CN107412729A - 用于治疗肾病综合征和有关病症的方法 - Google Patents

Abstract

本申请涉及用于治疗肾病综合征和有关病症的方法。本公开内容提供了一种用于治疗和/或预防肾病综合征(诸如但不限于MCD和MN)和与肾病综合征有关的病症(诸如但不限于、蛋白尿和水肿)以及糖尿病肾病、糖尿病、狼疮肾炎或原发性肾小球疾病的方法。本公开内容另外提供了用于减轻蛋白尿和本文讨论的其它疾病状态的方法。这样的方法包括：给受试者治疗性递送Angptl4多肽或Angptl4多肽衍生物。

Description

用于治疗肾病综合征和有关病症的方法

本申请是申请号为201180034162.1，申请日为2011年6月6日，发明名称为“用于治疗肾病综合征和有关病症的方法”的申请的分案申请。

关于联邦资助研究的声明

联邦政府为本文所述的工作提供了资金支持，政府具有本发明的某些权利。

技术领域

本公开内容涉及用于治疗和预防肾病综合征及其相关病症(例如，但不限于，蛋白尿和水肿)的方法。

背景技术

肾病综合征(NS)是表示尿中蛋白损失(蛋白尿)、高脂血症(高胆固醇血症和高甘油三酯血症)和水肿的一般术语。肾病综合征涉及肾中的细胞(诸如足细胞)的病理学变化。蛋白尿被定义为，过量血清蛋白在尿中的存在。白蛋白尿(蛋白尿的一种特定类型)是这样的病理学状况：其中白蛋白存在于尿中。

足细胞(或内脏上皮细胞)是在肾的肾小球毛细血管袢的外层中的细胞。肾小球过滤血液，阻挡大分子(诸如蛋白)，并允许小分子(诸如水、盐和糖)穿过，作为形成尿的第一步。足细胞的长突或“足突”围绕毛细血管，并接近以停留在肾小球基膜上。足突通过称作裂孔隔膜的多孔结构相连。肾小球毛细血管袢的最内层由有孔的内皮细胞组成。受肾病综合征影响的肾具有肾小球毛细血管袢的异常，所述异常会造成血液蛋白质的渗漏，从而导致蛋白尿。

当蛋白损失在尿中时，它的血浆浓度下降，因而允许水迁移进身体的其它部位，这导致肿胀(称作水肿)。水肿常见于脚和腿、腰部或腹部(腹水)和眼周围，但是可以发生在任何地方，特别是响应于重力。另外，因为这种停留在体内的额外流体，人们经常增加体重、经历疲劳，且可能发现他们经常排尿更少。

许多病症被归类为肾病综合征，包括轻微改变型肾病(MCD)、局灶性节段性肾小球硬化症(FSGS)、膜性肾病(MN)(也称作膜性肾小球肾炎,MGN)和膜性增生性肾小球肾炎(MPGN)。多年来，当在光学显微镜下观察样本时，病理学家没有发现MCD组织中的变化，因此得名轻微改变型肾病。随着电子显微术的出现，现在已知是该疾病的标志的变化包括：足细胞足突的扩散损失，足细胞足突的空泡形成，和微绒毛在内脏上皮细胞上的生长。糖尿病肾病是肾病综合征的最常见原因。

降解甘油三酯的酶(诸如脂蛋白脂肪酶(LPL))的活性的变化，可能引起高甘油三酯血症(2-4)。在肾病综合征和蛋白尿的病原学中涉及的某些蛋白质，诸如血管生成素-样4(Angptl4)，会抑制LPL的活性。

肾病综合征的分子基础是未知的。已经在肾病综合征(诸如MCD、MN/MGN和MPGN)中观察到Angptl4水平的增加，但是增加的Angptl4循环水平尚未与肾病综合征中的蛋白尿的原因相关联。但是，以前尚未报道Angptl4在肾病综合征(诸如但不限于、MCD、FSGS、MN/MGN和MPGN)和相关病症(例如，但不限于，蛋白尿)中的作用。此外，有待确立蛋白尿和糖皮质激素敏感性在肾病综合征中的联系以及蛋白尿和高甘油三酯血症(肾病综合征的2种关键组分)之间的关联。设计成减轻蛋白尿的疗法，进一步使疾病机理的研究复杂化。例如，用于治疗MCD中的蛋白尿的糖皮质激素会独立地升高血浆甘油三酯水平(5)，且在某些形式的肾病综合征(诸如MCD)中，血浆甘油三酯水平的正常化落后于蛋白尿对糖皮质激素的应答(6)。

附图说明

图1显示了aP2-Angptl4TG大鼠的开发和表征。

图1a显示了200μg人血浆的二维凝胶分析(n＝4位患者/组，显示了裁切的代表性印迹)，并证实了与MCD缓解的患者(即非蛋白尿患者)相比，在具有复发的轻微改变型肾病(MCD)的患者中和在具有膜性肾病(MN)的患者中，存在增加的Angptl4循环水平(用箭头指示)。

图1b显示了Angptl4的脂肪组织特异性过表达的转基因(TG)大鼠模型(aP2-Angplt4TG)。

图1c显示了Angptl4mRNA在aP2-Angptl4TG大鼠中的组织特异性的过表达(n＝3只大鼠/组)。WAT是白色脂肪组织，BAT是褐色脂肪组织。***P<0.001。

图1d显示了200μg血浆的二维凝胶电泳，随后进行Angptl4的蛋白质印迹，并证实，杂合的aP2-Angptl4TG大鼠具有比野生型大鼠更高的Angptl4循环水平(3个月龄，n＝3印迹/组)。

图1e显示了200μg血浆的二维凝胶电泳，随后进行抗-V5和抗-Angptl4抗体的蛋白质印迹，并证实了脂肪组织分泌的V5标记的Angptl4在aP2-Angptl4TG大鼠的血浆中的存在。

图1f显示了来自aP2-Angptl4TG大鼠血浆的抗-N-端Angptl4免疫沉淀物的二维凝胶电泳，随后使用凝集素SNA I和抗-Angptl4抗体进行蛋白质印迹法，并证实了循环的唾液酸化的Angptl4在aP2-Angptl4中的存在。

图1g显示了来自3个月龄杂合的aP2-Angptl4TG大鼠(n＝3只大鼠/组)的PAS染色的切片，并证实了正常的肾小球形态学(放大率400x)。

图1h显示了在3个月杂合的aP2-Angplt4TG雄性大鼠中用抗-V5抗体来特异性地检测转基因蛋白的免疫金EM，并证实了在aP2-Angptl4TG大鼠的内皮表面上的选择性的金颗粒(用箭头指示)。

图2显示了增加的Angptl4循环水平与蛋白尿/白蛋白尿的关联。

图2a显示了通过GelCode蓝染色的SDS PAGE评估在不同的人和实验性疾病条件下的尿蛋白排泄(3μg/泳道，除了MCD缓解以外)，并证实在aP2-Angptl4TG大鼠中缺失显著的蛋白尿(用*标记的泳道，箭头显示了在约70kDa处的完整白蛋白)。

图2b显示了通过ELISA来评估白蛋白尿，并揭示，杂合的雌性aP2-Angptl4TG大鼠具有比野生型同胞仔更低的白蛋白尿(n＝6只大鼠/组)。

图2c显示了通过ELISA来评估白蛋白尿，并揭示，杂合的雄性aP2-Angptl4TG大鼠具有比野生型同胞仔更低的白蛋白尿(n＝6只大鼠/组)。

图2d显示了在野生型和aP2-Angptl4TG大鼠中诱导嘌罗霉素肾病(PAN)(一种肾病综合征模型)，并证实在aP2-Angptl4TG大鼠中比野生型同胞仔更少的蛋白尿(n＝8只大鼠/组)。*P<0.05,**P<0.01，相对于对应的对照。

图2e显示了重组Angptl4对培养的肾小球内皮细胞(GEnC)具有保护作用。**P<0.01,***P<0.001，相对于对应的对照。

图2f显示了在第6天Angptl4在野生型大鼠疾病模型(如PAN)中的增量调节仅是肾小球的，而在第10天(此时蛋白尿和肾小球Angptl4表达都处于下降)，观察到Angptl4在脂肪组织中的增量调节(n＝3大鼠/样品)。**P<0.01,***P<0.001，相对于对应的对照。

图2g显示了在aP2-Angptl4TG大鼠中在基线时和在诱导PAN以后增加的Angptl4循环水平会导致与野生型大鼠相比增加的血浆甘油三酯水平。*P<0.05，相对于对应的对照。

图2h显示了在aP2-Angptl4TG大鼠中在基线时和在诱导PAN以后增加的Angptl4循环水平会导致与野生型大鼠相比降低的肝素后脂蛋白脂肪酶(LPL)活性。*P<0.05，相对于对应的对照。

图3显示了用于Taqman实时PCR的引物和探针(SEQ ID NO.11-22)。

图4显示了重组Angptl4会减轻人肾小球疾病动物模型中的蛋白尿。

图4a显示了在Buffalo/Mna大鼠(一种FSGS模型)中的蛋白尿的减轻。在Buffalo/Mna大鼠模型中，在第0天评估基线蛋白尿。连续2天(第1天和第2天，箭头)，将Angptl4或对照蛋白腹膜内地注射进Buffalo Mna大鼠(n＝4只大鼠/组)。隔日评估蛋白尿，并表示为基线值的百分比。在重组Angptl4治疗的大鼠中，观察到蛋白尿的显著减轻。

图4b显示了在Thy1.1肾炎(肾小球系膜损伤的一种短期模型)中的蛋白尿的减轻。在雄性Wistar大鼠中诱导Thy1.1肾炎(n＝4只大鼠/组)。在评估基线蛋白尿(第1天)以后，连续2天(第1天和第2天，箭头)静脉内地注射来自Angptl4稳定细胞系或对照细胞系的浓缩上清液蛋白，随后评估蛋白尿。在Angptl4治疗的大鼠中，蛋白尿自始至终更低，且在第5天是统计上显著的。*P<0.05；**P<0.01。所有值都是平均值±SE。

图5显示了来自不同物种的Angptl4的氨基酸和cDNA序列。SEQ ID NO.1和2显示了来自人的氨基酸和cDNA序列(蛋白变体1同种型a，长形式；在位置40和161-164处的标有下划线的氨基酸序列)；SEQ ID NO.3和4显示了来自人的氨基酸和cDNA序列(蛋白变体3同种型b，短形式；在位置40和161-164处的标有下划线的氨基酸序列)；SEQ ID NO.5和6显示了来自大鼠的氨基酸和cDNA序列；SEQ ID NO:7和8显示了来自小鼠的氨基酸和cDNA；正向测序引物标有下划线。反向测序引物为粗体。

发明内容

本公开内容证实，增加的Angptl4循环水平会减轻肾病综合征及其相关病症(诸如但不限于、蛋白尿)的严重性。结果，本公开内容提供了用于治疗和/或预防肾病综合征(诸如但不限于、MCD、FSGS、MN/MGN、MPGN)和糖尿病肾病的方法，以及减轻与肾病综合征有关的征状(包括、但不限于蛋白尿和水肿)的方法。本公开内容另外提供了用于减轻蛋白尿和水肿的方法。

在第一方面，本公开内容提供了治疗和/或预防肾病综合征的方法。在一个实施方案中，所述肾病综合征被表征为MCD、FSGS、MN/MGN、MPGN或糖尿病肾病。在另一个实施方案中，所述肾病综合征被表征为MCD。在另一个实施方案中，所述肾病综合征被表征为MSGS。在另一个实施方案中，所述肾病综合征是由糖尿病病症造成。在一个实施方案中，所述糖尿病病症是糖尿病肾病、糖尿病、狼疮肾炎或原发性肾小球疾病。所述方法包括下述步骤：给受试者施用Angptl4多肽或Angptl4多肽衍生物。在一个实施方案中，所述Angptl4多肽包含SEQ ID NO:1、3、5、7、9或10的序列。在一个替代方案中，所述氨基酸序列是任意前述序列的片段，所述片段具有与野生型Angptl4或Angptl4多肽衍生物相当的活性。在另一个实施方案中，所述Angptl 4多肽衍生物是本文所述的衍生物，且已经被修饰成具有降低的LPL抑制活性，可耐受切割，或前述特征的组合。在一个实施方案中，所述Angptl4多肽或多肽衍生物被唾液酸化。这样的衍生物可以基于本文所述的任一种Angplt4多肽。所述Angptl4多肽或多肽衍生物可以以治疗有效剂量施用，单独地施用，作为药物组合物的一部分施用，或与第二种药剂联合施用。在一个实施方案中，这样的施用通过提供Angptl4功能来治疗肾病综合征。在一个替代实施方案中，这样的施用通过提供修改的Angptl4功能(例如，但不限于，表现出减少的LPL抑制或可耐受切割的Angptl4功能)来治疗肾病综合征。

在第二方面，本公开内容提供了治疗和/或预防MCD的方法。所述方法包括下述步骤：给受试者施用Angptl4多肽或Angptl4多肽衍生物。在一个实施方案中，所述Angptl4多肽包含SEQ ID NO:1、3、5、7、9或10的序列。在一个替代方案中，所述氨基酸序列是任意前述序列的片段，所述片段具有与野生型Angptl4相当的活性。在另一个实施方案中，所述Angptl 4多肽衍生物是本文所述的衍生物，且已经被修饰成具有降低的LPL抑制活性，可耐受切割，或前述特征的组合。在一个实施方案中，所述Angptl4多肽或多肽衍生物被唾液酸化。这样的衍生物可以基于本文所述的任一种Angplt4多肽。所述Angptl4多肽或多肽衍生物可以以治疗有效剂量施用，单独地施用，作为药物组合物的一部分施用，或与第二种药剂联合施用。在一个实施方案中，这样的施用通过提供Angptl4功能来治疗MCD。在一个替代实施方案中，这样的施用通过提供修改的Angptl4功能(例如，但不限于，表现出减少的LPL抑制或可耐受切割的Angptl4功能)来治疗MCD。

在第三方面，本公开内容提供了减轻肾病综合征的一种或多种征状(例如，但不限于，蛋白尿、高胆固醇血症、高甘油三酯血症和水肿)的方法。在一个实施方案中，所述肾病综合征被表征为MCD、FSGS、MN/MGN、MPGN和糖尿病肾病。在另一个实施方案中，所述肾病综合征被表征为MCD。在另一个实施方案中，所述肾病综合征是由FSGS造成。在另一个实施方案中，所述肾病综合征是由糖尿病病症造成。在一个实施方案中，所述糖尿病病症是糖尿病肾病、糖尿病、狼疮肾炎或原发性肾小球疾病。所述方法包括下述步骤：给受试者施用Angptl4多肽或Angptl4多肽衍生物。在一个实施方案中，所述Angptl4多肽包含SEQ ID NO:1、3、5、7、9或10的序列。在一个替代方案中，所述氨基酸序列是任意前述序列的片段，所述片段具有与野生型Angptl4相当的活性。在另一个实施方案中，所述Angptl 4多肽衍生物是本文所述的衍生物，且已经被修饰成具有降低的LPL抑制活性，可耐受切割，或前述特征的组合。在一个实施方案中，所述Angptl4多肽或多肽衍生物被唾液酸化。这样的衍生物可以基于本文所述的任一种Angplt4多肽。所述Angptl4多肽或多肽衍生物可以以治疗有效剂量施用，单独地施用，作为药物组合物的一部分施用，或与第二种药剂联合施用。在一个实施方案中，这样的施用通过提供Angptl4功能来减轻肾病综合征的一种或多种征状。在一个替代实施方案中，这样的施用通过提供修改的Angptl4功能(例如，但不限于，表现出减少的LPL抑制或可耐受切割的Angptl4功能)来减轻肾病综合征的一种或多种征状。

在第四方面，本公开内容提供了用于减轻受试者中的蛋白尿的方法。在一个实施方案中，所述受试者正在遭受肾病综合征。在一个实施方案中，所述肾病综合征被表征为MCD、FSGS、MN/MGN、MPGN和糖尿病肾病。在另一个实施方案中，所述肾病综合征被表征为MCD。在另一个实施方案中，所述受试者正在遭受以蛋白尿为特征的障碍。在另一个实施方案中，所述受试者正在遭受糖尿病病症。在另一个实施方案中，所述蛋白尿是由FSGS造成。在一个实施方案中，所述糖尿病病症是糖尿病肾病、糖尿病、狼疮肾炎或原发性肾小球疾病。所述方法包括下述步骤：给受试者施用Angptl4多肽或Angptl4多肽衍生物。在一个实施方案中，所述Angptl4多肽包含SEQ ID NO:1、3、5、7、9或10的序列。在一个替代方案中，所述氨基酸序列是任意前述序列的片段，所述片段具有与野生型Angptl4相当的活性。在另一个实施方案中，所述Angptl 4多肽衍生物是本文所述的衍生物，且已经被修饰成具有降低的LPL抑制活性，可耐受切割，或前述特征的组合。在一个实施方案中，所述Angptl4多肽或多肽衍生物被唾液酸化。这样的衍生物可以基于本文所述的任一种Angplt4多肽。所述Angptl4多肽或多肽衍生物可以以治疗有效剂量施用，单独地施用，作为药物组合物的一部分施用，或与第二种药剂联合施用。在一个实施方案中，这样的施用通过提供Angptl4功能来减轻蛋白尿。在一个替代实施方案中，这样的施用通过提供修改的Angptl4功能(例如，但不限于，表现出减少的LPL抑制或可耐受切割的Angptl4功能)来减轻蛋白尿。

