CN113134011A - miR-129在制备治疗抑郁症产品中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了miR‑129在制备治疗抑郁症产品中的应用。本发明发现在抑郁小鼠模型的内侧缰核过表达miR‑129能显著改善小鼠的抑郁症状，说明，miR‑129或调控miR‑129含量或表达量的物质可以用于治疗抑郁症。因此，小分子miR‑129可以作为新型抗抑郁药物，内侧缰核区域单次注射可以起到安全持久抗抑郁作用，在临床上具有很好的应用前景。

Description

miR-129在制备治疗抑郁症产品中的应用
技术领域
本发明涉及生物医学领域中，miR-129在制备治疗抑郁症产品中的应用。
背景技术
作为影响人类生活最严重的精神疾病之一，抑郁症发病率高，全球超3亿抑郁症患者，发病率高达11％，我国抑郁障碍发病率为3.02％。严重抑郁症(Major DepressiveDisorder，MDD)影响约16％的人口，是一个重要的致残原因。MDD的特征是情绪沮丧、无精打采、注意力不集中和自杀倾向的增加。最严重时，抑郁症可引致自杀。每年自杀死亡人数估计高达100万人。虽然对抑郁症已有行之有效的治疗办法，但全球只有不足一半的患者(在一些国家中仅有不到10％的患者)接受有效治疗。目前临床广泛应用的抗抑郁药物，包括单胺氧化酶的抑制剂、三环类药物以及单胺递质重摄取抑制剂等，通过不同的方式延长单胺递质在脑内的作用时效，发挥抗抑郁效果。然而，这类药物产生抗抑郁效果相对缓慢。虽然患者服药后大脑中单胺类神经递质的水平会在几小时内恢复到正常水平，但情绪的改善往往要到几周之后才会发生，无法快速缓解伴有急性自杀风险的抑郁。氯胺酮可以快速抗抑郁，但同时存在较大风险，具有一定的精神依赖性，并且过量可以致死。开发安全有效的抗抑郁药物成为抗抑郁研究重点。
miRNA是一类具有20～24个核苷酸长度的非编码单链RNA，在基因表达的转录后调节中发挥重要作用并参与多种生物学功能。越来越多的证据表明，miRNA在调节大脑功能的基本过程以及在神经系统疾病的发展和治疗中发挥着关键作用。2011年Baudry等人发现，作用于5-羟色胺能中缝神经元的氟西汀可降低海马miR-16的含量，进而增加5-羟色胺转运体(SERT)和bcl-2的水平，从而发挥抗抑郁作用；2013年Zhonghua Hu等人发现miR-191和miR-135的表达变化在维持脊柱重建方面发挥巨大作用；2016年Angélica Torres-Berrío等人发现，小鼠前额叶皮层锥体神经元中Netrin-1信号受体DCC的上调会导致小鼠社交回避和快感缺失，而miR-218可通过抑制DCC发挥抗抑郁的作用；2017年Shile Qi等人发现miR-132在MDD的发病机制和神经机制中起着关键作用，MDD患者脑内miR-132显著升高。由此可见，miRNA在MDD中发挥重要的作用。miR-129家族由两个成员组成：位于染色体7q32.1上的miR-129-1和位于染色体11p11.2上的miR-129-2，它们含有共同的种子序列“UUUUUGC”。目前对miR-129功能研究主要集中在肿瘤发生和发展的调控作用，在其他生物进程中的作用仍知之甚少。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是如何治疗或预防抑郁症。
为解决上述技术问题，本发明首先提供了名称为miR-129的RNA或调控miR-129含量或表达量的物质在制备治疗和/或预防抑郁症产品中的应用。
上述应用中，miR-129可为序列表中序列2所示的RNA。
上述应用中，所述调控miR-129含量或表达量的物质可为下述B1)至B9)中的任一种：
B1)转录miR-129的核酸分子；
B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；
B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体、或含有B2)所述表达盒的重组载体；
