CN114702600A - SNAP25蛋白Ser187位点磷酸化抑制剂的用途 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了SNAP25蛋白Ser187位点磷酸化抑制剂的用途，涉及生物医学肽领域。本发明所要解决的技术问题是如何预防、干预、改善和/或治疗抑郁症。本发明具体地公开了SNAP25蛋白Ser187位点磷酸化抑制剂在制备预防、干预、改善和/或治疗抑郁症的产品中的应用，及SNAP25蛋白的Ser187位点或pS187‑SNAP25蛋白作为靶点在筛选或开发预防、干预、改善和/或治疗抑郁症的产品中的应用。本发明公开了氨基酸序列为SEQ ID No.1的干扰肽TAT‑S187在抑郁症治疗中的应用，实验表明本发明干扰肽干预SNAP25磷酸化的特异性位点可以纠正抑郁症谷氨酸水平的异常，进而干预或改善抑郁症。

Description

SNAP25蛋白Ser187位点磷酸化抑制剂的用途
技术领域
本发明属于生物医学肽领域，具体涉及SNAP25蛋白Ser187位点磷酸化抑制剂的用途。
背景技术
抑郁症又称抑郁障碍，是一种常见的以抑郁情绪为主的心境障碍或情感障碍，呈慢性、反复发作，以持续的情绪低落、兴趣与愉悦感丧失和精力减退为主要症状，具有高患病率、高致残率、高负担率的特点。谷氨酸系统的功能失衡是抑郁症病理过程的重要原因。谷氨酸（Glutamic acid，Glu）是哺乳动物中枢神经系统中最重要的兴奋性神经递质，脑内大约60%的神经元利用谷氨酸作为主要的神经递质。谷氨酸水平的异常变化会导致神经元树突棘形成异常，进而导致神经功能异常。临床数据表明，抑郁症患者血清、脑脊液中的谷氨酸水平长期显著高于基础值。研究表明，患有重度抑郁症的病人的额叶皮质区谷氨酸水平也显著上升。因此，以纠正谷氨酸水平异常为目标研究抑郁症的病理机制，有助于发现新的抗抑郁药靶点。
突触体相关蛋白25（Synaptosome Associated Protein 25，SNAP25）是囊泡运输家族的一员，特异性表达在中枢神经系统，受蛋白激酶C的磷酸化调控，介导含神经递质（谷氨酸）的囊泡的分泌过程。研究发现SNAP25与抑郁症相关并且磷酸化的SNAP25参与小鼠的应激行为。因此以磷酸化SNAP25为目标探究谷氨酸水平异常的抑郁症病理机制，可为抑郁症的治疗、预防、干预和/或改善提供新的抗抑郁药靶点及相关靶点药物。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是如何预防、干预、改善和/或治疗抑郁症。
本发明的目的是提供一种SNAP25蛋白的Ser187位点或Ser187位点磷酸化的SNAP25蛋白作为靶点在抑郁症治疗中的应用，和/或，提供一种SNAP25蛋白Ser187位点磷酸化抑制剂（如干扰肽）在制备预防、干预、改善和/或治疗抑郁症的产品中的应用。所要解决的技术问题不限于所描述的技术主题，本领域技术人员通过以下描述可以清楚地理解本文未提及的其它技术主题。
为了实现上述目的，本发明首先提供了SNAP25蛋白Ser187位点磷酸化抑制剂在制备预防、干预、改善和/或治疗抑郁症的产品中的应用。
所述SNAP25蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。
所述SNAP25蛋白Ser187位点为SNAP25蛋白（SEQ ID No.2）的第187位丝氨酸位点。
上述应用中，所述抑制剂可具有下述至少一种功能：
C1）抑制或降低SNAP25蛋白Ser187位点的磷酸化水平；
C2）抑制或降低Ser187位点磷酸化的SNAP25蛋白的表达；
C3）抑制或降低抑郁症患者脑中谷氨酸含量。
所述Ser187位点磷酸化的SNAP25蛋白名称为pS187-SNAP25。
上述应用中，所述抑制剂可为抑制SNAP25蛋白Ser187位点的磷酸化水平的物质或抑制Ser187位点磷酸化的SNAP25蛋白（pS187-SNAP25蛋白）的含量和/或活性的物质。
上述应用中，所述抑制剂可为核酸分子、碳水化合物、脂、小分子化合物、抗体、多肽、蛋白、基因编辑载体、慢病毒或腺相关病毒中的一种或多种。
