KR20140039322A - 대사성 장애 및 질환의 치료를 위한 조성물, 용도 및 방법 - Google Patents

대사성 장애 및 질환의 치료를 위한 조성물, 용도 및 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 하나 또는 그 이상의 활성, 예를 들어 당 저감 활성을 갖는 섬유아세포 성장인자 19 (FGF19) 의 변이체 및 융합체, 섬유아세포 성장인자 21 (FGF21) 의 변이체 및 융합체, 섬유아세포 성장인자 19 (FGF19) 및/또는 섬유아세포 성장인자 21 (FGF21) 의 융합체, 및 섬유아세포 성장인자 19 (FGF19) 및/또는 섬유아세포 성장인자 21 (FGF21) 의 변이체 또는 융합체 단백질 및 펩티드 서열 (그리고 펩티도 미메틱) 및 고혈당증 및 다른 장애의 치료 용도 및 방법에 관한 것이다.

Description

대사성 장애 및 질환의 치료를 위한 조성물, 용도 및 방법{Compositions, Uses and Methods for Treatment of Metabolic Disorders and Diseases}
본 출원은 2011년 7월 1일 출원된 출원번호 61/504,128 출원과 2011년 8월 4일에 출원된 출원번호 61/515,126 출원의 우선권의 이익을 주장하며, 두 개의 출원 모두 그들 전부가 참조로서 분명하게 본원에 포함되어 있다.
본 발명은 포도당 저하 활성을 갖는 섬유아세포 성장인자 19 (FGF19) 단백질과 펩티드 서열 (그리고 펩티도미메틱(peptidomimetics))의 변이체 및 섬유아세포 성장인자 19 (FGF19) 및/또는 섬유아세포 성장인자 21 (FGF21) 단백질과 펩티드서열 (그리고 펩티도미메틱) 의 융합, 그리고 섬유아세포 성장인자 19 (FGF19) 및/또는 섬유아세포 성장인자 21 (FGF21) 단백질과 펩티드서열 (그리고 펩티도미메틱) 의 융합의 변이체, 및 고혈당증 및 다른 장애의 치료 용도 그리고 이의 치료방법에 관한 것이다.
당뇨병은 판크레아틱 β세포에서 인슐린 생산물(type 1)의 결여 또는 인슐린저항성 또는 인슐린 생산물(type 2)의 부족에 의해 야기되는 쇠약성 대사성 질환이다. β세포는 식사 후에 방출되는 인슐린 생산과 저장을 하는 내분비계 세포로 특화되었다. 인슐린은 필요한 조직에 혈액으로부터 당(glucose)의 이동을 용이하게 하는 호르몬이다. 당뇨병을 가진 환자는 혈중 당 수치를 자주 관찰해 주어야 하고, 많은 이들은 생존을 위해 매일 다수의 인슐린 주입이 필요하다. 그러나, 그러한 환자들은 인슐린 주입에 의해 이상적인 포도당 수치를 거의 얻지 못한다(Turner, R.C. et al. JAMA 281:2005(1999)). 게다가, 계속된 인슐린 수치의 증가는 저혈당 쇼크와 인슐린에 대한 몸의 반응의 불감증과 같은 해로운 부작용을 야기시킬 수 있다. 그 결과 당뇨병 환자들은 여전히 심혈관질환, 신장질환, 실명, 신경손상 그리고 부상 장애와 같은 만성합병증으로 발전된다 (UK Prospective Diabetes Study (UKPDS) Group, Lancet 352:837 (1998)).
비만 수술은 당뇨병에 대한 잠재적인 치료법으로서 제안되어 왔다. 그 수술 후 소화관 호르몬 세크레틴의 변화는 당뇨질환의 해결책에 도움이 된다고 상정되어져 왔다. 그 근본적인 분자메커니즘은 아직 설명되지 않았지만 글루카곤 유사 펩티드1(GLP-1)이 가능한 후보로서 추측되어 왔다(Rubino, F. Diabetes Care 32 Suppl 2:S368(2009)). FGF19는 소장의 말단에서 높게 발현되며 형질전환된 FGF19의 과발현은 포도당항상성을 증가시킨다 (Tomlinson, E. Endocrinology 143(5):1741-7(2002)). 인간의 혈청에서 FGF19의 수준은 위우회수술 후에 증가된다. FGF19의 발현 증가와 분비는 수술 후 관찰된 당뇨질환 치료를 적어도 부분적으로 설명할 수 있었다.
이에 따라, 인간에서 당뇨병, 전당뇨병, 인슐린 저항성, 고인슐린혈증, 당불내성 또는 대사 증후군, 그리고 다른 상승된 당 수준과 연관된 장애 및 질환과 같은 고혈당질환의 대안적 치료에 대한 요구가 있다.
본 발명은 부분적으로 당 저감 활성과 같은 하나 또는 그 이상의 활성을 가진 섬유아세포 성장인자 19 (FGF19) 펩티드 서열의 변이체, 섬유아세포 성장인자 (FGF19) 및/또는 섬유아세포 성장인자 21 (FGF21) 펩티드 서열의 융합체, 섬유아세포 성장인자 19 (FGF19) 및/또는 섬유아세포 21 (FGF21) 펩티드 서열의 융합체의 변이체 (키메라)에 기반한다. 그러한 FGF19 및/또는 FGF21 펩티드 서열의 변이체와 융합체(키메라) 는 간세포 암종 (HCC)의 형성 또는 HCC 종양형성을 증가시키거나 유도시키지 않는 서열을 포함한다. 그러한 FGF19 및/또는 FGF21 펩티드서열의 변이체와 융합체 (키메라)는 또한 지질프로파일에 큰 증가 또는 상승을 유도하지 않는 서열을 포함한다.
하나의 실시예로, 키메라 펩티드 서열은 하기를 포함하거나 이로 구성된다: 적어도 7개의 아미노산 잔기를 가진 N-말단 영역, 첫째 아미노산 위치 및 마지막 아미노산 위치를 갖는 상기 N-말단 영역에서, 상기 N-말단 영역은 DSSPL 또는 DASP를 포함하며; 그리고 FGF19 일부를 포함하는 C-말단 영역, 여기에서 C-말단 영역은 첫번째 아미노산 위치 및 마지막 아미노산 위치를 갖는 것이고, 상기 C-말단 영역은 FGF19의 16 내지 29 아미노산 잔기(WGDPIRLRHLYTSG) 를 포함하며, 여기에서 W 잔기는 C-말단 영역의 첫번째 아미노산 위치에 상응하는 것.
다른 실시예에서, 키메라 펩티드 서열은 하기를 포함하거나 이로 구성된다: FGF21 의 일부를 포함하는 N-말단 영역, 여기에서 N-말단 영역은 첫째 아미노산 위치 및 마지막 아미노산 위치를 가지고, 상기 N-말단 영역은 GQV 서열을포함하며, 그리고 여기에서 V 잔기는 N-말단 영역의 마지막 아미노산 위치에 상응하는; 그리고 FGF19의 일부를 포함하는 C-말단 영역, 여기에서 C-말단 영역은 FGF19의 21 내지 29의 아미노산 잔기(RLRHLYTSG)를 포함하고, 여기에서 R 잔기는 C-말단 영역의 첫번째 위치에 상응하는 것.
또 다른 실시예로, 키메라 펩티드 서열은 하기 중 어느 것을 포함하거나 이로 구성된다: 서열번호 100 [FGF21] 의 일부를 포함하는 N-말단 영역, 첫째 아미노산 위치 및 마지막 아미노산 위치를 갖는 상기 N-말단 영역에서, 상기 N-말단 영역은 서열번호 100[FGF21]의 아미노산 잔기 GQV를 포함하는 적어도 5개 (또는 그 이상)의 연속된 아미노산 잔기를 포함하며, 그리고 여기에서 V 잔기는 N-말단 영역의 마지막 아미노산 위치에 상응하는; 그리고 서열번호 99 [FGF19] 일부를 포함하는 C-말단 영역, 첫째 아미노산 위치 및 마지막 아미노산 위치를 갖는 상기 C-말단 영역에서, 상기 C-말단 영역은 서열번호 99 [FGF19] 의 21 내지 29 아미노산 잔기, RLRHLYTSG를 포함하며, 여기에서 R 잔기는 C-말단 영역의 첫번째 위치에 상응하는 것. 특정 측면에서, N-말단 영역은 GQV 아미노산 잔기를 포함하는 서열번호100 [FGF21]의 적어도 6개의 연속적인 아미노산 (또는 그 이상 예를 들어 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 20-25, 25-30, 30-40, 40-50, 50-75, 75-100 연속적인 아미노산)을 포함한다.
추가적인 실시예로, 펩티드 서열은 하기 중 임의의 것을 포함하거나 이로 구성된다: 참조 또는 야생형 FGF19와 비교하여 하나 또는 그 이상의 아미노산 치환, 삽입 또는 결실을 가진 섬유아세포 성장인자 19(FGF19)의 서열 변이체; 참조 또는 야생형 FGF21과 비교하여 하나 또는 그 이상의 아미노산 치환, 삽입 또는 결실을 가진 섬유아세포 성장인자 21(FGF21) 서열 변이체; FGF19 서열의 일부와 FGF21 서열의 일부의 융합; 또는 FGF19 서열의 일부와 FGF21 서열 일부의 융합, 상기 FGF19 및/또는 FGF21 서열 일부(들)은 참조 또는 야생형 FGF19 및/또는 FGF21과 비교하여 하나 또는 그 이상의 아미노산 치환, 삽입 또는 결실을 갖는 것.
계속 또 다른 실시예로, 펩티드 서열 또는 키메라 펩티드서열은 서열번호 100 [FGF21] 의 아미노 말단 아미노산 1 내지 16 과 서열번호 99 [FGF19] 의 카르복시-말단 아미노산 21 내지 194가 융합된 것을 갖거나 또는 이로 구성되며, 또는 상기 펩티드 서열은 서열번호 99 [FGF19] 의 아미노 말단 아미노산 1 내지 147 과 서열번호 100 [FGF21] 의 카르복시-말단 아미노산 147 내지 181이 융합된 것(M41)을 갖거나, 또는 상기 펩티드 서열은 서열번호 99 [FGF19] 의 아미노 말단 아미노산 1 내지 20 과 서열번호 100 [FGF21] 의 카르복시-말단 아미노산 17 내지 181이 융합된 것 (M44)을 갖거나, 또는 상기 펩티드 서열은 서열번호 100 [FGF21] 의 아미노 말단 아미노산 1 내지 146 과 서열번호 99 [FGF19] 의 카르복시-말단 아미노산 148 내지 194이 융합된 것(M45) 을 갖거나, 또는 상기 펩티드 서열은 서열번호 99 [FGF19] 의 아미노 말단 아미노산 1 내지 20 과 서열번호 100 [FGF21] 의 내부 아미노산 17 내지 146이 융합되고 이에 서열번호 99 [FGF19] 의 카르복시-말단 아미노산 148 내지 194 가 융합된 것(M46) 을 포함하거나 또는 이로 구성된다.