B4)含有B1)所述核酸分子的重组微生物、或含有B2)所述表达盒的重组微生物、或含有B3)所述重组载体的重组微生物；
B5)含有B1)所述核酸分子的转基因细胞系、或含有B2)所述表达盒的转基因细胞系；
B6)含有B1)所述核酸分子的转基因组织、或含有B2)所述表达盒的转基因组织；
B7)含有B1)所述核酸分子的转基因器官、或含有B2)所述表达盒的转基因器官。
本发明还提供了miR-129或调控miR-129含量或表达量的物质在制备谷氨酸吞噬能力增强细胞模型或ATP释放能力增强细胞模型中的应用。
上述应用中，所述调控miR-129含量或表达量的物质可为下述B1)至B9)中的任一种：
B1)转录miR-129的核酸分子；
B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；
B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体、或含有B2)所述表达盒的重组载体；
B4)含有B1)所述核酸分子的重组微生物、或含有B2)所述表达盒的重组微生物、或含有B3)所述重组载体的重组微生物；
B5)含有B1)所述核酸分子的转基因细胞系、或含有B2)所述表达盒的转基因细胞系；
B6)含有B1)所述核酸分子的转基因组织、或含有B2)所述表达盒的转基因组织；
B7)含有B1)所述核酸分子的转基因器官、或含有B2)所述表达盒的转基因器官。
上述应用中，B1)所述核酸分子可为如下b11)或b12)：
b11)序列1的第106-126位所示的DNA分子；
b12)序列1所示的DNA分子。
其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA。
本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明的转录miR-129的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明的转录miR-129的核苷酸序列75％或者更高同一性的核苷酸，只要转录miR-129且具有相同功能，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。
上述应用中，B2)所述的表达盒(miR-129基因表达盒)，是指能够在宿主细胞中表达miR-129的DNA，该DNA不但可包括启动miR-129基因转录的启动子，还可包括终止miR-129基因转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。
可用现有的表达载体构建含有所述miR-129基因表达盒的重组载体。
所述载体可为质粒、黏粒、噬菌体或病毒载体(如腺相关病毒载体)。
上述应用中，B3)所述重组载体为表达miR-129的重组腺相关病毒载体。在本发明的一个实施例中，B3)所述重组载体为AAV-GFAP::miR-129。
上述应用中，所述微生物可为酵母、细菌、藻或真菌。
上述应用中，所述转基因细胞系、转基因组织和转基因器官均不包括繁殖材料。
上述应用中，所述细胞模型可为星形胶质细胞模型。
本发明还提供了一种抑郁症治疗产品，所述产品含有miR-129或所述调控miR-129含量或表达量的物质。
所述产品的活性可为miR-129或所述调控miR-129含量或表达量的物质。
所述产品可为药物或疫苗。
本发明发现在抑郁小鼠模型的内侧缰核表达miR-129能显著改善小鼠的抑郁症状，说明，miR-129或调控miR-129含量或表达量的物质可以用于治疗抑郁症。因此，小分子miR-129可以作为新型抗抑郁药物，内侧缰核区域单次注射可以起到安全持久抗抑郁作用，在临床上具有很好的应用前景。
附图说明
图1为小鼠抑郁模型构建及抑郁样行为检测实验流程图。
图2为CRS造模小鼠出现明显的抑郁样行为。(a)CRS造模组(实验组)和对照组(Crtl)悬尾实验结果(Ctrl组n＝8，CRS组n＝9)；(b)CRS造模组(实验组)和对照组(Crtl)强迫游泳实验结果(Ctrl组n＝8，CRS组n＝9)；(c)CRS抑郁造模组(实验组)和对照组(Crtl)每日被毛评分趋势图(n＝7)；(d)CRS抑郁造模组(实验组)和对照组(Crtl)造模后(即第14天)被毛评分结果(n＝7)。*，P<0.05；**，P<0.01；***，P<0.001；****，P<0.0001。