上述应用中，所述多肽名称为TAT-S187，可为下述任一种：
A1）氨基酸序列是SEQ ID No.1的多肽；
A2）将SEQ ID No.1的氨基酸序列经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与A1）所示的多肽具有80％以上的同一性且具有抑制SNAP25蛋白Ser187位点磷酸化的功能的多肽；
A3）在A1）或A2）的N端和/或C端连接标签得到的融合多肽；
A4）在A1）或A2）的N端和/或C端和/或氨基酸侧链基团上进行修饰得到的具有相同功能的多肽衍生物。
所述多肽TAT-S187为抑制SNAP25蛋白第187位丝氨酸磷酸化的干扰肽。
在本发明中，术语“多肽TAT-S187”和“干扰肽TAT-S187”具有相同的含义，可互换使用。
A3）中所述标签包括但不限于：GST（谷胱甘肽巯基转移酶）标签蛋白、His6标签蛋白（His-tag）、MBP（麦芽糖结合蛋白）标签蛋白、Flag标签蛋白、SUMO标签蛋白、HA标签蛋白、Myc标签蛋白、eGFP（增强型绿色荧光蛋白）、eCFP（增强型青色荧光蛋白）、eYFP（增强型黄绿色荧光蛋白）、mCherry（单体红色荧光蛋白）或AviTag标签蛋白。
A4）所述修饰可为氨基化、酰胺化、羟基化、羧基化、羰基化、烷基化、乙酰化、磷酸化、酯化、糖基化、环化、生物素化、荧光基团修饰、聚乙二醇PEG修饰或固定化修饰。
本文中，所述80％以上的同一性可为至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的同一性。
本文中，同一性是指氨基酸序列或核苷酸序列的同一性。可使用国际互联网上的同源性检索站点测定氨基酸序列的同一性，如NCBI主页网站的BLAST网页。
本发明所述多肽TAT-S187（RKKRRQRRRRIMEKADSNKTRIDE）为穿膜肽（RKKRRQRRR）与活性肽（RIMEKADSNKTRIDE）的嵌合肽，所述穿膜肽是来自HIV病毒的Tat蛋白，本领域技术人员应当理解，将活性肽和穿膜肽嵌合的目的主要在于使活性肽更好地到达作用靶点，因此，适用于本申请的穿膜肽并不局限于特定种类，只要能实现穿膜的目的即可。
术语“嵌合肽”是这样一种肽，其具有不天然彼此相关联的双组分肽或多组分肽，其作为融合蛋白或通过化学连接而彼此接合。
术语“穿膜肽”（penetratin）也称为细胞膜转导肽、细胞穿透肽或内化肽，在蛋白质药物领域被广泛使用，其功能是促进与其结合的活性肽被细胞摄取和吸收，即可以将多肽分子或药物分子等带入到细胞内发挥生物学活性。这类物质均为带有正电荷的长短不等的多肽片段，其中富含精氨酸、赖氨酸等碱性氨基酸残基，二级结构皆具有α-螺旋的空间构象。
本发明还提供了与所述多肽TAT-S187相关的生物材料在制备预防、干预、改善和/或治疗抑郁症的产品中的应用，所述生物材料可为下述任一种：
B1）编码所述多肽TAT-S187的核酸分子；
B2）含有B1）所述核酸分子的表达盒；
B3）含有B1）所述核酸分子的重组载体、或含有B2）所述表达盒的重组载体；
B4）含有B1）所述核酸分子的重组微生物、或含有B2）所述表达盒的重组微生物、或含有B3）所述重组载体的重组微生物；
B5）含有B1）所述核酸分子的细胞系、或含有B2）所述表达盒的细胞系、或含有B3）所述重组载体的细胞系。
上述生物材料中，所述载体是本领域技术人员公知的，包括但不限于：质粒、噬菌体（如λ噬菌体或M13丝状噬菌体等）、黏粒（即柯斯质粒）、Ti质粒或病毒载体。
所述微生物可为酵母、细菌、藻或真菌。其中，细菌可来自埃希氏菌属（Escherichia），欧文氏菌（Erwinia），根癌农杆菌属（Agrobacterium）、黄杆菌属（Flavobacterium），产碱菌属（Alcaligenes），假单胞菌属（Pseudomonas），芽孢杆菌属（Bacillus）等。
所述细胞系（宿主细胞）是指可用于导入载体的细胞，其包括但不限于：真核细胞（如酵母细胞、曲霉菌）、动物细胞（如哺乳动物细胞、昆虫细胞）或原核细胞。