또다른 추가 실시예에서, 펩티드 서열 또는 키메라 펩티드 서열들은 서열번호 99 [FGF19]의 아미노산 16 내지 20 의 WGDPI 서열에 상응하는 WGDPI 서열 모티브를 갖거나, 또는 FGF19의 아미노산 16 내지 20 의 FGF19 WGDPI 서열에 상응하는 WGDPI 서열 모티브가 치환, 돌연변이, 결실된 것을 갖거나, 또는 상기 WGDPI 서열 모티브가 하나 또는 그 이상 아미노산이 치환, 돌연변이 또는 결실된 것을 갖거나; 또는 아미노산 16 내지 20의 FGF19 WGDPI 서열이 GQV, GDI, WGPI, WGDPV, WGDI, GDPI, GPI, WGQPI, WGAPI, AGDPI, WADPI, WGDAI, WGDPA, WDPI, WGDI, WGDP 또는 FGDPI 중 어느 것으로 치환된 것을 갖는 FGF 19 변이체 서열로 구별되는 것이다.
또다른 실시예에서, 펩티드 서열 또는 키메라 펩티드 서열은 아미노산 잔기 VHYG 를 포함하거나 이로 구성된 N-말단 영역을 가지며, 여기에서 상기 N-말단 영역은 DASPHVHYG 아미노산 잔기를 포함하거나, 또는 상기 N-말단 영역은 DSSPLVHYG 아미노산 잔기를 포함하며, 또는 상기 N-말단 영역은 DSSPLLQ 아미노산 잔기를 포함하거나, 또는 여기에서 상기 N-말단 영역은 DSSPLLQFGGQV 아미노산 잔기를 포함한다. 특정한 측면에서, G가 상기 N-말단 영역의 마지막 위치에 상응하거나, 또는 Q 잔기가 N-말단 영역의 마지막 아미노산 위치이거나, 또는 V 잔기가 N-말단 영역의 마지막 위치에 상응한다.
계속 추가적인 실시예에서, 펩티드 서열 또는 키메라 펩티드 서열은 RHPIP, 여기에서 R은 N-말단 영역의 첫번째 아미노산 위치이고; 또는 HPIP (예를 들어, 여기에서 HPIP 들은 N-말단 영역의 처음 4 아미노산 잔기임), 여기에서 H는 N-말단 영역의 첫번째 아미노산 위치; 또는 RPLAF, 여기에서 R은 N-말단 영역의 첫번째 아미노산 위치; 또는 PLAF, 여기에서 P는 N-말단 영역의 첫번째 아미노산 위치; 또는 R, 여기에서 R은 N-말단 영역의 첫번째 아미노산 위치를 포함하거나 이로 구성된 N- 말단 영역을 갖거나, 또는 N-말단 영역에서 하기 서열들 중의 어느 하나를 갖는다: MDSSPL, MSDSSPL, SDSSPL, MSSPL 또는 SSPL.
또 다른 실시예에서, 펩티드 서열 또는 키메라 펩티드 서열은, N-말단 영역의 첫번째 위치에 “M”잔기, “R”잔기 “S”잔기 “H”잔기 “P”잔기 “L”잔기 또는 “D”잔기를 갖는다. 선택적 실시예에서, 펩티드 서열 또는 키메라 펩티드 서열은 N-말단 영역의 첫번째 아미노산 위치에 “M”잔기 또는 “R”잔기를 갖지 않는다.
계속 다른 실시예에서, 펩티드 서열 또는 키메라 펩티드 서열은 N-말단 영역의 첫번째 두번째 위치에 MR 서열을 갖거나, N-말단 영역의 첫번째 두번째 위치에 RM 서열을 갖거나, N-말단 영역의 첫번째 및 두번째 위치에 RD 서열을 갖거나, N-말단 영역의 첫번째 및 두번째 위치에 DS 서열을 갖거나, N-말단 영역의 첫번째 및 두번째 위치에 MD 서열을 갖거나, 또는 N-말단 영역의 첫번째 및 두번째 위치에 MS 서열을 갖거나, 또는 N-말단 영역의 첫번째 내지 세번째 위치에 MDS 서열을 갖거나, N-말단 영역의 첫번째 내지 세번째 위치에 RDS 서열을 갖거나, N-말단 영역의 첫번째 내지 세번째 위치에 MSD 서열을 갖거나, 또는 N-말단 영역의 첫번째 내지 세번째 위치에 MSS 서열을 갖거나, 또는 N-말단 영역의 첫번째 내지 세번째 위치에 DSS 서열을 갖거나, N-말단 영역의 첫번째 내지 네번째 위치에 RDSS 서열을 갖거나, N-말단 영역의 첫번째 내지 네번째 위치에 MDSS 서열을 갖거나, N-말단 영역의 첫번째 내지 다섯번째 위치에 MRDSS 서열을 갖거나, 또는 N-말단 영역의 첫번째 내지 다섯번째 위치에 MSSPL 서열을 갖거나, N-말단 영역의 첫번째 내지 여섯번째 위치에 MDSSPL 서열을 갖거나, N-말단 영역의 첫번째 내지 일곱번째 위치에 MSDSSPL 서열을 갖는다.
계속 다른 실시예에서, 펩티드 서열 또는 키메라 펩티드 서열은 C-말단에 서열번호99 [FGF19] 의 30 내지 194 아미노산 잔기가 추가된 것이고, 결과적으로 서열번호 99 [FGF19]의 약 194 잔기에 상응하는 C-말단 영역의 마지막 위치를 갖는 키메라 폴리펩티드이다. 추가의 다른 실시예에서, 키메라 펩티드 서열 또는 펩티드 서열은 FGF19 서열(예를 들어, 서열번호 99) 의 전부 또는 일부를 포함하고, 이는 상기 펩티드의 C-말단에 위치하며, 또는 여기서 아미노 말단 "R" 잔기는 펩티드로부터 결실되어 있다.
더 많은 특정 실시예에서, 키메라 펩티드 서열 또는 펩티드 서열은 임의의 M1 내지 M98 변이체 펩티드 서열 또는 임의의 M1 내지 M98 변이체 펩티드 서열 의 아서열 또는 절편을 포함하거나 이로 구성되어 있다.
추가적인 특정한 실시예에서, 키메라 펩티드 서열 또는 펩티드 서열은 약 20 내지 약 200 길이의 아미노산 잔기인 N-말단 또는 C-말단 영역을 갖는다. 또다른 특정한 실시예에서, 키메라 펩티드 서열 또는 펩티드 서열은 적어도 하나의 아미노산 결실을 갖는다.
계속 또다른 특정한 실시예에서, 키메라 펩티드 서열 또는 펩티드 서열 또는 그들의 아서열 또는 절편은 아미노 말단, 카르복시말단 또는 내부적으로 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 또는 그 이상의 아미노산 결실을 갖는다. 특정한 비제한적인 측면에서, 상기 아미노산 치환 또는 결실은 FGF19의 8 내지 20의 아미노산 위치(AGPHVHYGWGDPI) 중 어느 부분에서 나타난다.
더 많은 특정한 실시예에서, 키메라 펩티드 서열 또는 펩티드 서열은 약 5에서 10, 10에서 20, 20에서 30, 30에서 40, 40에서 50, 60에서 70, 70에서 80, 80에서 90, 90에서 100 또는 그 이상의 아미노산의 아미노산 서열을 포함하거나 그로 구성된다. 더많은 특정한 실시예에서, 키메라 펩티드 서열 또는 펩티드 서열은 FGF19 또는 FGF21의 약 5에서 10, 10 에서 20, 20에서 30, 30에서 40, 40 에서 50, 50 에서 60, 60 에서 70, 70 에서 80, 80 에서 90, 90 에서 100 또는 그 이상의 아미노산의 아미노산 서열을 포함하거나 그로 구성된다.
또 다른 특정한 실시예에서, 키메라 펩티드 또는 펩티드 서열은 특정한 기능이나 활성들을 갖는다. 한 측면에서, 키메라 펩티드 서열 또는 펩티드 서열은 FGFR4 매개된 활성을 유지시키거나 증가시킨다. 추가적인 측면에서, 키메라 펩티드 서열 또는 펩티드 서열은 섬유아세포 성장인자 수용체 4(FGFR4) 에 결합하거나 FGFR4 를 활성화시키고, 또는 검출불가능하게 섬유아세포 성장인자 수용체 4 (FGFR4)에 결합하거나 또는 FGFR4 를 활성화시키는, 또는 FGFR4에 대한 FGF19 결합 친화도보다 낮은 친화도를 가지고, 비슷하거나 높게 FGFR4와 결합하는 것, 또는 FGF19 활성화 FGFR4 보다 적은 정도 또는 양으로, 이와 비슷하거나 이보다 높게 FGFR4 를 활성화시키는 것이다. 또다른 측면에서, 키메라 펩티드 서열 또는 펩티드 서열은 FGF19 와 비교하여 간세포 암종(HCC) 형성이 감소되거나 또는 FGF19의 16 내지 20 아미노산인 WGDPI 서열이 GQV, GDI, WGPI, WGDPV, WGDI, GDPI, GPI, WGQPI, WGAPI, AGDPI, WADPI, WGDAI, WGDPA, WDPI, WGDI, WGDP 또는 FGDPI 중 어느 것으로 치환된 것을 갖는 FGF19 변이체 서열, 및/또는 FGF19 와 비교하여 높은 당(glucose) 저감 활성을 갖거나, 또는 FGF19의 16 내지 20 아미노산의 WGDPI 서열이 GQV, GDI, WGPI, WGDPV, WGDI, GDPI, GPI, WGQPI, WGAPI, AGDPI, WADPI, WGDAI, WGDPA, WDPI, WGDI, WGDP 또는 FGDPI 중 어느 것으로 치환된 것을 갖는 FGF19 변이체 서열, 및/또는 FGF19 와 비교하여 적은 지질 증가 활성을 가지거나, 또는 FGF19의 16 내지 20 아미노산의 WGDPI 서열이 GQV, GDI, WGPI, WGDPV, WGDI, GDPI, GPI, WGQPI, WGAPI, AGDPI, WADPI, WGDAI, WGDPA, WDPI, WGDI, WGDP 또는 FGDPI 중에서 어느 것으로 치환된 것을 갖는 FGF19 변이체 서열, 및/또는 FGF 19와 비교하여 적은 트리글리세라이드, 콜레스테롤, 비-HDL 또는 HDL 증가 활성을 갖거나 또는 FGF19의 16 내지 20 아미노산 WGDPI 서열이 GQV, GDI, WGPI, WGDPV, WGDI, GDPI, GPI, WGQPI, WGAPI, AGDPI, WADPI, WGDAI, WGDPA, WDPI, WGDI, WGDP 또는 FGDPI 중에서 어느 것으로 치환된 것을 갖는 FGF19 변이체 서열, 또는 FGF21 과 비교하여 적은 제지방 질량(lean mass) 감소 활성을 갖는다. 그러한 기능과 활성은 예를 들어 db/db 마우스에서와 같은, in vitro 또는 in vivo 에서 확인될 수 있다.
계속된 추가적 실시예에서, 단리 또는 정제된 키메라 펩티드 서열과 펩티드 서열, 및/또는 키메라 펩티드 서열과 펩티드 서열이 조성물 내에 포함될 수 있다. 다른 실시예에서 키메라 펩티드 서열 또는 펩티드 서열은 약학적 조성물에 포함된다. 그러한 조성물들은 비활성화 또는 다른 활성 성분의 조합을 포함한다. 하나의 실시예에서, 조성물, 예컨대 그러한 약학 조성물은 키메라 펩티드 서열 또는 펩티드 서열 및 당 저감제를 포함한다.