图3为内侧缰核病毒实验流程图。
图4为内侧缰核注射miR-129表达病毒可缓解小鼠抑郁样行为。(a)内侧缰核注射miR-129过表达病毒后悬尾实验和强迫游泳实验结果(悬尾实验，实验组n＝8，对照组n＝7；强迫游泳实验，实验组n＝8，对照组n＝7)；(b)2个月之后检测实验组和对照组悬尾实验和强迫游泳实验结果(悬尾实验，实验组n＝7，对照组n＝6；强迫游泳实验，实验组n＝7，对照组n＝6)。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。每幅图左侧均为对照组结果，右侧均为实验组结果。
图5为星形胶质细胞的鉴定结果。
图6为星形胶质细胞表达miR-129可增强谷氨酸吞噬能力。(a)C57BL/6小鼠原代星形胶质细胞感染AAV-GFAP::miR-129后胞内谷氨酸检测结果，No Astrocyle表示空白对照(Blank)；(b-c)C57BL/6小鼠星形胶质细胞感染AAV-GFAP::miR-129后谷氨酸转运体和谷氨酰胺合成酶表达的qRT-PCR结果，每幅图中左侧均为对照病毒AAV-CON结果，右侧均为AAV-GFAP::miR-129病毒结果。**P<0.01，***P<0.001；****，P<0.0001。
图7为星形胶质细胞过表达miR-129可增强ATP释放能力。(a)感染AAV-GFAP::miR-129星形胶质细胞加入100μM谷氨酸后不同时间段ATP释放量检测；(b)感染AAV-GFAP::miR-129星形胶质细胞加入100μM谷氨酸后不同时间段胞内ATP含量检测。每幅图中左侧均为对照病毒AAV-CON结果，右侧均为AAV-GFAP::miR-129病毒结果。ns表示无显著差异，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****，P<0.0001。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂、仪器等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。下述实施例中，如无特殊说明，序列表中各核苷酸序列的第1位均为相应DNA/RNA的5′末端核苷酸，末位均为相应DNA/RNA的3′末端核苷酸。
C57BL/6小鼠：北京维通利华实验动物技术有限公司。
AAV-GFAP::miR-129：上海吉凯基因科技有限公司的AAV病毒(腺相关病毒)，AAV-GFAP::miR-129含有GFP的编码基因与miR-129前体的编码基因(序列为序列表中序列1)。经鉴定，AAV-GFAP::miR-129能够表达GFP与序列表中序列2所示的miR-129。MiR-129的鉴定所用引物序列为：5’-CTTTTTGCGGTCTGGGCTTGC-3’(序列1的第106-126位)。
对照病毒AAV-Con：上海吉凯基因科技有限公司的AAV病毒。该病毒与AAV-GFAP::miR-129的区别仅在于对照病毒AAV-Con不含有miR-129前体的编码基因。
实施例1、
一、动物材料
SPF级雄性C57BL/6小鼠，北京维通利华实验动物技术有限公司产品，鼠龄为8-10周，体重平均在21-25g之间，动物饲养于太平路27号院军事医学研究院实验动物中心。小鼠饲养环境良好，标准鼠粮，清洁饮水，自由饮食，相对温度为20-24℃，相对湿度为55％±15％，光照节律为明场12h暗场12h，照明度为280-350LX。所有动物实验均按照军事医学研究院批准的“实验动物的护理和使用指南”进行。动物实验机构伦理审查委员会批准了所有实验方案。
二、抑郁模型小鼠的构建
1、抑郁模型小鼠的构建
