干净的1.5ml离心管中，在吸附膜中央加入15-40μl ElutionBuffer，室温静置1分钟后，离心1分钟。保存管中DNA溶液。

4.5、克隆序列：

4.5.1、连接反应，4℃过夜连接，如表5：

表5反应体系

4.5.2、连接产物转化，步骤如下：

1)在平板上挑取单克隆。接种至3.5ml合适的培养基中37℃培养过夜；

2)将过夜培养的菌液按1:100稀释比例加入到LB培养基中，250rpm 37℃培养至细菌生长至早对数期时，通常为2.5h；

3)取100μl菌液预冷，2×BT Buffer T混合，冰上放置10～30min；

4)取100l感受态细胞，置于冰上；

5)加入10l连接液，轻轻混匀，冰上放置30分钟；

6)42℃水浴热激45秒，冰上放置18分钟；

7)加600lSOC培养基，37℃200～250rpm振荡培养1小时；

8)室温下4000rpm离心5分钟，去上清液，用剩余的培养基将细胞悬浮；

9)将细菌涂布在预先用20ul 100mM IPTG和100ul 20mg/ml X-gal涂布的氨苄青霉素平板上；

10)平板在37℃下正向放置1小时以吸收过多的液体，然后倒置培养过夜。

4.5.3、质粒提取

使用生工质粒提取试剂盒提取质粒DNA。

4.6、定量质粒信息

质粒M13+/-测序，构建好的质粒经测序鉴定无误后用微量分光光度计测定质粒OD₂₆₀的值，通过公式换算成拷贝数(copies/μl)。

4.6.1、公式换算

1)质粒浓度换算公式(copies/μl)＝(mol数/ul)*6.02×10²³＝[质量(g)/分子量]/ul*6.02×10²³＝[质量(ng)×10^-9/分子量]/ul*6.02×10²³＝浓度(ng/ul)×6.02×10¹⁴/分子量

2)分子量＝(载体片段碱基对+PCR产物碱基对)*650

3)双链DNA分子的分子量(道尔顿)＝碱基对数目×650

4)一个DNA碱基对(钠盐)的平均分子量＝650道尔顿

4.6.2、标准曲线样品的制备

10倍梯度稀释质粒，做5个点，通过预实验选取合适标准品用于制备标准曲线。

5、荧光定量PCR检测

5.1、实验样本将制备好的样品提取RNA后反转录成的cDNA，稀释10倍上机(LightCycler480 II(Roche罗氏))。

5.2、PCR反应步骤

1)miRNA引物序列(Primer Premier 5.0设计)。管家基因引物序列，如表6：

表6引物名称和序列

目的基因引物序列，如表7：

表7引物名称及序列

2)配制主混液，如表8：

表8反应体系

3)PCR循环条件如下：

95℃-----3min

95℃-----15s

57℃-----20s 45cycles

72℃-----30s

4)仪器的操作

加好样后，将96孔板放在LightCycler480 II中开始反应。

6.1、候选miRNA的确定

利用生物信息学技术首先筛选与AD相关的miRNA，根据评分选取10条上调的miRNA。

6.2、AD模型鼠海马中候选miRNA的检测结果

对1、3、7月龄APP/PS1双转基因AD模型鼠的海马及皮质进行取材，AD、WT小鼠每个月龄3只，共36份组织。使用荧光定量PCR技术对十种特异性miRNA的表达量进行检测。结果：首先构建标准品并检测质量，在对36个样本进行荧光定量PCR检测的同时也对每种miRNA的标准品进行检测，之后算出36个样本中10种miRNA的绝对表达量。结合月龄分析可知：皮质组织中：仅miR-199a-5p在7月龄和1月龄AD组高于WT组，且有统计学意义。而海马组织中：miR-188-5p、miR-199a-5p、miR-182-5p在3月龄时，AD组显著高于WT组；其余组有不同程度的趋势但无统计学意义(见附图1)，因此确定miRNA-182、miRNA-188、miRNA-199a为待干预的目标miRNAs。