또 다른 실시예에서, 키메라 펩티드 서열 또는 펩티드 서열을 암호화하는 핵산분자가 제공된다. 그러한 분자들은 추가적으로 작동가능하게 연결된 발현 조절 요소를 포함할 수 있으며, 이것은 in vitro, 세포 내 또는 in vivo 또는 또는 핵산 분자를 포함하는 벡터(예를 들어, 바이러스성 벡터) 에서 펩티드를 암호화하는 핵산 분자가 발현되도록 한다. 키메라 펩티드 서열과 펩티드 서열을 발현하는 형질전환체 및 숙주세포가 또한 제공된다.
임의의 키메라 펩티드 서열 또는 펩티드 서열의 투여 또는 전달을 포함하는 치료방법 및 용도가 또한 제공된다. 특정 실시예에서, 대상의 치료방법 또는 용도는, 예컨대 본 발명의 펩티드 서열로 치료할 수 있는 질병 또는 장애를 갖거나 가질 위험이 있는 대상에, 본 발명의 키메라 펩티드 또는 펩티드 서열을 질병 또는 장애를 치료하기에 효과적인 양으로 투여하는 것을 포함한다. 또 다른 실시예에서 방법은 예컨대 고혈당 상태 (예를 들어, 당뇨병, 예컨대 인슐린-의존성 당뇨병 (I형), Ⅱ 형 당뇨병, 또는 임신성 당뇨병과 같은), 인슐린 저항성, 고인슐린혈증, 당불내성 또는 대사 증후군을 가진 대상 또는 비만 또는 원하지 않는 체질량을 갖는 대상에 본 발명의 키메라 펩티드 또는 펩티드 서열을 투여하는 것을 포함한다.
방법과 용도의 특정한 측면에서, 키메라 펩티드 서열 또는 펩티드 서열은 대상에서 당 대사를 증진시키기에 효과적인 양으로 대상에 투여된다. 더 많은 특정한 측면에서, 대상은 투여 전 공복 혈장 당 수준이 100 mg/dl 보다 높거나, 헤모글로빈 A1c (HbA1c)의 수준이 6 % 를 초과한다.
또 다른 실시예에서, 대상의 치료 방법 및 용도는 당 수준의 감소, 인슐린 민감도의 증가, 인슐린 저항성의 감소, 글루카곤의 감소, 당내성 또는 당 대사 또는 항상성의 증진, 췌장 기능의 증가, 또는 트리글리세라이드, 콜레스테롤, IDL, LDL 또는 VLDL 의 감소, 또는 혈압의 감소, 혈관 내막 비후의 감소, 또는 체질량 또는 무게 증가의 감소를 의도하거나 이러한 결과를 나타낸다.
예컨대 당 저감 활성을 갖고 실질적 간세포 암종(HCC) 활성을 갖지 않는 키메라 펩티드 서열 및 펩티드 서열과 같은, 키메라 펩티드 서열 또는 펩티드 서열을 확인 및/또는 분석하는 방법이 또한 제공된다. 하나의 실시예에서, 방법은 다음을 포함한다 : a) 후보 키메라 펩티드 서열 또는 펩티드 서열의 제공; b) 실험 동물 (예를 들어, db/db 마우스)에 후보 펩티드 서열을 투여, c) 후보 펩티드가 당 수준을 감소시키는지 여부를 결정하기 위하 후보 펩티드 서열 투여 후, 상기 동물의 당 수준을 측정. 특정한 측면에서, 키메라 펩티드 서열 또는 펩티드 서열은 또한 동물에서 HCC 유도(예를 들어, 실험 동물 유래 간 조직 시료의 평가), 또는 HCC 활성과 연관있는 마커의 발현에 대하여 분석되며, 상기 후보 펩티드는 당 저감 활성을 가지고 상당한 HCC 활성을 갖지 않는다. 이러한 방법은 당 저감 활성을 갖고, 선택적으로 또한 상당한 간세포 암종 (HCC) 활성을 갖지 않는 것인 후보를 확인한다.
도 1은 FGF19 및 FGF21 단백질 서열, 및 대표적인 변이체 서열, 즉 변이체 M5, 변이체 M1, 변이체 M2, 변이체 M69, 변이체 M3, 변이체 M48, 변이체 M49, 변이체 M50, 변이체 M51, 변이체 M52, 변이체 M53 및 변이체 M70 펩티드 서열을 나타낸다. FGF21의 3개의 추가적인 대립형(다형성), 즉 M71, M72 및 M73 또한 나타낸다.
도 2는 대표적인 FGF21 (음영 표시 없음) 및 FGF19 (회색 음영) 단백질 서열 사이의 도메인 교환 , 그리고 그러한 결과인 융합체 (키메라) 서열을 나타낸다. 상기 융합체 (키메라)에 존재하는 FGF21 및 FGF19 각각 유래의 아미노산 영역을 숫자로 나타낸다. 당 저감 및 지질 증가들을 각각의 키메라 서열에 대하여 나타낸다.
도 3A-3I 은 당 감소 및 체중 데이터를 나타낸다. A) 변이체 M5; B) 변이체 M1;C)의 변이체 M2 및 변이체 M69; D) 변이체 M3;E) 변이체 M48 및 변이체 M49; F) 변이체 M51과 변이체 M50; G) 변이체 M52 펩티드; H) 변이체 M53 펩티드; 그리고 I) 변이체 M70 펩티드 서열 모두 db/db 마우스에서 당 저감 활성 (즉, 항-당뇨) 을 가짐. 마우스들에 FGF19, FGF21, 선택된 변이체를 발현하는 AAV 벡터를 주입하였고, 염수 (saline) 및 GFP 들은 음성 대조군이다.
도 4A- 4I 는 FGF19, FGF21 또는 A) 변이체 M5; B) 변이체 M1; C) 변이체 M2 및 변이체 M69; D) 변이체 M3; E) 변이체 M48 및 변이체 M49; F) 변이체 M51 및 변이체 M50; G) 변이체 M52 펩티드; H) 변이체 M53 펩티드; 그리고 I) 변이체 M70 펩티드 서열을 발현하는 AAV 벡터가 주입된 db/db 마우스의 혈청 지질 프로파일(트리글리세라이드, 총 콜레스테롤, HDL 및 비-HDL) 을 나타낸다. 변이체 M5 펩티드 서열은 지질을 증가 및 상승시키는 FGF19, M1, M2 및 M69 와 반대로 지질을 증가 및 상승시키지 않았다. 모든 변이체의 혈청 수준은 유사하였다. 염수 및 GFP 는 음성 대조군이다.
도 5A - 5I 는 간세포 암종 (HCC) -A) 변이체 M5; B) 변이체 M1; C)의 변이체 M2 및 변이체 M69; D) 변이체 M3; E) 변이체 M48 및 변이체 M49; F) 변이체 M51 및 변이체 M50; G) 변이체 M52; H) 변이체 M53 펩티드; 그리고 I) 변이체 M70 펩티드 서열과 관련된 자료를 나타낸다. 모든 변이체는 FGF19와는 대조적으로, 간세포 암종 (HCC) 형성 또는 HCC의 종양화를 뚜렷하게 증가시키거나 유도하지 않았다. HCC의 스코어(score)는 변이체-주입된 마우스 유래 전체 간 표면 상에 HCC 결절의 수를 야생형 FGF19가 주입된 마우스 유래 HCC 결절의 수로 나눈 값으로 기록하였다.
도 6A-6I 은 A) 변이체 M5; B) 변이체 M1; C)의 변이체 M2 및 변이체 M69; D) 변이체 M3; E) 변이체 M48과 변이체 M49; F) 변이체 M51과 변이체 M50; G) 변이체 M52; H) 변이체 M53 펩티드; 그리고 I) 변이체 M70 펩티드 서열에 대한 제지방 질량 (lean mass) 또는 지방 질량 데이터를 나타낸다. M2, M5 및 M69를 제외하고, 변이체 펩티드 서열은 FGF21과 달리 제지방량(lean mass) 또는 체지방량을 감소시킨다.
도 7A-7B 은 재조합 A) 변이체 M5; 및 B) 변이체 M69의 폴리펩티드의 주입이 ob/ob 마우스에서 혈당을 낮추는 것을 나타낸 그래픽 데이터를 나타낸다.
도 8은 알도-케토 환원효소 패밀리 1, 멤버 C18 (Akr1C18) 및 slc1a2(용질 담체군 1, 멤버 2) 의 간 발현이 HCC 활성과 관련있다는 것을 나타내는 것을 가르키는 데이터를 나타낸다.
본 발명은 당 수준을 낮추거나 줄일 수있는 키메라 및 펩티드 서열을 제공한다. 하나의 실시 예에서, 키메라 펩티드 서열은, 7개 이상의 아미노산 잔기를 가진 N-말단영역이며, 첫번째 아미노산 위치 및 마지막 아미노산 위치를 갖는 N-말단 영역이고, 여기에서 N-말단 영역은 DSSPL 또는 DASPH 서열을 갖고; 그리고 FGF19의 일부를 갖는 C- 말단 영역이며, 첫번째 아미노산 위치 및 마지막 아미노산 위치를 갖는 C-말단 영역을 갖고, 여기에서 C-말단영역은 FGF19의 16-29의 아미노산 잔기(WGDPIRLRHLYTSG) 를 포함하고, 상기 W 잔기는 상기 C-말단영역의 첫번째 아미노산 위치에 상응하는 것을 포함하거나 이로 구성된다.
또 다른 실시 예에서, 키메라 펩티드 서열은, FGF21의 일부를 가진 N-말단 영역이며, 첫번째 아미노산 위치 및 마지막 아미노산 위치를 갖는 N-말단 영역이고, 여기에서 N-말단 영역은 GQV 서열을 갖고 상기 V 잔기는 N-말단 영역의 마지막 아미노산 위치에 상응하며; 그리고 FGF19의 일부를 갖는 C- 말단 영역이며, 첫번째 아미노산 위치 및 마지막 아미노산 위치를 갖는 C-말단 영역으로, 여기에서 C-말단영역은 FGF19의 21-29의 아미노산 잔기(RLRHLYTSG) 를 포함하고, 상기 R 잔기는 상기 C-말단영역의 첫번째 위치에 상응하는 것을 포함하거나 이로 구성된다.
또 다른 실시예에서, 펩티드 서열은 참조 또는 야생형 FGF19 과 비교하여 하나 또는 그 이상의 아미노산 치환, 삽입 또는 결실을 갖는 섬유아세포성장인자 19 (FGF19) 서열 변이체를 포함하거나 그로 구성된다. 추가적인 실시예에서, 펩티드 서열은 참조 또는 야생형 FGF21 과 비교하여 하나 또는 그 이상의 아미노산 치환, 삽입 또는 결실을 갖는 섬유아세포성장인자 21 (FGF21) 서열 변이체를 포함하거나 그로 구성된다. 또한 추가 실시예에서, 펩티드 서열은 FGF21서열의 일부와 융합한 FGF19서열의 일부를 포함하거나 그로 구성된다. 계속된 추가적인 실시예에서, 펩티드 서열은 FGF21서열 일부와 융합한 FGF19서열의 일부를 포함하거나 그로 구성되고, 여기에서 상기 FGF19 및/또는 FGF21서열 일부(들)는 참조 또는 야생형 FGF19 및/또는 FGF21과 비교하여 하나 또는 그 이상의 아미노산 치환, 삽입 또는 결실을 갖는다.
