CN111467479A - 眼镜蛇科蛇突触后神经毒素单体分子在治疗老年痴呆上的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及“眼镜蛇科蛇突触后神经毒素单体分子在治疗老年痴呆上的应用”老年性痴呆，也称为阿尔茨海默病，是一种以进行性记忆力障碍、判断推理障碍、运动障碍为主要临床特征的老年性疾病。老年痴呆的病理表现是一种以弥漫性脑萎缩为特征的神经系统的退行性病变，并伴有局部脑组织的炎性反应，故下调炎性细胞因子及抑制炎性反应可能是改善老年痴呆疾病的病理基础，改善老年痴呆临床症状的一个重要手段。本发明通过对实验大鼠脑组织炎性细胞因子的检测和大鼠Morris水迷宫实验，发现眼镜蛇科的蛇突触后神经毒素能抑制老年痴呆大鼠脑组织中的炎性细胞因子，并能改善老年痴呆大鼠的学习记忆能力，这个发现为眼镜蛇科的蛇突触后神经毒素在治疗老年痴呆上的应用提供了可能。

Description

眼镜蛇科蛇突触后神经毒素单体分子在治疗老年痴呆上的 应用

技术领域

本发明涉及一组具有抑制老年痴呆大鼠海马区脑组织中炎性因子水平，改善老年痴呆大鼠学习记忆能力的眼镜蛇科蛇突触后神经毒素单体分子和一种治疗老年 痴呆的方法，属于生化和生物制药领域。

背景技术

老年性痴呆，也称为阿尔茨海默病(Alzheimer Disease，AD)，是一种以进行性 记忆力障碍、判断推理能力障碍、运动障碍为主要临床特征的老年性疾病。痴呆 是一种由于脑功能障碍而产生的获得性和持续性的智能障碍综合征，痴呆的发病 率和患病率随年龄增加而上升。随着人口老龄化问题日益严重，AD已经成为人 类第4大死亡原因。

老年性痴呆的发病机制复杂，但目前国内外研究者普遍认同的病理基础是以大脑皮质弥漫性萎缩为特征的神经系统的退行性病变，并伴有神经元损伤和死亡。AD 患者整个大脑弥散性萎缩，大脑皮质和海马区出现以淀粉样蛋白(amyloid beda protein)为核心的老年斑(senile plaque，SP)，及以异常过度磷酸化的以tau 蛋白为核心成分的神经原纤维缠结等神经病理性病变。其中一种理论认为，淀粉 样前体蛋白(amyloid precursorprotein，APP)的代谢产物的神经毒性是因引起 老年性痴呆各种原的共同通路，其在脑组织中含量的异常增加可能是诱发老年性 痴呆的主要因素。但是，到目前为止，只是以清除淀粉样前体蛋白或tau蛋白为 目的的临床试验药物尚没能够证明它们在治疗老年痴呆上的真正有效性。

与此同时也有证据表明老年痴呆患者脑内存在着强烈的局灶性炎症反应，老年斑附近有激活的小胶质细胞和星形胶质细胞，研究发现这些激活的细胞可以表达白 细胞介素炎性因子白细胞介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)和肿瘤坏死因 子-a(TNF-a)等多种炎性细胞因子[1，2]。动物实验研究显示，用老年斑的 主要成分淀粉样肽可诱导出类AD患者脑内的炎症反应，并伴有白细胞的激活与 外渗，以及炎性细胞因子的产生。另外，过度磷酸化的淀粉样蛋白也会引起神经 组织的炎性反应。这些研究证实了老年痴呆患者脑内除了抗炎细胞因子(IL-1ra) 表达量的降低外，患者脑内TNF-a和(IL-1β)等炎性细胞因子的表达的确有显著 上升[3，4]。由此有专家提出神经元退行性病变可能是脑内免疫和炎症反应不 适当激活所致，超强的免疫反应可“方向错误”地攻击神经组织，造成神经元损 伤和死亡。因此有人提出这样的假说：尽管患者神经元退变的始动因素不同，并 由此出现不同神经病理损害的结局，但它们有可能通过启动炎性细胞因子产生的 级联反应这一相似的过程而引致神经元的损伤，而患者中枢神经系统炎性细胞因 子的大量释放有可能加重淀粉样肽的产生及淀粉样肽在血管内聚集和脑白质的 损害，从而引起一系列的恶性循环。近年来，在此领域的研究发现证实了位于脑 组织老年斑附近炎性因子的免疫反应呈阳性，并导致淀粉样蛋白合成的增加。因 此抑制过度的免疫炎性反应可能成为治疗老年痴呆的另一种探索。

