TW202317645A

TW202317645A - 一種融合蛋白及其醫藥用途

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Publication number: TW202317645A
Application number: TW111125168A
Authority: TW
Inventors: 毛東杰; 謝岳峻
Original assignee: 大陸商上海翰森生物醫藥科技有限公司; 大陸商常州恆邦藥業有限公司; 大陸商江蘇豪森藥業集團有限公司
Priority date: 2021-07-05
Filing date: 2022-07-05
Publication date: 2023-05-01
Also published as: WO2023280144A1; CN117677640A

Abstract

本發明關於一種FGF21蛋白和免疫球蛋白的融合蛋白及其醫藥用途。具體地，本發明提供了FGF21蛋白和免疫球蛋白的Fc或其片段組成的融合蛋白，以及FGF21-Fc融合蛋白及其醫藥組成物用於治療糖尿病、肥胖、血脂異常、代謝綜合症、非酒精性脂肪肝或非酒精性脂肪肝炎等相關疾病的方法。

Description

一種融合蛋白及其醫藥用途

本發明屬於生物醫藥領域，具體關於FGF21的融合蛋白及其醫藥用途。

成纖維細胞生長因21(Fibroblast growth factor 21,FGF21)是一種由209個胺基酸組成的多肽(SEQ ID NO：1)，其胺基酸序列與小鼠的FGF21具有約75%的同源性。FGF21 N末端含有28個胺基酸構成的信號肽，因而成熟的FGF21由181個胺基酸組成(SEQ ID NO：3)。成熟的FGF21在本文SEQ ID NO：3的第146位上具有Leu替代Pro的天然人FGF21同等型(isoform)或等位形式(allelic form)。FGF21主要在肝臟和胰腺中表達，同時也存在於脂肪和肌肉組織中。藉由FGFR的介導和跨膜蛋白β Klotho(KLB)的輔助，FGF21能誘導肝臟、胰腺和脂肪組織中的多種信號通路和功能活動，進而實現對糖脂代謝的調節和對胰島β細胞進行保護的生理功能。FGF21藉由激活非胰島素依賴的葡萄糖吸收，調節脂肪細胞對葡萄糖的攝取。另外，研究還表明，FGF21可劑量依賴性的減少體重和全身體脂，如向患糖尿病的恆河猴施用FGF21，發現其空腹血漿葡萄糖、甘油三酯和胰高血糖素水平均有顯著減少。同時，在FGF21轉基因小鼠身上發現，其白色脂肪組織脂肪酶表達增加，血漿β-羥丁酸和游離脂肪酸水平升高。這意味著FGF21可能是藉由促進脂肪分解以及生酮作用調控脂質代謝。在胰島細胞和INS-1E細胞中，FGF21能夠抑制葡萄糖介導的胰高血糖素的釋放，刺激胰島素的產生，並防止胰島細胞凋亡，進而改善胰腺細胞功能。此外，FGF21還能激活外分泌胰腺細胞和肝細胞信號通路，抑制肝糖原輸出。

FGF21作為FGF基因家族的成員，大多數FGF具有廣譜的促有絲分裂的能力，而探究結果表明，FGF21既沒有促進細胞增殖的能力，也不會拮抗FGF家族其他成員的功能。實驗證明，FGF21轉基因鼠(體內FGF21量是正常鼠的150倍左右)在整個生命週期內，體內未發現腫瘤以及組織增生等異常狀況。同時，其代謝調節作用與機體的代謝水平相關，調節作用僅在代謝異常時發揮作用，即使超過藥理學劑量的FGF21也不會出現低血糖症。而目前市場上主要的治療糖尿病的藥物(胰島素，噻唑烷二酮等)在劑量不當時易產生副作用，如大劑量的胰島素導致的低血糖，噻唑烷二酮導致的肝功能損壞和水腫，這些在接受FGF21治療的動物實驗中均沒有發現，這也足以證明FGF21是一種理想的治療糖尿病以及肥胖等疾病的藥物。