본 발명은 또한 섬유아세포 성장인자 19(FGF19) 및/또는 섬유아세포 성장인자 21(FGF21) 펩티드 서열의 변이체와 융합체를 이용하여 치료가능한 대사 장애를 갖거나 가질 위험이 있는 대상을 치료하는 방법 및 용도를 제공한다. 일 실시예에서, 방법은 장애를 치료하는데 효과적인 양으로 섬유아세포 성장인자 19(FGF19) 및/또는 섬유아세포 성장인자 21(FGF21) 펩티드 서열의 하나 또는 그 이상의 변이체 또는 융합체를 대상에게 접촉 또는 투여하는 것을 포함한다. 다른 실시예에서, 방법은 장애를 치료하는데 효과적인 양으로 섬유아세포 성장인자 19(FGF19)및/또는 섬유아세포 성장인자 21(FGF21) 펩티드 서열의 변이체 또는 융합체를 암호화하는 하나 또는 그 이상의 핵산 분자 (예를 들어, 펩티드 서열을 암호화하는 핵산 서열과 작동가능하게 연결된 발현 조절 요소, 선택적으로 벡터 포함)를 대상에게 접촉 또는 투여하는 것을 포함한다.
본 발명의 펩티드 작용의 기본 메커니즘에 대한 이해가 임의의 특정 이론이나 가설에 구속되지 않고, 본 발명을 실시하기 위해서는 필요하지 않지만, 본 발명의 펩티드는 적어도 부분적으로 비만 수술이 갖는 효과, 예를 들어, 당 항상성 및 체중 감소를 모방한다는 것으로 여겨진다. 비만 수술 후 위장관 호르몬 (예를 들어, 글루카곤 - 유사 펩티드 1 (GLP-1)) 분비에서의 변화는, 예를 들어, 당뇨 상태를 해결할 수 있다고 여겨진다. FGF19는 원위부 소장에서 높게 발현되고, FGF19의 유전자 이식 과발현은 당 항상성을 개선시킨다. 인간의 FGF19 수준 역시 위 우회 수술에 따라 상승되므로, 상승된 FGF19가 비만수술 후 관찰되는 당뇨병의 차도와 관련있을 수 있다.
대표적인 참조 또는 야생형 FGF19 서열은 다음과 같다 :
RPLAFSDAGPHVHYGWGDPIRLRHLYTSGPHGLSSCFLRIRADGVVDCARGQSAHSLLEIKAVALRTVAIKGVHSVRYLCMGADGKMQGLLQYSEEDCAFEEEIRPDGYNVYRSEKHRLPVSLSSAKQRQLYKNRGFLPLSHFLPMLPMVPEEPEDLRGHLESDMFSSPLETDSMDPFGLVTGLEAVRSPSFEK (서열번호99).
대표적인 참조 또는 야생형 FGF21 서열은 다음과 같다:
HPIPDSSPLLQFGGQVRQRYLYTDDAQQTEAHLEIREDGTVGGAADQSPESLLQLKALKPGVIQILGVKTSRFLCQRPDGALYGSLHFDPEACSFRELLLEDGYNVYQSEAHGLPLHLPGNKSPHRDPAPRGPARFLPLPGLPPALPEPPGILAPQPPDVGSSDPLSMVGPSQGRSPSYAS (서열번호100). FGF21 대립 유전자 변이체들은 도 1에 도시하였다 (예를 들어, M70, M71 그리고 M72).
용어 "펩티드", "단백질" 및 "폴리펩티드”서열은 아미드 결합 또는 등가로 공유적으로 연결되고, 화학적 변형 및 아미노산 유도체를 포함하는 두 개 또는 그 이상의 아미노산, 또는 “잔기”을 나타내기 위하여 여기에서 상호교환적으로 사용된다. 펩티드의 전부 또는 일부를 형성하는 아미노산은 단일 문자로 된 약어 또는 일반적인 세 글자 약어 모두에 의해 나타내는 것으로 알려진 21개의 자연적으로 발생하는 아미노산들 사이에서 비롯될 수 있다. 본 발명의 펩티드 서열에 있어서, 종래의 아미노산 잔기는 그들의 통상적인 의미를 갖는다. 따라서, " Leu" 는 류신, “Ile”는 아이소류신, “Nle”는 노르 류신 등을 말한다.
in vivo 에서 당을 낮추거나 저감하는 본원에 예시된 펩티드 서열들(표 1 내지 8 및 도 1) 은, 본원에서 개시된 참조 FGF19 및 FGF21 폴리펩티드들과 구별된다. 비 제한적인 특정 예로는 FGF19의 카르복시-말단 아미노산 21 내지 194 와 융합된 FGF21의 아미노-말단 아미노산 1 내지 16 을 가진 펩티드 서열; FGF21의 카르복시-말단의 아미노산 147 내지 181에 융합된 FGF19의 아미노-말단의 아미노산 1 내지 147 을 가진 펩티드 서열; FGF21의 카르복시-말단의 아미노산 17 내지 181에 융합된 FGF19의 아미노-말단의 아미노산 1 내지 20 을 가진 펩티드 서열; FGF19의 카르복시-말단의 아미노산 148 내지 194 에 융합된 FGF21의 아미노-말단의 아미노산 1 내지 146 을 가진 펩티드 서열; 그리고 FGF19 의 아미노-말단 아미노산 1 내지 20 과 FGF21 의 내부 아미노산 17 내지 146이 융합되고 이에 FGF19 의 카르복시-말단 아미노산 148 내지 194 이 융합된 것을 갖는 펩티드 서열이 있다.
추가적인 특정 펩티드 서열은 FGF19의 아미노산 16-20의 WGDPI 서열에 상응하는 WGDPI서열 모티브를 갖고, FGF19의 아미노산 16-20의 WGDPI 의 서열에 상응하는 WGDPI 서열 모티프가 결핍되거나, FGF19의 아미노산 16-20의 FGF19 WGDPI 의 서열에 상응하는 치환된(즉, 돌연변이된) WGDPI 서열 모티프를 갖는다.
본 발명의 특정 펩티드 서열은 또한 FGF19 및 FGF21 (예를 들어, 본원에 개시된 바와 같은) 과 구별되는 서열 및 아미노산 16-20 에서 FGF19 WGDPI 서열이 GQV, GDI, WGPI, WGDPV, WGDI, GDPI, GPI, WGQPI, WGAPI, AGDPI, WADPI, WGDAI, WGDPA, WDPI, WGDI, WGDP 또는 FGDPI 중 어느 것으로 치환된 것을 갖는 FGF19 변이체 서열을 포함한다. 따라서, 야생형 FGF19 및 FGF21 (예를 들어, 각각 서열번호 99 및 100 로 개시된)은 서열에서 제외될 수 있고, FGF19의 아미노산 16-20에서 WGDPI서열이 GQV, GDI, WGPI, WGDPV, WGDI, GDPI, GPI, WGQPI, WGAPI, AGDPI, WADPI, WGDAI, WGDPA, WDPI, WGDI, WGDP 또는 FGDPI 중 어느 것으로 치환된 것을 갖는 FGF19 또한 제외될 수 있다. 그러나 이러한 제외는 예를 들어, 예를 들어, GQV, GQV, GDI, 또는 GPI 중 어느 것을 갖는 FGF19 에 3 FGF21 잔기가 융합되거나, 또는 WGPI, WGDI, GDPI, WDPI, WGDI, 또는 WGDP 중 어느 하나에 2 FGF21 잔기가 융합된 경우 적용되지 않는다.
펩티드 서열의 비 제한적인 특정한 예는 M1-M98 로 여기에 지정된 서열 변이체 (서열번호 1 내지 98)의 전부 또는 일부를 포함하거나 그로 구성되어 있다. 또다른 펩티드 서열의 비 제한적인 특정 예는 다음과 같이 표시된 서열의 전부 또는 일부를 포함하거나 그로 구성되어 있다:
HPIPDSSPLLQFGGQVRLRHLYTSGPHGLSSCFLRIRADGVVDCARGQSAHSLLEIKAVALRTVAIKGVHSVRYLCMGADGKMQGLLQYSEEDCAFEEEIRPDGYNVYRSEKHRLPVSLSSAKQRQLYKNRGFLPLSHFLPMLPMVPEEPEDLRGHLESDMFSSPLETDSMDPFGLVTGLEAVRSPSFEK (FGF21서열 역시 아미노 말단에 “R”잔기를 포함할 수 있다), 또는 이들의 아서열 또는 절편; 또는
DSSPLLQFGGQVRLRHLYTSGPHGLSSCFLRIRADGVVDCARGQSAHSLLEIKAVALRTVAIKGVHSVRYLCMGADGKMQGLLQYSEEDCAFEEEIRPDGYNVYRSEKHRLPVSLSSAKQRQLYKNRGFLPLSHFLPMLPMVPEEPEDLRGHLESDMFSSPLETDSMDPFGLVTGLEAVRSPSFEK, 또는 이들의 아서열 또는 절편; 또는
RPLAFSDASPHVHYGWGDPIRLRHLYTSGPHGLSSCFLRIRADGVVDCARGQSAHSLLEIKAVALRTVAIKGVHSVRYLCMGADGKMQGLLQYSEEDCAFEEEIRPDGYNVYRSEKHRLPVSLSSAKQRQLYKNRGFLPLSHFLPMLPMVPEEPEDLRGHLESDMFSSPLETDSMDPFGLVTGLEAVRSPSFEK, 또는 이들의 아서열 또는 절편; 또는
RPLAFSDSSPLVHYGWGDPIRLRHLYTSGPHGLSSCFLRIRADGVVDCARGQSAHSLLEIKAVALRTVAIKGVHSVRYLCMGADGKMQGLLQYSEEDCAFEEEIRPDGYNVYRSEKHRLPVSLSSAKQRQLYKNRGFLPLSHFLPMLPMVPEEPEDLRGHLESDMFSSPLETDSMDPFGLVTGLEAVRSPSFEK, 또는 이들의 아서열 또는 절편; 또는
DSSPLVHYGWGDPIRLRHLYTSGPHGLSSCFLRIRADGVVDCARGQSAHSLLEIKAVALRTVAIKGVHSVRYLCMGADGKMQGLLQYSEEDCAFEEEIRPDGYNVYRSEKHRLPVSLSSAKQRQLYKNRGFLPLSHFLPMLPMVPEEPEDLRGHLESDMFSSPLETDSMDPFGLVTGLEAVRSPSFEK, 또는 이들의 아서열 또는 절편; 또는