术语“细胞”和“细胞系”可互换使用，并且所有这类名称都包括其后代。
本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化或点突变的方法，对本发明的编码多肽TAT-S187的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明分离得到的多肽TAT-S187的核苷酸序列75％或者更高同一性的核苷酸，只要编码多肽TAT-S187且具有多肽TAT-S187功能，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。
上述75％或者更高同一性，可为80％、85％、90％或95％以上的同一性。
本发明还提供了预防、干预、改善和/或治疗抑郁症的药物组合物，所述药物组合物包括所述多肽TAT-S187。
进一步地，所述药物组合物还含有一种或多种药学上可接受的载体。
所述药学上可接受的载体可为稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、吸附载体、表面活性剂或润滑剂但不限于此。
所述药物组合物可用于预防、干预、改善和/或治疗抑郁症。
本发明还提供了SNAP25蛋白的Ser187位点或Ser187位点磷酸化的SNAP25蛋白（pS187-SNAP25蛋白）作为靶点在筛选或开发预防、干预、改善和/或治疗抑郁症的产品中的应用。
本发明还提供了预防、干预、改善和/或治疗抑郁症的药物的筛选方法，所述方法包括利用抑制SNAP25蛋白Ser187位点的磷酸化水平的物质或抑制Ser187位点磷酸化的SNAP25蛋白的含量和/或活性的物质作为候选药物进行病理实验、临床试验或治疗，筛选出预防、干预、改善和/或治疗抑郁症的药物。
本文中，所述SNAP25蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。
所述多肽TAT-S187，和/或，所述生物材料也在本发明的保护范围内。
本文中，所述产品可为试剂或药物。
上述应用和方法的目的可以是疾病诊断目的、疾病预后目的和/或疾病治疗目的，它们的目的也可以是非疾病诊断目的、非疾病预后目的和非疾病治疗目的；它们的直接目的可以是获取疾病诊断结果、疾病预后结果和/或疾病治疗结果的中间结果的信息，它们的直接目的可以是非疾病诊断目的、非疾病预后目的和/或非疾病治疗目的。
本发明发现抑郁模型小鼠vmPFC（腹内侧前额叶）脑区pS187-SNAP25蛋白表达和谷氨酸神经递质水平，显著高于对照小鼠。进一步通过干扰肽TAT-S187特异性干预Ser187-SNAP25的磷酸化，可以显著抑制抑郁模型小鼠的焦虑抑郁行为，并显著逆转兴奋性神经递质谷氨酸水平的升高，表明本发明的干扰肽TAT-S187可通过调控谷氨酸水平来有效抑制抑郁模型小鼠的抑郁行为。
本发明证明小鼠vmPFC中pS187-SNAP25通过调控突触前谷氨酸的释放作用于抑郁行为的形成，该研究结果对揭示抑郁形成和干预的分子机制提供了依据，本发明的干扰肽TAT-S187干预SNAP25磷酸化的特异性位点可以纠正抑郁症谷氨酸水平的异常，进而干预、改善抑郁症。
附图说明
图1为35天慢性不可预期轻度应激（CUMS）处理小鼠形成抑郁行为，建立小鼠抑郁模型。其中图1中A为糖水偏好测试，图1中B为强迫游泳测试，图1中C为高架十字迷宫测试，图1中D为对照组和CUMS组小鼠在高架十字迷宫测试中的代表性运动轨迹，图1中E为旷场实验测试，图1中F为对照组和CUMS组小鼠在旷场实验测试中的代表性运动轨迹。
图2为抑郁模型小鼠vmPFC脑区pS187-SNAP25蛋白表达水平和谷氨酸神经递质水平显著升高。其中图2中A为谷氨酸表达水平，图2中B为pS187-SNAP25蛋白表达情况。
图3为抑郁模型小鼠vmPFC脑区给予特异性干扰肽干预S187-SNAP25磷酸化显著抑制小鼠抑郁的形成。其中图3中A为实验流程图，图3中B为糖水偏好测试，图3中C为强迫游泳测试，图3中D为高架十字迷宫测试，图3中E为给予干扰肽后对照组和CUMS组小鼠在高架十字迷宫测试中的代表性运动轨迹，图3中F为旷场实验测试，图3中G为给予干扰肽后对照组和CUMS组小鼠在旷场实验中的代表性运动轨迹。