在第五方面，本公开内容提供了减轻受试者的水肿的方法。在一个实施方案中，所述受试者正在遭受肾病综合征。在一个实施方案中，所述肾病综合征被表征为MCD、FSGS、MN/MGN、MPGN和糖尿病肾病。在另一个实施方案中，所述肾病综合征被表征为MCD。在另一个实施方案中，所述肾病综合征是由FSGS造成。在一个具体的实施方案中，所述水肿是由降低的血浆蛋白(诸如白蛋白)循环水平造成。在另一个实施方案中，所述肾病综合征是由糖尿病病症造成。在一个实施方案中，所述糖尿病病症是糖尿病肾病、糖尿病、狼疮肾炎或原发性肾小球疾病。通过施用Angptl4多肽或Angptl4多肽衍生物来减轻蛋白尿，会减轻蛋白尿，升高血浆蛋白水平，并从而减轻水肿。所述方法包括下述步骤：给受试者施用Angptl4多肽或Angptl4多肽衍生物。在一个实施方案中，所述Angptl4多肽包含SEQ ID NO:1、3、5、7、9或10的序列。在一个替代方案中，所述氨基酸序列是任意前述序列的片段，所述片段具有与野生型Angptl4相当的活性。在另一个实施方案中，所述Angptl 4多肽衍生物是本文所述的衍生物，且已经被修饰成具有降低的LPL抑制活性，可耐受切割，或前述特征的组合。在一个实施方案中，所述Angptl4多肽或多肽衍生物被唾液酸化。这样的衍生物可以基于本文所述的任一种Angplt4多肽。所述Angptl4多肽或多肽衍生物可以以治疗有效剂量施用，单独地施用，作为药物组合物的一部分施用，或与第二种药剂联合施用。在一个实施方案中，这样的施用通过提供Angptl4功能来减轻水肿。在一个替代实施方案中，这样的施用通过提供修改的Angptl4功能(例如，但不限于，表现出减少的LPL抑制或可耐受切割的Angptl4功能)来减轻水肿。

在第六方面，本公开内容提供了减轻受试者的高胆固醇血症和/或高甘油三酯血症的方法。在一个实施方案中，所述受试者正在遭受肾病综合征。在一个实施方案中，所述肾病综合征被表征为MCD、FSGS、MN/MGN、MPGN和糖尿病肾病。在另一个实施方案中，所述肾病综合征被表征为MCD。在另一个实施方案中，所述肾病综合征是由糖尿病病症造成。在一个实施方案中，所述糖尿病病症是糖尿病肾病、糖尿病、狼疮肾炎或原发性肾小球疾病。所述方法包括下述步骤：给受试者施用Angptl4多肽或Angptl4多肽衍生物。在一个实施方案中，所述Angptl4多肽包含SEQ ID NO:1、3、5、7、9或10的序列。在一个替代方案中，所述氨基酸序列是任意前述序列的片段，所述片段具有与野生型Angptl4相当的活性。在另一个实施方案中，所述Angptl 4多肽衍生物是本文所述的衍生物，且已经被修饰成具有降低的LPL抑制活性，可耐受切割，或前述特征的组合。在一个实施方案中，所述Angptl4多肽或多肽衍生物被唾液酸化。这样的衍生物可以基于本文所述的任一种Angplt4多肽。所述Angptl4多肽或多肽衍生物可以以治疗有效剂量施用，单独地施用，作为药物组合物的一部分施用，或与第二种药剂联合施用。在一个实施方案中，这样的施用通过提供Angptl4功能来减轻高胆固醇血症和/或高甘油三酯血症。在一个替代实施方案中，这样的施用通过提供修改的Angptl4功能(例如，但不限于，表现出减少的LPL抑制或可耐受切割的Angptl4功能)来减轻高胆固醇血症和/或高甘油三酯血症。

在第七方面，本公开内容提供了治疗和/或预防糖尿病病症的方法。在一个实施方案中，所述糖尿病病症是糖尿病肾病、糖尿病、狼疮肾炎或原发性肾小球疾病。所述方法包括下述步骤：给受试者施用Angptl4多肽或Angptl4多肽衍生物。在一个实施方案中，所述Angptl4多肽包含SEQ ID NO:1、3、5、7、9或10的序列。在一个替代方案中，所述氨基酸序列是任意前述序列的片段，所述片段具有与野生型Angptl4相当的活性。在另一个实施方案中，所述Angptl 4多肽衍生物是本文所述的衍生物，且已经被修饰成具有降低的LPL抑制活性，可耐受切割，或前述特征的组合。在一个实施方案中，所述Angptl4多肽或多肽衍生物被唾液酸化。这样的衍生物可以基于本文所述的任一种Angplt4多肽。所述Angptl4多肽或多肽衍生物可以以治疗有效剂量施用，单独地施用，作为药物组合物的一部分施用，或与第二种药剂联合施用。在一个实施方案中，这样的施用通过提供Angptl4功能来治疗前述病症。在一个替代实施方案中，这样的施用通过提供修改的Angptl4功能(例如，但不限于，表现出减少的LPL抑制或可耐受切割的Angptl4功能)来治疗前述病症。

在第八方面，本公开内容提供了一种药物组合物，所述药物组合物用于第一方面至第八方面的方法中。所述组合物包含一种或多种Anpt14多肽或多肽衍生物。在一个实施方案中，所述Angptl4多肽包含SEQ ID NO:1、3、5、7、9或10的序列。在一个替代方案中，所述氨基酸序列是任意前述序列的片段，所述片段具有与野生型Angptl4相当的活性。在另一个实施方案中，所述Angptl 4多肽衍生物是本文所述的衍生物，且已经被修饰成具有降低的LPL抑制活性，可耐受切割，或前述特征的组合。在一个实施方案中，所述Angptl4多肽或多肽衍生物被唾液酸化。这样的衍生物可以基于本文所述的任一种Angplt4多肽。

本申请提供了以下项目：

项目1.一种用于治疗或预防受试者的肾病综合征的方法，所述方法包括下述步骤：给所述受试者施用Angptl4多肽、Angptl4多肽衍生物或前述的组合。

项目2.根据项目1所述的方法，其中所述肾病综合征被表征为轻微改变型肾病、局灶性节段性肾小球硬化症、膜性肾病/膜性肾小球肾炎、膜性增生性肾小球肾炎或糖尿病病症。

项目3.根据项目1所述的方法，其中所述方法包括施用Angptl4多肽的步骤。

项目4.根据项目1所述的方法，其中所述Angptl4多肽包含SEQ ID NO:1或3的序列。

项目5.根据项目1所述的方法，其中所述Angptl4多肽包含SEQ ID NO:5或7的序列。

项目6.根据项目1所述的方法，其中所述方法包括施用Angptl4多肽衍生物的步骤。

项目7.根据项目6所述的方法，其中所述Angptl 4多肽衍生物具有降低的脂蛋白脂肪酶抑制活性、可耐受切割或前述的组合。

项目8.根据项目6所述的方法，其中所述Angptl 4多肽衍生物具有降低的脂蛋白脂肪酶抑制活性。

项目9.根据项目8所述的方法，其中与野生型Angptl4多肽相比，所述Angptl 4多肽衍生物含有在位置40处的氨基酸置换。

项目10.根据项目8所述的方法，其中所述Angptl 4多肽衍生物含有E40K置换。

项目11.根据项目8所述的方法，其中所述Angptl 4多肽衍生物含有E40A置换。

项目12.根据项目10或11所述的方法，其中所述Angptl 4多肽衍生物另外含有D39K或D39A置换。

项目13.根据项目6所述的方法，其中所述Angptl 4多肽衍生物可耐受切割。

项目14.根据项目13所述的方法，其中所述Angptl 4多肽衍生物含有在位置161、162、163或164中的一个或多个处的氨基酸置换。

项目15.根据项目13所述的方法，其中所述Angptl 4多肽衍生物含有至少一个氨基酸置换，其中在位置161、162和164中的一个或多个处的精氨酸残基被中性氨基酸置换，且在位置163处的赖氨酸残基被中性氨基酸置换。

项目16.根据项目13所述的方法，其中所述Angptl 4多肽衍生物含有至少一个氨基酸置换，其中在位置161、162和164中的一个或多个处的精氨酸残基被D、R、K、G、A、V或S置换，且在位置163处的赖氨酸残基被D、R、K、G、A、V或S置换。

项目17.根据项目13所述的方法，其中所述Angptl 4多肽衍生物含有R₁₆₁RKR₁₆₄至G₁₆₁SGS₁₆₄置换。

项目18.根据项目6所述的方法，其中所述Angptl 4多肽衍生物具有SEQ ID NO:9或10的序列，其中X₃₉是D，X₄₀是A或K，X₇₆和X₈₀是C，且X₁₆₁、X₁₆₂、X₁₆₃和X₁₆₄独立地被D、R、K、G、A、V或S置换，任选地条件是，X₁₆₁、X₁₆₂、X₁₆₃和X₁₆₄中的至少一个是在SEQ ID NO:1或3中不存在的氨基酸。

项目19.根据项目6所述的方法，其中所述Angptl 4多肽衍生物具有SEQ ID NO:9或10的序列，其中X₃₉是D，X₄₀是A或K，X₇₆和X₈₀之一是A或S，且X₇₆和X₈₀中的另一个是C，且X₁₆₁、X₁₆₂、X₁₆₃和X₁₆₄独立地被D、R、K、G、A、V或S置换，任选地条件是，X₁₆₁、X₁₆₂、X₁₆₃和X₁₆₄中的至少一个是在SEQ ID NO:1或3中不存在的氨基酸。

项目20.根据项目6所述的方法，其中所述Angptl 4多肽衍生物具有SEQ ID NO:9或10的序列，其中X₃₉是A或K，X₄₀是E，X₇₆和X₈₀是C，且X₁₆₁、X₁₆₂、X₁₆₃和X₁₆₄独立地被D、R、K、G、A、V或S置换，任选地条件是，X₁₆₁、X₁₆₂、X₁₆₃和X₁₆₄中的至少一个是在SEQ ID NO:1或3中不存在的氨基酸。

项目21.根据项目6所述的方法，其中所述Angptl 4多肽衍生物具有SEQ ID NO:9或10的序列，其中X₃₉是D，X₄₀是K，X₇₆和X₈₀是C，且X₁₆₁、X₁₆₂、X₁₆₃和X₁₆₄独立地被D、R、K、G、A、V或S置换，任选地条件是，X₁₆₁、X₁₆₂、X₁₆₃和X₁₆₄中的至少一个是在SEQ ID NO:1或3中不存在的氨基酸。

项目22.根据项目6所述的方法，其中所述Angptl 4多肽衍生物具有SEQ ID NO:9或10的序列，其中X₃₉是D，X₄₀是K，X₇₆和X₈₀之一是A或S，且X₇₆和X₈₀中的另一个是C，且X₁₆₁、X₁₆₂、X₁₆₃和X₁₆₄独立地被D、R、K、G、A、V或S置换，任选地条件是，X₁₆₁、X₁₆₂、X₁₆₃和X₁₆₄中的至少一个是在SEQ ID NO:1或3中不存在的氨基酸。

项目23.根据项目1所述的方法，其中所述Angptl4多肽或所述Angptl4多肽衍生物以治疗有效量施用。

项目24.根据项目1所述的方法，其中所述施用减轻水肿、减轻蛋白尿、增加血浆白蛋白水平、减轻高胆固醇血症、减轻高甘油三酯血症、或前述的组合。

项目25.根据项目1所述的方法，其中所述Angptl4多肽或所述Angptl4多肽衍生物被唾液酸化。

项目26.根据项目1所述的方法，其中所述肾病是轻微改变型肾病。

项目27.根据项目2所述的方法，其中所述糖尿病病症是糖尿病肾病、糖尿病、狼疮肾炎或原发性肾小球疾病。

具体实施方式

在下面的讨论中，将为了背景和介绍目的而描述某些物品和方法。本文包含的任何内容都不应解释为现有技术的“承认”。申请人明确地保留下述权利：在适当时，在适用的法律允许下，证实在本文中提及的物品和方法不构成现有技术。

在研究肾病综合征的过程中，发现了由足细胞分泌的Angptl4会诱导蛋白尿。更重要的是，如本文所述，循环的Angptl4会在转基因动物模型中减轻蛋白尿。已经在肾病综合征(诸如MCD和MN)中观察到增加的Angptl 4水平，但是尚未将增加的Angptl4循环水平与肾病综合征的原因相关联。

尽管证实了增加的Angptl4水平会治疗肾病综合征和减轻有关的蛋白尿，已经观察到增加的循环Angptl4会诱导高脂血症(高甘油三酯血症)，例如，但不限于，通过LPL的抑制。有利的是，提供增加的Angptl4循环水平的益处，且没有高脂血症的不利后果。使用本文公开的Angptl4多肽衍生物，这样的方案是可能的。

血管生成素-样蛋白已经涉入高甘油三酯血症的形成和肿瘤转移，且在功能上不同于血管生成素。Angptl4是在肝和脂肪组织中高度表达的PPARγ(8)和PPARα(9)靶基因，在白脂肪组织和肝中被禁食强烈诱导，且是在含氧量正常条件下血管内皮细胞的细胞凋亡存活因子(10)。Angptl4是的一种有效的LPL抑制剂(11)，其在静脉内注射或腺病毒介导的表达以后，诱导显著的高甘油三酯血症(12,13)。其它研究证实了Angptl4在心肌细胞和骨骼肌中的更少表达，并通过RNA印迹分析证实了在全肾中的低水平表达(8)。最近的基于人群的ANGPTL4基因研究揭示了影响人类的甘油三酯水平的变体(14,15)。

本公开内容证实了循环Angptl4的减轻在肾病综合征(例如，但不限于，MCD、FSGS、MN、MPGN和糖尿病肾病)中观察到的蛋白尿的确定作用。

定义

本文使用的术语“预防”、“抑制”表示，在疾病或病症的征状、表现或特征出现之前，开始动作过程(诸如施用化合物或药物组合物)，从而预防或减轻这样的征状、表现或特征。这样的预防和抑制不需要是绝对有用的。

本文使用的术语“治疗”表示，在疾病或病症的征状、表现或特征出现之后，开始动作过程(诸如施用化合物或药物组合物)，从而消除或减轻这样的征状、表现或特征。这样的治疗不需要是绝对有用的。

本文使用的术语“需要治疗”表示，看护人员做出的患者需要治疗或将受益于治疗的判断。该判断是基于多种因素而做出，所述因素是在看护人员经验范围内，但是所述经验包括患者患病或将患病的知识，所述患病是本公开内容的方法或化合物可治疗的疾病或病症的结果。

本文使用的术语“需要预防”表示，看护人员做出的患者需要预防或将受益于预防的判断。该判断是基于多种因素而做出，所述因素是在看护人员经验范围内，但是所述经验包括患者患病或将患病的知识，所述患病是本公开内容的方法或化合物可治疗的疾病或病症的结果。

本文使用的术语“个体”、“受试者”或“患者”表示任意动物，包括哺乳动物，诸如小鼠、大鼠、其它啮齿类动物、兔、狗、猫、猪、牛、绵羊、马或灵长类动物和人类。该术语可以特指雄性或雌性或二者，或排除雄性或雌性。

本文使用的术语“治疗有效量”表示，单独的或作为药物组合物的一部分的化合物的量，所述量能够对疾病或病症的任何征状、表现或特征产生任何可检测的积极作用。这样的作用不需要是绝对有益的。当提及Angptl4多肽或Angptl4多肽衍生物时，术语“治疗有效量”表示，足以减轻受试者的蛋白尿的这种多肽的量。

术语“药学上可接受的衍生物”是指，本公开内容的Angptl4多肽或多肽衍生物的任何药学上可接受的盐、酯、酯的盐、溶剂化物或其它衍生物，其在施用给受试者以后，能够(直接地或间接地)提供野生型Angptl4的功能；在特定实施方案中，所述Angptl4多肽或多肽衍生物显示出降低的耐受切割的LPL抑制活性。特别有利的衍生物是这样的衍生物：当这种多肽被施用给受试者时，其会增加本公开内容的Angptl4多肽或多肽衍生物的生物利用度(例如，通过允许口服施用的化合物更容易地吸收进血液中)，增强这种多肽向给定的生物学隔室的递送，增加溶解度以允许注射给药，改变代谢或改变排泄速率。在一个实施方案中，所述衍生物是前体药物。

除非另有说明，否则术语“药学上可接受的盐”包括，可能存在于本公开内容的Angptl4多肽或多肽衍生物中的酸性或碱性基团的盐。

术语“约”和“大约”应通常表示，对于描述测量的属性和精密度的测量的量而言，可接受程度的误差或变异。通常，误差或变异的示例性程度是在给定值或者数值范围的20％以内，优选10％以内，更优选在5％以内。对于生物学系统，术语“约”表示可接受的误差标准差，优选地不超过给定值的2倍。除非另有说明，否则本文给出的数值的量都是近似的，这意味着，在没有明确地表明时，也可以推测术语“约”或“大约”。

治疗和预防方法

本公开内容提供了治疗和/或预防肾病综合征的方法。本公开内容另外提供了治疗和/或预防MCD、FSGS和/或具有肾小球系膜损伤的病症(诸如糖尿病)的方法。本公开内容另外提供了治疗和/或预防糖尿病病症的的方法。在一个实施方案中，所述糖尿病病症是糖尿病肾病、糖尿病、狼疮肾炎或原发性肾小球疾病。本公开内容另外提供了减轻肾炎综合征的一种或多种征状(例如，但不限于，蛋白尿、高胆固醇血症、高甘油三酯血症和水肿)的方法。此外，本公开内容提供了减轻蛋白尿的方法。此外，本公开内容提供了减轻水肿的方法。本公开内容另外提供了药物组合物，所述药物组合物包含一种或多种Angptl4多肽或Angptl4多肽衍生物。