FGF21在控制血糖和降低體重等方面的生理功能為治療相關疾病帶來了希望，但是野生型FGF21作為小分子蛋白易被蛋白酶水解，也可藉由腎小球濾過，半衰期僅為0.5-2h，難以保證有效藥物作用時間。面對這種困難，醫藥工業界藉由進行酶切位點胺基酸定點突變，製備長效融合蛋白或將聚乙二醇連接到多肽骨架等方法來提高FGF21的半衰期。此外，在研發FGF21作為蛋白質製劑中的重大挑戰還來自其自身聚集造成的不穩定性。目標治療蛋白的理想效果是增加對蛋白水解的耐受性以及降低蛋白的聚集性，進而增強FGF21蛋白製劑的半衰期和穩定性，實現對患者的低頻給藥。在WO2009/149171和WO2017/074117中已經描述了一些基於人野生型FGF21多肽序列的突變體，本領域亟需適合藥用的FGF21多肽序列的突變體。

本發明提供了一種FGF21蛋白或其變體，其通式如下：

(II)

其中，

X₁₆₆選自L或F；

X₁₇₅選自R或W。

本發明的一個較佳的實施方案是通式(II)所述的FGF21蛋白或其變體，其序列如SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：6所示。

另一方面，本發明還提供一種融合蛋白，其通式如下：

F₁-F₂-F₃ (I)

其中，

F₁選自如通式(II)所述的FGF21蛋白或其變體；

F₂為連接肽；

F₃為免疫球蛋白的Fc或其片段組成的結構域。

本發明的一個較佳的實施方案中，F₁為序列如SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：6所示。

本發明的一個較佳的實施方案中，F₁為序列如SEQ ID NO：5所示。

本發明的一個較佳的實施方案中，F₂為序列如SEQ ID NO：7所示。

在本發明的一個較佳實施方案中，該F₃如通式(III)所示：

F₄(GGGGGS)_m(GGGGS)_nF₄ (III)

其中，

F₄為免疫球蛋白的Fc片段；

m選自1-10的整數；且

n選自1-10的整數。

在本發明一個較佳的實施方案中，對於通式(III)，其中，

F₄為SEQ ID NO：8；

m為1；且

n為9。

在本發明一個較佳的實施方案中，該F₃為SEQ ID NO：9。

在本發明一個的較佳方案中，該融合蛋白選自SEQ ID NO：12或SEQ ID NO：13。

本發明還關於一種多核苷酸，其編碼包含通式(I)所述的融合蛋白。

在本發明的較佳方案中，該核苷酸的編碼包含FGF21蛋白SEQ ID NO：5。

在本發明的較佳方案中，該核苷酸的編碼包含FGF21融合蛋白SEQ ID NO：12-13。

本發明還關於一種表達載體，其含有如上所述的多核苷酸。

另外，本發明還關於一種宿主細胞，其導入或含有如上所述的表達載體，其中該宿主細胞為細菌，較佳為大腸桿菌；或者該宿主細胞為酵母菌，較佳為畢赤酵母；或者該宿主細胞為哺乳動物細胞，較佳為CHO細胞或HEK293細胞。

本發明還關於一種生產如上所述融合蛋白的方法，包括步驟：

1)培養如上所述的宿主細胞；

2)從培養物中分離蛋白；

3)以及對該蛋白進行純化。

本發明進一步包含一種醫藥組成物，其含有通式(I)所述的融合蛋白以及可藥用的賦形劑、稀釋劑或載體。

本發明還關於該融合蛋白，或如上所述的醫藥組成物在製備藥物中的用途，該藥物用於治療或預防治療糖尿病、肥胖、血脂異常、代謝綜合症、非酒精性脂肪肝或非酒精性脂肪肝炎等相關疾病。

本發明提供的融合蛋白，具有顯著促成纖維細胞增殖的作用，和良好的血漿穩定性，能夠誘導葡萄糖攝取、促進ERK1/2蛋白的磷酸化，這些特徵對於治療性蛋白的製備和配製有利，並具有對糖尿病、肥胖、血脂異常、代謝綜合症、非酒精性脂肪肝或非酒精性脂肪肝炎等相關疾病的潛在治療效果。