从公开的信息来看，有一些关于眼镜蛇蛇毒治疗老年痴呆的报道，但眼镜蛇毒素种类繁多，已知成分有神经毒素、细胞毒素、心脏毒素、神经生长因子、溶血素 (DLP)、CVA蛋白、膜活性多肽、眼镜蛇毒因子等及其他成分，如碱性磷酸单酯 酶、磷酸二酯酶、乙酰胆碱酯酶、L-氨基酸氧化酶、核糖核酸酶、蛋白水解酶 等，对于眼镜蛇蛇毒制剂，混合毒素会对生物构成生命危险，这可能是在进化过 程中一种增强毒性的策略。各种蛇毒中不同类的毒素或同类毒素复合物之间存在 协同作用，主要毒素如磷脂酶A2、三指毒素(神经毒素)在协同过程中发挥着 重要作用[5，6]。而正是这种协同作用导致了对生物体致命的后果。

发明内容

本发明首次公开了一组能对老年痴呆大鼠海马区相关炎性因子IL-1β，TNF-a 的含量增高有抑制作用，在Morris水迷宫实验中能明显改善治疗后老年痴呆大 鼠学习记忆能力(缩短逃避潜伏期)的眼镜蛇科蛇突触后神经毒素单体分子。

我们前期的研究发现，眼镜蛇神经毒素单体分子可以抑制老年痴呆大鼠的脑组织中的炎性细胞因子并能改善老年痴呆大鼠的学习记忆能力(专利申请号CN201910986752.2眼镜蛇神经毒素单体分子在治疗老年痴呆上的应用)，我们 的进一步研究发现，除了眼镜蛇神经毒素单体分子外，眼镜蛇科的其他一些蛇种， 包括银环蛇，眼镜王蛇，黑曼巴蛇，金环蛇等，它们的突触后神经毒素或α-神 经毒素也有同样的能抑制老年痴呆大鼠脑组织中的炎性细胞因子并改善老年痴 呆大鼠学习记忆能力的功效，这个发现还是首次被报道。

突触是指一个神经元的冲动传到另一个神经元或传到另一细胞间的相互接触的结构。突触是神经元之间在功能上发生联系的部位，也是信息传递的关键部位。 在光学显微镜下，可以看到一个神经元的轴突末梢经过多次分支，最后每一小支 的末端膨大呈杯状或球状，叫做突触小体。这些突触小体可以与多个神经元的细 胞体或树突相接触，形成突触。从电子显微镜下观察，可以看到，这种突触是由 突触前膜、突触间隙和突触后膜三部分构成。

乙酰胆碱是一种神经递质，乙酰胆碱能特异性地作用于各类胆碱受体。乙酰胆碱受体包括两种：毒蕈碱型受体和烟碱型受体。毒蕈碱型受参与副交感神经兴奋 效应，如支气管胃肠平滑肌的收缩等；烟碱型受体位于神经节突触后膜或骨骼肌 终板膜，可引起自主神经节的节后神经元兴奋，或导致骨骼肌兴奋。

眼镜蛇科蛇神经毒素根据它们作用靶点的不同，可分为两类：一类为突触后神经毒素或α-神经毒素，这类毒素竞争性的与位于突触后膜的神经神经接头处的烟 碱型乙酰胆碱受体结合，阻断神经递质乙酰胆碱的传导[7]；另一类为突触前神 经毒素或β-神经毒素，其直接作用于运动神经突触前膜，阻断乙酰胆碱的释放， 使骨骼肌失去收缩功能而麻痹。

所以眼镜蛇科蛇突触后神经毒素是烟碱乙酰胆碱受体(nAChR)的拮抗剂，以拮 抗和缓慢可逆的方式与神经元的烟碱型乙酰胆碱受体结合[8，9]。在结构上，它 们有共同的三指的结构，故也被称为三指毒素，活性部位靠近中指末端[7]，这 种三指的结构是一种多功能的结构，具有能够调节乙酰胆碱及受体的功能[10]。

眼镜蛇科蛇突触后神经毒素能够通过抑制炎性反应来改善老年痴呆大鼠学习记忆力的共性可能和他们具有共同的三指蛋白结构对烟碱型乙酰胆碱受体的拮抗 和调节有关，因为有实验显示乙酰胆碱受体可能参与了炎性反应的过程，故通过 拮抗和调节乙酰胆碱受体就能相应的抑制炎性反应，从而改善了老年痴呆大鼠的 学习记忆能力，这可能就是眼镜蛇科蛇突触后神经毒素能够治疗老年痴呆的共同 作用机理。我们的研究发现这些突触后神经毒素包括具有以下成熟蛋白或多肽的 神经毒素：它们的成熟蛋白或多肽的氨基酸序列(FASTA)分别如下：