在一个实施方案中，本公开内容的教导提供了需要这种治疗或预防的受试者的肾病综合征的治疗和/或预防。在一个实施方案中，所述肾病综合征被表征为MCD、FSGS、MN/MGN和MPGN。在另一个实施方案中，所述肾病综合征被表征为MCD。在另一个实施方案中，所述肾病综合征是由FSGS造成。在另一个实施方案中，所述肾病综合征是由糖尿病病症造成。在一个实施方案中，所述糖尿病病症是糖尿病肾病、糖尿病、狼疮肾炎或原发性肾小球疾病。所述方法包括下述步骤：给受试者施用Angptl4多肽或Angptl4多肽衍生物。在一个实施方案中，所述Angptl4多肽包含SEQ ID NO:1、3、5、7、9或10的序列。在一个替代方案中，所述氨基酸序列是任意前述序列的片段，所述片段具有与野生型Angptl4相当的活性。在另一个实施方案中，所述Angptl 4多肽衍生物是本文所述的衍生物，且已经被修饰成具有降低的LPL抑制活性，可耐受切割，或前述特征的组合。在一个实施方案中，所述Angptl4多肽或多肽衍生物被唾液酸化。这样的衍生物可以基于本文所述的任一种Angplt4多肽。所述Angptl4多肽或多肽衍生物可以以治疗有效剂量施用，单独地施用，作为药物组合物的一部分施用，或与第二种药剂联合施用。在一个实施方案中，这样的施用通过提供Angptl4功能来治疗肾病综合征。在一个替代实施方案中，这样的施用通过提供修改的Angptl4功能(例如，但不限于，表现出减少的LPL抑制或可耐受切割的Angptl4功能)来治疗肾病综合征。这种方法可以另外包括：鉴别需要这种治疗和/或预防的受试者。

在一个替代实施方案中，本公开内容的教导提供了需要这种治疗或预防的受试者的MCD的治疗和/或预防。所述方法包括下述步骤：给受试者施用Angptl4多肽或Angptl4多肽衍生物。在一个实施方案中，所述Angptl4多肽包含SEQ ID NO:1、3、5、7、9或10的序列。在一个替代方案中，所述氨基酸序列是任意前述序列的片段，所述片段具有与野生型Angptl4相当的活性。在另一个实施方案中，所述Angptl 4多肽衍生物是本文所述的衍生物，且已经被修饰成具有降低的LPL抑制活性，可耐受切割，或前述特征的组合。在一个实施方案中，所述Angptl4多肽或多肽衍生物被唾液酸化。这样的衍生物可以基于本文所述的任一种Angplt4多肽。所述Angptl4多肽或多肽衍生物可以以治疗有效剂量施用，单独地施用，作为药物组合物的一部分施用，或与第二种药剂联合施用。在一个实施方案中，这样的施用通过提供Angptl4功能来治疗MCD。在一个替代实施方案中，这样的施用通过提供修改的Angptl4功能(例如，但不限于，表现出减少的LPL抑制或可耐受切割的Angptl4功能)来治疗MCD。这种方法可以另外包括：鉴别需要这种治疗和/或预防的受试者。

在其它实施方案中，本公开内容的教导提供了减轻肾病综合征的一种或多种征状(例如，但不限于，蛋白尿、高胆固醇血症、高甘油三酯血症和水肿)的方法。在一个实施方案中，所述肾病综合征被表征为MCD、FSGS、MN/MGN、MPGN和糖尿病肾病。在另一个实施方案中，所述肾病综合征被表征为MCD。在另一个实施方案中，所述肾病综合征是由FSGS造成。在另一个实施方案中，所述肾病综合征是由糖尿病病症造成。在一个实施方案中，所述糖尿病病症是糖尿病肾病、糖尿病、狼疮肾炎或原发性肾小球疾病。所述方法包括下述步骤：给受试者施用Angptl4多肽或Angptl4多肽衍生物。在一个实施方案中，所述Angptl4多肽包含SEQID NO:1、3、5、7、9或10的序列。在一个替代方案中，所述氨基酸序列是任意前述序列的片段，所述片段具有与野生型Angptl4相当的活性。在另一个实施方案中，所述Angptl 4多肽衍生物是本文所述的衍生物，且已经被修饰成具有降低的LPL抑制活性，可耐受切割，或前述特征的组合。在一个实施方案中，所述Angptl4多肽或多肽衍生物被唾液酸化。这样的衍生物可以基于本文所述的任一种Angplt4多肽。所述Angptl4多肽或多肽衍生物可以以治疗有效剂量施用，单独地施用，作为药物组合物的一部分施用，或与第二种药剂联合施用。在一个实施方案中，这样的施用通过提供Angptl4功能来减轻肾病综合征的一种或多种征状。在一个替代实施方案中，这样的施用通过提供修改的Angptl4功能(例如，但不限于，表现出减少的LPL抑制或可耐受切割的Angptl4功能)来减轻肾病综合征的一种或多种征状。这种方法可以另外包括：鉴别需要这种治疗和/或预防的受试者。

在另一个实施方案中，本公开内容的教导提供了减少受试者的蛋白尿的方法。在一个实施方案中，所述受试者正在遭受肾病综合征。在一个实施方案中，所述肾病综合征被表征为MCD、FSGS、MN/MGN、MPGN和糖尿病肾病。在另一个实施方案中，所述肾病综合征被表征为MCD。在另一个实施方案中，所述肾病综合征是由FSGS造成。在另一个实施方案中，所述肾病综合征是由糖尿病病症造成。在一个实施方案中，所述糖尿病病症是糖尿病肾病、糖尿病、狼疮肾炎或原发性肾小球疾病。所述方法包括下述步骤：给受试者施用Angptl4多肽或Angptl4多肽衍生物。在一个实施方案中，所述Angptl4多肽包含SEQ ID NO:1、3、5、7、9或10的序列。在一个替代方案中，所述氨基酸序列是任意前述序列的片段，所述片段具有与野生型Angptl4相当的活性。在另一个实施方案中，所述Angptl 4多肽衍生物是本文所述的衍生物，且已经被修饰成具有降低的LPL抑制活性，可耐受切割，或前述特征的组合。在一个实施方案中，所述Angptl4多肽或多肽衍生物被唾液酸化。这样的衍生物可以基于本文所述的任一种Angplt4多肽。所述Angptl4多肽或多肽衍生物可以以治疗有效剂量施用，单独地施用，作为药物组合物的一部分施用，或与第二种药剂联合施用。在一个实施方案中，这样的施用通过提供Angptl4功能来减轻蛋白尿。在一个替代实施方案中，这样的施用通过提供修改的Angptl4功能(例如，但不限于，表现出减少的LPL抑制或可耐受切割的Angptl4功能)来减轻蛋白尿。这种方法可以另外包括：鉴别需要这种治疗和/或预防的受试者。

在另一个实施方案中，本公开内容的教导提供了减轻受试者的水肿的方法。在一个实施方案中，所述受试者正在遭受肾病综合征。在一个实施方案中，所述肾病综合征被表征为MCD、FSGS、MN/MGN、MPGN和糖尿病肾病。在另一个实施方案中，所述肾病综合征被表征为MCD。在另一个实施方案中，所述肾病综合征是由FSGS造成。在另一个实施方案中，所述肾病综合征是由糖尿病病症造成。在一个实施方案中，所述糖尿病病症是糖尿病肾病、糖尿病、狼疮肾炎或原发性肾小球疾病。在一个具体的实施方案中，所述水肿是由降低的血浆蛋白(诸如白蛋白)循环水平造成。通过施用Angptl4多肽或Angptl4多肽衍生物来减轻蛋白尿，会减轻蛋白尿，升高血浆蛋白水平，并从而减轻水肿。所述方法包括下述步骤：给受试者施用Angptl4多肽或Angptl4多肽衍生物。在一个实施方案中，所述Angptl4多肽包含SEQ IDNO:1、3、5、7、9或10的序列。在一个替代方案中，所述氨基酸序列是任意前述序列的片段，所述片段具有与野生型Angpt14相当的活性。在另一个实施方案中，所述Angptl 4多肽衍生物是本文所述的衍生物，且已经被修饰成具有降低的LPL抑制活性，可耐受切割，或前述特征的组合。在一个实施方案中，所述Angptl4多肽或多肽衍生物被唾液酸化。这样的衍生物可以基于本文所述的任一种Angplt4多肽。所述Angptl4多肽或多肽衍生物可以以治疗有效剂量施用，单独地施用，作为药物组合物的一部分施用，或与第二种药剂联合施用。在一个实施方案中，这样的施用通过提供Angptl4功能来减轻水肿。在一个替代实施方案中，这样的施用通过提供修改的Angptl4功能(例如，但不限于，表现出减少的LPL抑制或可耐受切割的Angptl4功能)来减轻水肿。这种方法可以另外包括：鉴别需要这种治疗和/或预防的受试者。

在另一个实施方案中，本公开内容的教导提供了减轻受试者的高胆固醇血症和/或高甘油三酯血症的方法。在一个实施方案中，所述受试者正在遭受肾病综合征。在一个实施方案中，所述肾病综合征被表征为MCD、FSGS、MN/MGN和MPGN。在另一个实施方案中，所述肾病综合征被表征为MCD。在另一个实施方案中，所述肾病综合征是由FSGS造成。在另一个实施方案中，所述肾病综合征是由糖尿病病症造成。在一个实施方案中，所述糖尿病病症是糖尿病肾病、糖尿病、狼疮肾炎或原发性肾小球疾病。所述方法包括下述步骤：给受试者施用Angptl4多肽或Angptl4多肽衍生物。在一个实施方案中，所述Angptl4多肽包含SEQ IDNO:1、3、5、7、9或10的序列。在一个替代方案中，所述氨基酸序列是任意前述序列的片段，所述片段具有与野生型Angptl4相当的活性。在另一个实施方案中，所述Angptl 4多肽衍生物是本文所述的衍生物，且已经被修饰成具有降低的LPL抑制活性，可耐受切割，或前述特征的组合。在一个实施方案中，所述Angptl4多肽或多肽衍生物被唾液酸化。这样的衍生物可以基于本文所述的任一种Angplt4多肽。所述Angptl4多肽或多肽衍生物可以以治疗有效剂量施用，单独地施用，作为药物组合物的一部分施用，或与第二种药剂联合施用。在一个实施方案中，这样的施用通过提供Angptl4功能来减轻蛋白尿。在一个替代实施方案中，这样的施用通过提供修改的Angptl4功能(例如，但不限于，表现出减少的LPL抑制或可耐受切割的Angptl4功能)来减轻蛋白尿。这种方法可以另外包括：鉴别需要这种治疗和/或预防的受试者。

在另一个实施方案中，本公开内容的教导提供了用于治疗和/或预防由糖尿病病症造成的肾病综合征的方法。在一个实施方案中，所述糖尿病病症是糖尿病肾病、糖尿病、狼疮肾炎或原发性肾小球疾病。所述方法包括下述步骤：给受试者施用Angptl4多肽或Angptl4多肽衍生物。在一个实施方案中，所述Angptl4多肽包含SEQ ID NO:1、3、5、7、9或10的序列。在一个替代方案中，所述氨基酸序列是任意前述序列的片段，所述片段具有与野生型Angptl4相当的活性。在另一个实施方案中，所述Angptl 4多肽衍生物是本文所述的衍生物，且已经被修饰成具有降低的LPL抑制活性，可耐受切割，或前述特征的组合。在一个实施方案中，所述Angptl4多肽或多肽衍生物被唾液酸化。这样的衍生物可以基于本文所述的任一种Angplt4多肽。所述Angptl4多肽或多肽衍生物可以以治疗有效剂量施用，单独地施用，作为药物组合物的一部分施用，或与第二种药剂联合施用。在一个实施方案中，这样的施用通过提供Angptl4功能来治疗前述病症。在一个替代实施方案中，这样的施用通过提供修改的Angptl4功能(例如，但不限于，表现出减少的LPL抑制或可耐受切割的Angptl4功能)来治疗前述病症。

筛选方法

本公开内容也涉及一种用于鉴别化合物的方法，所述化合物可有效地治疗或预防肾病综合征或其有关病症，例如，但不限于，蛋白尿、高胆固醇血症、高甘油三酯血症或水肿。在一个实施方案中，所述肾病综合征被表征为MCD或MN。在另一个实施方案中，所述肾病综合征被表征为MCD。在另一个实施方案中，所述肾病综合征被表征为FSGS。在另一个实施方案中，所述肾病综合征是由糖尿病病症造成。在一个实施方案中，所述糖尿病病症是糖尿病肾病、糖尿病、狼疮肾炎或原发性肾小球疾病。这样的化合物可以用作被包含在药物组合物中的活性成分，或用于单独施用。在一个实施方案中，所述方法包括：测定在肾病综合征的病原学中涉及的多肽(例如，但不限于，Angptl4)的水平。

一般而言，这样的筛选方法包括下述步骤：提供一种试验系统(在下面更详细地描述)，所述系统会表达在肾病综合征的病原学中涉及的多肽(例如，但不限于，Angptl4)，向所述试验系统中引入要测试的实验化合物，并测定所述实验化合物对所述多肽水平的影响。所述方法包括：鉴别会影响所述多肽的唾液酸化水平的候选物或实验化合物或药剂(多肽、功能核酸、碳水化合物、抗体、小分子或其它分子)。然后可以在适当的系统(例如，但不限于，本文所述的动物模型系统)中进一步测试这样的化合物，以测定鉴别的化合物的活性。

使用多种试验来鉴别候选化合物，例如，但不限于，采用表达在肾病综合征的病原学中涉及的多肽(例如，但不限于，Angptl4)的细胞的试验。或使用分离的多肽的试验。各种试验可以采用这种多肽的多种变体(例如，全长、生物活性片段或包括目标多肽的全部或一部分的融合蛋白)。此外，这种多肽可以源自任意合适的哺乳动物物种(例如，人、大鼠或小鼠)；在一个具体的实施方案中，所述多肽源自人类。

在试验包括使用完整细胞的情况下，所述细胞可以天然地表达在肾病综合征的病原学中涉及的多肽(例如，但不限于，Angptl4)，或可以修饰成来表达它们。在后一种情况下，通过常规分子生物学技术，诸如通过用包含这种多肽的病毒感染细胞，可以修饰细胞来表达所需多肽。所述细胞也可以是已经用编码这种多肽的核苷酸序列转染的原核或真核细胞。在前一种情况下，可以使用全长多肽、片段或含有这种多肽的至少一部分的融合蛋白。在本说明书中描述了示例性的试验系统。

各种筛选试验可以与体内试验相组合，所述体内试验需要测量实验化合物对本文讨论的疾病状态和病症的征状的影响。在这样的一个实施方案中，可以评价化合物，以确定它们是否影响与肾病综合征或其相关病症(例如，但不限于，蛋白尿或水肿)有关的参数。这样的参数包括、但不限于：1)在肾病综合征和相关病症的病原学中涉及的多肽(例如，但不限于，Angptl4)的水平，和2)蛋白排泄水平，无论是总水平，还是关于特定组分的水平。

在一个实施方案中，这样的筛选试验可以如下进行：例如，通过测定多肽(例如，但不限于，Angptl4)的水平，并检测与实验化合物不存在相比，在有实验化合物存在下，这种多肽的水平的差异。这样的筛选试验可以是体外的、体内的或离体的，且可以以细胞培养物为基础(使用完整细胞或裂解物)，或可以以动物模型为基础。本公开内容的任何试验可以用于前述方法中。

适用于所述筛选方法中的实验化合物，可以从任意合适的来源(诸如常规化合物文库)得到。使用本领域已知的组合文库方法的众多方案中的任一种，也可以得到实验化合物，所述方案包括：生物学文库，空间上可接近的平行固相或溶液相文库，需要解卷积的合成文库方法，“一个珠子一种化合物”文库方法，和使用亲和色谱法选择的合成文库方法。所述生物学文库方案限于肽文库，而其它4种方案适用于肽、非肽寡聚体或小分子化合物文库。在本领域中可以找到用于合成分子文库的方法的实例。化合物文库可以存在于溶液中或珠子、细菌、孢子、质粒或噬菌体上。

本公开内容也提供了用于实现本公开内容的任意方法的试剂盒，所述试剂盒可以含有本文公开的任意化合物和/或组合物，或以其它方式用于实现本公开内容的方法。

Angptl4多肽衍生物的建立和选择

血管生成素相关蛋白4是一种在人类中由ANGPTL4基因编码的多肽。该基因是血管生成素/血管生成素-样基因家族的成员，并编码糖基化的分泌型蛋白，所述蛋白具有：N-端信号序列(SEQ ID NO:1的氨基酸残基1-22)、卷曲螺旋结构域(SEQ ID NO:1的氨基酸残基23-170)、接头区域(SEQ ID NO:1的氨基酸残基171-185)和纤维蛋白原C-端结构域(SEQ IDNO:1的氨基酸残基186-406)。该基因在低氧条件下在内皮细胞中诱导，且是过氧化物酶体增殖活化剂的靶标。编码的蛋白是血清激素，所述血清激素直接参与调节葡萄糖体内稳态、脂类代谢和胰岛素敏感性，并也起血管内皮细胞的细胞凋亡存活因子的作用。已经描述了编码不同同种型的交替剪接的转录物变体。该基因以前被称作ANGPTL2，但是已经被更名为ANGPTL4。

Angptl4会通过断裂LPL二聚体分子而抑制LPL。已经明确地确认Angptl4为血浆甘油三酯(TG)清除的有效抑制剂，其会造成血浆TG水平的升高。最近的证据指示，Angptl4多肽序列中的变化会影响对甘油三酯的作用，其中某些突变会赋予降低的甘油三酯水平，这暗示降低的LPL抑制(33和34，它们每篇通过引用并入，用于教导Angptl4变体)。此外，已经报道，Angptl4多肽以寡聚体形式存在，并且LPL活性的抑制需要寡聚化。从细胞中分泌以后，所述寡聚体形式在切割位点(SEQ ID NO:1和3的R₁₆₁RKR₁₆₄)处被切割，以提供单体C-端形式和寡聚的N-端形式(34)。发现Angptl4肽的N-端残基1-187足以抑制LPL(33)。