二、三种miRNA抑制剂对AD模型鼠的作用

1、采用侧脑室给药，步骤如下：

1)将麻醉好的小鼠平放到脑立体定位仪平台之上，注射期间腹部一直接触金属底板，防止体温过凉，在其腹下防止一张软纸；

2)将耳杆插入小鼠耳道，平衡左右耳杆使小鼠两耳间连线与耳杆在同一直线上；

3)用镊子拨开小鼠门齿，将动物门齿卡在小鼠适配器的孔内，压下鼻杆锁紧螺丝，同时上下调节门齿夹高度以及前后调节适配器位置，使小鼠头颅面保持水平，锁紧螺丝，使小鼠头部不能晃动；

4)根据小鼠体型，在小鼠固定器(适配器)的底座上用纸板或泡沫等垫高小鼠的身体，防止小鼠呼吸阻塞；

5)剃除小鼠头部颅面毛发，用酒精消毒，剪开头皮，去除骨膜；

6)根据小鼠颅骨骨缝找到前囟点(bregma)，以该点作为三维坐标系参考点，以此点向后0.6mm，旁开1.1mm，为侧脑室正上方方位；

7)找到侧脑室并标记，用电钻在侧脑室方位打孔，注意力度不要破坏脑；

8)将平头微量注射器下深2.6mm-3.0mm，缓慢注射干预物，速度为1μl/min，由机器控制。注射完毕缓释10min，之后拔针，速度为1μl/min；

9)伤口消毒，手术缝合，撒上云南白药，并腹腔注射抗生素；

10)小鼠药物干预之后继续放在原处饲养，之后每周给药干预一次，连续给药干预四周。

2、AM干预后，AD模型鼠行为学的检测

2.1、Morris水迷宫测试

2.1.1、关于实验

水迷宫实验是用来检测APP/PS1双转基因AD模型鼠对于空间记忆能力的实验。装置包括圆柱体无盖水池、可伸缩小鼠逃生平台、720p黑白摄像头，anymaze视频分析软件。水池h＝50cm，r＝60cm，在anymaze软件中将期均匀划分为分为4个象限，各个象限交点处贴有不同形状、颜色的图案，水池内壁为黑色，填充有高度约40cm的透明自来水，水温调整至22度左右，由于本实验中所用转基因鼠均为灰色或黑色，所以需要在水中加入二氧化钛(食品级)使之完全溶解，让自来水成白色不透明。可升缩小鼠逃生平台置于第一象限中央，r＝5cm，高度视水面及实验需求而定。水池正上方装有720p黑白摄像头，捕捉小鼠在游泳的实时画面。整个实验是用anymaze视频分析软件来完成数据的记录和分析，包括小鼠游泳总距离、小鼠平均游泳速度、小鼠在各个象限停留时间及穿经次数，穿过平台次数，小鼠游泳逃逸潜伏期、游泳轨迹图等。实验过程中图案位置保持不变，方便受试小鼠识别方位，整个实验在光线较弱的环境中进行，并保持安静。

2.1.2、实验流程

在水迷宫实验正式开始前7天，将准备参与水迷宫测试的APP/PS1双转基因AD模型鼠从SPF屏障转移至行为学实验室，让其适应环境。之后进行为期6天的水迷宫实验，第一天小鼠逃生平台高于水面1cm，第二至五天小鼠逃生平台低于水面1cm，第六天撤出小鼠逃生平台。按小鼠昼夜节律，每天夜间在相同的时间段，将小鼠头朝向池壁放入水中，每天2次，分别从一、二象限的交点，三、四象限的交点入水，给小鼠60秒的自由游泳时间，若在60秒内成功爬上平台，则计时、记录停止，让其在平台上休息5s后，将其取出，用干净毛巾擦干体表水分，在小动物恒温加热台上停留5分钟烘干，放回笼盒中，若在既定时间内没有找到平台，60s时计时、记录停止，并引导小鼠登上小鼠逃生平台休息20s后取出放回笼盒中；第六天撤离第一象限的平台后，让小鼠自由在水中游泳，60s时计时、记录停止，取出放回笼盒。