图4为抑郁模型小鼠vmPFC脑区给予特异性干扰肽干预S187-SNAP25磷酸化，降低pS187-SNAP25蛋白表达水平，显著逆转谷氨酸水平的升高。其中图4中A为套管的定位位置图，图4中B为给予干扰肽后pS187-SNAP25蛋白表达情况，图4中C为给予干扰肽后谷氨酸水平变化情况。
图5为实施例1中CUMS组小鼠35天应激方案。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中的小鼠为C57BL/6品系小鼠（6-8周龄，体重23-25克），购自北京大学医学部实验动物中心。
实施例1、构建小鼠抑郁模型
本实施例以慢性不可预期轻度应激方法（CUMS法）建立小鼠抑郁模型。6-8周龄，体重23-25克的C57BL/6品系小鼠30只，随机均分为CUMS组和对照组，每组15只，进行下述平行试验。
1. 小鼠抑郁模型的建立采用目前世界公认的抑郁动物造模方法：慢性不可预期轻度应激模型。采用35天应激方案，遵循随机、不可预见性原则，每天不固定时间点给予CUMS组小鼠两种刺激，刺激类型包括：束缚、倾斜45度、4 ℃低温、潮湿、游泳、对养、禁水、禁食、拥挤、空笼。CUMS组小鼠单笼饲养。CUMS组小鼠进行如下35天的应激处理，得到抑郁模型小鼠。具体35天应激方案如图5所示。
其中10种应激的操作方式如下：
潮湿/24小时：将垫料全部用水弄湿润，小鼠在湿垫料的笼子待24小时。
禁水/24小时：将水瓶拿掉24小时。
禁食/24小时：将粮食拿掉24小时。
空笼/24小时：小鼠在没有垫料的笼子里待24小时。
倾斜45度/24小时：将小鼠笼子倾斜45度，保持24小时。
束缚/15分钟：将每只小鼠放到束缚器里待15分钟。
拥挤/1小时：将这15只小鼠放到一个笼子里待1小时。
4度/5分钟：将每只小鼠放到一个笼子里放在冰箱4度待5分钟。
游泳/15分钟：小鼠在高20cm，直径14cm，水深13cm的圆柱体容器中游泳15分钟。
对养/2小时：两只小鼠一组放到一个笼子里待2小时。
对照组小鼠（Control组小鼠）：正常饲养（4-5只/笼）35天，不做应激处理。
2. 第36天对两组小鼠（CUMS组和Control组）进行旷场实验测试，旷场为40 cm×40 cm×40 cm，由白色ABS板拼接而成。测试在昏暗照明条件（照度≈60 lux）下进行。小鼠从旷场中心开始，自由活动5分钟，对其行为进行红外录像，利用ANY-maze软件记录小鼠在旷场中的活动轨迹。分别统计小鼠在中心区域（20 cm×20 cm）活动的时间、路程以及在旷场中活动的总路程。动物单独测试，两只小鼠之间将场地清理干净，避免气味干扰。采用GraphPad Prism 8软件对数据进行统计分析，发现抑郁模型小鼠在中心区域活动的时间和路程与对照组小鼠相比显著降低，见图1中E和图1中F（数据显示为Mean±SEM，**表示p<0.01，未配对双尾t检验，n=15每组），说明抑郁模型小鼠的焦虑抑郁行为增加。
3. 第37天对两组小鼠进行高架十字迷宫测试。高架十字迷宫包括中间区域（5 cm×5 cm），两个开放臂（30 cm×5 cm，无侧壁）和两个封闭臂（30 cm×5 cm，侧壁高15 cm）。测试在昏暗照明情况（照度≈5 lux）下进行。小鼠从中心区域（头朝向选定的一个开放臂）开始，自由探索5分钟，利用ANY-maze软件记录小鼠活动的路径。以小鼠身体80%跨过中心区域边界为准，分别统计小鼠在开放臂内停留时间，进入开放臂的次数，以及小鼠在开放臂和封闭臂中穿梭的总次数。采用GraphPad Prism 8软件对数据进行统计分析，发现抑郁模型小鼠在开放臂停留的时间和进入开放臂的次数与对照组小鼠相比显著降低，见图1中C和图1中D（数据显示为Mean±SEM，*表示p<0.05，未配对双尾t检验，n=15每组），说明抑郁模型小鼠的焦虑抑郁行为增加。