RDSSPLVHYGWGDPIRLRHLYTSGPHGLSSCFLRIRADGVVDCARGQSAHSLLEIKAVALRTVAIKGVHSVRYLCMGADGKMQGLLQYSEEDCAFEEEIRPDGYNVYRSEKHRLPVSLSSAKQRQLYKNRGFLPLSHFLPMLPMVPEEPEDLRGHLESDMFSSPLETDSMDPFGLVTGLEAVRSPSFEK (M69), 또는 이들의 아서열 또는 절편; 또는
RDSSPLLQWGDPIRLRHLYTSGPHGLSSCFLRIRADGVVDCARGQSAHSLLEIKAVALRTVAIKGVHSVRYLCMGADGKMQGLLQYSEEDCAFEEEIRPDGYNVYRSEKHRLPVSLSSAKQRQLYKNRGFLPLSHFLPMLPMVPEEPEDLRGHLESDMFSSPLETDSMDPFGLVTGLEAVRSPSFEK (M52), 또는 이들의 아서열 또는 절편; 또는 HPIPDSSPLLQFGGQVRLRHLYTSGPHGLSSCFLRIRADGVVDCARGQSAHSLLEIKAVALRTVAIKGVHSVRYLCMGADGKMQGLLQYSEEDCAFEEEIRPDGYNVYRSEKHRLPVSLSSAKQRQLYKNRGFLPLSHFLPMLPMVPEEPEDLRGHLESDMFSSPLETDSMDPFGLVTGLEAVRSPSFEK (M5), 또는 이들의 아서열 또는 절편; 또는
HPIPDSSPLLQFGGQVRQRYLYTDDAQQTEAHLEIREDGTVGGAADQSPESLLQLKALKPGVIQILGVKTSRFLCQRPDGALYGSLHFDPEACSFRELLLEDGYNVYQSEAHSLPLHLPGNKSPHRDPAPRGPARFLPLPGLPPALPEPPGILAPQPPDVGSSDPLSMVGPSQGRSPSYAS (M71), 또는 이들의 아서열 또는 절편; 또는
HPIPDSSPLLQFGGQVRQRYLYTDDAQQTEAHLEIREDGTVGGAADQSPESLLQLKALKPGVIQILGVKTSRFLCQRPDGALYGSLHFDPEACSFRELLLEDGYNVYQSEAHGLPLHLPGNKSPHRDPAPRGPARFLPLPGLPPAPPEPPGILAPQPPDVGSSDPLSMVGPSQGRSPSYAS (M72), 또는 이들의 아서열 또는 절편; 또는
HPIPDSSPLLQFGGQVRQRYLYTDDAQQTEAHLEIREDGTVGGAADQSPESLLQLKALKPGVIQILGVKTSRFLCQRPDGALYGSLHFDPEACSFRELLLEDGYNVYQSEAHGLPLHLPGNKSPHRDPAPRGPARFLPLPGLPPALPEPPGILAPQPPDVGSSDPLSMVVQDELQGVGGEGCHMHPENCKTLLTDIDRTHTEKPVWDGITGE (M73), 또는 이들의 아서열 또는 절편; 또는
RPLAFSDASPHVHYGWGDPIRLRHLYTSGPHGLSSCFLRIRADGVVDCARGQSAHSLLEIKAVALRTVAIKGVHSVRYLCMGADGKMQGLLQYSEEDCAFEEEIRPDGYNVYRSEKHRLPVSLSSAKQRQLYKNRGFLPLSHFLPMLPMVPEEPEDLRGHLESDMFSSPLETDSMDPFGLVTGLEAVRSPSFEK (M1), 또는 이들의 아서열 또는 절편; 또는
RPLAFSDSSPLVHYGWGDPIRLRHLYTSGPHGLSSCFLRIRADGVVDCARGQSAHSLLEIKAVALRTVAIKGVHSVRYLCMGADGKMQGLLQYSEEDCAFEEEIRPDGYNVYRSEKHRLPVSLSSAKQRQLYKNRGFLPLSHFLPMLPMVPEEPEDLRGHLESDMFSSPLETDSMDPFGLVTGLEAVRSPSFEK (M2), 또는 이들의 아서열 또는 절편; 또는 RPLAFSDAGPHVHYGWGDPIRLRHLYTSGPHGLSSCFLRIRADGVVDCARGQSAHSLLEIKAVALRTVAIKGVHSVRYLCMGADGKMQGLLQYSEEDCAFEEEILEDGYNVYRSEKHRLPVSLSSAKQRQLYKNRGFLPLSHFLPMLPMVPEEPEDLRGHLESDMFSSPLETDSMDPFGLVTGLEAVRSPSFEK (M3), 또는 이들의 아서열 또는 절편; 또는 RDSSPLLQFGGQVRLRHLYTSGPHGLSSCFLRIRADGVVDCARGQSAHSLLEIKAVALRTVAIKGVHSVRYLCMGADGKMQGLLQYSEEDCAFEEEIRPDGYNVYRSEKHRLPVSLSSAKQRQLYKNRGFLPLSHFLPMLPMVPEEPEDLRGHLESDMFSSPLETDSMDPFGLVTGLEAVRSPSFEK (M48), 또는 이들의 아서열 또는 절편; 또는 RPLAFSDSSPLLQFGGQVRLRHLYTSGPHGLSSCFLRIRADGVVDCARGQSAHSLLEIKAVALRTVAIKGVHSVRYLCMGADGKMQGLLQYSEEDCAFEEEIRPDGYNVYRSEKHRLPVSLSSAKQRQLYKNRGFLPLSHFLPMLPMVPEEPEDLRGHLESDMFSSPLETDSMDPFGLVTGLEAVRSPSFEK (M49), 또는 이들의 아서열 또는 절편; 또는 RHPIPDSSPLLQFGDQVRLRHLYTSGPHGLSSCFLRIRADGVVDCARGQSAHSLLEIKAVALRTVAIKGVHSVRYLCMGADGKMQGLLQYSEEDCAFEEEILEDGYNVYRSEKHRLPVSLSSAKQRQLYKNRGFLPLSHFLPMLPMVPEEPEDLRGHLESDMFSSPLETDSMDPFGLVTGLEAVRSPSFEK (M50), 또는 이들의 아서열 또는 절편; 또는 RHPIPDSSPLLQFGGNVRLRHLYTSGPHGLSSCFLRIRADGVVDCARGQSAHSLLEIKAVALRTVAIKGVHSVRYLCMGADGKMQGLLQYSEEDCAFEEEIRPDGYNVYRSEKHRLPVSLSSAKQRQLYKNRGFLPLSHFLPMLPMVPEEPEDLRGHLESDMFSSPLETDSMDPFGLVTGLEAVRSPSFEK (M51), 또는 이들의 아서열 또는 절편; 또는 MDSSPLLQWGDPIRLRHLYTSGPHGLSSCFLRIRADGVVDCARGQSAHSLLEIKAVALRTVAIKGVHSVRYLCMGADGKMQGLLQYSEEDCAFEEEIRPDGYNVYRSEKHRLPVSLSSAKQRQLYKNRGFLPLSHFLPMLPMVPEEPEDLRGHLESDMFSSPLETDSMDPFGLVTGLEAVRSPSFEK (M53), 또는 이들의 아서열 또는 절편; 및 MRDSSPLVHYGWGDPIRLRHLYTSGPHGLSSCFLRIRADGVVDCARGQSAHSLLEIKAVALRTVAIKGVHSVRYLCMGADGKMQGLLQYSEEDCAFEEEIRPDGYNVYRSEKHRLPVSLSSAKQRQLYKNRGFLPLSHFLPMLPMVPEEPEDLRGHLESDMFSSPLETDSMDPFGLVTGLEAVRSPSFEK (M70), 또는 이들의 아서열 또는 절편, 또는 앞서 언급한 펩티드 서열 중 어느 것은 R 말단 잔기가 결실될 수 있다.
또다른 펩티드 서열의 특정한 비 제한적인 예는 다음을 포함하거나 그로 구성되어 있다. :
HPIPDSSPLLQFGGQVRLRHLYTSGPHGLSSCFLRIRADGVVDCARGQSAHSLLEIKAVALRTVAIKGVHSVRYLCMGADGKMQGLLQYSEEDCAFEEEIRPDGYNVYRSEKHRLPVSLSSAKQRQLYKNRGFLPLSHFLPMLPMVPEEPEDLRGHLESDMFSSPLETDSMDPFGLVTGLEAVRSPSFEK, 또는 이들의 아서열 또는 절편; 또는 DSSPLLQFGGQVRLRHLYTSGPHGLSSCFLRIRADGVVDCARGQSAHSLLEIKAVALRTVAIKGVHSVRYLCMGADGKMQGLLQYSEEDCAFEEEIRPDGYNVYRSEKHRLPVSLSSAKQRQLYKNRGFLPLSHFLPMLPMVPEEPEDLRGHLESDMFSSPLETDSMDPFGLVTGLEAVRSPSFEK, 또는 이들의 아서열 또는 절편; RPLAFSDASPHVHYGWGDPIRLRHLYTSGPHGLSSCFLRIRADGVVDCARGQSAHSLLEIKAVALRTVAIKGVHSVRYLCMGADGKMQGLLQYSEEDCAFEEEIRPDGYNVYRSEKHRLPVSLSSAKQRQLYKNRGFLPLSHFLPMLPMVPEEPEDLRGHLESDMFSSPLETDSMDPFGLVTGLEAVRSPSFEK, 또는 이들의 아서열 또는 절편; RPLAFSDSSPLVHYGWGDPIRLRHLYTSGPHGLSSCFLRIRADGVVDCARGQSAHSLLEIKAVALRTVAIKGVHSVRYLCMGADGKMQGLLQYSEEDCAFEEEIRPDGYNVYRSEKHRLPVSLSSAKQRQLYKNRGFLPLSHFLPMLPMVPEEPEDLRGHLESDMFSSPLETDSMDPFGLVTGLEAVRSPSFEK, 또는 이들의 아서열 또는 절편; DSSPLVHYGWGDPIRLRHLYTSGPHGLSSCFLRIRADGVVDCARGQSAHSLLEIKAVALRTVAIKGVHSVRYLCMGADGKMQGLLQYSEEDCAFEEEIRPDGYNVYRSEKHRLPVSLSSAKQRQLYKNRGFLPLSHFLPMLPMVPEEPEDLRGHLESDMFSSPLETDSMDPFGLVTGLEAVRSPSFEK, 또는 이들의 아서열 또는 절편.