2.1.3、实验结果

小鼠游泳速度显示，不同给药组之间无明显差异，排除了小鼠由于自身运动能力不同、或者颅部手术创伤等原因而造成测试指标出现差异的情况。

定位巡航实验显示：随着训练天数的增加，各组小鼠登台潜伏期均呈现缩短的趋势；AM组和联合给药组与NC组相比，登台潜伏期下降趋势更为明显，Neuritin组与NC组相比，登台潜伏期下降有趋势，但不很明显。

空间探索实验显示：穿经次数

目标象限停留时间：Neuritin组、AM组和联合给药组小鼠在目标象限明显停留时间较NC组长，AM组和联合给药组小鼠停留时间较NC组有明显差异P<0.05，而Neuritin组小鼠停留时间较NC组有差异，但无统计学意义。

轨迹图：Neuritin组、AM组和联合给药组小鼠呈现出局部环绕的游泳轨迹，且AM组和联合给药组小鼠游泳轨迹更多集中在目标象限和平台处；NC组小鼠更多的呈现出四周环绕式的游泳轨迹，较为随机。(见附图2)

2.2、条件恐惧实验

2.2.1、关于实验

条件恐惧实验是检测学习记忆与环境条件刺激之间的关联的能力，反应大脑--主要为海马区的功能变化。条件恐惧设备是由两个条件恐惧箱、控制声音和电流的硬件及Panlab软件构成。条件恐惧箱A为白色正方体，底板为栅状，无特殊气味，条件恐惧箱B为黑色圆柱体，底板为平板，放有特殊的气味清新剂。

2.2.2、实验流程

实验设计分为两大阶段，第一阶段为Training Phase,第二阶段为Test Phase。Training Phase流程为开始有120s的Exploration,之后进入7次循环，具体为30s的声音刺激80db，在最后2s时，条件恐惧箱的电板将产生0.35mA的电刺激，随后声音刺激和电刺激一起停止，进入30s～60s不等的cond time，7次循环结束后，进入30s的Pre-End期，时间到后将小鼠从条件恐惧箱A中取出，放回笼盒中休息，全程均有white noise 30db。Test Phase分为场景恐惧测试及声音恐惧测试，场景恐惧测试流程为再次将小鼠放入与之前TrainingPhase相同的条件恐惧箱A中，给与white noise 180s，时间到后将小鼠从条件恐惧箱A中取出，放回笼盒中休息，全程均有white noise 30db；声音恐惧测试流程再次将小鼠放入与之前Training Phase形状、材料、颜色、气味均不相同的条件恐惧箱B中，在120s的Exploration之后，在箱中开始180s的声音刺激80db(与Training Phase相同的声刺激)，时间到后将小鼠从条件恐惧箱B中取出，放回笼盒中休息，全程均有white noise 30db。整个实验周期为48h，在0h时，对小鼠进行Training，在3h时对小鼠进行场景恐惧测试及声音恐惧测试，在24h时对小鼠进行场景恐惧测试及声音恐惧测试，测试结束后继续对其进行Training，48h时对小鼠进行场景恐惧测试及声音恐惧测试。每次替换小鼠时，用75％医用酒精擦拭对条件恐惧箱。Panlab软件全程记录小鼠在整个实验过程中处于各个状态的时间及占比，分为活跃状态(active)和凝滞状态(freezing)，即小鼠在条件恐惧箱中不动的时间大于2000ms为凝滞状态，其余时间为活跃状态。整个实验在条件恐惧箱中进行，并保持周围环境安静。

2.2.3、实验结果

对比早期干预的条件恐惧数据(NC＝10，AM＝10)可知：在context 3h测试中，AM组明显高于NC组(P<0.05)；24h、48h测试中，AM组均值较NC组低，但各组均无统计学差异。在cued测试，3h、24h、48hAM组均值高于NC组但统计学无差异。(见附图3)