8周龄C57BL/6小鼠随机分为两组，即实验组和对照组，实验组10只，对照组10只。对于实验组小鼠采取慢性束缚应激(CRS)来构建抑郁模型，将8周龄C57BL/6小鼠放置于带孔的50ml离心管中，使其承受慢性束缚应激，连续14天，每天进行3h，将开始进行慢性束缚应激实验的当天记为第1天(D1)。在最后一次束缚后24h(即第15天(D15))进行悬尾实验，在第16天(D16)进行强迫游泳实验，检测抑郁样行为，流程图如图1所示。对照组不进行任何处理，与实验组小鼠同时进行强迫游泳实验和悬尾实验。
2、行为学实验
2.1强迫游泳实验(FST)
强迫游泳实验广泛用于潜在抗抑郁药物的基础研究和筛选，也是评价啮齿类动物模型的抑郁类行为最常用的实验之一。该实验基于小鼠天生厌恶游泳的特点，将小鼠放入局限且不可逃避的压迫环境，正常状态下，小鼠将通过游泳在水中寻找逃生路径，设计出行为无助情境，以衡量小鼠的抑郁样行为。将小鼠轻柔地放入盛有水的玻璃烧杯中(直径12cm，高度25cm)，水温为23-25℃，并使其在正常光照下游泳6min。摄像机从烧杯侧面记录动物游泳的具体细节。开始的2min为小鼠的适应期，之后4min进入测试期，记录小鼠的不动时间。不动时间被定义为动物保持漂浮或静止不动，仅能保持水中平衡所需的时间。不动时间是由一名对动物分组不知情的观察者计算的。
2.2悬尾试验(TST)
悬尾实验是一种经典而又能快速评价抗抑郁药物、兴奋药物、镇静药物药效的方法。其原理是利用小鼠悬尾后企图逃脱但又无法逃脱，从而放弃挣扎，进入特有的抑郁不动状态，被研究者们视作实验动物不想为逃跑做出任何努力而表现出的绝望行为。正如MDD患者，在面对压力或者其他困难情境时所表现出的消极被动，放弃做出任何努力去改变现状的行为和机会一样。实验步骤如下：将小鼠尾巴挂在铁架(直径15厘米，高30厘米)上悬吊6min，摄像机从侧面记录动物行为的具体细节。开始的1min为小鼠的适应期，之后5min进入测试期，记录小鼠在悬尾期间的不动时间。不动时间被定义为动物保持静止，只有在空中保持平衡所需动作的时间。不动时间是由一名对动物分组不知情的观察者计算的。在录像时期掉下铁架的小鼠实验数据予以剔除。
结果显示，慢性束缚应激可以成功构建抑郁模型小鼠，步骤1实验结束后，与对照组相比实验组小鼠表现为在慢性束缚应激后在悬尾实验(TST)和强迫游泳实验(FST)中不动时间显著延长(图2中a和b)。
2.3被毛评分实验
在抑郁小鼠模型中，被毛状态是一个可靠且得到充分验证的指标。步骤1实验过程中，每天对动物毛皮的身体状态进行评估，总被毛评分是头、颈、背毛、腹毛、尾巴、前爪和后爪七个不同身体部位得分的总和。对于这七个区域中的每一个区域，被毛整洁的部位得1分，被毛凌乱的部位得0分。计算7个部位得分的综合以评价小鼠抑郁样行为。被毛评分是由对动物分组不知情的观察者计算的。
被毛状态评分实验结果发现，与对照组相比，实验组小鼠(CRS造模小鼠)被毛评分显著下降(图2中c)。以上结果表明，连续14天慢性束缚应激(CRS)加重了小鼠的抑郁样行为，可以构建抑郁模型小鼠。
三、内侧缰核脑立体定位注射实验
取8周龄C57BL/6小鼠随机分为两组，即实验组和对照组，每组10只。对于实验组与对照组小鼠均采取慢性束缚应激(CRS)来构建抑郁模型，将8周龄C57BL/6小鼠放置于带孔的50ml离心管中，使其承受慢性束缚应激，连续14天，每天进行3h，将开始进行慢性束缚应激实验的当天记为第0天(D0)。在第14天(D14)在内侧缰核进行病毒注射，在第36天(D36)和第97天(D97)分别进行悬尾实验，在第37天(D37)和第98天(D98)分别进行强迫游泳实验，流程图见图3。
内侧缰核病毒注射步骤如下：
1术前准备
微量注射针先吸取少量PBS溶液，洗干净后在空气中测试注射器是否通畅，然后吸取一定量的腺相关病毒AAV-GFAP::miR-129悬浮液或对照病毒AAV-Con悬浮液，并将显微注射器固定在立体定位仪上，微量注射泵向下调节注射器直到其能够恰好挤出少许药物。
其中，AAV-GFAP::miR-129悬浮液由磷酸盐缓冲液(PBS)悬浮AAV-GFAP::miR-129得到，AAV-GFAP::miR-129悬浮液病毒滴度为2.62×1012v.g/mL；AAV-Con悬浮液由磷酸盐缓冲液(PBS)悬浮AAV-Con得到，AAV-Con悬浮液病毒滴度为1.25×1013v.g/mL。