银环蛇突触后神经毒素

黑曼巴眼镜蛇突触后神经毒素

眼镜王蛇突触后神经毒素

金环蛇突触后神经毒素

在生产上，因为本发明所公开的眼镜蛇科蛇突触后神经毒素单体分子具有明确的氨基酸序列，故能够通过基因工程来生产，解决了蛇毒资源稀缺的实际问题；即 是如果继续通过天然蛇毒的分离纯化来得到突触后神经毒素，因为过程中由于有 了明确的氨基酸序列而更容易达到质量和纯度上的控制，这为蛇毒中单体成分的 药品开发奠定了必要的基础。最后蛇毒单体分子的应用能避免一般蛇毒混合物引 起的协同毒性作用，提高了产品在使用上的安全性。

以下结合附图和具体实施例对本发明做进一步说明，但以下实施例并非对本发明的限定；同时凡依照本发明公开内容所进行的本领域等同替换，均属于本发明的 保护范围。

附图说明：

图1是给药前和给药后，老年痴呆大鼠对照组，4种突触后神经毒素治疗组，和 青年大鼠对照组的逃避潜伏期(表-1)对应的折线图。

具体实施

实施例A：具有本发明所述的成熟蛋白或多肽的蛇突触后神经毒素的获得 蛇突触后神经毒素SEQ ID No.1由基因重组获得，具体如下：

1.重组表达载体的克隆

根据Genbank上提供的突触后神经毒素SEQ ID No.1的基因合成DNA序列，对目 的DNA序列进行PCR扩增，在上游引物的5’端引入编码肠激酶识别位点的序列 和Nde I酶切位点，在下游引物的5’端引入终止密码子和BamHI酶切位点。用 PCR的方法扩增出含突触后神经毒素SEQ ID No.1的基因并克隆到pBS-T载体， 对所构建的重组子pBS-T-突触后神经毒素SEQ ID No.1进行分析鉴定。

2.基因表达

把重组质粒转化到大肠杆菌表达载体pET15b中，构建重组表达质粒pET15b-突 触后神经毒素SEQ ID No.1，将分析鉴定正确的重组子转化大肠杆菌BL21(DE3) LysS。将单克隆接种至5mL LB培养基中，37℃培养过夜，次日按1∶100的比例 接种至50mL LB培养基中，37℃振荡培养至OD600nm＝0.4～0.6。

3.表达产物的收集分析

用1mmol/L IPTG继续培养3小时，诱导转化的大肠杆菌BL21(DE3)。表达菌经 超声破碎后离心，包涵体溶于缓冲液，离心收集后上清和沉淀分别进行SDS.PAGE 电泳检测，目的蛋白以包涵体的形式存在。

4.表达产品的亲和和纯化

超声破菌后的包涵体溶于缓冲液(6mol/L盐酸胍、20mmol/L Tris-HCL pH8.0、0.5mol/L NaCI、5mmol/L咪唑)中；通过镍-NTA柱亲合层析纯化，具体为上柱 前用上述缓冲液平衡，上样后用含20mmol/L咪唑的上述缓冲液洗至基线，最后 用含300mol/L咪唑的上述缓冲液洗脱。肠激酶切割得到了突触后神经毒素SEQ ID No.1蛋白。

5.表达产物的复性

用6mol/l盐酸胍、0.1mol/L Tris-HCL pH8.0、0.01mol/LEDTA、0.1mmol/L PMSF、10mmol/L DTT缓冲液透析上述洗脱蛋白，缓冲液中的DTT和盐酸胍浓 度递减，然后再用10倍体积的0.1mol/L Tris-HCL pH8.0、5μmol/L CuSo4、 20％甘油的缓冲液透析。RP-HPLC法对复性结果进行检测，通过与标样保留时间 的对比确定已复性的成份，复性产物冷藏保存。

6.氨基酸序列测定

用Edaman降解法对纯化脱盐后的突触后神经毒素SEQ ID No.1进行氨基酸序列测定(样品状态为无色液体，环境温度20℃，环境相对湿度45％)，测得的序列 与蛋白库中银环蛇突触后神经毒素之一的氨基酸序列进行对比，确认序列完全一 致后用以进行下一步对老年痴呆大鼠的治疗使用。