人、大鼠和小鼠的氨基酸和cDNA序列提供在图5中，并指定SEQ ID NO:1-8。本公开内容预见到Angptl4多肽和多肽衍生物在本文公开的方法(诸如但不限于，治疗和预防方法)中的用途。如本文所定义的，Angptl4多肽衍生物表示，与SEQ ID NO:1或3所示的人多肽的氨基酸序列相比包括一个或多个插入、缺失和/或置换的Angptl4多肽，或在SEQ ID NO:5或7中所示的多肽。在一个实施方案中，去除野生型Angptl 4多肽的氨基酸残基，并用不同的氨基酸残基替代。可以如本文所述或如本领域已知地构建变体。使用本文所述的用于筛选活性的方法和试验，可以评价如此构建的变体。

当在本文中使用时，用于表示氨基酸的单个字母具有下述含义：

G	甘氨酸	P	脯氨酸
				A	丙氨酸	V	缬氨酸
L	亮氨酸	I	异亮氨酸
				M	甲硫氨酸	C	半胱氨酸
F	苯丙氨酸	Y	酪氨酸
				W	色氨酸	H	组氨酸
K	赖氨酸	R	精氨酸
				Q	谷氨酰胺	N	天冬酰胺
E	谷氨酸	D	天冬氨酸
				S	丝氨酸	T	苏氨酸

在一个实施方案中，所述变体包含在Angptl4多肽的氨基酸序列中的变化，所述变化会降低Angptl4的抑制LPL或耐受切割的能力。所述变化可以是在该区域中的一个或多个残基的替换、缺失和/或置换。这样的变化已经在本领域中有所描述(参见参考文献33和34，它们通过引用并入本文，用于这样的教导)。在一个实施方案中，这样的变化发生在SEQ IDNO:1的残基1-187或SEQ ID NO:3的残基1-182中。在一个替代实施方案中，这样的变化发生在SEQ ID NO:1、3、5或7或SEQ ID NO:1或3的位置40处。在一个实施方案中，在位置40处的氨基酸(在野生型Angptl4中的带负电荷的谷氨酸残基)被中性氨基酸或带正电荷的氨基酸替换。在一个具体实施方案中，所述变化是E40K置换。在另一个具体实施方案中，所述变化是E40A置换。已经证实，所述E40K和E40A置换会减少Angptl4的LPL抑制，但是不会干扰多肽的表达、分泌、加工和其它功能。在另一个具体实施方案中，在SEQ ID NO:1和3的位置40处的变化选自下面表1中所示的那些。在另一个实施方案中，在位置39处的氨基酸(在野生型Angptl4中的带负电荷的天冬氨酸残基)被中性氨基酸或带正电荷的氨基酸替换。在一个实施方案中，所述置换是D39K置换或D39A置换。在另一个具体实施方案中，在SEQ ID NO:1和3的位置39处的变化选自下面表1中所示的那些。在某些实施方案中，多肽变体可以含有在位置40处的前述变化之一，在位置39处的前述变化之一，或前述的组合。在一个具体实施方案中，所述多肽含有D39K置换和E40K置换、D39A置换和E40K置换、或D39K置换和E40A置换。

表1

在另一个实施方案中，所述变体包含在Angptl4多肽的负责所述多肽的切割的区域中的一个或多个变化。在一个实施方案中，该区域是Angptl4的R₁₆₁RKR₁₆₄区域。所述变化可以是在该区域中的一个或多个残基的替换、缺失和/或置换。已经证实，所述R₁₆₁RKR₁₆₄区域负责Angptl4的寡聚体形式的切割，这会释放出N-端序列的寡聚体和C-端序列的单体。经证实，与野生型多肽相比，具有突变的切割位点的Angptl4形式会以更高的水平在循环中积累。此外，阻止Angptl4多肽的切割会稳定化Angptl4的寡聚体形式，所述形式在本公开内容中发现是有效的。在一个实施方案中，改变在所述R₁₆₁RKR₁₆₄区域中的所有4个氨基酸残基；在一个替代实施方案中改变在所述R₁₆₁RKR₁₆₄区域中的1、2或3个氨基酸残基。在另一个实施方案中，在位置161、162或164处的精氨酸残基独立地被甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸或丝氨酸置换，且在位置163处的赖氨酸残基被甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸或丝氨酸置换。在一个具体的实施方案中，SEQ ID NO:1或3的R₁₆₁RKR₁₆₄氨基酸序列被G₁₆₁AAG₁₆₄替换；在另一个具体的实施方案中，SEQ ID NO:1或3的R₁₆₁RKR₁₆₄氨基酸序列被G₁₆₁SGS₁₆₄替换。用于替换SEQ ID NO:1或3的整个R₁₆₁RKR₁₆₄区域的示例性氨基酸序列提供在下面的表2中。

在另一个实施方案中，改变SEQ ID NO:I或3的R₁₆₁RKR₁₆₄氨基酸序列的一个或多个氨基酸，以去除能够切割Angplt4的酶的共有结合位点，使得Angptl4可耐受切割。在一个实施方案中，所述酶是前蛋白转化酶，且所述共有结合位点是RXKR、RXRR、RR或KR，其中X是任意氨基酸。在制作这样的替换中，可以删除一个或多个氨基酸，或用甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸或丝氨酸置换，或用本文讨论的任意其它置换进行置换。

在另一个实施方案中，所述变体包含在Angptl4多肽的负责所述多肽的寡聚化的区域中的一个或多个变化。在一个实施方案中，该区域是Angptl4的C₇₆和/或C₈₀区域。已经证实，C₇₆和/或C₈₀区域参与Angptl4多肽的寡聚化(34，该参考文献并入本文中，用于这样的教导)。所述变化可以是在该区域中的一个或多个残基的替换、缺失和/或置换。在一个具体实施方案中，在位置76和80处的半胱氨酸残基中的仅一个被置换；在一个替代实施方案中，在位置76和80处的两个半胱氨酸残基都被置换。在一个实施方案中，在位置76和80处的半胱氨酸残基中的至少一个独立地被丙氨酸或丝氨酸置换；在另一个实施方案中，两个半胱氨酸残基都被丙氨酸或丝氨酸置换。

在另一个实施方案中，所述变体包含：在Angplt4的R₁₆₁RKR₁₆₄区域中会抑制Angptl4多肽寡聚体的切割的一个或多个变化，和在位置40处减少Angptl4的LPL活性抑制的变化。本文讨论的任意变化都被包括在内。

在一个实施方案中，本公开内容提供了Angptl4多肽变体，所述变体具有SEQ IDNO:9或10的氨基酸序列。SEQ ID NO:9显示在图5中，且包括来自SEQ ID NO:1的Angptl4的野生型序列，例外是，分别用X₃₉、X₄₀、X₇₆、X₈₀、X₁₆₁、X₁₆₂、X₁₆₃和X₁₆₄指示的在位置39、40、76、80和161-164处的置换。SEQ ID NO:10显示在图5中，且包括来自SEQ ID NO:3的Angptl4的野生型序列，例外是，分别用X₃₉、X₄₀、X₇₆、X₈₀、X₁₆₁、X₁₆₂、X₁₆₃和X₁₆₄指示的在位置39、40、76、80和161-164处的置换。

在SEQ ID NO:9和10中，X₃₉可以是A、G、P、V、L、I、M、C、F、Y、W、H、R、Q、N、S、T或K。在一个实施方案中，X₃₉是中性或带正电荷的氨基酸。在另一个实施方案中，X₃₉可以是A或K。在另一个实施方案中，X₃₉可以是D。

在SEQ ID NO:9和10中，X₄₀可以是A、G、P、V、L、I、M、C、F、Y、W、H、R、Q、N、S、T或K。在一个实施方案中，X₄₀是中性或带正电荷的氨基酸。在另一个实施方案中，X₄₀可以是A或K。在另一个实施方案中，X₄₀可以是E。在另一个实施方案中，X₄₀可以是E(当X₃₉不是D时)，且X₃₉可以是D(当X₄₀不是E时)。

在SEQ ID NO:9和10中，X₇₆和X₈₀中的至少一个可以被置换。在一个实施方案中，X₇₆和X₈₀独立地是A或S或C。在一个实施方案中，X₇₆和X₈₀之一可以是A或S，且X₇₆和X₈₀中的另一个是C。在另一个实施方案中，X₇₆和X₈₀二者可以独立地是A或S。在另一个实施方案中，X₇₆和X₈₀二者可以是C。

在SEQ ID NO:9和10中，X₁₆₁、X₁₆₂、X₁₆₃和X₁₆₄中的至少一个可以被置换。在一个实施方案中，X₁₆₁、X₁₆₂、X₁₆₃和X₁₆₄中的所有四个被置换；在一个替代实施方案中，X₁₆₁、X₁₆₂、X₁₆₃和X₁₆₄中的1、2或3个被置换。在另一个实施方案中，X₁₆₁、X₁₆₂、X₁₆₃和X₁₆₄独立地是D、R、K、G、A、V或S。在另一个实施方案中，X₁₆₁、X₁₆₂、X₁₆₃和X₁₆₄中的所有四个被在表2列出的组合置换。

本公开内容预见到前述内容的任意形式的组合。此外，在SEQ ID NO:9和10中的指定残基可以被在表3中指定的保守氨基酸置换所置换，或被具有±1或更小的亲水指数差异的残基置换，或被具有±1或更小的亲水性值差异的残基置换。

在一个实施方案中，X₃₉是D，X₄₀是A或K，X₇₆和X₈₀是C，且X₁₆₁、X₁₆₂、X₁₆₃和X₁₆₄独立地被D、R、K、G、A、V或S置换，任选地条件是，X₁₆₁、X₁₆₂、X₁₆₃和X₁₆₄中的至少一个是在SEQ ID NO:1或3中不存在的氨基酸。在另一个实施方案中，X₃₉是D，X₄₀是A或K，X₇₆和X₈₀是C，且X₁₆₁、X₁₆₂、X₁₆₃和X₁₆₄选自在表2中所示的组合。在另一个实施方案中，X₃₉是D，X₄₀是A或K，X₇₆和X₈₀是C，且X₁₆₁、X₁₆₂、X₁₆₃和X₁₆₄是GSGS或GAAG。

在另一个实施方案中，X₃₉是D，X₄₀是A或K，X₇₆和X₈₀之一是A或S，且X₇₆和X₈₀中的另一个是C，且X₁₆₁、X₁₆₂、X₁₆₃和X₁₆₄独立地被D、R、K、G、A、V或S置换，任选地条件是，X₁₆₁、X₁₆₂、X₁₆₃和X₁₆₄中的至少一个是在SEQ ID NO:1或3中不存在的氨基酸。在另一个实施方案中，X₃₉是D，X₄₀是A或K，X₇₆和X₈₀之一是A或S，且X₇₆和X₈₀中的另一个是C，且X₁₆₁、X₁₆₂、X₁₆₃和X₁₆₄选自在表2中所示的组合。在另一个实施方案中，X₃₉是D，X₄₀是A或K，X₇₆和X₈₀之一是A或S，且X₇₆和X₈₀中的另一个是C，且X₁₆₁、X₁₆₂、X₁₆₃和X₁₆₄是GSGS或GAAG。

在一个实施方案中，X₃₉是A或K，X₄₀是E，X₇₆和X₈₀是C，且X₁₆₁、X₁₆₂、X₁₆₃和X₁₆₄独立地被D、R、K、G、A、V或S置换，任选地条件是，X₁₆₁、X₁₆₂、X₁₆₃和X₁₆₄中的至少一个是在SEQ ID NO:1或3中不存在的氨基酸。在另一个实施方案中，X₃₉是A或K，X₄₀是E，X₇₆和X₈₀是C，且X₁₆₁、X₁₆₂、X₁₆₃和X₁₆₄选自在表2中所示的组合。在另一个实施方案中，X₃₉是A或K，X₄₀是E，X₇₆和X₈₀是C，且X₁₆₁、X₁₆₂、X₁₆₃和X₁₆₄是GSGS或GAAG。

在一个实施方案中，X₃₉是D，X₄₀是K，X₇₆和X₈₀是C，且X₁₆₁、X₁₆₂、X₁₆₃和X₁₆₄独立地被D、R、K、G、A、V或S置换，任选地条件是，X₁₆₁、X₁₆₂、X₁₆₃和X₁₆₄中的至少一个是在SEQ ID NO:1或3中不存在的氨基酸。在另一个实施方案中，X₃₉是D，X₄₀是K，X₇₆和X₈₀是C，且X₁₆₁、X₁₆₂、X₁₆₃和X₁₆₄选自在表2中所示的组合。在另一个实施方案中，X₃₉是D，X₄₀是K，X₇₆和X₈₀是C，且X₁₆₁、X₁₆₂、X₁₆₃和X₁₆₄是GSGS或GAAG。

在一个实施方案中，X₃₉是D，X₄₀是K，X₇₆和X₈₀之一是A或S，且X₇₆和X₈₀中的另一个是C，且X₁₆₁、X₁₆₂、X₁₆₃和X₁₆₄独立地被D、R、K、G、A、V或S置换，任选地条件是，X₁₆₁、X₁₆₂、X₁₆₃和X₁₆₄中的至少一个是在SEQ ID NO:1或3中不存在的氨基酸。在另一个实施方案中，X₃₉是D，X₄₀是K，X₇₆和X₈₀之一是A或S，且X₇₆和X₈₀中的另一个是C，且X₁₆₁、X₁₆₂、X₁₆₃和X₁₆₄选自在表2中所示的组合。在另一个实施方案中，X₃₉是D，X₄₀是K，X₇₆和X₈₀之一是A或S，且X₇₆和X₈₀中的另一个是C，且X₁₆₁、X₁₆₂、X₁₆₃和X₁₆₄是GSGS或GAAG。

在一个实施方案中，所述Angptl4衍生物是基于Angplt4的片段。合适的片段包括：保留野生型Angplt4活性的任意片段，或100或更多个连续氨基酸的任意片段。在一个实施方案中，这样的片段是基于SEQ ID NO:1的氨基酸1-187或SEQ ID NO:3的氨基酸1-182。这样的片段可以具有在前述段落中描述的氨基酸置换。

Angptl4多肽衍生物可以具有与野生型Angptl4多肽活性相比相当或增加(在一个实施方案中，50％或更多)的活性；或者，所述Angptl4多肽衍生物可以具有与野生型Angptl4多肽活性相比降低(在一个实施方案中，小于50％)的活性。在一个具体的实施方案中，所述Angptl4多肽衍生物具有降低的LPL的能力，且表现出增加的切割抗性。

如本领域普通技术人员已知的，可以选择所述缺失、添加和置换，以产生所需的Angptl4多肽衍生物。例如，预期保守置换或具有类似性质的氨基酸置换是可耐受的。另外，特定的缺失、插入和置换可以正面地或负面地影响某种Angptl4多肽活性，但是不会影响不同的Angptl4多肽活性。

对SEQ ID NO:1或3或5或7中的任一个氨基酸序列的保守修饰(包括其组合)(和对编码核苷酸的对应修饰)，会产生这样的Angptl4多肽衍生物：所述衍生物具有与天然存在的Angptl4多肽的相应特征类似的功能和化学特征，同时使不希望的性质(诸如LPL抑制活性)最小化。相比而言，可以如下实现Angptl4多肽的功能和/或化学特征的重大修饰：选择在SEQ ID NO:1或3或5或7中的任一个氨基酸序列内的置换，包括其组合，所述置换在它们的下述作用方面显著不同：维持置换区域中的分子主链的结构。

例如，“保守氨基酸置换”可涉及用非天然氨基酸残基置换天然氨基酸残基，结果对置换位置的氨基酸残基的极性或电荷有极少或没有影响。此外，所述多肽中的任何天然残基也可用丙氨酸置换。

保守氨基酸置换也包括非天然存在的氨基酸残基，所述残基通常通过化学肽合成(而不是通过在生物系统中的合成)掺入。这些包括肽拟似物和氨基酸部分的其它反转或倒转形式。本领域技术人员应当理解，本文所述的核酸和多肽分子可以化学合成以及通过重组方式生产。

基于共同的侧链性质，可以将天然存在的残基分类：1)疏水的：正亮氨酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile；2)中性亲水的：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；3)酸性的：Asp、Glu；4)碱性的：His、Lys、Arg；5)影响链朝向的残基：Gly、Pro；和6)芳族的：Trp、Tyr、Phe。

例如，非保守置换可包括这些类别中的某一类别的成员与另一类别的成员互换。这种置换残基可被引入Angptl4多肽衍生物的与非人Angptl4多肽直系同源物同源的区域中，或者被引入所述分子中的非同源区域中。

在造成这种变化时，可考虑氨基酸的亲水指数。根据每种氨基酸的疏水性和电荷特征，给予其亲水指数。它们为：异亮氨酸(+4.5)；缬氨酸(+4.2)；亮氨酸(+3.8)；苯丙氨酸(+2.8)；半胱氨酸/胱氨酸(+2.5)；甲硫氨酸(+1.9)；丙氨酸(+1.8)；甘氨酸(0.4)；苏氨酸(-0.7)；丝氨酸(-0.8)；色氨酸(-0.9)；酪氨酸(-1.3)；脯氨酸(-1.6)；组氨酸(-3.2)；谷氨酸盐(-3.5)；谷氨酰胺(-3.5)；天冬氨酸盐(-3.5)；天冬酰胺(-3.5)；赖氨酸(-3.9)；和精氨酸(-4.5)。

本领域理解亲水性氨基酸指数在赋予蛋白质相互作用生物功能方面的重要性(Kyte等人,J.Mol.Biol.,157:105-131,1982)。已知，可用某些氨基酸置换具有类似亲水指数或分数的其它氨基酸，且仍保持类似的生物活性。