2小鼠的麻醉与固定
抓取小鼠，称量体重，使用阿弗丁(2-2-2-三溴乙醇，Sigma)，按照240mg/kg体重的比例进行腹腔注射麻醉；轻掐鼠尾和脚趾，无明显反应代表小鼠进入深度麻醉；
去除头顶毛发并将其固定于立体定位仪上，先把小鼠门齿固定，然后右侧耳板顶住一侧，把小鼠耳朵头皮整体向后拉，再把另一侧耳板紧紧固定到相同高度，后检测小鼠固定情况(头部不动，体尾不掉)。
3小鼠皮肤消毒
使用酒精棉球擦拭手术器械，用镊子夹起头皮，沿中缝剪开；
用棉球剃掉表面结缔组织，将杂质剥离并充分暴露头骨，给小鼠眼睛涂上红霉素眼膏(防止手术过程中小鼠角膜干燥和强光灼伤)。
4立体定位注射
使用棉签蘸取少许双氧水擦拭头骨以更清晰地显示前囟等解剖结构；
以前囟Bregma为原点，移动注射器至前囟上方，当针头刚刚接触前囟颅骨表面时停针，以前囟为原点：将桌面数显仪X,Y,Z轴归零；
查看内侧缰核坐标(ML：±0.25mm；AP：-1.34mm；DV：2.75mm)，移动注射器针头到目标脑区上方停针并标记(标记用马克笔点一个黑点)，小心地用颅骨钻在注射位点处轻磨颅骨，将颅骨慢慢打孔，如果在此过程中有出血，可以用很小的医药棉球拉成长条形将血吸走，钻孔时一定要控制好，否则很容易在钻通颅骨后一不小心钻头进入脑组织，造成损伤；
设置微量注射泵参数，每只小鼠注射体积0.5μl，速度0.25μl/min，并留针6-10min，一方面让注射的目标药物在脑内扩散，另一方面防止目标药物随着针拔出而漏出核团。
实验组小鼠注射AAV-GFAP::miR-129悬浮液，对照组小鼠注射对照病毒AAV-Con悬浮液。
3.5术后处理
将鼠头皮充分缝合，放置于加热垫等小鼠复苏后放归鼠笼。
结果显示，与不表达miR-129的对照组小鼠相比，表达miR-129的实验组小鼠在悬尾实验(TST)和强迫游泳实验(FST)中不动时间明显减少，图4中a；2个月之后的悬尾实验(TST)和强迫游泳实验(FST)结果类似，图4中b。以上实验表明，内侧缰核miR-129的表达可显著缓解小鼠抑郁样行为，且这种治疗作用可长期存在。
四、病毒感染星形胶质细胞实验
1、星形胶质细胞的病毒感染
1.1、星形胶质细胞的分离纯化
(1)取新生24h内的C57BL/6小鼠乳鼠，75％的乙醇水溶液浸泡消毒，无菌条件下取出大脑并置于预冷的PBS液中；
(2)解剖显微镜下剥除脑膜及血管，分离出大脑皮层组织；
(3)使用枪头吹散脑组织，0.25％胰酶((Gibco)37℃消化5min，之后用含有10％FBS的DMEM-F12培养基终止消化，吹散后放置于筛网(100目在上，200目在下)上进行机械过滤以制备单细胞悬液；
(4)1500rpm/5min离心，之后倒掉上清，使用含有10％FBS的DMEM-F12培养基吹散细胞，种于预先用多聚赖氨酸铺板的细胞培养皿中，放于含5％C02的37℃细胞培养箱中；
(5)之后每隔3d换液，观察所得星形胶质细胞(鉴定结果见图5中a、b)生长情况，7d左右待细胞汇合度达70％时传代培养；
(6)一般细胞传代至P2-P3代开始进行实验。
星形胶质细胞的鉴定步骤如下：
细胞接种于24孔板内的盖玻片上(盖玻片预先泡酸，漂洗和消毒处理)，4d后取出爬满细胞的盖玻片，进行GFAP免疫荧光鉴定，步骤如下：
(1)培养于盖玻片上的细胞，0.01M PBS缓冲液漂洗3min×3次，加入4％多聚甲醛，室温固定30min,
(2)0.01M PBS漂洗5min×3次；
(3)0.3％TritonX-100，室温30min；
(4)正常山羊血清封闭，37℃、30min；
(5)加一抗小鼠抗GFAP单克隆抗体(1：200，Milipore，MAB360)，4℃冰箱湿盒孵育过夜；
(6)0.01M PBS漂洗5min×3次；
(7)加二抗羊抗小鼠FITC单克隆抗体(1:400，ImmunoResearch，150565)，室温适合内避光孵育1h；
(8)0.01M PBS漂洗5min×3次；
(9)30％甘油封片，倒置荧光显微镜观察和计数.