N-말단에 하기 중 어느 것의 전부 또는 부분을 포함하거나 그로 구성되는 펩티드 서열을 가진 펩티드 서열의 추가적인 비-제한적인 특정한 예는 다음과 같다:
HPIPDSSPLLQFGGQVRLRHLYTSG (M5); DSSPLLQFGGQVRLRHLYTSG (M6); RPLAFSDSSPLLQFGGQVRLRHLYTSG (M7); HPIPDSSPLLQWGDPIRLRHLYTSG (M8); HPIPDSSPLLQFGWGDPIRLRHLYTSG (M9); HPIPDSSPHVHYGWGDPI RLRHLYTSG (M10); RPLAFSDAGPLLQWGDPIRLRHLYTSG (M11); RPLAFSDAGPLLQFGWGDPIRLRHLYTSG (M12); RPLAFSDAGPLLQFGGQVRLRHLYTSG (M13); HPIPDSSPHVHYGGQVRLRHLYTSG (M14); RPLAFSDAGPHVHWGDPIRLRHLYTSG (M15); RPLAFSDAGPHVHWGDPI RLRHLYTSG (M16); RPLAFSDAGPHVGWGDPI RLRHLYTSG (M17); RPLAFSDAGPHYGWGDPIRLRHLYTSG (M18); RPLAFSDAGPVYGWGDPIRLRHLYTSG (M19); RPLAFSDAGPVHGWGDPI RLRHLYTSG (M20); RPLAFSDAGPVHYWGDPIRLRHLYTSG (M21); RPLAFSDAGPHVHGWGDPIRLRHLYTSG (M22); RPLAFSDAGPHHGWGDPIRLRHLYTSG (M23); RPLAFSDAGPHHYWGDPIRLRHLYTSG (M24); RPLAFSDAGPHVYWGDPIRLRHLYTSG (M25); RPLAFSDSSPLVHWGDPIRLRHLYTSG (M26); RPLAFSDSSPHVHWGDPIRLRHLYTSG (M22); RPLAFSDAGPHVWGDPIRLRHLYTSG (M28); RPLAFSDAGPHVHYWGDPI RLRHLYTSG (M29); RPLAFSDAGPHVHYAWGDPIRLRHLYTSG (M30); RHPIPDSSPLLQFGAQVRLRHLYTSG (M31); RHPIPDSSPLLQFGDQVRLRHLYTSG (M32); RHPIPDSSPLLQFGPQVRLRHLYTSG (M33); RHPIPDSSPLLQFGGAVRLRHLYTSG (M34); RHPIPDSSPLLQFGGEVRLRHLYTSG (M35); RHPIPDSSPLLQFGGNVRLRHLYTSG (M36); RHPIPDSSPLLQFGGQARLRHLYTSG (M37); RHPIPDSSPLLQFGGQI RLRHLYTSG (M38); RHPIPDSSPLLQFGGQTRLRHLYTSG (M39); RHPIPDSSPLLQFGWGQPVRLRHLYTSG (M40); DAGPHVHYGWGDPIRLRHLYTSG (M74); VHYGWGDPIRLRHLYTSG (M75); RLRHLYTSG (M77); RHPIPDSSPLLQFGWGDPIRLRHLYTSG; RHPIPDSSPLLQWGDPIRLRHLYTSG; RPLAFSDAGPLLQFGWGDPI RLRHLYTSG; RHPIPDSSPHVHYGWGDPIRLRHLYTSG; RPLAFSDAGPLLQFGGQVRLRHLYTSG; RHPIPDSSPHVHYGGQVRLRHLYTSG; RPLAFSDAGPHVHYGGDIRLRHLYTSG; RDSSPLLQFGGQVRLRHLYTSG; RPLAFSDSSPLLQFGGQVRLRHLYTSG; RHPIPDSSPLLQFGAQVRLRHLYTSG; RHPIPDSSPLLQFGDQVRLRHLYTSG; RHPIPDSSPLLQFGPQVRLRHLYTSG; RHPIPDSSPLLQFGGAVRLRHLYTSG; RHPIPDSSPLLQFGGEVRLRHLYTSG; RHPIPDSSPLLQFGGNVRLRHLYTSG; RHPIPDSSPLLQFGGQARLRHLYTSG; RHPIPDSSPLLQFGGQIRLRHLYTSG; RHPIPDSSPLLQFGGQTRLRHLYTSG; RHPIPDSSPLLQFGWGQPVRLRHLYTSG; 그리고 앞서 언급한 펩티드 서열 중 어느 것에서는 아미노 말단 R 잔기가 결실될 수 있다.
본 발명의 펩티드 서열은 추가적으로 FGF19 과 비교하여 간세포 암종 (HCC) 의 형성 또는 유도가 감소되거나 사라진 것을 갖는 것 또는 FGF19의 아미노산 16-20의 WGDPI 서열이 GQV, GDI, WGPI, WGDPV, WGDI, GDPI, GPI, WGQPI, WGAPI, AGDPI, WADPI, WGDAI, WGDPA, WDPI, WGDI, WGDP 또는 FGDPI 중 어느 것으로 치환된 것을 갖는 FGF19 변이체 서열을 포함한다. 본 발명의 펩티드 서열은 또한 FGF19와 비교하여 더 큰 당 저감 활성을 가진 것 또는 FGF19의 아미노산 16-20의 WGDPI서열이 GQV, GDI, WGPI, WGDPV, WGDI, GDPI, GPI, WGQPI, WGAPI, AGDPI, WADPI, WGDAI, WGDPA, WDPI, WGDI, WGDP 또는 FGDPI 중 어느 것으로 치환된 것을 갖는 FGF19 변이체 서열을 포함한다. 본 발명의 펩티드 서열은 또한 FGF19와 비교하여 적은 지질(예를 들어, 트리글리세라이드, 콜레스테롤, 비-HDL 또는 HDL) 증가 활성을 가진 것 또는 FGF19의 아미노산 16-20의 WGDPI 서열이 GQV, GDI, WGPI, WGDPV, WGDI, GDPI, GPI, WGQPI, WGAPI, AGDPI, WADPI, WGDAI, WGDPA, WDPI, WGDI, WGDP 또는 FGDPI 중 어느 것으로 치환된 것을 갖는 FGF19 변이체 서열을 포함한다.
일반적으로, 본 발명의 펩티드 서열의 아미노산 또는 잔기(예를 들어, 아미노산 또는 이의 미메틱)의 수는 총 약 250보다 적게 된다. 여러 가지 특정 실시 예에서, 잔기(예를 들어, 아미노산 또는 이의 미메틱)의 수는 약 20 내지 약 200 잔기까지를 포함한다. 추가적인 실시예에서, 잔기(예를 들어, 아미노산 또는 이의 미메틱)의 수는 약 50 내지 약 200 잔기를 포함한다. 또 다른 실시 예에서, 잔기(예를 들어, 아미노산 또는 이의 미메틱)의 수는 약 100 내지 약 195 잔기 길이를 포함한다.
아미노산 또는 잔기는 아미드 결합에 의하여 또는 예를 들어, 글루타르알데히드, N- 하이드록시숙시니미드 에스터(N-hydroxysuccinimide esters), 이관능성 말레이미드(bifunctional maleimides) 또는 N, N'-다이사이클로헥실카보이미드 (DCC)로 형성되는 것을 포함하는 비-자연적 또는 비-아미드화학결합에 의해 연결될 수 있다. 비 아미드 결합은, 예를 들어, 케토메틸렌, 아미노 메틸렌, 올레핀, 에테르, 싸이오에테르 등과 같은 것을 포함한다(예를 들어, Spatola in Chemistry and Biochemistry of Amino Acids, Peptides and Proteins, Vol. 7, pp 267-357 (1983), “Peptide and Backbone Modifications,” Marcel Decker, NY 참조). 따라서, 본 발명의 펩티드는 FGF19 서열의 일부 및 FG21 서열의 일부를 포함할 때, 상기 두 부분은 아미드 결합에 의해 서로 결합될 필요는 없고, 다른 화학적 모이어티에 의해서 결합 또는 링커 모이어티를 통하여 함께 접합될 수 있다.
본 발명은 또한 앞서 언급한 검출가능하거나 측정가능한 활성 또는 기능들이 적어도 유지되는 한, 상기 예시된 펩티드 서열들의 아서열, 변이체, 변형된 형태(표 1-8 및 도 1에 나열된 FGF19 및 FGF21 변이체 및 아서열, 그리고 표 1-8 및 도 1에 나열된 FGF19/FGF21 융합체 및 키메라를 포함)를 포함한다.
예를 들어, 예시된 특정 변이체 펩티드는, C-말단 부위에서, 예를 들어 변이체의 "TSG" 아미노산 잔기 뒤에서 FGF19의 C-말단 서열PHGLSSCFLRIRADGVVDCARGQSAHSLLEIKAVALRTVAIKGVHSVRYLCMGADGKMQGLLQYSEEDCAFEEEIRPDGYNVYRSEKHRLPVSLSSAKQRQLYKNRGFLPLSHFLPMLPMVPEEPEDLRGHLESDMFSSPLETDSMDPFGLVTGLEAVRSPSFEK 을 갖는다.
또한, 예를 들어 아미노-말단에 FGF21서열의 전부 또는 일부를 갖는 특정 예시 변이체 펩티드들은, N-말단 부위에 위치한 "R" 잔기를 가지고, 그것은 생략될 수 있다. 유사하게, 특정 예시된 변이체 펩티드들은, N-말단 부위에 위치한 "M" 잔기를 포함하고, 이는 첨가되거나 또는 예컨대 "R" 잔기와 같은 제거된 잔기를 추가적으로 치환할 수 있다. 보다 구체적으로, 다양한 실시예의 펩티드 서열은 N-말단에서 다음 중 어느 것을 포함한다 : RDSS, DSS, MDSS 또는 MRDSS. 게다가, 세포 내에서 "M" 잔기가 "S" 잔기에 인접한 경우에, " M" 잔기가 펩티드 서열로부터 제거되도록 "M" 잔기는 절단될 수 있고, 반면 "M" 잔기가 "D" 잔기에 인접한 경우, "M" 잔기는 절단되지 않을 수 있다. 그러므로, 예를 들면, 다양한 실시예의 펩티드서열은 N-말단 잔기에서 하기 잔기를 갖는 것들을 포함한다: MDSSPL, MSDSSPL (SDSSPL로 절단) 및 MSSPL (SSPL로 절단).
따라서, 아서열, 변이체 또는 변형된 형태 (예를 들어, 융합체 또는 키메라)가 최소한 검출 가능한 활성 또는 기능을 유지하는 한, 본 발명의 "펩티드", "폴리펩티드" 및 "단백질”서열은 표 1-8 및 도 1에 열거된 FGF19 의 아서열, 변이체 및 변형된 형태 및 FGF21 변이체 및 아서열, 그리고 표 1-8 및 도 1에 열거된 그 FGF19 / FGF21 융합체 및 키메라를 포함한다.
본원에서 사용된, 용어 "변형" 및 이의 문법적 변형은, 조성물이 예컨대 펩티드 서열과 같은 참조 조성물과 관련된 것을 것을 벗어나는 것을 의미한다. 이러한 변형된 펩티드 서열, 핵산 및 다른 조성물들은 변형이 없는 참조 펩티드 서열, 핵산, 또는 다른 조성물들과 비교하여 더 크거나 적은 활성 또는 기능을 가지거나 또는 별개의 기능 또는 활성을 가질 수 있으며, 또는 치료를 위하여 제형화된 단백질에서 검출 분석 용도 및/또는 단백질 정제에 사용하기 위한 항체를 끌어내기 위한 바람직한 능력을 가질 수 있다 (예를 들어, 혈청 반감기). 예를 들어, 본 발명의 펩티드 서열은 혈청 반감기 증가, 단백질의 in vitro 및/또는 in vivo 안정성 증가 등을 위하여 변형될 수 있다.
본원에서 예시된 펩티드 서열(예를 들어, 표 1-8 및 도 1에 열거된 펩티드 서열)의 이러한 아서열, 변이체 및 변형된 형태의 구체적인 예는 아미노말단, 카르복시-말단 또는 내부로 또는 이들로부터 하나 또는 그 이상의 아미노산의 치환, 결실 및/또는 삽입/추가를 포함한다. 하나의 예는 펩티드 서열 내의 아미노산 잔기를 다른 아미노산 잔기로 치환하는 것이다. 또 다른 예는 펩티드 서열로부터 하나 또는 그 이상의 아미노산 잔기의 결실 또는 펩티드 서열로 하나 또는 그 이상의 아미노산 잔기의 삽입 또는 부가이다.