在根据亲水指数造成变化时，可以使用其亲水指数在±2之内的氨基酸置换；在一个替代实施方案中，所述亲水指数是在±1之内；在另一个替代实施方案中，所述亲水指数是在±0.5之内。

本领域还认识到，可根据亲水性有效地造成相似氨基酸的置换。由其邻近氨基酸的亲水性所决定的多肽最大局部平均亲水性与该蛋白质的生物学性质相关。

已给氨基酸残基分配以下亲水性值：精氨酸(+3.0)；赖氨酸(+3.0)；天冬氨酸盐(+3.0.+-.1)；谷氨酸盐(+3.0.+-.1)；丝氨酸(+0.3)；天冬酰胺(+0.2)；谷氨酰胺(+0.2)；甘氨酸(0)；苏氨酸(-0.4)；脯氨酸(-0.5.+-.1)；丙氨酸(-0.5)；组氨酸(-0.5)；半胱氨酸(-1.0)；甲硫氨酸(-1.3)；缬氨酸(-1.5)；亮氨酸(-1.8)；异亮氨酸(-1.8)；酪氨酸(-2.3)；苯丙氨酸(-2.5)；色氨酸(-3.4)。

在根据类似的亲水性值造成变化时，可以使用其亲水性值在±2之内的氨基酸置换；在一个替代实施方案中，所述亲水性值是在±1之内；在另一个替代实施方案中，所述亲水性值是在±0.5之内。

在需要这种置换时，本领域技术人员可以确定需要的氨基酸置换(无论保守的还是非保守的)。例如，可以使用氨基酸置换来鉴别Angptl4多肽的重要残基。或来增加或降低Angptl4多肽与特定结合靶物的亲和力，以便增加或降低Angptl4多肽活性。

示例性的氨基酸置换如表3所述。

技术人员使用公知的技术，将能够确定在SEQ ID NO:1或3或5或7中的任一个中所述的多肽的合适变体，包括其组合。为了鉴别可改变而又不破坏活性的合适分子区域，本领域技术人员可以以认为对活性不重要的区域为目标。例如，当已知来自相同物种或来自其它物种的具有类似活性的类似多肽时，本领域技术人员可以将Angptl4多肽的氨基酸序列与这样的类似多肽进行对比。利用这样的对比，可以鉴别在类似多肽中保守的残基和分子部分。应当理解，相对于这样的类似多肽不保守的Angptl4多肽区域中的变化，不太可能不利地影响Angptl4多肽的生物活性和/或结构。本领域技术人员还已知，甚至在相对保守的区域中，可以用化学上类似的氨基酸置换天然存在的残基，同时保留活性(保守氨基酸残基置换)。因此，甚至对于生物活性或对于结构具有重要性的区域，也可进行保守氨基酸置换，而又不破坏生物活性，或者不对多肽的结构产生不利影响。

另外，本领域技术人员可检阅结构-功能研究，从而鉴别在类似多肽中对活性或结构重要的残基。基于这样的对比，可以预测出Angptl4多肽中的氨基酸残基的重要性，其对应于类似多肽.中对活性或结构重要的氨基酸残基。本领域技术人员可为Angptl4多肽的这种预测重要的氨基酸残基选择在化学上类似的氨基酸置换。

本领域技术人员还可以参照类似多肽中的结构，分析三维结构和氨基酸序列。基于该信息，本领域技术人员可以参照它的三维结构预测Angptl4多肽的氨基酸残基排列。本领域技术人员可选择不对预测位于蛋白质表面的氨基酸残基造成基团变化，因为这种残基可能参与与其它分子的重要相互作用。此外，本领域技术人员可以产生出在每个所需的氨基酸残基处包含单个氨基酸置换的试验Angptl4多肽衍生物。然后可以使用本领域技术人员公知的和本文公开的活性试验，筛选所述衍生物。可以用这样的衍生物来收集关于合适置换的信息。例如，如果发现特定氨基酸残基的变化导致活性破坏、不合乎需要的降低或者不合适的活性，那么可以避免带有这种变化的衍生物。换句话说，基于从这种常规实验收集到的信息，本领域技术人员可以容易地确定这样的氨基酸：此处应避免单独的或者与其它突变相组合的进一步置换。

众多科学出版物已致力于从氨基酸序列分析来预测二级结构(参见Chou等人,Biochemistry,13(2):222-245,1974；Chou等人,Biochemistry,113(2):211-222,1974；Chou等人,Adv.Enzymol.Relat.Areas Mol.Biol.,47:45-148,1978；Chou等人,Ann.Rev.Biochem.,47:251-276,1979；和Chou等人,Biophys.J.,26:367-384,1979)。此外，目前也有计算机程序可用于帮助预测多肽的二级结构。实例包括：以Jameson-Wolf分析为基础的那些程序(Jameson等人,Comput.Appl.Biosci.,4(1):181-186,1998；和Wolf等人,Comput.Appl.Biosci.,4(1):187-191；1988),PepPlot.RTM.程序(Brutlag等人,CABS,6:237-245,1990；和Weinberger等人,Science,228:740-742,1985)，和用于蛋白质三级结构预测的其它新程序(Fetrow.Et al.,Biotechnology,11:479-483,1993)。

此外，目前也有计算机程序可用于辅助预测二级结构。一种预测二级结构的方法是基于同源性建模。例如，序列一致性大于30％或者相似性大于40％的两种多肽或蛋白质经常具有类似的拓扑结构。蛋白质结构数据库(PDB)的近期发展已使二级结构(包括在多肽或蛋白质结构内部的潜在折叠数目)的预测性提高(参见Holm等人,Nuci.Acid.Res.,27(1):244-247,1999)。

另外的预测二级结构的方法包括“串线算法(threading)”(Jones,D.,Curr.Opin.Struct.Biol.,7(3):377-87,1997；Suppl等人,Structure,4(1):15-9,1996),“序型分析”(Bowie等人,Science,253:164-170,1991；Gribskov等人,Meth.Enzym.,183:146-159,1990；和Gribskov等人,Proc.Nat.Acad.Sci.,84(13):4355-4358,1987),和“进化连锁”(参见Home,同上,和Brenner,同上)。

本文讨论的任意多肽形式也可以含有可用于鉴别或纯化多肽的序列；这样的序列的一个实例是C-端V5标签。前述内容也包括核酸序列(例如，但不限于，cDNA序列)，其编码这种多肽，包括本文所述的多肽衍生物。

组合物

本公开内容的有用组合物可以包含可用于本公开内容的治疗和预防方法中的本公开内容的一种或多种多肽；有用组合物也包括一种或多种核酸，所述核酸编码可用于本公开内容的治疗和预防方法中的本公开内容的一种或多种多肽。公开的组合物可以包含与药学上可接受的载体相组合的一种或多种这样的化合物。这样的载体和配制方法的实例，可以参见：Remington:The Science and Practice of Pharmacy(第20版,Lippincott,Williams&Wilkins,Daniel Limmer编)。为了形成适合施用的药学上可接受的组合物，这样的组合物将含有治疗有效量的化合物。

本公开内容的药物组合物可以用于本公开内容的治疗和预防方法中。这样的组合物以下述量施用给受试者：所述量足以递送治疗有效量的化合物，因而在本文公开的治疗和预防方法中是有效的。所述治疗有效量可以根据多种因素而变化，所述因素例如，但不限于，受试者的病症、体重、性别和年龄。其它因素包括：给药模式和部位。可以以本领域已知的任意方法，将药物组合物提供给受试者。示例性的给药途径包括、但不限于：皮下的、静脉内的、表面的、表皮的、口服的、骨内的和肌肉内的。本公开内容的组合物可以给受试者仅施用1次，或者给受试者施用超过1次。此外，当所述组合物给受试者施用超过1次时，可以使用多种方案，例如，但不限于，每天1次，每周1次，或每月1次。所述组合物也可以每天给受试者施用超过1次。通过常规测试，可以鉴别治疗有效量和适当的给药方案，以便获得最佳活性，同时使任何潜在副作用最小化。另外，其它药剂的共同施用或先后施用可以是合乎需要的。

本公开内容的组合物可以全身地(诸如通过静脉内给药)施用，或局部地(诸如通过皮下注射，或通过施用糊剂或乳膏剂)施用。

在一个实施方案中，提供了编码本公开内容的Angptl4多肽或Angptl4多肽变体的核酸，所述核酸可以是合适的质粒或载体的形式。通过本领域已知的合适的方法(例如，电穿孔)，将这样的核酸导入细胞中，所述细胞可以从受试者得到。在一个实施方案中，所述细胞是脂肪细胞。可以测定所述细胞的Angptl4多肽或多肽衍生物的表达(在一个实施方案中，通过标签在本文讨论的多肽上的存在，可以测定所述多肽的表达)。然后可以将表达Angptl4多肽或多肽衍生物的细胞导入受试者中。在一个实施方案中，通过皮下注射，将所述细胞施用给受试者；还可以使用其它施用方法，包括本文讨论的那些。所述细胞然后表达Angptl4多肽或Angptl4多肽衍生物，其溶解于循环中。

本公开内容的组合物可以另外包含提高所述化合物的溶解度、半衰期、吸收等的试剂。此外，本公开内容的组合物可以另外包含减弱不希望的副作用和/或降低所述化合物的毒性的试剂。这样的试剂的实例描述在多种教科书中，例如，但不限于，Remington:TheScience and Practice of Pharmacy(第20版,Lippincott,Williams&Wilkins,DanielLimmer编)。

本公开内容的组合物可以在多种施用剂型中施用。例如，所述组合物可以以下述形式施用：例如，但不限于，片剂、胶囊剂、药囊、锭剂、糖锭、丸剂、散剂、颗粒、酏剂、酊剂、溶液、混悬液、酏剂、糖浆剂、软膏剂、乳膏剂、糊剂、乳剂或用于静脉内给药或注射的溶液。其它剂型包括透皮施用、经由贴剂机理或软膏剂。可以改进前述任一种，以提供定时释放和/或持续释放制剂。

在本公开内容中，所述药物组合物可以另外包含药学上可接受的载体，包括、但不限于：媒介物、佐剂、表面活性剂、助悬剂、乳化剂、惰性填充剂、稀释剂、赋形剂、润湿剂、粘合剂、润滑剂、缓冲剂、崩解剂和载体，以及助剂，例如，但不限于，着色剂和矫味剂(在本文中统称为载体)。通常，所述药学上可接受的载体对活性化合物而言是化学惰性的，且在使用条件下没有有害的副作用或毒性。所述药学上可接受的载体可以包括聚合物和聚合物基质。所述药学上可接受的载体的性质，可以随采用的特定剂型和组合物的其它特征而变化。

例如，就固体形式(诸如但不限于，片剂、胶囊剂、药囊、锭剂、糖锭、丸剂、散剂或颗粒)的口服给药而言，所述化合物可以与口服的、无毒的药学上可接受的惰性载体相混合，所述载体例如，但不限于，惰性填充剂、合适的粘合剂、润滑剂、崩解剂和助剂。合适的粘合剂包括、但不限于：淀粉、明胶、天然糖(诸如葡萄糖或β-乳糖)、玉米甜味剂、天然的和合成的树胶(诸如阿拉伯胶、黄蓍胶或海藻酸钠)、羧甲基纤维素、聚乙二醇、蜡类等等。用于这些剂型中的润滑剂包括、但不限于：油酸钠、硬脂酸钠、硬脂酸镁、苯甲酸钠、醋酸钠等等。崩解剂包括、但不限于：淀粉、甲基纤维素、琼脂、皂粘土、黄原胶等等。片剂形式可以包括下述的一种或多种：乳糖、蔗糖、甘露醇、玉米淀粉、马铃薯淀粉、海藻酸、微晶纤维素、阿拉伯胶、明胶、瓜尔胶、胶体二氧化硅、交联羧甲基纤维素钠、滑石、硬脂酸镁、硬脂酸钙、硬脂酸锌、硬脂酸，以及本文描述的其它载体。锭剂形式可以包括：在矫味剂(通常是蔗糖和阿拉伯胶或黄蓍胶)中的活性成分，以及包含在惰性基质(诸如明胶和甘油或蔗糖和acadia)中的活性成分的软锭剂，乳剂和凝胶，所述凝胶除了含有活性成分以外，还含有本领域已知的载体。

就口服液体形式(诸如但不限于，酊剂、溶液、混悬液、酏剂、糖浆剂)而言，本公开内容的核酸分子可以溶解在稀释剂(诸如水、盐水或醇)中。此外，所述口服液体形式可以包括适当矫味的助悬剂或分散剂，诸如合成的和天然的胶，例如，黄蓍胶、阿拉伯胶、甲基纤维素等等。此外，当需要或必要时，也可以将合适的着色剂或其它助剂掺入混合物中。可以采用的其它分散剂包括甘油等等。

适于肠胃外给药的制剂包括：水性的和非水性的、等渗的无菌注射溶液(其可以含有抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂、和使制剂与患者血液等渗的溶质)，以及水性的和非水性的无菌混悬液(其可以包括助悬剂、增溶剂、增稠剂、稳定剂和防腐剂)。所述化合物可以在生理上可接受的稀释剂中给药，这些稀释剂例如无菌液体或液体的混合物，所述液体包括：水，盐水，葡萄糖水溶液和相关的糖溶液，醇(诸如乙醇、异丙醇或十六醇)，二醇(诸如丙二醇)，或聚乙二醇(诸如聚乙二醇400)，甘油缩酮(诸如2,2-二甲基-1,3-二氧戊环-4-甲醇)，醚，油，脂肪酸，脂肪酸酯或甘油酯，或乙酰化的脂肪酸甘油酯，加入或不加入药学上可接受的表面活性剂(例如，但不限于，肥皂、油或去污剂)、助悬剂(例如，但不限于，果胶、卡波姆、甲基纤维素、羟丙甲基纤维素或羧甲基纤维素)或乳化剂和其它药物佐剂。

可以用于肠胃外制剂的油包括：石油、动物油、植物油或合成油。油的具体实例包括：花生油、大豆油、芝麻油、棉籽油、玉米油、橄榄油、凡士林和矿物油。适用于肠胃外制剂的脂肪酸包括：聚乙烯脱水山梨糖醇脂肪酸酯(诸如脱水山梨糖醇单油酸酯)，环氧乙烷与疏水基质的高分子量加合物(通过环氧丙烷与丙二醇缩合而形成)，油酸，硬脂酸，和异硬脂酸。油酸乙酯和肉豆蔻酸异丙酯是合适的脂肪酸酯的实例。适用于肠胃外制剂的肥皂包括：脂肪碱金属、铵和三乙醇胺盐，适当的去污剂包括：(a)阳离子去污剂，例如，二甲基二烷基铵卤化物，和烷基吡啶鎓卤化物，(b)阴离子去污剂，例如，烷基、芳基和烯烃磺酸盐，烷基，烯烃，醚，和单酸甘油酯硫酸盐，和磺基丁二酸盐，(c)非离子去污剂，例如，脂肪胺氧化物，脂肪酸烷醇酰胺，和聚氧乙烯聚丙烯共聚物，(d)两性去污剂，例如，β-氨基丙酸烷基酯，和2-烷基-咪唑啉季铵盐，和(e)它们的混合物。

合适的防腐剂和缓冲剂可以用于这样的制剂中。为了减少或消除在注射部位处的刺激，这样的组合物可以含有一种或多种非离子表面活性剂，所述非离子表面活性剂具有约12至约17的亲水亲油平衡值(HLB)。在这样的制剂中的表面活性剂的量的范围通常是约5重量％至约15重量％。

含有本公开内容的核酸分子的外用剂型(例如，但不限于，软膏剂、乳膏剂、糊剂、乳剂)可以与本领域众所周知的多种载体材料(例如，醇、真芦荟凝胶、尿囊素、甘油、维生素A和E油、矿物油、PPG2、丙酸肉豆蔻酯等等)相混合，以形成醇溶液、表面清洁剂、清洁霜、皮肤凝胶、皮肤洗剂以及乳膏剂或凝胶制剂形式的洗发剂。也可以包括皮肤脱落剂或皮肤磨擦制品。这样的表面制品可以应用于透皮递送的贴剂、绷带或敷药，或可以应用于直接向伤口或皮肤损伤部位递送的绷带或敷药。

本公开内容的化合物还可以以脂质体递送系统(诸如小单层囊泡、大单层囊泡和多层囊泡)的形式施用。脂质体可以从多种磷脂(诸如胆固醇、硬脂酰胺或磷脂酰胆碱)形成。这样的脂质体还可以含有单克隆抗体，以指导脂质体向特定细胞类型或细胞类型群体的递送。

本公开内容的化合物还可以与作为可靶向的药物载体的可溶性聚合物相偶联。这样的聚合物可以包括、但不限于：聚乙烯吡咯烷酮、吡喃共聚物、多羟丙基甲基丙烯酰胺苯酚、多羟乙基天冬氨酰胺苯酚或被棕榈酰残基取代的聚环氧乙烷聚赖氨酸。此外，本发明的化合物可以与可用于实现药物控释的可生物降解的聚合物类型相偶联，所述聚合物例如：聚乳酸、聚ε己内酯、多羟基丁酸、聚原酸酯、聚缩醛、聚二氢吡喃、聚氰基丙烯酸酯和交联的或两亲的水凝胶嵌段共聚物。

结果

在下述结果中，使用的方法是在本公开内容的方法部分和其中引用的参考文献中指出的那些方法。一些下述的结果描述在：Clement LC等人,Podocyte secretedAngiopoietin-like 4mediates proteinuria in glucocorticoid-sensitive nephroticsyndrome,Nature Medicine,2011年1月(该参考文献中包含的关于Angptl4多肽的使用的公开内容，通过引用并入本文)。