4. 第38天对两组小鼠进行糖水偏好测试，小鼠禁水16小时之后，给予一瓶水和一瓶1%的糖水，两个瓶子事先已称重量，每30分钟调整两瓶子的位置并称量瓶子的重量，时间为1.5小时。统计后60分钟的液体消耗量。计算糖水偏爱分数=糖水摄入量/（糖水摄入量+水摄入量）×100%。统计分析发现模型小鼠对糖水的偏爱程度显著低于对照组，见图1中A（数据显示为Mean±SEM，**表示p<0.01，未配对双尾t检验，n=15每组），说明模型小鼠具有明显的抑郁行为。
5. 第39天对两组小鼠进行强迫游泳实验测试，游泳时间总计6分钟，ANY-maze软件记录小鼠后4分钟漂浮不动时间。统计分析发现与对照组小鼠相比，抑郁模型小鼠的不动时间显著增加，见图1中B（数据显示为Mean±SEM，*表示p<0.05，未配对双尾t检验，n=15每组），说明模型小鼠具有明显的抑郁行为。
综上，成功建立模拟人类抑郁症特征的小鼠抑郁模型。
实施例2、SNAP25蛋白的Ser187位点磷酸化作为靶点（pS187-SNAP25蛋白）在抑郁症中的应用
检测实施例1的抑郁模型小鼠的vmPFC（腹内侧前额叶）脑区pS187-SNAP25蛋白（Ser187位点磷酸化的SNAP25蛋白）表达和谷氨酸神经递质水平，其中SNAP25蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。
1. 强迫游泳实验测试后的90分钟内，取两组小鼠的脑组织，冻存于-80 ℃冰箱，用于检测蛋白表达和神经递质的水平。
2. 取小鼠vmPFC脑组织，提取突触体蛋白，利用western blot实验检测pS187-SNAP25蛋白表达。采用imageJ软件对western blot结果进行定量，经过统计分析，抑郁模型小鼠vmPFC脑区pS187-SNAP25蛋白表达显著高于对照组，见图2中B（数据显示为Mean±SEM，*表示p<0.05，未配对双尾t检验，n=6每组）。
3. 取小鼠vmPFC脑组织，匀浆，采用全自动氨基酸分析仪（日立L8900）测定氨基酸含量，主要分析谷氨酸水平。统计分析后发现抑郁模型小鼠vmPFC脑区谷氨酸水平升高，见图2中A（数据显示为Mean±SEM，*表示p<0.05，未配对双尾t检验，n=6每组）。
实施例3、干扰肽TAT-S187在抑郁症治疗中的应用
本实施例通过抑制SNAP25蛋白第187位丝氨酸磷酸化的干扰肽TAT-S187来研究SNAP25蛋白的Ser187位点或Ser187位点磷酸化的SNAP25蛋白（pS187-SNAP25蛋白）作为靶点在抑郁症治疗中的应用。其中干扰肽TAT-S187的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。
一、检测抑郁模型小鼠vmPFC脑区给予特异性干预S187-SNAP25磷酸化的干扰肽后，小鼠抑郁行为形成情况。
1. 为了能特异性干预SNAP25的187位丝氨酸的磷酸化，设计了针对该位点的干扰肽（TAT-S187：RKKRRQRRR-RIMEKADSNKTRIDE，SEQ ID No.1）和对照肽（TAT-S187A：RKKRRQRRR-RIMEKADANKTRIDE，SEQ ID No.3）。
2. 6-8周龄，体重23-25克的C57BL/6品系小鼠40只，随机均分为对照组+TAT-S187A、对照组+TAT-S187和CUMS组+TAT-S187A、CUMS组+TAT-S187，每组10只，进行下述平行试验。小鼠在进行抑郁模型造模前的一周，在vmPFC脑区（前囟向前，+1.7 mm；矢状缝左右，±0.4 mm；埋管深度，−2.6 mm）植入套管，恢复一周后CUMS组小鼠进行如下35天的应激处理，完成抑郁模型训练（参照表1）。对照组小鼠（Control组小鼠）：正常饲养（4-5只/笼）35天，不做应激处理。