치환된, 결실된 또는 삽입/부가된 잔기의 개수는 펩티드 서열의 하나 또는 그 이상의 아미노산이다 (예를 들어, 1-3, 3-5, 5-10, 10-20, 20-30, 30-40, 40-50, 50-60, 60-70, 70-80, 80-90, 90-100, 100-110, 110-120, 120-130, 130-140, 140-150, 150-160, 160-170, 170-180, 180-190, 190-200, 200-225, 225-250, 또는 그 이상). 그러므로, FGF19 또는 FGF21 서열은 몇 가지 또는 많은 치환, 결실 또는 삽입/추가된 아미노산을 가질 수 있다 (예를 들어, 1-3, 3-5, 5-10, 10-20, 20-30, 30-40, 40 - 50, 50-60, 60-70, 70-80, 80-90, 90-100, 100-110, 110-120, 120-130, 130-140, 140-150, 150-160, 160-170, 170 ~ 180, 180 ~ 190, 190-200, 200-225, 225-250, 또는 그 이상). 게다가, FGF19 아미노산 서열은 FGF21 유래의 약 1-3, 3-5, 5-10, 10-20, 20-30, 30-40, 40-50, 50-60, 60-70, 70-80, 80-90, 90-100, 100-110, 110-120, 120-130, 130-140, 140-150, 150-160, 160-170, 170-180, 180-190, 190-200, 200-225, 225-250 또는 그 이상 아미노산의 아미노산 서열을 포함하거나 그로 구성될 수 있다; 또는 FGF21 아미노산 또는 서열은 FGF19 유래의 약 1-3, 3-5, 5-10, 10-20, 20-30, 30-40, 40-50, 50-60, 60-70, 70-80, 80-90, 90-100, 100-110, 110-120, 120-130, 130-140, 140-150, 150-160, 160-170, 170-180, 180-190, 190-200, 200-225, 225-250 또는 그 이상 아미노산의 아미노산 서열을 포함하거나 그로 구성될 수 있다.
치환의 구체적인 예시는 L-잔기를 D 잔기로 치환하는 것을 포함한다. 따라서 비록 본 발명의 펩티드 서열이 L-이성질체 배열로 기재되었을지라도, 임의의 특정 부위 또는 전체 부위에서 D-이성질체가 검출가능하거나 측정가능한 기능을 갖는 서열을 이끌지 않는 한 D-아미노산이 포함된다.
추가적인 구체적인 예시는 비-보존적 및 보존적 치환이다. "보존적 치환”은 생물학적, 화학적 또는 구조적으로 유사한 잔기를 이용한 하나의 아미노산의 대체이다. 생물학적 유사성은 예를 들어, 당 저감 활성과 같은 생물학적 활성과 양립가능한 치환을 의미한다. 구조적 유사성은 아미노산이 예컨대 알라닌, 글라이신 및 세린과 같이 유사한 길이의 측쇄를 갖거나, 또는 유사한 크기를 갖거나 또는 1차 2차 또는 추가적인 펩티드 서열의 구조가 유지되는 것을 의미한다. 화학적 유사성은 잔기가 같은 전하를 갖거나 또는 그들이 모두 친수성 또는 소수성인 것을 의미한다. 특정한 예는 예컨대 이소류신, 발린, 류신 또는 메티오닌과 같은 하나의 소수성 잔기를 다른 것으로 치환하는 것, 또는 예컨대 아르기닌을 리신으로, 글루탐산을 아스파르트산으로 또는 글루타민을 아스파라긴으로, 세린을 트레오닌 등으로 치환하는 것과 같이 하나의 극성 잔기를 다른 것으로 치환하는 것을 포함한다. 아서열, 변이체 또는 변형된 형태가 활성, 예를 들어, 당 저감 활성을 갖는지 여부를 확인하는 데 통상적인 분석을 사용할 수 있다.
본원에서 예시된 펩티드 서열(예를 들어, 표 1-8 및 도 1에 열거된 펩티드 서열)의 아서열, 변이체 및 변형된 형태의 특정한 예는 참조 펩티드 서열(예를 들어, 표 1-8 및 도 1에 열거된 펩티드 서열 중 어느 펩티드 서열)과 50%-60%, 60%-70%, 70%-75%, 75%-80%, 80%-85%, 85%-90%, 90%-95%, 또는 96%, 97%, 98%, 또는 99% 의 동일성을 갖는다. 용어 "동일성" 및 " 상동성" 및 이들의 문법적 변형들은 두개 또는 그 이상의 기준 독립체가 동일한 것을 의미한다. 그러므로, 두개의 아미노산 서열이 동일하다면, 그들은 동일한 아미노산 서열을 갖는다. "부위, 영역 또는 도메인의 동일"은 두 개 또는 그 이상의 기준 독립체의 일부분이 동일한 것을 의미한다. 따라서, 두 개의 아미노산 서열이 하나 또는 그 이상의 서열 영역에 걸쳐 동일하거나 상동이라면, 그들은 이들 영역에서 동일성을 공유한다.
두 서열간의 동일성의 정도는 당해 분야에 공지된 컴퓨터 프로그램 및 수학적 알고리즘을 사용하여 확인 될 수 있다. 서열동일성 (상동성)의 비율을 계산하는 그러한 알고리즘은 일반적으로 비교 영역에 걸친 서열 갭 및 미스매치를 설명한다. 예를 들어, BLAST (예를 들어, BLAST 2.0) 검색 알고리즘 (예를 들어, NCBI를 통해 공중이 이용가능한, Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403 (1990) 참조) 은 다음과 같은 예시적인 검색 파라미터를 갖는다: 미스매치- 2; 갭 오픈 5; 갭 확장 2. 펩티드 서열 비교를 위하여, BLASTP 알고리즘은 일반적으로 예컨대 PAM100, PAM 250, BLOSUM 62 또는 BLOSUM 50 과 같은 스코어링 매트릭스와 조합하여 사용된다. FASTA (예를 들어, FASTA2 및 FASTA3) 및 SSEARCH 의 서열 비교 프로그램은 또한 동일성의 정도를 정량하는데 사용된다(Pearson 등., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444 (1988); Pearson, Methods Mol Biol. 132:185 (2000); 그리고 Smith 등., J. Mol. Biol. 147:195 (1981)). 델 로니 기반의 위상학적 맵핑(Delaunay-based topological mapping)을 이용한 단백질의 구조적 유사성 정량화용 프로그램이 또한 개발되었다(Bostick 등, Biochem Biophys Res Commun. 304:320 (2003)).
본원에서 예시된 펩티드 서열의 아서열, 변이체 및 변형된 형태를 포함하는 본 발명의 펩티드 서열(예를 들어, 표 1-8 과 도 1에 기재된 서열) 에서, "아미노산" 또는 "잔기"는 β- 아미노산 , α, α- 이치환아미노산 및 N-치환 아미노산 뿐만 아니라 종래의 α- 아미노산도 포함하고, 상기에서 적어도 하나의 측쇄는 본원에서 정의된 바와 같이 아미노산 측쇄 모이어티이다. "아미노산”은 또한 N-알킬 α- 아미노산을 포함하며, 여기에서 상기 N-말단 아미노 군은 C1 내지 C6 의 선형 또는 분지된 알킬치환체를 갖는다. 상기 용어 "아마노산"은 그러므로 입체이성질체 및 자연 발생적 단백질 아미노산의 변형, 비-단백질 아미노산, 번역 후 변형된 아미노산(예를 들어, 글리코실화, 인산화, 에스테르 또는 아미드 절단 등에 의해), 효소적으로 변형 또는 합성된 아미노산, 아미노산 유도체, 아미노산을 모방하도록 설계된 구성 또는 구조, 측쇄 모이어티 변형을 가진 아미노산, 자연 발생적 모이어티 유래 유도체, 또는 합성 또는 자연 발생적이 아닌 것 등을 포함한다. 변형된 및 일반적이지 않은 아미노산은 본 발명의 펩티드 서열에 포함된다(예를 들어, in Synthetic Peptides: A User's Guide; Hruby 등, Biochem. J. 268:249 (1990); 및 Toniolo C., Int. J. Peptide Protein Res. 35:287 (1990) 참조).
또한, 아미노산의 보호 및 변형기가 포함된다. 상기 용어“아미노산”이 본원에서 정의된 바와 같이, 본원에서 사용되는 용어 "아미노산 측쇄 모이어티"는 임의 아미노산의 임의의 측쇄를 포함한다. 따라서 이것은 자연적으로 발생하는 아미노산의 측쇄 모이어티를 포함한다. 이 것은 또한 예컨대 입체이성질체 및 자연적으로 발생한 단백질 아미노산의 변형, 비- 단백질 아미노산, 번역후 변형 아미노산, 효소적으로 변형된 또는 합성된 아미노산, 아미노산 유도체, 아미노산을 모방하도록 설계된 구성 또는 구조 등과 같이 본원에서 개시되고 당 분야 속하는 통상의 기술자에게 알려진 것과 같은 변형된 자연 발생적 아미노산 내의 측쇄 모이어티를 포함한다. 예를 들어, 본원에 개시된 또는 당업자에게 공지된 임의의 아미노산의 측쇄 모이어티는 정의 내에 포함된다.
"아미노산 측쇄 모이어티의 유도체 "는 아미노산 측쇄 모이어티의 정의에 포함된다. 유도된 아미노산 측쇄 모이어티의 비 제한적인 예는, 예를 들어 다음을 포함한다: (a)기존의 알킬, 아릴 또는 아르 알킬 쇄에 하나 또는 그 이상의 포화 또는 불포화 탄소 원자의 첨가; (b) 측쇄 탄소를 다른 원자, 바람직하게는 산소 또는 질소로 치환; (c) 측쇄의 탄소원자에 메틸 (--CH3), 메톡시(--OCH3), 니트로 (--NO2), 하이드록실(--OH), 또는 시아노(--C = N)를 포함하는 말단기 첨가; (d) 하이드록시, 싸이올 또는 아미노기를 포함하는 측쇄 모이어티에, 적합한 하이드록시, 싸이올 또는 아미노 보호기를 추가; 또는 (e) 고리 구조를 포함하는 측쇄 모이어티에 대하여, 직접 또는 에테르 결합을 통해 부착된 하이드록실, 할로겐, 알킬 또는 아릴 그룹을 포함하는 하나 또는 그 이상의 고리 치환체를 추가. 아미노기에 있어서, 적합한 보호기는 당업자에게 공지되어 있다. 제공된 그러한 유도체는 최종 펩티드 서열에 원하는 활성을 제공한다(예를 들어, 당 저감, 당 또는 지질대사의 개선, 항 당뇨 활성, 상당한 HCC 형성 또는 종양생성의 결핍, 제지방 (Lean) 또는 지방 질량의 상당한 변조 결핍 등).
"아미노산 측쇄 부분"은 그러한 모든 유도체를 포함하고, 특정의 비 제한적인 예는 다음을 포함한다 : γ-아미노 부티르산, 12 - 아미노 도데칸산, α-아미노 이소부티르산, 6 - 아미노 헥산산, 4 - (아미노메틸) - 시클로헥산 카르복실산, 8 - 아미노 옥탄산, 바이페닐알라닌, BOC - t-뷰톡시 카르보닐, 벤질, 벤조일, 시트룰린, 다이아미노부티르산, 피롤라이신, 다이아미노프로판산, 3,3 - 다이페닐알라닌, 오르토닌, 시트룰린, 1,3 - 다이하이드로-2H-아이소인돌카르복시산, 에틸, Fmoc-플루오르닐메톡시카보닐 (Fmoc-luorenylmethoxycarbonyl), 헵타오닐(CH3--(CH2).sub.--5C(=O)--), 헥사노일 (CH3--(CH2)4--C(=O)--), 호모 아르기닌, 호모시스테인, 호모라이신, 호모페닐알라닌, 호모세린, 메틸, 메티오닌 설폭 사이드, 메티오닌 술폰, 노르발린 (NVA), 페닐글라이신, 프로필, 이소프로필, 사르코신 (SAR), tert-부틸 알라닌, 및 벤질옥시카보닐.