倒置荧光显微镜下计数，统计GFAP阳性细胞的百分比，以确定星形胶质细胞的阳性率；另一部分进行qPCR检测。
qPCR鉴定星形胶质细胞：
1.细胞裂解
将星形胶质细胞提取总RNA，并反转录，利用如下引物进行定量PCR；
名称 Forward Primer(5’-3’) Reverse Primer(5’-3’)
Actin TCACTATTGGCAACGAGCGGTTC CAGCACTGTGTTGGCATAGAGGTC
Aldh1l1 AGCAGAGGCCA TTCACAACT GCCACCAGTCCTGAAGTGTT
Aqp4 CTCCCTTTGCTTTGGACTCA CGA TGCTGA TCTTTCGTGTG
GFAP GCCACCAGTAACA TGCAAGA GGCGA TAGTCGTTAGCTTCG
Vim CTGCACGA TGAAGAGA TCCA AGCCACGCTTTCA TACTGCT
Aif1 CCGAGGAGACGTTCAGCTAC GACCAGTTGGCCTCTTGTGT
Cx3cr1 AGCTCACGACTGCCTTCTTC GTCCGGTTGTTCA TGGAGTT
Snap25 GAGCAGGTGAGCGGCA TCA TC CGTTGGTTGGCTTCA TCAA TTCTGG
Syt1 GACTA TGACAAGATTGGCAAGAACGAC A TGGCA TCAACCTCCTCCTCTACC
1.2、病毒感染星形胶质细胞
(1)将所培养的星形胶质细胞种于六孔板，每孔种4X105细胞，第二天待细胞长至50-70％汇合度时，进行病毒感染；
(2)MOI以104、105和106进行梯度摸索，筛选出最适MOI值为105；
(3)感染实验分为两组，分别感染AAV-CON和AAV-GFAP::miR-129；病毒感染2h后再补等体积的10％FBS的DMEM-F12培养液，放于含5％C02的37℃细胞培养箱中过夜；
(4)感染12-24h后换新含有10％FBS的DMEM-F12培养液；
(5)感染至72-96h，荧光显微镜下可观察到大量GFP表达。
2、病毒感染星形胶质细胞谷氨酸吞噬能力检测
使用谷氨酸检测试剂盒(Sigma，MAK004)进行星形胶质细胞谷氨酸检测，步骤如下：
(1)谷氨酸检测试剂盒主要包括以下试剂：
1.谷氨酸测定缓冲液(Glutamate Assay Buffer)：25mL(货号MAK004A)；
2.谷氨酸酶混合液(Glutamate Enzyme Mix)：1vl(货号MAK004B)；
3.谷氨酸显影剂(Glutamate Developer)：1vl(货号MAK004C)；
4.谷氨酸标准液(Glutamate Standard，0.1M)：0.1ml(货号MAK004D)。
(2)感染病毒的星形胶质细胞在不含钙镁的HBSS缓冲液中孵育30min，然后在含有100μM谷氨酸的HBSS中孵育1.5h，加入ATP以促进吞噬；同时设置空白对照组，即在无细胞的孔板里加入100μM谷氨酸的HBSS1.5h；
(3)收集细胞加入谷氨酸测定缓冲液(每1X106细胞加100μl缓冲液)，13000g离心10min，取上清进行谷氨酸检测；
(4)对于标准品，990μL谷氨酸测定缓冲液稀释10μL的0.1M谷氨酸标准溶液，以制备1mM的标准溶液。将0、2、4、6、8和10μL 1mM标准溶液添加到96孔板中，产生0(空白)，2、4、6、8和10nmole/孔标准液。在每个孔中添加谷氨酸测定缓冲液，使体积达到50μL。
(5)按照以下表配制反应混合物。每个反应(孔)需要100μL反应混合物。
试剂 空白对照 样本/标准品
Glutamate Assay Buffer 92μl 90μl
Glutamate Developer 8μl 8μl
Glutamate Enzyme Mix 2μl
(6)在每个孔中加入100μL适当的反应混合物。使用卧式摇床或移液器充分混合，然后将反应液在37℃孵育30分钟。孵育期间保护板避光；
(7)利用酶标仪(Thermo)，测量450nm(A450)的吸光度，根据标准曲线计算出样品中谷氨酸的浓度。
qRT-PCR检测谷氨酸转运体GLT-1、GLAST和谷氨酰胺合成酶(GS)基因表达情况，Actin为内参，各引物序列如下表所示：
名称 正向引物 反向引物
Actin TCACTATTGGCAACGAGCGGTTC CAGCACTGTGTTGGCATAGAGGTC
GLT-1 TTTTTGCTGGCATATTCCAAGC AGATTATCTTCCAAGCAACGGA
GLAST CAGAGAAGGTAAAATCGTGCAG TTTAAAGCAGGCTTCTACCAGA
GS TGAGAAAGTCCAAGCCATGTAT CAGACTGAAAGGTACTAGAGCC
谷氨酸检测结果显示，感染AAV-GFAP::miR-129的星形胶质细胞胞内谷氨酸含量显著升高(图6中a)；qRT-PCR结果显示，感染AAV-GFAP::miR-129的星形胶质细胞谷氨酸转运体GLT-1、GLAST和谷氨酰胺合成酶(GS)表达均显著升高(图6中b-c)。说明，星形胶质细胞过表达miR-129可增强谷氨酸吞噬能力。
3、星形胶质细胞过表达miR-129可增强ATP释放能力
对AAV-GFAP::miR-129感染组和对照AAV-Con感染组细胞加入100μM谷氨酸刺激，然后在刺激5min、30min和60min分别收取部分细胞上清液，并在刺激60min后对星形胶质细胞收样，利用ATP检测试剂盒(Beyotime，S0026)分别检测不同时间段ATP的释放量和星形胶质细胞细胞ATP含量。此外利用qRT-PCR检测ATP受体的变化。