3. 抑郁模型训练完成后，再按照实施例1的方法对CUMS组小鼠和Control组小鼠进行抑郁行为测试。从插入套管当天开始计，在第43天按照实施例1的方法进行旷场实验，在第44天按照实施例1的方法进行高架十字迷宫测试，在第45天按照实施例1的方法进行糖水偏爱测试和在第46天按照实施例1的方法进行强迫游泳测试，分别在四种行为测试前30分钟，通过预先埋置的套管进行微量注射干扰肽，见图3中A。干扰肽的注射采用微量注射泵和1 μL微量注射器，每只小鼠每侧vmPFC脑区注射0.5 μL干扰肽溶液（溶质为TAT-S187或TAT-S187A，溶剂为ddH2O），干扰肽溶液中多肽的浓度为3.2 nmol/μL。采用GraphPad Prism8软件对小鼠行为数据进行统计分析，发现给予S187-SNAP25磷酸化的干扰肽TAT-S187后，抑郁模型小鼠对糖水的偏爱增加，见图3中B；在强迫游泳中不动时间减少，见图3中C；在高架十字迷宫的开放臂停留的时间和进入的次数均增加，见图3中D和图3中E；在旷场中心区域活动的时间和路程显著增加，见图3中F和图3中G。数据显示为Mean±SEM，*表示p<0.05，Bonferroni多重检验的双因素方差分析，n=10每组。
综上，抑郁模型小鼠vmPFC脑区给予干扰肽TAT-S187可以抑制抑郁行为。
二、检测抑郁模型小鼠vmPFC脑区给予特异性干预S187-SNAP25磷酸化的干扰肽后，pS187-SNAP25蛋白表达和谷氨酸神经递质水平。
1. 强迫游泳实验测试后的90分钟内，取两组小鼠的脑组织，冻存于-80 ℃冰箱，用于检测蛋白表达和神经递质的水平。
2. 利用HE染色对脑区插管的位置进行了鉴定，以确保vmPFC脑区微量给干扰肽的准确性，见图4中A。
3. 取小鼠vmPFC脑组织，提取突触体蛋白，利用western blot实验检测pS187-SNAP25蛋白表达。采用imageJ软件对western blot结果进行定量，经过统计分析发现给予干扰肽TAT-S187后抑郁模型小鼠vmPFC脑区的pS187-SNAP25蛋白的高表达被抑制，见图4中B（数据显示为Mean±SEM，*表示p<0.05，Bonferroni多重检验的双因素方差分析，n=5每组）。
4. 取小鼠vmPFC脑组织，匀浆，采用全自动氨基酸分析仪（日立L8900）测定氨基酸含量，主要分析谷氨酸水平。统计分析后发现给予干扰肽TAT-S187后抑郁模型小鼠vmPFC脑区谷氨酸水平的升高被显著抑制，见图4中C（数据显示为Mean±SEM，**表示p<0.01，Bonferroni多重检验的双因素方差分析，n=5每组）。
综上，干扰肽TAT-S187可通过调控谷氨酸水平来抑制抑郁模型小鼠的抑郁行为。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。
序列表
<110> 北京大学人民医院
<120> SNAP25蛋白Ser187位点磷酸化抑制剂的用途
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 1
Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Arg Ile Met Glu Lys Ala Asp
1 5 10 15
Ser Asn Lys Thr Arg Ile Asp Glu
20
<210> 2
<211> 206
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 2
Met Ala Glu Asp Ala Asp Met Arg Asn Glu Leu Glu Glu Met Gln Arg
1 5 10 15
Arg Ala Asp Gln Leu Ala Asp Glu Ser Leu Glu Ser Thr Arg Arg Met
20 25 30
Leu Gln Leu Val Glu Glu Ser Lys Asp Ala Gly Ile Arg Thr Leu Val
35 40 45
Met Leu Asp Glu Gln Gly Glu Gln Leu Glu Arg Ile Glu Glu Gly Met
50 55 60
Asp Gln Ile Asn Lys Asp Met Lys Glu Ala Glu Lys Asn Leu Thr Asp