發明的詳細說明

除非有相反陳述，在說明書和申請專利範圍中使用的術語具有下述含義。

本發明的FGF21突變體中胺基酸的位置改變從成熟的人野生型FGF21(SEQ ID NO：3)多肽中的胺基酸位置決定。

本發明的胺基酸序列含有二十種胺基酸的標準單字母或三字母代碼。

術語“FGF21多肽”是指人體內表達的天然存在的野生型多肽。包括SEQ ID NO：1組成由SEQ ID NO：2編碼的全長形式和SEQ ID NO：3組成由SEQ ID NO：4編碼的成熟形式。

術語“FGF21突變體”是指基於天然存在的FGF21胺基酸(SEQ ID NO：4)序列而修飾的FGF21多肽。這類修飾包括但不僅限於一個或多個胺基酸被取代，包括且不僅限於本文所述的蛋白酶抗性FGF21突變體、聚集減少的FGF21突變體以及FGF21組合突變體。

術語“患者”是哺乳動物，較佳人。

術語“治療”指減緩、降低或逆轉症狀、病症或疾病的進展或嚴重性。

術語“Fc片段”指免疫球蛋白的重鏈的恆定區。

術語“載體”指用於向宿主細胞傳遞編碼信息的任何分子(例如核酸、質粒或病毒)。

術語“表達載體”指適於宿主細胞轉化並含有指導和/或控制插入異源核酸序列表達的核酸序列的載體。包含但不限於諸如轉錄、翻譯和RNA剪接等過程。

術語“宿主細胞”用來指被核酸序列轉化或能夠被該核酸序列轉化然後能夠表達選定目標基因的細胞。該術語包括親代細胞的子代，無論子代在形態或遺傳組成上是否與最初的親代相同，主要存在選定的基因。

為了更詳細的說明本發明，本說明書提供了下列具體實施方案，但本發明的方案並非僅限於此。

1.主要實驗試劑：

2.主要實驗儀器：

實施例1 FGF21突變體蛋白的製備

採用ExpiCHO系統(Thermo Fisher #A29133)表達FGF21突變體蛋白(SEQ ID NO：5-6)。

具體的，將編碼C端帶有His標簽的FGF21突變體蛋白的DNA序列選殖至pCDNA3.1載體中，經過測序，確認得到表達融合蛋白的質粒。使用ExpiFectamine試劑將質粒轉染至ExpiCHO-S細胞中，在100毫升的ExpiCHO培養基中培養細胞7天後，收穫上清液；採用離心過濾或深層過濾的方法進行發酵液的澄清。

配置EQ緩衝液(PBS,pH7.4)的方法為取PBS磷酸緩衝液粉劑一袋，將該粉末用2000ml超純水溶解，用0.22μm濾膜過濾備用。

配置Elution緩衝液(500mM咪唑，pH7.4)的方法為稱取咪唑34g加EQ緩衝液450ml，調節ph至7.4，定容至500ml，0.22μm濾膜過濾備用。

將收穫後的上清液藉由AKTA Pure儀器進行純化。首先用EQ緩衝液平衡儀器，直至流出液體的pH和電導值與EQ緩衝液一致；再用Elution緩衝液收集樣品。

採用同樣的方法表達融合蛋白SEQ ID NO：10-16，使用Protein A親和層析柱純化，依次洗滌含有表達受體的條件培養基。將沖提物在10mM tris緩衝鹽水，pH 7.2的環境中透析。

用紫外分光光度法測定製備蛋白的濃度和純度。

實施例2 FGF21突變體誘導的葡萄糖攝取功能研究

評價FGF21蛋白突變體對葡萄糖攝取水平的調節作用。3T3-L1小鼠胚胎成纖維細胞分化成熟的脂肪細胞表面表達葡萄糖轉運蛋白1(GLUT1)，FGF21蛋白藉由調節GLUT1的表達水平，進而調節脂肪細胞對葡萄糖攝取水平。

將培養的3T3-L1(南京科佰，cat #：CBP60758)小鼠胚胎成纖維細胞用胰蛋白酶(gibco，cat #：25200-056)消化，製備單細胞懸液，調整細胞密度至1x10⁶/mL，接種於T75培養瓶，於37℃，5%二氧化碳培養箱內培養過夜。吸取原培養基，加入誘導培養基，即在含10%胎牛血清(gibco，cat #：1009141C)的DMEM(gibco，cat #：11995-065)完全培養基中加入2μg/ml人胰島素(Sinobiologics，cat #：11038-HNAY)溶液，1μM地塞米松(Sigma，cat #：D4902-25MG)和0.5mM 3-異丁基-1-甲基黃嘌呤(IBMX)(Sigma，cat #：I7018-100MG)，誘導培養3T3-L1細胞3天，鏡下觀察細胞內脂肪粒的數量及大小，使其分化成脂肪細胞，之後將分化培養基換成只含有2μg/ml人胰島素完全培養基。