实施例B：蛇突触后神经毒素对老年痴呆大鼠学习记忆力改善的实验

1.动物模型的选择

本发明采用了自然衰老认知障碍(老年痴呆)动物模型，通过动物本身的自然衰老来获得老年痴呆的动物模型，包括老龄大鼠、大鼠及猴等。这类模型的认知障 碍等神经系统改变是自然发生的，更贴近AD的真实病理生理改变。Cummings等 报道老龄犬脑中有Aβ沉淀斑块，同时有相应的选择性的行为能力损害；Higgins 等报道老龄鼠可出现Aβ沉积于前脑基底区，并有记忆缺损。

2.试验动物与分组

对120个月龄在21～22的大鼠适应性饲养10天，动物自由摄水，室温控制22-25度，湿度为50％-70％，光照12小时，黑12小时。通过Morris水迷宫定位实验 训练来筛选认知障碍的大鼠(老年痴呆大鼠)。Morris水迷宫实验是一种强迫 动物游泳，寻找水下平台的实验，主要用于评价动物空间学习记忆能力，提供的 实验指标敏感可靠，操作简便，是测试和评价大鼠老年痴呆指标的经典实验。 水迷宫水深50cm，水温控制在22-25度，水池中央设平台。水池中放入奶粉，充 分混匀至水呈乳白色，使大鼠无法通过视觉辨认平台位置。正式试验前训练日将 大鼠面向池壁放入水中，训练其寻找逃避平台，若大鼠找到并站在平台上3秒后 不再滑落，可中止此次训练，记录其抵达平台所用时间及所游距离，并让其在平 台上停留10秒，由此让大鼠学习记忆。不能找到者持续记录120s后将其引至平 台并放置30秒，培训其学习记忆。每天4次训练，间隔15～30秒进行下一次训 练，从4个不同方向入水，连续4天。第5天正式试验测试，实时图像系统自动 记录大鼠的活动情况，并计算大鼠首次穿越平台(中心区域)的平均时间，评价 动物的学习记忆情况。以青年(4月龄)大鼠平均逃避潜伏期99％正常值范围上 限值为标准，将逃避潜伏期大于99％上限值的老年大鼠定为知障碍老年大鼠。标 签每个大鼠，以便在完成最后试验后能计算出每组大鼠用药前平均逃避潜伏期。

筛选出认知障碍大鼠后随机分为5组：即老年痴呆大鼠对照组(不给药，灌胃等 体积的生理盐水)和4种眼镜蛇科突触后神经毒素治疗组(突触后神经毒素按 45μg/Kg配成液态，连续灌胃给药，每天2次，连续8周)；同时设青年大鼠 对照组(不给药，灌胃等体积的生理盐水)。在实验过程中，保持每组10个大 鼠。多余的出组。

3.行为学(学习记忆能力)的测试

给药8周后，再次连续训练5天，记录每天各组动物在水中寻找平台的平均时间，第6天直接进行Morris水迷宫测试。测定各组动物在水中寻找平台的时间。在 训练过程中仍继续给药。

4.实验结果

表-1为老年痴呆大鼠对照组、4种突触后神经毒素组(简称神经毒素组)、青年 大鼠对照组的平均逃避潜伏期的比较。

表-1

n＝10

给药前，老年认痴呆大鼠对照组和4组突触后神经毒素治疗组之间无显著性差异，但是它们与青年大鼠对照组存在显著性差异，###表示P＜0.001。

给药8周后，再次进行Morris水迷宫定位实验训练，从第一天到第5天，老年 痴呆大鼠对照组和4组突触后神经毒素治疗组之间开始出现显著性差异，*表示 P＜0.05，**表示P＜0.01；***表示P＜0.001。到第六天，老年认痴呆大鼠对 照组和4组神经毒素治疗组之间出现显著性差异，***表示P＜0.001。

从第一到第六天，老年痴呆大鼠对照组和4组突触后神经毒素组与青年大鼠对照组相比存在显著性差异，###表示P＜0.001。

以上的数据显示：老年痴呆大鼠对照组和4组突触后神经毒素组与青年大鼠对照组相比存在显著性差异，但眼镜蛇科突触后神经毒素能缩短老年痴呆大鼠的平均 逃避潜伏期，改善老年痴呆大鼠的学习记忆能力。

实施例C：实验大鼠脑组织炎性细胞因子的测定

1.样本的获取与测试方式

实验结束后，选取10％水合氯醛腹腔麻醉各组实验大鼠，按照0.3ml/100g的 剂量，麻醉完毕后断头处死各组实验大鼠，然后在操作台上迅速分离出海马区组 织。根据1g海马组织样，加入4℃预冷的生理盐水，13 500r/min离心，低 温匀浆时间10s/次，间隔30s，连续4次，制备出10％的组织匀浆，后低温 低速(4℃，3 000r/min)离心15min，取上清液，-40℃保存。海马区炎性 细胞因子白细胞介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)和肿瘤坏死因子-a (TNF-a)含量水平采用ELISA法按试剂盒说明步骤进行操作。