65 70 75 80
Leu Gly Lys Phe Cys Gly Leu Cys Val Cys Pro Cys Asn Lys Leu Lys
85 90 95
Ser Ser Asp Ala Tyr Lys Lys Ala Trp Gly Asn Asn Gln Asp Gly Val
100 105 110
Val Ala Ser Gln Pro Ala Arg Val Val Asp Glu Arg Glu Gln Met Ala
115 120 125
Ile Ser Gly Gly Phe Ile Arg Arg Val Thr Asn Asp Ala Arg Glu Asn
130 135 140
Glu Met Asp Glu Asn Leu Glu Gln Val Ser Gly Ile Ile Gly Asn Leu
145 150 155 160
Arg His Met Ala Leu Asp Met Gly Asn Glu Ile Asp Thr Gln Asn Arg
165 170 175
Gln Ile Asp Arg Ile Met Glu Lys Ala Asp Ser Asn Lys Thr Arg Ile
180 185 190
Asp Glu Ala Asn Gln Arg Ala Thr Lys Met Leu Gly Ser Gly
195 200 205
<210> 3
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 3
Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Arg Ile Met Glu Lys Ala Asp
1 5 10 15
Ala Asn Lys Thr Arg Ile Asp Glu
20

Claims (10)

1.SNAP25蛋白Ser187位点磷酸化抑制剂在制备预防、干预、改善和/或治疗抑郁症的产品中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述抑制剂具有下述至少一种功能：
C1）抑制或降低SNAP25蛋白Ser187位点的磷酸化水平；
C2）抑制或降低Ser187位点磷酸化的SNAP25蛋白的表达；
C3）抑制或降低抑郁症患者脑中谷氨酸含量。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述抑制剂为核酸分子、碳水化合物、脂、小分子化合物、抗体、多肽、蛋白、基因编辑载体、慢病毒或腺相关病毒中的一种或多种。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述多肽为下述任一种：
A1）氨基酸序列是SEQ ID No.1的多肽；
A2）将SEQ ID No.1的氨基酸序列经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与A1）所示的多肽具有80％以上的同一性且具有抑制SNAP25蛋白Ser187位点磷酸化的功能的多肽；
A3）在A1）或A2）的N端和/或C端连接标签得到的融合多肽；
A4）在A1）或A2）的N端和/或C端和/或氨基酸侧链基团上进行修饰得到的具有相同功能的多肽衍生物。
5.与权利要求4中所述多肽相关的生物材料在制备预防、干预、改善和/或治疗抑郁症的产品中的应用，所述生物材料为下述任一种：
B1）编码权利要求4中所述多肽的核酸分子；
B2）含有B1）所述核酸分子的表达盒；
B3）含有B1）所述核酸分子的重组载体、或含有B2）所述表达盒的重组载体；
B4）含有B1）所述核酸分子的重组微生物、或含有B2）所述表达盒的重组微生物、或含有B3）所述重组载体的重组微生物；
B5）含有B1）所述核酸分子的细胞系、或含有B2）所述表达盒的细胞系、或含有B3）所述重组载体的细胞系。
6.预防、干预、改善或/和治疗抑郁症的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包括权利要求4中所述的多肽。