將誘導分化成熟的脂肪細胞消化，製備單細胞懸液，用DMEM完全基礎培養基調整細胞密度至1x10⁶/mL，100uL/孔，接種於96孔板(Corning，cat #：3610)，待細胞貼壁，在實驗組加入以DMEM基礎培養基稀釋待測突變體蛋白(SEQ ID NO：5)，使其終濃度為5000nM，100uL/孔加入板內，對照組加入相同體積的DMEM基礎培養基，於37℃，5%二氧化碳孵育過夜。次日，將細胞在DMEM基礎培養基中饑餓2小時，之後加入100uM 2-NBDG，於37℃孵育1小時，pH7.4 PBS溶液洗細胞2次，胰蛋白酶消化，製備單細胞懸液，將細胞轉移至V型底96孔板，利用ZE5流式細胞儀檢測胞內2-NBDG信號，利用MFI計算葡萄糖的攝取率，計算公式：葡萄糖攝取率%=(實驗組MFI-對照組MFI)/對照組MFI*100%。

FGF21蛋白突變體對葡萄糖攝取水平的調節作用

實驗結果表明，FGF21突變體(SEQ ID NO：6)顯著誘導脂肪細胞對葡糖糖類似物2-NBDG攝取，誘導效率良好。

實施例3 FGF21突變體誘導ERK1/2蛋白磷酸化的細胞功能研究

FGF21蛋白藉由Ras/Raf/MAPK信號通路途徑調節ERK1/2蛋白的磷酸化水平轉導細胞信號參與體內能量代謝。評價比較FGF21蛋白突變體對ERK1/2蛋白的磷酸水平調節差異可評價其轉導細胞信號的水平。

將HuH-7(中科院，cat #：SCSP-526)以1x10⁵/mL接種於96孔板，100uL/孔，於37℃，5%二氧化碳孵育過夜，次日，將細胞在DMEM(gibco，cat #：11995-065)基礎培養基中饑餓2小時，在實驗組加入以DMEM基礎培養基稀釋待測蛋白，調整待測突變體蛋白(SEQ ID NO：5)終濃度為50nM，100uL/孔加入板內，對照組加入相同體積的DMEM基礎培養基，37℃孵育20分鐘，加入固定液(BD Cytofix，cat #：554655)於37℃固定30分鐘，以400g，4℃離心5分鐘，洗兩遍。加入通透液(BD Phosflow，cat #：558050)4℃通透1小時之後加入Alexa Fluor® 647標記小鼠抗人pERK1/2蛋白抗體(Biolegend，cat #：369504)，4℃孵育1小時，以400g，4℃離心5分鐘，洗兩遍，100uL/孔加入2%FBS溶液重新懸浮細胞於ZE5(Bio-Rad)流式細胞儀檢測Alexa Fluor® 647通道信號，利用平均螢光強度(MFI)計算pERK1/2增長效率，計算公式：pERK1/2增長率%=(實驗組MFI-對照組MFI)/對照組MFI*100%。

實驗結果表明，FGF21突變體(SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6)可上調HuH-7細胞內ERK1/2蛋白的磷酸水平，效果良好。

實施例4 融合蛋白與Fc受體結合的BLI檢測

FGF21融合蛋白由發揮功能的FGF21和Fc片段組成，其中Fc結合FcγR的胞外域藉由非共價鍵結合，激活免疫受體酪胺酸激活基序，介導的ADCC(細胞毒性)所引發的免疫激活效應對於疾病治療不利。而Fc 與FcRn(新生兒Fc受體)的結合，則有利於融合蛋白在體內具有更長的循環週期。