ATP检测结果显示，AAV-GFAP::miR-129组星形胶质细胞ATP的释放量显著升高(图7中a)，且胞内ATP含量也显著升高(图7中b)。以上结果表明，星形胶质细胞过表达miR-129可增强ATP释放能力。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。
<110> 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院
<120> miR-129在制备治疗抑郁症产品中的应用
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 273
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 1
tccaggtccc agctctgctt ccctgacccc atctgcagtc gcaagcaagc cccagccctg 60
gaggggctgc accctgcaac cttcccacag ctgtctcctt tggatctttt tgcggtctgg 120
gcttgctgtt ctctcgacag tagtcaggaa gcccttaccc caaaaagtat ctacgggagg 180
cttggtctac aggggagacc cccaagggct ccaggtgagt cacaccaaac tcaagactac 240
catgtggatc cagggcgtct ttgccatacc tta 273
<210> 2
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 2
cuuuuugcgg ucugggcuug c 21

Claims (9)

1.名称为miR-129的RNA或调控miR-129含量或表达量的物质在制备治疗和/或预防抑郁症产品中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：miR-129为序列表中序列2所示的RNA。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述调控miR-129含量或表达量的物质为下述B1)至B9)中的任一种：
B1)转录miR-129的核酸分子；
B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；
B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体、或含有B2)所述表达盒的重组载体；
B4)含有B1)所述核酸分子的重组微生物、或含有B2)所述表达盒的重组微生物、或含有B3)所述重组载体的重组微生物；
B5)含有B1)所述核酸分子的转基因细胞系、或含有B2)所述表达盒的转基因细胞系；
B6)含有B1)所述核酸分子的转基因组织、或含有B2)所述表达盒的转基因组织；
B7)含有B1)所述核酸分子的转基因器官、或含有B2)所述表达盒的转基因器官。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：B1)所述核酸分子为如下b11)或b12)：
b11)序列1的第106-126位所示的DNA分子；
b12)序列1所示的DNA分子；
B3)所述重组载体为过表达miR-129的重组腺相关病毒载体。
5.miR-129或调控miR-129含量或表达量的物质在制备谷氨酸吞噬能力增强细胞模型或ATP释放能力增强细胞模型中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述调控miR-129含量或表达量的物质为下述B1)至B9)中的任一种：
B1)转录miR-129的核酸分子；
B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；
B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体、或含有B2)所述表达盒的重组载体；
B4)含有B1)所述核酸分子的重组微生物、或含有B2)所述表达盒的重组微生物、或含有B3)所述重组载体的重组微生物；
B5)含有B1)所述核酸分子的转基因细胞系、或含有B2)所述表达盒的转基因细胞系；
B6)含有B1)所述核酸分子的转基因组织、或含有B2)所述表达盒的转基因组织；
B7)含有B1)所述核酸分子的转基因器官、或含有B2)所述表达盒的转基因器官。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：B1)所述核酸分子为如下b11)或b12)：
b11)序列1的第106-126位所示的DNA分子；
b12)序列1所示的DNA分子；
B3)所述重组载体为过表达miR-129的重组腺相关病毒载体。
8.根据权利要求6或7所述的应用，其特征在于：所述细胞模型为星形胶质细胞模型。
9.抑郁症治疗产品，含有miR-129或权利要求3或4中所述调控miR-129含量或表达量的物质。
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