肾病综合征患者具有增加的Angptl4循环水平

肾病综合征患者具有增加的循环Angptl4多肽水平。通过二维凝胶电泳，分析了200μg人血浆，所述血浆来自已经确诊患有MCD和MN的患者(n＝4位患者/组)和处于MCD复发中的患者，并使用抗-Angptl4抗体制备蛋白质印迹(图1a)。图1a表明，仅患有MCD复发和MN的患者具有增加的Angptl4水平(用箭头指示)。该形式的Angptl4作为中性pI形式存在，且作为单体和寡聚体存在。

aP2-Angptl4 TG大鼠具有增加的Angptl4循环水平

开发了脂肪细胞特异性的Angptl4过表达的转基因大鼠模型，并显示在图1b中(aP2-Angptl4TG)。正常地表达Angptl4的器官的mRNA表达分析，证实了表达的特异性，其中在褐色脂肪组织(BAT)和白脂肪组织(WAT)中检测到Angplt4(图1c)。

200μg血浆的二维凝胶电泳和随后使用抗-Angptl4抗体进行的蛋白质印迹法揭示，杂合的aP2-Angptl4TG大鼠具有比野生型大鼠更高的Angptl4循环水平(图1d)(3个月龄，n＝3印迹/组)。图1e显示了200μg血浆的二维凝胶电泳，随后使用抗-Angptl4和抗-V5抗体进行的蛋白质印迹法证实了脂肪组织分泌的V5标记的Angptl4在aP2-Angptl4TG大鼠的血浆中的存在。来自aP2-Angptl4TG大鼠血浆的免疫沉淀的Angptl4的二维凝胶电泳(使用对Angptl4的N-端特异性的抗体)，随后使用抗-Angptl4或抗-凝集素进行蛋白质印迹法。SNA I抗体揭示了唾液酸化的Angptl4多肽在循环中的存在。

通过光学显微术(图1g)和电子显微术(未显示)，证实aP2-Angptl4TG大鼠具有形态学上正常的肾小球，且肾小球Angptl4表达未改变。这不同于Angptl4的足细胞特异性的表达：这样的表达导致肾小球缺陷，包括在1-5个月龄之间的足突展平的进行性发展(参见美国临时申请号61/351,865(2010年6月5日提交)，其通过引用并入本文，用于这样的教导)。

在3个月龄的杂合的aP2-Angptl4TG雄性大鼠中用抗-V5抗体来特异性地检测转基因表达的蛋白的免疫金EM，证实了在内皮表面上的选择性的检测，这指示：循环的Angptl4中级和高级寡聚体没有进入GBM，且具有在内皮表面上的受体。循环Angptl4的作用与人和实验性肾病综合征有关，因为在肾病综合征的晚期(此时蛋白尿处于下降中)观察到Angptl4的脂肪组织增量调节。

增加的Angpt14循环水平与蛋白尿和白蛋白尿的关联

为了检查Angptl4蛋白尿(包括白蛋白尿)的循环水平之间的关联，在aP2-Angptl4TG大鼠中分析了蛋白尿。图2a表明，aP2-Angptl4TG没有表现出蛋白尿，这通过尿蛋白分析测得。在图2a中，通过GelCode蓝染色的SDS PAGE(3μg/泳道，除了MCD缓解以外)分析了尿蛋白(在每个泳道的下面提供了光密度测定法读数)。在70kDa观察到完整的白蛋白带(用箭头指示)。可以看出，野生型大鼠、aP2-Angptl4TG大鼠和MCD缓解患者在分析的尿样品中几乎没有表现出或没有表现出完整的白蛋白，其中NPHS2-Angplt4TG大鼠(一种大鼠转基因模型，其具有足细胞特异性的Angptl4表达，且经证实会形成具有蛋白尿的MCD；参见美国临时申请号，其通过引用并入本文中，用于这样的教导)、MCD复发、MN复发和PAN大鼠(肾病综合征的一种大鼠模型)表现出指示白蛋白尿的强烈白蛋白染色。图2b表明，雌性杂合的aP2-Angptl4雌性TG大鼠具有比野生型同胞仔对照降低的白蛋白尿。图2c显示了aP2-Angptl4杂合的雄性TG大鼠的相同结果。图2d表明，与野生型同胞仔相比，aP2-Angptl4TG大鼠在嘌罗霉素肾病(PAN模型；肾病综合征的一种大鼠模型)中表现出降低的蛋白尿。如上所证实的，aP2-Angptl4TG大鼠具有更高循环水平的Angptl4，其迁移至中性等电点处或附近，且被唾液酸化。这些结果证实了循环Angptl4在减轻蛋白尿和肾病综合征中的作用。

由于与肾小球内皮结合的脂肪组织分泌的Angptl4的内皮结合，进行实验来测定重组Angptl4对肾小球上皮细胞(GEnC)的影响，以研究在该大鼠模型中更低的基线白蛋白尿和更少的PAN诱导的蛋白尿是否由肾小球内皮保护介导。如下使GenC遭受氧化性损伤：将过氧化氢加入培养基中，并与浓缩上清液(600μg/孔)一起温育，所述浓缩上清液来自：对照稳定细胞系Angptl4-HEK293细胞系(分泌高等电点(pI)，低唾液酸化的Angptl4)，或用ManNAc温育的Angptl4-HEK293细胞系(中性pI，正常唾液酸化的Angptl4)。应当指出，从处于MCD的足细胞大量分泌高pI形式的Angptl4。将LDH的释放评估为细胞损伤的标志物。为没有过氧化氢损伤的对照细胞给出1的相对评分。高pI Angptl4会增加GEnC损伤，而中性pIAngptl4(其构成大部分循环Angptl4)在所有测量的时间点是明显保护性的(n＝3读数/条件)。

Angptl4在PAN第6天的野生型大鼠中的增量调节仅是肾小球的，而在第10天(此时蛋白尿和肾小球Angptl4表达都处于下降)，观察到在脂肪组织中的增量调节(n＝3大鼠/样品)(图2f)。因此，Angptl4循环水平的增加与循环Angptl4在肾病综合征中的保护作用和蛋白尿的减轻相一致。循环Angptl4的作用可能与人和实验性MCD有关，因为在PAN的晚期(此时蛋白尿处于下降中)观察到Angptl4的脂肪组织增量调节。此外，在aP2-Angptl4TG大鼠中在基线时和在诱导PAN以后增加的Angptl4循环水平会导致与野生型大鼠相比增加的血浆甘油三酯水平(图2g)和降低的肝素后脂蛋白脂肪酶活性(图2h)。

为了证实Angptl4向循环中的治疗性递送的有效性，将野生型Angptl4或对照蛋白施用给Buffalo/Mna大鼠(一种FSGS模型)或Wistar大鼠(其中诱导了Thy1.1肾炎，即肾小球系膜损伤的一种短期模型)(图4a和b)。通过收获重组蛋白，产生野生型重组Angptl4多肽。在15cm培养皿中培养Angptl4-HEK293稳定细胞系或pcDNA3.1-HEK293对照稳定细胞系至汇合，用温PBS洗涤2次，并用无血清的DMEM(没有酚红，含有或没有25mM ManNAc)温育48小时。收获细胞，并浓缩上清液。在每个注射时间点，使用来自1个15cm培养皿的浓缩上清液。

Buffalo/Mna大鼠在约2个月龄时自发地形成类似于人FSGS的病变，包括：在光学显微术下的局灶性病变和节段性病变、在电子显微术下的足细胞足突的展平、和蛋白尿。所述大鼠随着它们老化而发展蛋白尿的进行性增加。在上述研究中使用的大鼠是雄性和5个月龄。通过将150μg抗-Thy1.1(Ox-7杂交瘤)或对照IgG静脉内地注射进不同组的雄性Wistar大鼠(100-125克，n＝4只大鼠/组)中，诱导抗-Thy1.1肾炎。

在Buffalo/Mna大鼠模型中，在第0天评估基线蛋白尿。连续2天(第1天和第2天，箭头)，将Angptl4或对照蛋白腹膜内地注射进Buffalo Mna大鼠(n＝4只大鼠/组)。隔日评估蛋白尿，并表示为基线值的百分比。在重组Angptl4治疗的大鼠中，观察到蛋白尿的显著减轻。

在Thy1.1肾炎模型中，在第1天证实蛋白尿。连续2天(第1天和第2天，箭头)，给大鼠静脉内地注射重组Angptl4或对照蛋白。然后评估蛋白尿。如图4b所示，在Angptl4治疗的大鼠中，蛋白尿自始至终较低，且在第5天是统计上显著的。

这些结果表明，Angptl4向循环中的治疗性递送，可有效地治疗：肾病综合征，例如但不限于，轻微改变型肾病，局灶性节段性肾小球硬化症，膜性肾病/膜性肾小球肾炎，膜性增生性肾小球肾炎，或糖尿病病症，例如但不限于，糖尿病肾病，糖尿病，狼疮肾炎或原发性肾小球疾病。此外，这些结果表明，Angptl4向循环中的治疗性递送，可有效地治疗下述病症及其有关病症：肾病综合征，诸如但不限于，蛋白尿，高胆固醇血症，高甘油三酯血症和水肿。在一个实施方案中，所述Angptl4多肽是具有降低的LPL抑制活性、切割抗性的衍生物或本文所述的衍生物。这样的衍生物的施用，会保留Angptl4治疗的有益作用，没有与抑制LPL活性有关的不利作用，诸如增加的血浆甘油三酯水平。

方法

克隆全长大鼠Angptl4，制备针对全长重组Angptl4的抗体

将来自我们的先前实验(7)的1218bp的全长大鼠Angptl4开放读码框(不包括终止密码子)克隆进pcDNA3.1/V5-HisB中(就真核表达而言和pET28a中(就原核表达而言)。使用表达纯化的全长蛋白的大肠杆菌在兔子中产生多克隆抗体(Proteintech group,Inc.Chicago IL USA)，并通过ELISA和蛋白质印迹进行测试。从GelCode蓝染色的凝胶切离抗体反应带，用胰蛋白酶消化，并通过MALDI-TOF/TOF证实Angptl4肽序列的存在。针对抗原亲和纯化一部分抗血清。除非另外指出，否则描述的所有研究都使用该抗体。

类似地，在兔中制备针对大鼠Angptl4的N-端部分(氨基酸7-86，不包括信号肽)的其它多克隆抗体。

在人肾小球疾病动物模型中诱导蛋白尿

所有动物研究都得到动物实验管理小组(institutional IACUC)的批准。在括号内的先前出版物中，描述了在野生型大鼠中诱导蛋白尿的动物模型(n＝4只大鼠/组)：PAN(7)，PHN(7)，使用糖皮质激素的PAN(20)，非-HIV塌陷性肾小球病(18)，肾毒血清诱导的异相蛋白尿(7)。通过将200微克抗-Thy1.1(Ox-7杂交瘤)或对照IgG静脉内地注射进不同组的雄性Wistar大鼠(100-125克，n＝4只大鼠/组)中，诱导抗-Thy1.1肾炎，并在24和72小时以后将大鼠安乐死。

下述技术描述在先前的出版物中：Taqman实时PCR(26)，共焦成像(7)，原位杂交(27)，免疫金EM(26)，用于蛋白质印迹的肾小球提取和处理(26)，通过PEI方法评估电荷(28)。为了阿辛蓝染色，使用醋酸，将染色溶液的pH调至2.5，并使用0.1％核坚牢红溶液作为复染剂。使用Image-Pro软件(Media Cybernetics,Inc.,Bethesda MD,USA)，评估肾小球基膜阿辛蓝染色剂的光密度测定法(20个肾小球/大鼠，3只大鼠/组)。使用Gel-ProAnalyzer软件(Media Cybernetics,Inc.)，评估二维凝胶蛋白质印迹的光密度测定法。Taqman实时PCR引物和探针列出在图3中。为了原位杂交，大鼠Angptl4的地高辛配基标记的探针包括ORF的碱基对1-548。

为了得到用于肝素后LPL活性的样品，给大鼠静脉内地注射10单位/100克体重的猪肝素，在15分钟以后安乐死，并使用来自Roar Biomedical,Inc(New York NY)的试验，测量活性。在禁食状态，测量血清甘油三酯。

将NTS注射进Angptl4-/-小鼠中

Angptl4-/-小鼠是由Eli Lily Corporation(Indianapolis IN USA)提供给Sander Kersten的友情赠品。研究方案得到Wageningen大学的动物研究委员会的批准。给11周龄的雄性Angptl4-/-或+/+小鼠(n＝4小鼠/组)静脉内地注射1.5mgγ2-NTS或标准绵羊血清(Sigma Aldrich St.Louis MO USA)，在48小时时收集尿斑样品，在72小时时将小鼠安乐死，收集血浆用于生化测量，并保存肾用于组织学分析。通过ELISA(Bethyllaboratories,Montgomery TX USA)评估尿白蛋白，并通过质谱法测量尿肌酸酐。为了评估足突展平，首先在对照治疗的Angptl4+/+小鼠透射电子显微照片中测量足突的平均宽度(10个均匀间隔的读数/环，3环/肾小球，3个肾小球/肾，3个肾/组)。将展平描述为，平均宽度的超过2.5倍增加。在NTS治疗的或对照治疗的Angptl4-/-小鼠中，计数总足突和展平的足突。

使用保藏的人样品的研究

在墨西哥城的Instituto Nacional de Cardiologia，对经由IRB批准的方案得到的样品，进行保藏的人肾活组织检查样品的免疫染色(n＝5活组织检查样品/条件)。用于这些研究的对照肾活组织检查是性别和年龄匹配的方案移植前活组织检查。从以前公开的研究(29)，得到用于二维凝胶电泳和蛋白质印迹的存档的人血清(n＝4样品/条件)。

转基因大鼠的制备

通过将具有C-端V5标签的大鼠Angptl4cDNA(包括信号序列)克隆在聚腺苷酸尾巴上游紧邻的NotI位点处，在含有5.4Kb小鼠aP2启动子构建体的载体(30)(购自AddgeneInc.Cambridge MA USA)中制备aP2-Angptl4TG大鼠(脂肪组织特异性的)构建体。如下制备转基因大鼠：将消化过的DNA构建体显微注射进受精的Sprague Dawley卵子中(在Michigan大学进行)，植入假妊娠的宿主Sprague Dawley雌性中，通过常规PCR和TaqMan基因组DNA实时PCR策略(使用构建体特异性的和对照基因组催乳素的引物和探针组合(图3))，测定得到的后代的基因型。制备了用于脂肪组织特异性表达的3个原始系。显示了来自aP2-Angptl4TG大鼠系375的数据(3个拷贝)，二者都稳定超过4代。使用Bradford方法(Bioradlaboratories,Hercules CA USA)，评估尿总蛋白，并通过ELISA(Bethyl laboratories,Montgomery TX USA)，评估白蛋白尿。

使用GEnC的体外研究

为了GEnC研究，将培养的大鼠GEnC(32)在6孔板中培养至75％汇合(n＝3孔/条件)，用下述物质洗涤2次：温PBS，无血清的RPMI(含有200μM H202)，以及600μg/孔的对照稳定细胞系上清液，或Angptl4-HEK293稳定细胞系上清液，或来自ManNAc治疗的Angptl4-HEK293细胞系的上清液。在24、36和48小时，对孔取样。使用细胞毒性检测试剂盒(RocheDiagnostics,Mannheim Germany)，测量LDH释放。将OD 492值表示为，其中没有加入H202或加入了稳定细胞系上清液的孔的读数之比。

统计分析

使用GraphPad InStat软件3.05版，通过具有分析后检验的ANOVA，分析涉及3个或更多个组的蛋白尿或基因表达差异。为了对比2个组，在Microsoft Excel 2003中使用不成对的Students t检验。

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Met Ser Gly Ala Pro Thr Ala Gly Ala Ala Leu Met Leu Cys Ala Ala