藉由融合蛋白與FcγRI、FcγRIIa、FcγRIIIa、FcRn之間的親和力分析來評估Fc片段介導的潛在免疫效應及體內循環特性。使用PBST(pH=7.4)溶液將融合蛋白12稀釋到1108.0nM、553.8nM、276.9nM、138.4nM和69.2nM；將FcγRI(Sino,# 10256-H27H-B)、FcγRIIa(Sino,# 10374-H27H-B)、FcγRIIIa(Sino,10389-H27H1-B)和FcRn(Sino,# CT009-H08H-B)分別稀釋到10μg/mL、3μg/mL、5μg/mL和3μg/mL濃度。

在PBST(pH=7.4)溶液中用蛋白相互作用儀(PALL,#Red)的SA探針捕獲FcγRI、FcγRIIa、FcγRIIIa；隨後與融合蛋白12混合進行反應，充分反應後的固相結合物在PBST緩衝液中進行解離分析，以Data Analysis軟體對結果分析。同樣的方法，使用PBST(pH=6.0)溶液用於融合蛋白與FcRn的結合檢測。獲得親和力常數如下表所示：

融合蛋白突變體12與FcγR(FcγRI、FcγRIIa、FcγRIIIa)的結合均較弱，免疫效應帶來的副作用風險較小；與FcRn之間結合較強，有利於其在血液中長效循環。

實施列5 FGF21融合蛋白突變體PK研究

利用人FcRn轉基因小鼠模型評價FGF21融合蛋白突變體在小鼠體內的藥物代謝情況。

將平均體重為18-22g，18-22週齡的人FcRn轉基因小鼠隨機分組，每組3隻動物，受試FGF21融合蛋白突變體12均以4mpk，s.c.，單次的方式給藥，PBS溶媒作為陰性對照組，分別在0.5、2、4、6、8、24、48、72、96、120小時採血分離血漿，凍存於-20℃冰箱，之後利用人KLB蛋白-FGF21融合蛋白突變體-Fc-HRP間接ELISA法檢測小鼠血漿中FGF21融合蛋白突變體的濃度，並利用PK solver軟體非房室模型，血管內給藥的公式分析其PK參數，實驗結果如下表所示：

綜合半衰期t_1/2、暴露量、血藥最高濃度達峰時間等參數，FGF21融合蛋白突變體12顯示出良好的體內代謝活性。

實施例6 FGF21融合蛋白在DIO小鼠體內藥效研究

利用高脂飲食誘導C57BL/6小鼠肥胖模型，即DIO模型小鼠，評價FGF21融合蛋白突變體在降低體重、肝臟重量的效果。

將體重為30-50g，12週齡的DIO雄性肥胖模型小鼠隨機分組，每組8隻動物，受試FGF21融合蛋白突變體12、13，以2mpk,s.c.，q3d的方式給藥，PBS溶媒作為陰性對照組，共給藥3次。第0天稱量體重並給藥，以後每3天給藥並測量體重，累計進食量。第9天稱重並禁食過夜於第10天稱重並採血，取肝臟，並稱量肝臟。

DIO小鼠體重變化(%)(Mean±SD)

DIO小鼠實驗終點(第10天)血糖水平(Mean±SD)

DIO小鼠實驗終點(第10天)肝重變化

綜合實驗結果，2mpk,s.c.，q3d的方式給藥方式下，隨著小鼠進食量增加，FGF21融合蛋白突變體12、13顯示出顯著且持久的降體重作用；對於降低肝臟重量及血糖水平，與溶媒組PBS相比均具有明顯的統計學差異，結果表明在減少肝臟脂肪蓄積，降低血糖水平，均顯示出較好的代謝調節效果。

實施例7 FGF21融合蛋白在ob/ob小鼠體內藥效研究

利用瘦素敲除的小鼠糖尿模型，即ob/ob模型小鼠，評價FGF21融合蛋白突變體12在降低體重、血糖水平、肝-體重比、血脂四項：總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白(LDL)、高密度脂蛋白(HDL)水平效果。

將體重為30-50g，12週齡的ob/ob雄性肥胖模型小鼠隨機分組，每組6隻動物，受試FGF21融合蛋白突變體12，以2mpk,s.c.，q3d的方式給藥，PBS溶媒作為陰性對照組，共給藥3次。第0天稱量體重並給藥，以後每3天給藥並測量體重，累計進食量。第8天稱重並禁食過夜於第9天稱重並採血檢測血糖水平及血糖四項，分離肝臟，並分別稱量肝臟、體重，計算肝臟-體重比。