2.4、各项指标检测

2.4.1、小鼠脑组织标本提取及保存、组织切片制作

1)小鼠完全麻醉后，将其固定在操作台上，用手术剪沿腹腔剪开腹部，接着向上剪破胸腔，暴露心脏，用血管钳固定心脏后，慢慢将针头已经磨平的灌注针插入左心室；

2)剪开右心耳，然后快速灌注0.9％生理盐水待小鼠四肢、舌头变白之后，用4％PFA灌流固定，整个PFA灌流时间约为20min；

3)PFA灌注之后，剪开头部皮肤，露出白色头盖骨。可以闻到多聚甲醛的刺鼻气味，由于多聚甲醛有毒，注意带上口罩防护；

4)将头盖骨小心剥开，露出白色的脑部(如果未灌注，脑部是血色或肉色)，逐渐向两边破开头盖骨直至剖到嗅球部位，然后准备将脑组织从中用镊子取出；

5)注意取脑时，将脑下部连接的神经逐条剪短(可看到视神经交叉)，待全部剪断后将脑整个剥离出来；

6)将剥离出来的全脑浸泡在4％PFA中，4℃冰箱过夜固定；

7)将4％PFA固定液换为15％蔗糖进行脱水，4℃冰箱过夜处理；

8)将15％蔗糖换为30％蔗糖继续进行脱水，4℃处理24-48h(防止冷冻切片时形成冰晶和孔洞)，初始脱水时脑会浮在蔗糖上面，待完全脱水后脑会沉底；

9)次日根据脑地大小进行锡箔纸折叠成盒，将30％蔗糖溶液中的脑取出进行OCT胶包埋，没过脑组织，将包埋好的脑组织放入-70℃冰箱；

10)次日进行脑切片，冰冻切片机提前遇冷，-20℃工作温度。切片厚度12μm，每个脑组织切5-10张冰冻切片，切好的片子如果不立即染色，放入-80℃冰箱备用。如果立即染色，先将其放置55℃烘箱进行烘干2h。

2.4.2、免疫荧光

1)-80℃取出切片，室温放置30min；

2)55℃烘箱烘干，时间2h；

3)洗涤玻片，1ⅹPBS清洗15minⅹ2次；0.2％PBST清洗15minⅹ2次；

4)用2％BSA进行封闭，室温1h；

5)0.2％BSA稀释一抗，4℃进行过夜孵育荧光一抗；

6)弃废液，0.2％PBST进行清洗，10minⅹ4次；

7)2％BSA稀释二抗，室温孵育荧光二抗90min；

8)弃废液，0.2％PBST清洗5min；1ⅹPBS清洗5minⅹ2次；

9)滴DAPI封片，注意不要有气泡。

2.4.3、实验结果

MAP-2指标的检测

MAP-2的表达与树突的生长、分支和重塑相一致，在调节突触可塑性方面起着关键的作用。免疫荧光结果显示：观察海马CA1区并进行放大，NC组神经突起数量极少，AM组神经突起数量较NC多(P<0.05)。(见附图4)

GAP43指标的检测

GAP43是一种生长相关的神经组织专一性蛋白，主要分布于生长锥，与神经生长发育、轴突生长及再生的关系密切。

免疫荧光结果显示:NC组荧光强度较弱，且海马回附近基本没有荧光，无法显示出完整的生长锥，AM组的荧光强度强于NC组，仍留有较完整的生长锥。(见附图5)

AM对AD模型鼠组织水平观察Aβ病理学变化结果

通过Thoflavin-T对冰冻切片的Aβ斑块进行染色，结果显示，对比NC组，AM组的小鼠海马区Aβ斑块数量明显下降(P<0.05)。(见附图6)

对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。

Claims (3)

1.miRNA-182、miRNA-188和miRNA-199a的抑制剂中的一种或多种在制备治疗AD药物中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述miRNA-182的抑制剂为Anti-miRmiRNA-182inhibitors，miRNA-188的抑制剂为Anti-miRmiRNA-188inhibitors，miRNA-199a的抑制剂为Anti-miRmiRNA-199a inhibitors。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物为注射制剂。

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