1 5 10 15

Thr Ala Val Leu Leu Ser Ala Gln Gly Gly Pro Val Gln Ser Lys Ser

20 25 30

Pro Arg Phe Ala Ser Trp Asp Glu Met Asn Val Leu Ala His Gly Leu

35 40 45

Leu Gln Leu Gly Gln Gly Leu Arg Glu His Ala Glu Arg Thr Arg Ser

50 55 60

Gln Leu Ser Ala Leu Glu Arg Arg Leu Ser Ala Cys Gly Ser Ala Cys

65 70 75 80

Gln Gly Thr Glu Gly Ser Thr Asp Leu Pro Leu Ala Pro Glu Ser Arg

85 90 95

Val Asp Pro Glu Val Leu His Ser Leu Gln Thr Gln Leu Lys Ala Gln

100 105 110

Asn Ser Arg Ile Gln Gln Leu Phe His Lys Val Ala Gln Gln Gln Arg

115 120 125

His Leu Glu Lys Gln His Leu Arg Ile Gln His Leu Gln Ser Gln Phe

130 135 140

Gly Leu Leu Asp His Lys His Leu Asp His Glu Val Ala Lys Pro Ala

145 150 155 160

Arg Arg Lys Arg Leu Pro Glu Met Ala Gln Pro Val Asp Pro Ala His

165 170 175

Asn Val Ser Arg Leu His Arg Leu Pro Arg Asp Cys Gln Glu Leu Phe

180 185 190

Gln Val Gly Glu Arg Gln Ser Gly Leu Phe Glu Ile Gln Pro Gln Gly

195 200 205

Ser Pro Pro Phe Leu Val Asn Cys Leu Met Thr Ser Asp Gly Gly Trp

210 215 220

Thr Val Ile Gln Arg Arg His Asp Gly Ser Val Asp Phe Asn Arg Pro

225 230 235 240

Trp Glu Ala Tyr Lys Ala Gly Phe Gly Asp Pro His Gly Glu Phe Trp

245 250 255

Leu Gly Leu Glu Lys Val His Ser Ile Thr Gly Asp Arg Asn Ser Arg

260 265 270

Leu Ala Val Gln Leu Arg Asp Trp Asp Gly Asn Ala Glu Leu Leu Gln

275 280 285

Phe Ser Val His Leu Gly Gly Glu Asp Thr Ala Tyr Ser Leu Gln Leu

290 295 300

Thr Ala Pro Val Ala Gly Gln Leu Gly Ala Thr Thr Val Pro Pro Ser

305 310 315 320

Gly Leu Ser Val Pro Phe Ser Thr Trp Asp Gln Asp His Asp Leu Arg

325 330 335

Arg Asp Lys Asn Cys Ala Lys Ser Leu Ser Gly Gly Trp Trp Phe Gly

340 345 350

Thr Cys Ser His Ser Asn Leu Asn Gly Gln Tyr Phe Arg Ser Ile Pro

355 360 365

Gln Gln Arg Gln Lys Leu Lys Lys Gly Ile Phe Trp Lys Thr Trp Arg

370 375 380

Gly Arg Tyr Tyr Pro Leu Gln Ala Thr Thr Met Leu Ile Gln Pro Met

385 390 395 400

Ala Ala Glu Ala Ala Ser

405

<210> 2

<211> 1967

<212> DNA

<213> 人类

<400> 2

ataaaaaccg tcctcgggcg cggcggggag aagccgagct gagcggatcc tcacacgact 60

gtgatccgat tctttccagc ggcttctgca accaagcggg tcttaccccc ggtcctccgc 120

gtctccagtc ctcgcacctg gaaccccaac gtccccgaga gtccccgaat ccccgctccc 180

aggctaccta agaggatgag cggtgctccg acggccgggg cagccctgat gctctgcgcc 240

gccaccgccg tgctactgag cgctcagggc ggacccgtgc agtccaagtc gccgcgcttt 300

gcgtcctggg acgagatgaa tgtcctggcg cacggactcc tgcagctcgg ccaggggctg 360

cgcgaacacg cggagcgcac ccgcagtcag ctgagcgcgc tggagcggcg cctgagcgcg 420

tgcgggtccg cctgtcaggg aaccgagggg tccaccgacc tcccgttagc ccctgagagc 480

cgggtggacc ctgaggtcct tcacagcctg cagacacaac tcaaggctca gaacagcagg 540

atccagcaac tcttccacaa ggtggcccag cagcagcggc acctggagaa gcagcacctg 600

cgaattcagc atctgcaaag ccagtttggc ctcctggacc acaagcacct agaccatgag 660

gtggccaagc ctgcccgaag aaagaggctg cccgagatgg cccagccagt tgacccggct 720

cacaatgtca gccgcctgca ccggctgccc agggattgcc aggagctgtt ccaggttggg 780

gagaggcaga gtggactatt tgaaatccag cctcaggggt ctccgccatt tttggtgaac 840

tgcaagatga cctcagatgg aggctggaca gtaattcaga ggcgccacga tggctcagtg 900

gacttcaacc ggccctggga agcctacaag gcggggtttg gggatcccca cggcgagttc 960

tggctgggtc tggagaaggt gcatagcatc acgggggacc gcaacagccg cctggccgtg 1020

cagctgcggg actgggatgg caacgccgag ttgctgcagt tctccgtgca cctgggtggc 1080

gaggacacgg cctatagcct gcagctcact gcacccgtgg ccggccagct gggcgccacc 1140

accgtcccac ccagcggcct ctccgtaccc ttctccactt gggaccagga tcacgacctc 1200

cgcagggaca agaactgcgc caagagcctc tctggaggct ggtggtttgg cacctgcagc 1260

cattccaacc tcaacggcca gtacttccgc tccatcccac agcagcggca gaagcttaag 1320

aagggaatct tctggaagac ctggcggggc cgctactacc cgctgcaggc caccaccatg 1380

ttgatccagc ccatggcagc agaggcagcc tcctagcgtc ctggctgggc ctggtcccag 1440

gcccacgaaa gacggtgact cttggctctg cccgaggatg tggccgttcc ctgcctgggc 1500

aggggctcca aggaggggcc atctggaaac ttgtggacag agaagaagac cacgactgga 1560

gaagccccct ttctgagtgc aggggggctg catgcgttgc ctcctgagat cgaggctgca 1620

ggatatgctc agactctaga ggcgtggacc aaggggcatg gagcttcact ccttgctggc 1680

cagggagttg gggactcaga gggaccactt ggggccagcc agactggcct caatggcgga 1740

ctcagtcaca ttgactgacg gggaccaggg cttgtgtggg tcgagagcgc cctcatggtg 1800

ctggtgctgt tgtgtgtagg tcccctgggg acacaagcag gcgccaatgg tatctgggcg 1860

gagctcacag agttcttgga ataaaagcaa cctcagaaca cttaaaaaaa aaaaaaaaaa 1920

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaa 1967

<210> 3

<211> 368

<212> PRT

<213> 人类

<400> 3

Met Ser Gly Ala Pro Thr Ala Gly Ala Ala Leu Met Leu Cys Ala Ala

1 5 10 15

Thr Ala Val Leu Leu Ser Ala Gln Gly Gly Pro Val Gln Ser Lys Ser

20 25 30

Pro Arg Phe Ala Ser Trp Asp Glu Met Asn Val Leu Ala His Gly Leu

35 40 45

Leu Gln Leu Gly Gln Gly Leu Arg Glu His Ala Glu Arg Thr Arg Ser

50 55 60

Gln Leu Ser Ala Leu Glu Arg Arg Leu Ser Ala Cys Gly Ser Ala Cys

65 70 75 80

Gln Gly Thr Glu Gly Ser Thr Asp Leu Pro Leu Ala Pro Glu Ser Arg

85 90 95

Val Asp Pro Glu Val Leu His Ser Leu Gln Thr Gln Leu Lys Ala Gln

100 105 110

Asn Ser Arg Ile Gln Gln Leu Phe His Lys Val Ala Gln Gln Gln Arg

115 120 125

His Leu Glu Lys Gln His Leu Arg Ile Gln His Leu Gln Ser Gln Phe

130 135 140

Gly Leu Leu Asp His Lys His Leu Asp His Glu Val Ala Lys Pro Ala

145 150 155 160

Arg Arg Lys Arg Leu Pro Glu Met Ala Gln Pro Val Asp Pro Ala His

165 170 175

Asn Val Ser Arg Leu His His Gly Gly Trp Thr Val Ile Gln Arg Arg

180 185 190

His Asp Gly Ser Val Asp Phe Asn Arg Pro Trp Glu Ala Tyr Lys Ala

195 200 205

Gly Phe Gly Asp Pro His Gly Glu Phe Trp Leu Gly Leu Glu Lys Val

210 215 220

His Ser Ile Thr Gly Asp Arg Asn Ser Arg Leu Ala Val Gln Leu Arg

225 230 235 240

Asp Trp Asp Gly Asn Ala Glu Leu Leu Gln Phe Ser Val His Leu Gly

245 250 255

Gly Glu Asp Thr Ala Tyr Ser Leu Gln Leu Thr Ala Pro Val Ala Gly

260 265 270

Gln Leu Gly Ala Thr Thr Val Pro Pro Ser Gly Leu Ser Val Pro Phe

275 280 285

Ser Thr Trp Asp Gln Asp His Asp Leu Arg Arg Asp Lys Asn Cys Ala

290 295 300

Lys Ser Leu Ser Gly Gly Trp Trp Phe Gly Thr Cys Ser His Ser Asn

305 310 315 320

Leu Asn Gly Gln Tyr Phe Arg Ser Ile Pro Gln Gln Arg Gln Lys Leu

325 330 335

Lys Lys Gly Ile Phe Trp Lys Thr Trp Arg Gly Arg Tyr Tyr Pro Leu

340 345 350

Gln Ala Thr Thr Met Leu Ile Gln Pro Met Ala Ala Glu Ala Ala Ser

355 360 365

<210> 4

<211> 1853

<212> DNA

<213> 人类

<400> 4

ataaaaaccg tcctcgggcg cggcggggag aagccgagct gagcggatcc tcacacgact 60

gtgatccgat tctttccagc ggcttctgca accaagcggg tcttaccccc ggtcctccgc 120

gtctccagtc ctcgcacctg gaaccccaac gtccccgaga gtccccgaat ccccgctccc 180

aggctaccta agaggatgag cggtgctccg acggccgggg cagccctgat gctctgcgcc 240

gccaccgccg tgctactgag cgctcagggc ggacccgtgc agtccaagtc gccgcgcttt 300

gcgtcctggg acgagatgaa tgtcctggcg cacggactcc tgcagctcgg ccaggggctg 360

cgcgaacacg cggagcgcac ccgcagtcag ctgagcgcgc tggagcggcg cctgagcgcg 420

tgcgggtccg cctgtcaggg aaccgagggg tccaccgacc tcccgttagc ccctgagagc 480

cgggtggacc ctgaggtcct tcacagcctg cagacacaac tcaaggctca gaacagcagg 540

atccagcaac tcttccacaa ggtggcccag cagcagcggc acctggagaa gcagcacctg 600

cgaattcagc atctgcaaag ccagtttggc ctcctggacc acaagcacct agaccatgag 660

gtggccaagc ctgcccgaag aaagaggctg cccgagatgg cccagccagt tgacccggct 720

cacaatgtca gccgcctgca ccatggaggc tggacagtaa ttcagaggcg ccacgatggc 780

tcagtggact tcaaccggcc ctgggaagcc tacaaggcgg ggtttgggga tccccacggc 840

gagttctggc tgggtctgga gaaggtgcat agcatcacgg gggaccgcaa cagccgcctg 900

gccgtgcagc tgcgggactg ggatggcaac gccgagttgc tgcagttctc cgtgcacctg 960

ggtggcgagg acacggccta tagcctgcag ctcactgcac ccgtggccgg ccagctgggc 1020

gccaccaccg tcccacccag cggcctctcc gtacccttct ccacttggga ccaggatcac 1080

gacctccgca gggacaagaa ctgcgccaag agcctctctg gaggctggtg gtttggcacc 1140

tgcagccatt ccaacctcaa cggccagtac ttccgctcca tcccacagca gcggcagaag 1200

cttaagaagg gaatcttctg gaagacctgg cggggccgct actacccgct gcaggccacc 1260

accatgttga tccagcccat ggcagcagag gcagcctcct agcgtcctgg ctgggcctgg 1320

tcccaggccc acgaaagacg gtgactcttg gctctgcccg aggatgtggc cgttccctgc 1380

ctgggcaggg gctccaagga ggggccatct ggaaacttgt ggacagagaa gaagaccacg 1440

actggagaag ccccctttct gagtgcaggg gggctgcatg cgttgcctcc tgagatcgag 1500

gctgcaggat atgctcagac tctagaggcg tggaccaagg ggcatggagc ttcactcctt 1560

gctggccagg gagttgggga ctcagaggga ccacttgggg ccagccagac tggcctcaat 1620

ggcggactca gtcacattga ctgacgggga ccagggcttg tgtgggtcga gagcgccctc 1680

atggtgctgg tgctgttgtg tgtaggtccc ctggggacac aagcaggcgc caatggtatc 1740

tgggcggagc tcacagagtt cttggaataa aagcaacctc agaacactta aaaaaaaaaa 1800

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaa 1853

<210> 5

<211> 405

<212> PRT

<213> 褐家鼠(Rattus norvegicus)

<400> 5

Met Arg Cys Ala Pro Thr Ala Gly Ala Ala Leu Val Leu Cys Ala Ala

1 5 10 15

Thr Ala Gly Leu Leu Ser Ala Gln Gly Arg Pro Ala Gln Pro Glu Pro

20 25 30

Pro Arg Phe Ala Ser Trp Asp Glu Met Asn Leu Leu Ala His Gly Leu

35 40 45

Leu Gln Leu Gly His Gly Leu Arg Glu His Val Glu Arg Thr Arg Gly

50 55 60

Gln Leu Gly Ala Leu Glu Arg Arg Met Ala Ala Cys Gly Asn Ala Cys

65 70 75 80

Gln Gly Pro Lys Gly Thr Asp Pro Lys Asp Arg Val Pro Glu Gly Gln

85 90 95

Ala Pro Glu Thr Leu Gln Ser Leu Gln Thr Gln Leu Lys Ala Gln Asn

100 105 110

Ser Lys Ile Gln Gln Leu Phe Gln Lys Val Ala Gln Gln Gln Arg Tyr

115 120 125

Leu Ser Lys Gln Asn Leu Arg Ile Gln Asn Leu Gln Ser Gln Ile Asp

130 135 140

Leu Leu Thr Pro Thr His Leu Asp Asn Gly Val Asp Lys Thr Ser Arg

145 150 155 160

Gly Lys Arg Leu Pro Lys Met Ala Gln Leu Ile Gly Leu Thr Pro Asn

165 170 175

Ala Thr Arg Leu His Arg Pro Pro Arg Asp Cys Gln Glu Leu Phe Gln

180 185 190

Glu Gly Glu Arg His Ser Gly Leu Phe Gln Ile Gln Pro Leu Gly Ser

195 200 205

Pro Pro Phe Leu Val Asn Cys Glu Met Thr Ser Asp Gly Gly Trp Thr

210 215 220

Val Ile Gln Arg Arg Leu Asn Gly Ser Val Asp Phe Asn Gln Ser Trp

225 230 235 240

Glu Ala Tyr Lys Asp Gly Phe Gly Asp Pro Gln Gly Glu Phe Trp Leu

245 250 255

Gly Leu Glu Lys Met His Ser Ile Thr Gly Asp Arg Gly Ser Gln Leu

260 265 270

Ala Val Gln Leu Gln Asp Trp Asp Gly Asn Ala Lys Leu Leu Gln Phe

275 280 285

Pro Ile His Leu Gly Gly Glu Asp Thr Ala Tyr Ser Leu Gln Leu Thr

290 295 300

Glu Pro Thr Ala Asn Glu Leu Gly Ala Thr Asn Val Ser Pro Asn Gly

305 310 315 320

Leu Ser Leu Pro Phe Ser Thr Trp Asp Gln Asp His Asp Leu Arg Gly

325 330 335

Asp Leu Asn Cys Ala Lys Ser Leu Ser Gly Gly Trp Trp Phe Gly Thr

340 345 350

Cys Ser His Ser Asn Leu Asn Gly Gln Tyr Phe His Ser Ile Pro Arg

355 360 365

Gln Arg Gln Gln Arg Lys Lys Gly Ile Phe Trp Lys Thr Trp Lys Gly

370 375 380

Arg Tyr Tyr Pro Leu Gln Ala Thr Thr Leu Leu Ile Gln Pro Met Glu

385 390 395 400

Ala Thr Ala Ala Ser

405

<210> 6

<211> 1218

<212> DNA

<213> 褐家鼠

<400> 6

atgcgctgcg ctccgaccgc aggcgctgct ctagtgctat gcgcagctac tgcggggctg 60

ctgagcgcgc aagggcgccc tgcacagccg gagccgccgc gcttcgcatc ctgggatgaa 120

atgaacttgc tggctcacgg gctgctgcag ctcggtcacg ggctgcggga acacgtggag 180

cgcacccgtg gacagctggg cgcgctggaa cgccgcatgg ctgcctgcgg taacgcttgt 240

caggggccca aggggacaga cccgaaggat agagtccccg aaggccaggc tcctgagact 300

ctgcagagtt tacagactca actcaaggct cagaacagca agatccagca actgttccag 360

aaggtagccc agcagcagag atacctatca aagcagaatc tgagaataca gaatcttcag 420

agccagattg acctcttgac ccccacacac ctagacaatg gggtagacaa gacttcgagg 480

ggaaagaggc ttcccaagat ggcccagctc attggcttga ctcccaacgc cacccgctta 540

cacaggcctc cccgggactg ccaggaactc tttcaagaag gggagcggca cagtggactt 600

ttccagatcc agcctctggg atctccacca tttttggtca actgtgagat gacttcagat 660

ggaggctgga cggtgattca gagacgcctg aacggctctg tggacttcaa tcagtcttgg 720

gaagcctaca aagatggctt cggagatccc caaggcgagt tctggctggg cctagagaag 780

atgcacagca tcacagggga ccgaggaagc cagttggctg tgcagctcca ggactgggat 840

ggcaatgcca aattgctcca atttcctatc catttggggg gtgaggacac agcctacagc 900

ctgcagctca ccgagcccac ggccaatgag ctgggtgcca ccaatgtttc ccccaatggc 960

ctttccctgc ccttctctac ctgggaccaa gaccacgacc tccgagggga ccttaactgt 1020

gccaagagcc tctctggtgg ctggtggttt ggcacctgca gccattccaa tctaaatgga 1080

caatacttcc actctattcc acggcaacgg cagcagcgta aaaaggggat cttctggaaa 1140

acatggaagg gccgctacta tccactacag gctaccaccc tgttgatcca gcccatggag 1200

gctacagcag cctcttag 1218

<210> 7

<211> 410

<212> PRT

<213> 小家鼠(Mus musculus)