2.实验结果

表-2为各实验组大鼠的炎性因子白细胞介素-1β(interleukin-1β，IL-1β) 和肿瘤坏死因子-a(TNF-a)含量水平比较。

表-2

以上数据显示，老年痴呆对照组和青年对照组的IL-1β及TNF-a相比有显著性 差异，###表示P＜0.001；老年痴呆对照组和4组突触后神经毒素治疗组的IL-1 β及TNF-a相比，有显著性差异，*表示P＜0.05，**表示P＜0.01。以上实验数 据显示，眼镜蛇科突触后神经毒素单体分子可以通过抑制老年痴呆大鼠海马区脑 组织中的炎性细胞因子水平，减轻海马区神经元的损伤，这可能为改善老年痴呆 大鼠脑组织的炎性环境以达到改善老年痴呆大鼠的学习记忆能力提供了病理基 础。

上述实施例只为说明本发明的实施思路和技术特点，其目的在于让熟悉此技术的人员能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此而限制本发明的保护范围。 凡根据本发明精神实质所做的任何等效改变或修饰，都应涵盖在本发明的保护范 围之内。

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Claims (8)

1.一种治疗病人老年痴呆的方法，通过使用该方法含有的治疗有效量的眼镜蛇科蛇突触后神经毒素分子及其药物可接受载体的组合物来逆转或减轻老年痴呆症状。

2.一种治疗病人老年痴呆的方法，通过使用该方法含有的治疗有效量的眼镜蛇科蛇突触后神经毒素分子及其药物可接受载体的组合物来抑制或降低老年痴呆患者炎性细胞因子白细胞介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)和肿瘤坏死因子-a(tumor necrosis factors-a，TNF-a)在体内的表达水平。

3.根据权利要求(1-2)以上所述的眼镜蛇科蛇突触后神经毒素分子，其特征在于，它的成熟蛋白或多肽是具有SEQ ID No.1至SEQ ID No.28所示的任何一个氨基酸序列的眼镜蛇科蛇突触后神经毒素蛋白或多肽；或分别与SEQ ID No.1至SEQ ID No.28中的眼镜蛇科蛇突触后神经毒素蛋白或多肽具有70％或以上同源性的成熟蛋白或多肽，该成熟蛋白或多肽的功能与SEQ ID No.1至SEQ ID No.28所示的氨基酸序列的眼镜蛇科蛇突触后神经毒素蛋白或多肽功能相同或相似。

4.权利要求(1-2)以上所述眼镜蛇科蛇突触后神经毒素分子蛋白或多肽，其特征在于，它们可来自于从天然蛇毒中分离提取、或化学多肽合成、或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)中产生。

5.根据权利要求(4)以上所述重组生产的眼镜蛇科蛇突触后神经毒素分子蛋白或多肽，根据重组生产方案所用的宿主，本发明的蛋白或多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的；可以是包含二硫键的，或可以是不包含二硫键的。本发明中所述的蛋白或多肽还可包括或不包括起始的甲硫氨酸残基。

6.权利要求(1-5)以上所述眼镜蛇科蛇突触后神经毒素分子蛋白或多肽，其特征还在于本发明中所述的蛋白或多肽可包括上述各种眼镜蛇科蛇突触后神经毒素分子蛋白或多肽经过水解或酶解后的片段、用物理和化学方法处理后的衍生物和类似物，他们是基本保持着与上述眼镜蛇科蛇突触后神经毒素分子蛋白或多肽相同的生物学功能或活性的蛋白或多肽。本发明中所述的片段、衍生物或类似物可以是一个或多个氨基酸残基被取代的多肽或蛋白，或在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽或蛋白，或与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇、脂肪链融合所形成的多肽或蛋白)，或附加的氨基酸序列融合到此多肽或蛋白序列而形成的多肽或蛋白。根据本文的描述，这些片段、衍生物和类似物都属于本领域熟练技术人员公知的范围。

7.权利要求(1-2)的方法包括静脉注射、肌肉注射、皮下注射、口服、舌下、鼻腔、直肠、真皮内、腹膜内或鞘內给药，或经皮给药。

8.权利要求(1-2)的方法的眼镜蛇科蛇突触后神经毒素分子蛋白或多肽的剂量包括从1μg/Kg到350μg/kg每次，给药频率从每天一次到每天多次；或一年多次。

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