7.SNAP25蛋白的Ser187位点或Ser187位点磷酸化的SNAP25蛋白作为靶点在筛选或开发预防、干预、改善和/或治疗抑郁症的产品中的应用。
8.预防、干预、改善和/或治疗抑郁症的药物的筛选方法，其特征在于，所述方法包括利用抑制SNAP25蛋白Ser187位点的磷酸化水平的物质或抑制Ser187位点磷酸化的SNAP25蛋白的含量和/或活性的物质作为候选药物进行病理实验、临床试验或治疗，筛选出预防、干预、改善和/或治疗抑郁症的药物。
9.权利要求4中所述的多肽。
10.权利要求5中所述的生物材料。
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Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2006058781A2 (en) * 2004-12-03 2006-06-08 Proteosys Ag Finasteride, dutasteride and related compounds for preventing/treating neurologically-associated disorders
CN108096568A (zh) * 2018-01-03 2018-06-01 苏州大学附属第二医院 A型肉毒毒素在抗抑郁症中的应用
CN113134011A (zh) * 2021-05-24 2021-07-20 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 miR-129在制备治疗抑郁症产品中的应用
CN114072673A (zh) * 2018-11-29 2022-02-18 秀杰股份公司 基于细胞的用于测定肉毒杆菌毒素活性的方法

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2006058781A2 (en) * 2004-12-03 2006-06-08 Proteosys Ag Finasteride, dutasteride and related compounds for preventing/treating neurologically-associated disorders
CN108096568A (zh) * 2018-01-03 2018-06-01 苏州大学附属第二医院 A型肉毒毒素在抗抑郁症中的应用
CN114072673A (zh) * 2018-11-29 2022-02-18 秀杰股份公司 基于细胞的用于测定肉毒杆菌毒素活性的方法
CN113134011A (zh) * 2021-05-24 2021-07-20 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 miR-129在制备治疗抑郁症产品中的应用

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
NORIKAZU KATAYAMA等: "SNAP-25 phosphorylation at Ser187 regulates synaptic facilitation and short-term plasticity in an age-dependent manner", 《SCIENTIFIC REPORTS》 *
RÉGINE HEPP等: "Differential phosphorylation of SNAP-25 in vivo by protein kinase C and protein kinase A", 《FEBS LETT.》 *
余学婕等: "血清谷氨酸水平对脑梗死后抑郁发病的影响", 《海南医学》 *
程红等: "中枢谷氨酸增多可能是抑郁与吸烟成瘾伴发的原因", 《中国健康心理学杂志》 *

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