<400> 7

Met Arg Cys Ala Pro Thr Ala Gly Ala Ala Leu Val Leu Cys Ala Ala

1 5 10 15

Thr Ala Gly Leu Leu Ser Ala Gln Gly Arg Pro Ala Gln Pro Glu Pro

20 25 30

Pro Arg Phe Ala Ser Trp Asp Glu Met Asn Leu Leu Ala His Gly Leu

35 40 45

Leu Gln Leu Gly His Gly Leu Arg Glu His Val Glu Arg Thr Arg Gly

50 55 60

Gln Leu Gly Ala Leu Glu Arg Arg Met Ala Ala Cys Gly Asn Ala Cys

65 70 75 80

Gln Gly Pro Lys Gly Lys Asp Ala Pro Phe Lys Asp Ser Glu Asp Arg

85 90 95

Val Pro Glu Gly Gln Thr Pro Glu Thr Leu Gln Ser Leu Gln Thr Gln

100 105 110

Leu Lys Ala Gln Asn Ser Lys Ile Gln Gln Leu Phe Gln Lys Val Ala

115 120 125

Gln Gln Gln Arg Tyr Leu Ser Lys Gln Asn Leu Arg Ile Gln Asn Leu

130 135 140

Gln Ser Gln Ile Asp Leu Leu Ala Pro Thr His Leu Asp Asn Gly Val

145 150 155 160

Asp Lys Thr Ser Arg Gly Lys Arg Leu Pro Lys Met Thr Gln Leu Ile

165 170 175

Gly Leu Thr Pro Asn Ala Thr His Leu His Arg Pro Pro Arg Asp Cys

180 185 190

Gln Glu Leu Phe Gln Glu Gly Glu Arg His Ser Gly Leu Phe Gln Ile

195 200 205

Gln Pro Leu Gly Ser Pro Pro Phe Leu Val Asn Cys Glu Met Thr Ser

210 215 220

Asp Gly Gly Trp Thr Val Ile Gln Arg Arg Leu Asn Gly Ser Val Asp

225 230 235 240

Phe Asn Gln Ser Trp Glu Ala Tyr Lys Asp Gly Phe Gly Asp Pro Gln

245 250 255

Gly Glu Phe Trp Leu Gly Leu Glu Lys Met His Ser Ile Thr Gly Asn

260 265 270

Arg Gly Ser Gln Leu Ala Val Gln Leu Gln Asp Trp Asp Gly Asn Ala

275 280 285

Lys Leu Leu Gln Phe Pro Ile His Leu Gly Gly Glu Asp Thr Ala Tyr

290 295 300

Ser Leu Gln Leu Thr Glu Pro Thr Ala Asn Glu Leu Gly Ala Thr Asn

305 310 315 320

Val Ser Pro Asn Gly Leu Ser Leu Pro Phe Ser Thr Trp Asp Gln Asp

325 330 335

His Asp Leu Arg Gly Asp Leu Asn Cys Ala Lys Ser Leu Ser Gly Gly

340 345 350

Trp Trp Phe Gly Thr Cys Ser His Ser Asn Leu Asn Gly Gln Tyr Phe

355 360 365

His Ser Ile Pro Arg Gln Arg Gln Glu Arg Lys Lys Gly Ile Phe Trp

370 375 380

Lys Thr Trp Lys Gly Arg Tyr Tyr Pro Leu Gln Ala Thr Thr Leu Leu

385 390 395 400

Ile Gln Pro Met Glu Ala Thr Ala Ala Ser

405 410

<210> 8

<211> 1869

<212> DNA

<213> 小家鼠

<400> 8

acgggctcca gatcttcttc tgcaccagag caagtctaag tctgagccgg ctcccccaga 60

actccagctg ctgggtcttg aactcctgcg ttccggagtc ctagcgttgc tgcacccaag 120

gccaccccca gaatcatgcg ctgcgctccg acagcaggcg ctgccctggt gctatgcgcg 180

gctactgcgg ggcttttgag cgcgcaaggg cgccctgcac agccagagcc accgcgcttt 240

gcatcctggg acgagatgaa cttgctggct cacgggctgc tacagctcgg ccatgggctg 300

cgcgaacacg tggagcgcac ccgtgggcag ctgggcgcgc tggagcgccg catggctgcc 360

tgtggtaacg cttgtcaggg gcccaaggga aaagatgcac ccttcaaaga ctccgaggat 420

agagtccctg aaggccagac tcctgagact ctgcagagtt tgcagactca gctcaaggct 480

caaaacagca agatccagca attgttccag aaggtggccc agcagcagag atacctatca 540

aagcagaatc tgagaataca gaatcttcag agccagatag acctcttggc ccccacgcac 600

ctagacaatg gagtagacaa gacttcgagg ggaaagaggc ttcccaagat gacccagctc 660

attggcttga ctcccaacgc cacccactta cacaggccgc cccgggactg ccaggaactc 720

ttccaagaag gggagaggca cagtggactt ttccagatcc agcctctggg gtctccacca 780

tttttggtca actgtgagat gacttcagat ggaggctgga cagtgattca gagacgcctg 840

aacggctctg tggacttcaa ccagtcctgg gaagcctaca aggatggctt cggagatccc 900

caaggcgagt tctggctggg cctggaaaag atgcacagca tcacagggaa ccgaggaagc 960

caattggctg tgcagctcca ggactgggat ggcaatgcca aattgctcca atttcccatc 1020

catttggggg gtgaggacac agcctacagc ctgcagctca ctgagcccac ggccaatgag 1080

ctgggtgcca ccaatgtttc ccccaatggc ctttccctgc ccttctctac ttgggaccaa 1140

gaccatgacc tccgtgggga ccttaactgt gccaagagcc tctctggtgg ctggtggttt 1200

ggtacctgta gccattccaa tctcaatgga caatacttcc actctatccc acggcaacgg 1260

caggagcgta aaaagggtat cttctggaaa acatggaagg gccgctacta tcctctgcag 1320

gctaccaccc tgctgatcca gcccatggag gctacagcag cctcttagcc tcctcactgg 1380

agcctggttc caggcctaag aagacagtga ctttggttgt ggccctgaga tttggccatt 1440

ctctgctggg ggcaggagct ctaagtaggg ctatctgcgt cttgtggaca aagaagaagc 1500

ccgtaactgg agagactgga ggaccccttt tccgtgttgg ggtctgcaag cattgttgtc 1560

tgaaacagtc agagcaacag gaaacaaatg gcccagatcc agaaaacatg ggctcgaggg 1620

gcactgaata tcacttctcg cctaccagag aagttgggga tgcagaggga ccactacagt 1680

ccaactagct gggcccttaa tggcggactc agtcatattg actgactgga gacagggtgc 1740

caggagccct ggatacactc atggtgctgt tgtaggtgct gtggatgcac aggtgctaac 1800

tgtggttccc aggcacaact cacagcattc ttacaataaa aacaacctca gaacaaaaaa 1860

aaaaaaaaa 1869

<210> 9

<211> 406

<212> PRT

<213> 人类

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (39)..(39)

<223> x = A、K、E或D

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (40)..(40)

<223> x = A、K、E或D

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (76)..(76)

<223> x = A或S

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (80)..(80)

<223> x = A或S

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (161)..(161)

<223> x = D、R、K、G、A、V或S

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (162)..(162)

<223> x = D、R、K、G、A、V或S

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (163)..(163)

<223> x = D、R、K、G、A、V或S

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (164)..(164)

<223> x = D、R、K、G、A、V或S

<220>

<221> misc_feature

<222> (221)..(221)

<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<400> 9

Met Ser Gly Ala Pro Thr Ala Gly Ala Ala Leu Met Leu Cys Ala Ala

1 5 10 15

Thr Ala Val Leu Leu Ser Ala Gln Gly Gly Pro Val Gln Ser Lys Ser

20 25 30

Pro Arg Phe Ala Ser Trp Xaa Xaa Met Asn Val Leu Ala His Gly Leu

35 40 45

Leu Gln Leu Gly Gln Gly Leu Arg Glu His Ala Glu Arg Thr Arg Ser

50 55 60

Gln Leu Ser Ala Leu Glu Arg Arg Leu Ser Ala Xaa Gly Ser Ala Xaa

65 70 75 80

Gln Gly Thr Glu Gly Ser Thr Asp Leu Pro Leu Ala Pro Glu Ser Arg

85 90 95

Val Asp Pro Glu Val Leu His Ser Leu Gln Thr Gln Leu Lys Ala Gln

100 105 110

Asn Ser Arg Ile Gln Gln Leu Phe His Lys Val Ala Gln Gln Gln Arg

115 120 125

His Leu Glu Lys Gln His Leu Arg Ile Gln His Leu Gln Ser Gln Phe

130 135 140

Gly Leu Leu Asp His Lys His Leu Asp His Glu Val Ala Lys Pro Ala

145 150 155 160

Xaa Xaa Xaa Xaa Leu Pro Glu Met Ala Gln Pro Val Asp Pro Ala His

165 170 175

Asn Val Ser Arg Leu His Arg Leu Pro Arg Asp Cys Gln Glu Leu Phe

180 185 190

Gln Val Gly Glu Arg Gln Ser Gly Leu Phe Glu Ile Gln Pro Gln Gly

195 200 205

Ser Pro Pro Phe Leu Val Asn Cys Lys Met Thr Ser Xaa Gly Gly Trp

210 215 220

Thr Val Ile Gln Arg Arg His Asp Gly Ser Val Asp Phe Asn Arg Pro

225 230 235 240

Trp Glu Ala Tyr Lys Ala Gly Phe Gly Asp Pro His Gly Glu Phe Trp

245 250 255

Leu Gly Leu Glu Lys Val His Ser Ile Thr Gly Asp Arg Asn Ser Arg

260 265 270

Leu Ala Val Gln Leu Arg Asp Trp Asp Gly Asn Ala Glu Leu Leu Gln

275 280 285

Phe Ser Val His Leu Gly Gly Glu Asp Thr Ala Tyr Ser Leu Gln Leu

290 295 300

Thr Ala Pro Val Ala Gly Gln Leu Gly Ala Thr Thr Val Pro Pro Ser

305 310 315 320

Gly Leu Ser Val Pro Phe Ser Thr Trp Asp Gln Asp His Asp Leu Arg

325 330 335

Arg Asp Lys Asn Cys Ala Lys Ser Leu Ser Gly Gly Trp Trp Phe Gly

340 345 350

Thr Cys Ser His Ser Asn Leu Asn Gly Gln Tyr Phe Arg Ser Ile Pro

355 360 365

Gln Gln Arg Gln Lys Leu Lys Lys Gly Ile Phe Trp Lys Thr Trp Arg

370 375 380

Gly Arg Tyr Tyr Pro Leu Gln Ala Thr Thr Met Leu Ile Gln Pro Met

385 390 395 400

Ala Ala Glu Ala Ala Ser

405

<210> 10

<211> 368

<212> PRT

<213> 人类

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (39)..(39)

<223> x = A、K、D或E

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (40)..(40)

<223> x = A、K、D或E

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (76)..(76)

<223> x = A或C

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (80)..(80)

<223> x = A或C

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (161)..(161)

<223> x = D、R、K、G、A、V或S

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (162)..(162)

<223> x = D、R、K、G、A、V或S

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (163)..(163)

<223> x = D、R、K、G、A、V或S

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (164)..(164)

<223> x = D、R、K、G、A、V或S

<400> 10

Met Ser Gly Ala Pro Thr Ala Gly Ala Ala Leu Met Leu Cys Ala Ala

1 5 10 15

Thr Ala Val Leu Leu Ser Ala Gln Gly Gly Pro Val Gln Ser Lys Ser

20 25 30

Pro Arg Phe Ala Ser Trp Xaa Xaa Met Asn Val Leu Ala His Gly Leu

35 40 45

Leu Gln Leu Gly Gln Gly Leu Arg Glu His Ala Glu Arg Thr Arg Ser

50 55 60

Gln Leu Ser Ala Leu Glu Arg Arg Leu Ser Ala Xaa Gly Ser Ala Xaa

65 70 75 80

Gln Gly Thr Glu Gly Ser Thr Asp Leu Pro Leu Ala Pro Glu Ser Arg

85 90 95

Val Asp Pro Glu Val Leu His Ser Leu Gln Thr Gln Leu Lys Ala Gln

100 105 110

Asn Ser Arg Ile Gln Gln Leu Phe His Lys Val Ala Gln Gln Gln Arg

115 120 125

His Leu Glu Lys Gln His Leu Arg Ile Gln His Leu Gln Ser Gln Phe

130 135 140

Gly Leu Leu Asp His Lys His Leu Asp His Glu Val Ala Lys Pro Ala

145 150 155 160

Xaa Xaa Xaa Xaa Leu Pro Glu Met Ala Gln Pro Val Asp Pro Ala His

165 170 175

Asn Val Ser Arg Leu His His Gly Gly Trp Thr Val Ile Gln Arg Arg

180 185 190

His Asp Gly Ser Val Asp Phe Asn Arg Pro Trp Glu Ala Tyr Lys Ala

195 200 205

Gly Phe Gly Asp Pro His Gly Glu Phe Trp Leu Gly Leu Glu Lys Val

210 215 220

His Ser Ile Thr Gly Asp Arg Asn Ser Arg Leu Ala Val Gln Leu Arg

225 230 235 240

Asp Trp Asp Gly Asn Ala Glu Leu Leu Gln Phe Ser Val His Leu Gly

245 250 255

Gly Glu Asp Thr Ala Tyr Ser Leu Gln Leu Thr Ala Pro Val Ala Gly

260 265 270

Gln Leu Gly Ala Thr Thr Val Pro Pro Ser Gly Leu Ser Val Pro Phe

275 280 285

Ser Thr Trp Asp Gln Asp His Asp Leu Arg Arg Asp Lys Asn Cys Ala

290 295 300

Lys Ser Leu Ser Gly Gly Trp Trp Phe Gly Thr Cys Ser His Ser Asn

305 310 315 320

Leu Asn Gly Gln Tyr Phe Arg Ser Ile Pro Gln Gln Arg Gln Lys Leu

325 330 335

Lys Lys Gly Ile Phe Trp Lys Thr Trp Arg Gly Arg Tyr Tyr Pro Leu

340 345 350

Gln Ala Thr Thr Met Leu Ile Gln Pro Met Ala Ala Glu Ala Ala Ser

355 360 365

<210> 11

<211> 22

<212> DNA

<213> 人类

<400> 11

tctgggatct ccaccatttt tg 22

<210> 12

<211> 18

<212> DNA

<213> 人类

<400> 12

tcaccgtcca gcctccat 18

<210> 13

<211> 18

<212> DNA

<213> 人类

<400> 13

caactgtgag atgacttc 18

<210> 14

<211> 17

<212> DNA

<213> 人类

<400> 14

cgccacccgc ttacaca 17

<210> 15

<211> 22

<212> DNA

<213> 人类

<400> 15

cagaggctgg atctggaaaa gt 22

<210> 16

<211> 15

<212> DNA

<213> 人类

<400> 16

tgccaggaac tcttt 15

<210> 17

<211> 23

<212> DNA

<213> 人类

<400> 17

tacaggctac caccctgttg atc 23

<210> 18

<211> 17

<212> DNA

<213> 人类

<400> 18

aaccgcgggc cctctag 17

<210> 19

<211> 17

<212> DNA

<213> 人类

<400> 19

ccatggaggc tacagca 17

<210> 20

<211> 27

<212> DNA

<213> 人类

<400> 20

cttgaaggga ttgaaaagat aattagc 27

<210> 21

<211> 24

<212> DNA

<213> 人类

<400> 21

ccatgagtca gaaaagcatt gaac 24

<210> 22

<211> 17

<212> DNA

<213> 人类

<400> 22

aggtgagcat tttcctg 17

Claims (16)

1.一种用于治疗受试者的肾病综合征的药物组合物，所述组合物包含：中性pIAngptl4多肽，所述中性pI Angptl4多肽具有降低的脂蛋白脂肪酶抑制活性、耐受切割或前述的组合；以及药学上可接受的载体。

2.如权利要求1所述的药物组合物，其中所述中性pI Angptl4多肽具有降低的脂蛋白脂肪酶抑制活性。

3.如权利要求1所述的药物组合物，其中所述中性pI Angptl4多肽含有E40K置换。

4.如权利要求1所述的药物组合物，其中所述中性pI Angptl4多肽含有E40A置换。

5.如权利要求1所述的药物组合物，其中所述中性pI Angptl4多肽含有E40置换，所述E40置换选自G、P、V、L、I、M、C、F、Y、W、H、R、Q、N、S或T。

6.如权利要求1所述的药物组合物，其中所述中性pI Angptl4多肽含有E40K置换或E40A置换，并且置换前的序列为SEQ ID NO:1、3、5、7、9或10的序列。

7.如权利要求1所述的药物组合物，其中所述中性pI Angptl4多肽含有D39置换，所述D39置换选自A、G、P、V、L、I、M、C、F、Y、W、H、R、Q、N、S、T或K。

8.如权利要求1所述的药物组合物，其中所述中性pI Angptl4多肽含有D39K置换或D39A置换。

9.如权利要求1所述的药物组合物，其中所述中性pI Angptl4多肽耐受切割。

10.如权利要求1所述的药物组合物，其中所述中性pI Angptl4多肽耐受切割并且其中所述中性pI Angptl4多肽含有选自表2的R₁₆₁RKR₁₆₄置换。

11.如权利要求1所述的药物组合物，其中所述中性pI Angptl4多肽耐受切割并且其中所述中性pI Angptl4多肽含有R₁₆₁RKR₁₆₄至G₁₆₁SGS₁₆₄置换。

12.如权利要求1所述的药物组合物，其中所述中性pI Angptl4多肽耐受切割并且其中所述中性pI Angptl4多肽含有R₁₆₁RKR₁₆₄至G₁₆₁SGS₁₆₄置换，并且置换前的序列为SEQ ID NO:1、3、5、7、9或10的序列。

13.如权利要求1所述的药物组合物，其中所述中性pI Angptl4多肽耐受切割并且其中所述中性pI Angptl4多肽含有R₁₆₁RKR₁₆₄至G₁₆₁AAG₁₆₄置换。

14.如权利要求1所述的药物组合物，其中所述中性pI Angptl4多肽耐受切割并且其中所述中性pI Angptl4多肽含有R₁₆₁RKR₁₆₄至G₁₆₁AAG₁₆₄置换，并且置换前的序列为SEQ ID NO:1、3、5、7、9或10的序列。

15.如权利要求1所述的药物组合物，其中所述药物组合物含有治疗有效量的所述中性pI Angptl4多肽。

16.如权利要求1所述的药物组合物，其中所述中性pI Angptl4多肽被唾液酸化。