實驗結果表明，相對於溶媒組候選分子具有明顯的降體重效果和降血糖效果。

ob/ob小鼠體重變化(%)(Mean±SD)

ob/ob小鼠實驗終點(第9天)血糖水平變化(mmoL/L)(Mean±SD)

實施例8 FGF21融合蛋白對NASH模型藥效研究

CD57 BL/6小鼠採購於南京集萃藥康，在本實驗室適應一週後即進行飲食誘導NASH模型。使用膽鹼缺乏的高脂肪含量飼料即，CDA HFD誘導。正常健康組小鼠常規飼料飼喂，溶媒(pH7.4 PB溶液)對照組和實驗組小鼠使用含60%高脂肪，2%膽固醇的CDA/HFD飼料，並在飲水中添加10%果糖飼餵，誘導9週。隨後將實驗小鼠隨機分為4組，每組5動物，從第3週開始給藥(即誘導2週後給藥，給藥7週)。受試藥物以5mg/kg，藉由皮下以q3d頻次給藥，連續給藥7週，到達實驗終點後，稱量體重，安樂死處理動物，收集肝臟稱重後將肝臟保存於4%中性甲醛，供組織切片以檢測脂肪沉積、幹細胞氣球樣病變、肝細胞炎症水平等指標評估受試藥物對NASH發生進程的影響。

實驗結果表明，與健康組對照比，受試藥物在減輕體重方面效果明顯可達24.92%，同時明顯在降低肝臟-體重比水平，與健康組水平相當；相對於溶媒組候選分子在改善NASH纖維化水平有統計學差異。

NASH小鼠體重變化(%)(Mean±SEM)

受試藥物對纖維化水平及NAS評分的改善

受試藥物對肝臟-體重比的影響

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Claims

一種融合蛋白，其通式如下：

F₁-F₂-F₃ (I)

其中，

F₁為FGF21蛋白或其變體，其結構如下通式(II)所示：

(II)

X₁₆₆選自L或F；

X₁₇₅選自R或W；

F₂為連接肽；

F₃為免疫球蛋白的Fc或其片段組成的結構域。
如請求項2所述的融合蛋白，其中，F₁為序列如SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：6所示。
如請求項2所述的融合蛋白，其中，F₂為序列如SEQ ID NO：7所示。
如請求項1至3中任一項所述的融合蛋白，其中，該F₃如通式(III)所示：

F₄(GGGGGS)_m(GGGGS)_nF₄ (III)

其中，

F₄為免疫球蛋白的Fc片段；

m選自1-10的整數；且

n選自1-10的整數。
如請求項4所述的融合蛋白，其中，

F₄為SEQ ID NO：8；

m為1；且

n為9。
如請求項1至3中任一項所述的融合蛋白，其中，該F₃為SEQ ID NO：9。
如請求項1至6中任一項所述的融合蛋白，其中，該融合蛋白選自SEQ ID NO：12或SEQ ID NO：13。
一種多核苷酸，其編碼包含如請求項1至7中任一項所述的融合蛋白。
一種表達載體，其含有如請求項8所述的多核苷酸。
一種宿主細胞，其導入或含有如請求項9所述的表達載體，其中該宿主細胞選自細菌、酵母菌或哺乳動物細胞，該細菌較佳為大腸桿菌；該酵母菌，較佳為畢赤酵母；該哺乳動物細胞，較佳為CHO細胞或HEK293細胞。
一種生產蛋白的方法，包括步驟：

培養如請求項10所述的宿主細胞；

從培養物中分離蛋白；

以及對該蛋白進行純化。
一種醫藥組成物，其含有如請求項1至7中任一項所述的融合蛋白，以及可藥用的賦形劑、稀釋劑或載體。
一種如請求項如請求項1至7中任一項所述的融合蛋白、或如請求項12所述的醫藥組成物在製備藥物中的用途，該藥物用於治療或預防治療糖尿病、肥胖、血脂異常、代謝綜合症、非酒精性脂肪肝或非酒精性脂肪肝炎相關疾病。