입체이성질체 및 자연적으로 발생하는 단백질 아미노산의 변형체, 비-단백질 아미노산, 번역 후 변형된 아미노산, 효소적으로 합성된 아미노산, 아미노산 유도체를 포함하는 비-자연적으로 발생한 아미노산, 상기의 임의의 것으로부터 유도된 아미노산, α, α 이치환 아미노산 (즉, 적어도 하나의 측쇄가 유도되는 잔기와 동일한 것을 특징으로 하는 α, α 이치환 아미노산), 상기의 임의의 것으로부터 유도된 β- 아미노산 (즉, β- 탄소의 존재 이외의 β- 아미노산은 유도된 잔기와 동일하지 않다)등을 포함하고, 앞서 언급한 모든 것을 포함하는 단일 아미노산은 "잔기" 로 본원에서 지칭 될 수 있다. α-아미노산의 측쇄 모이어티에 더하여, 적절한 치환체는 C1 내지 C6의 선형 또는 분지형 알킬을 포함한다. Aib는 α, α 이치환된 아미노산의 예이다. α, α 이치환 아미노산은 종래의 L- 및 D- 이성질체의 참조를 사용하여 지칭될 수 있는 반면, 이러한 참조는 편의를 위한 것으로 이해되어야 하고, 그 α- 위치 치환체가 다른 경우, 이런 아미노산은, 적절하게는, 지정된 아미노산 측쇄 모이어티를 갖는 잔기의 L-또는 D-이성질체 유래의 α, α 이치환 아미노산으로서 상호 교환적으로 언급될 수 있는 것으로 이해될 수 있다. 따라서 (S)-2-아미노-2-메틸-헥산산은 L-Nle(노르 류신)에서 유래된 α, α 이치환 아미노산 또는 D-Ala에서 유래된 α, α 이치환 아미노산으로 지칭될 수 있다. 마찬가지로, Aib 는 Ala에서 유래된 α, α 이치환 아미노산으로 지칭될 수 있다. α, α 이치환 아미노산이 제공될 때마다 그것은 이들의 (R) 및 (S)의 배위를 모두 포함하는것으로 이해된다.
"N-치환된 아미노산"은 아미노산 잔기 쇄 모이어티가 아미노기의 골격에 공유결합된 임의의 아미노산을 포함하고, 선택적으로 그들은 α-탄소 위치 내 H 외는 다른 치환기가 없다. 사르코진은 N-치환 아미노산의 예이다. 예로서, 사르코진은 사르코진 및 Ala의 그 아미노산 측쇄 모이어티가 같다는 점, 즉 메틸이라는 점에서 Ala의 N-치환 아미노산 유도체로 지칭될 수 있다.
본원에서 예시된 펩티드 서열의 아서열, 변이체 및 변형된 형태 (예를 들어, 표 1-8 와 도 1에 기재된 서열)를 포함하는 본 발명 펩티드 서열의 공유결합 변형들이 본 발명에 포함된다. 공유결합 변형의 한 유형은 펩티드의 선택된 측쇄 또는 N- 또는 C -말단 잔기와 반응할 수 있는 유기 유도제와 표적 아미노산 잔기의 반응을 포함한다. 예를 들어, 두 가지 기능을 가진 유도제는 항- 펩티드 항체의 정제를 위한 방법에 사용하기 위하여 불수용성 지지 매트릭스 또는 표면에 대한 가교 펩티드로 유용하고 그 반대의 경우도 마찬가지다. 예를 들어, 1,1-비스(다이아조아세틸)-2-페닐에탄, 글루타르 알데히드, N-하이드록시 숙신 에스테르와 같이 일반적으로 사용되는 가교제는, 예를 들어, 3,3'-dithiobis(succinimidylpropionate)와 같은 디숙신이미딜 에스테르(disuccinimidyl esters), 비스-N 말레이미도-1,8옥탄과 같은 이기능성 말레이미드 그리고 메틸-3-[(p-아지도페닐)다이티오]프로피오이미데이트와 같은 제를 포함하는 4 - 아지도살리실산(azidosalicylic acid), 호모이기능성 이미도에스테르를 가진 에스테르를 포함한다.
다른 변형은 각각 글루타밀 및 아스파라기닐에 상응하는 글루타미닐 및 아스파라지닐 잔기의 탈아미드화, 프롤린 및 라이신의 하이드록실화, 세릴 또는 트레오닐 잔기의 하이드록실기의 인산화, 라이신, 아르기닌 및 히스티딘 측쇄의 α-아미노기의 메틸화 (T. E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman & Co., San Francisco, pp. 79-86 (1983)), N-말단 아민의 아세틸화, 임의의 C-말단 카르복실기의 아미드화 등을 포함한다.
예시 펩티드 서열, 및 본원의 예시된 펩티드 서열의 아서열, 변이체 및 변형된 형태 (예를 들어, 표 1-8과 도 1에 열거된 서열)는 안정성을 위한 골격의 변화, 유도체, 및 펩티도미메틱을 또한 포함할 수있다. 용어 "펩티도미메틱(peptidomimetic)"은 이에 제한되는 것은 아니나, 피페라진 핵 분자, 케토-피페라진 핵 분자 및 다아제핀 핵분자를 포함하는 잔기 모방("미메틱"으로 언급)인 분자를 포함한다. 달리 명시되지 않는 한, 본 발명의 펩티드 서열의 아미노산 미메틱은 카르복실기와 아미노기 및 아미노산기, 그리고 아미노산 측쇄 또는 글라이신, 수소 이외에 측쇄가 없는 미메틱의 경우에 상응하는 기 모두를 포함한다.
예를 들어, 이들은 자연적으로 발생한 아미노산의 입체, 표면전하분포, 극성 등을 모방한 화합물을 포함할 것이나, 생물학적 시스템의 안정성을 부여할 아미노산일 필요는 없다. 예를 들어, 프롤린은 다른 적당한 크기의 락탐 또는 락톤 및 치환기로 치환 될 수 있고 치환; 류신은 알킬, 알케닐 또는 다른 치환기를 사용한 아미노산 측쇄 길이의 변화뿐만 아니라 알킬 케톤, N- 치환 아마이드에 의해 치환 될 수 있고, 다른 것들은 당업자에게 명백할 것이다. 그러한 치환을 만드는 중요한 요소는 분자를 설계하는데 사용되는 잔기로 대략 동일한 크기 및 전하 및 배위의 분자를 제공하는 것이다. 이러한 변형의 개선은 기능적(예를 들어, 당 저감) 또는 다른 분석법 내 화합물의 분석, 및 구조 활성 관계 의 비교에 의해서 만들어 질 것이다. 이러한 방법은 의약 화학 및 의약품 개발에서 일하는 당업자의 작업 범위 내에 있다.
예시된 펩티드 서열의 아서열, 서열 변이체 및 변형된 형태 (표 1-8 및 도 1에 열거된 펩티드 포함)을 포함하는 본 발명의 펩티드 서열의 또 다른 유형의 변형은 글리코실화이다. 여기에 사용된 "글리코실화"는 광범위하게 단백질, 지질 또는 다른 유기분자에 하나 또는 그 이상의 당 (예를 들어, 탄수화물) 모이어티의 존재, 첨가 또는 부착을 말한다. 본원에서 용어 "탈글리코실화"의 사용은 일반적으로 하나 또는 그 이상의 당 (예를 들어, 탄수화물) 모이어티의 제거 또는 결실을 의미하는 것으로 의도된다. 게다가 상기 구는 존재하는 다양한 당(예를 들어, 탄수화물) 모이어티 유형 및 비율 (양)의 변화에 관여하는 천연 단백질의 글리코실화에서의 질적 변화를 포함한다.
글리코실화는 아미노산 잔기의 변형에 의해, 또는 천연서열에 존재하거나 하지 않을 수 있는 하나 또는 그 이상의 글리코실화 부위를 추가함으로써 달성될 수 있다. 예를 들어, 일반적으로 비-당화된 잔기는 당화될 수 있는 잔기로 치환될 수 있다. 당화부위의 첨가는 아미노산 서열을 변화시킴으로써 달성될 수 있다. 예를 들어, 펩티드 서열변화는 하나 또는 그 이상의 세린 또는 트레오닌 잔기(O-결합 당화부위의 경우) 또는 아스파라긴 잔기 (N-결합 당화 부위의 경우)의 첨가 또는 치환에 의해 만들어질 수 있다. N- 연결된 및 O- 연결된 올리고당, 당 잔기의 구조는 각각의 유형에서 다르게 발견된다. 일반적으로 모두에서 발견되는 당 유형의 하나는 N- 아세틸 뉴라민산(N-acetylneuraminic acid) 이다 (이하, 시알산(sialic acid) 으로 칭함). 시알산은 일반적으로 N- 연결 및 O- 연결된 올리고당 모두의 말단 잔기이고, 그 음전하 덕분에 당 단백질에 산성 특성을 부여 할 수 있을 것이다.
본 발명의 펩티드 서열은 특히 원하는 아미노산으로 번역될 코돈이 생성되도록 미리 선택된 염기에서 펩티드를 암호화하는 DNA 를 돌연변이시키는 것에 의해 선택적으로 뉴클레오티드 (예, DNA) 수준의 변화를 통해 변경될 수 있다. 펩티드 상에서 탄수화물 모이어티 수를 증가시키는 다른 수단은 화학적 또는 효소적으로 폴리펩티드에 글리코시드를 커플링시키는 것이다(참조, 예를 들어, WO 87/05330 내). 탈-당화는 내부 당화 위치 제거, 화학적 및/또는 효소적 수단에 의한 당화 결실, 또는 당화되는 아미노산 잔기를 암호화하는 코돈의 치환에 의해 달성될 수있다. 화학적 탈당화 기술은 공지되어 있으며, 폴리펩티드상의 탄수화물 모이어티의 효소적 절단은 다양한 엔도 - 및 엑소 - 글리코시다아제의 사용에 의해 달성될 수 있다.
다양한 세포주가 당화된 단백질을 생산하는 데 사용될 수있다. 하나의 비 제한적인 예는 다이히드로 엽산환원효소(Dihydrofolate reductase)(DHFR)- 결핍 중국 햄스터 난소 (CHO) 세포로, 이는 일반적으로 재조합 당 단백질을 생산하기 위해 숙주세포로 사용된다. 이들 세포들은 β- 갈락토시다아제 α-2,6-시아릴전달효소를 발현하지 않으며, 따라서 이들 세포에서 생산되는 당단백의 N-결합 올리고당으로 α-2,6 결합 내에 시알산이 추가되지 않는다.
변형의 다른 유형은 본 발명의 펩티드 서열의 N- 및/또는 C-말단에 하나 또는 그 이상의 부가 성분 또는 분자, 예컨대 다른 단백질(예를 들어, 목적 단백질에 이종성인 아미노산 서열을 갖는 단백질) 또는 전달 분자를 접합(예를 들어, 결합) 시키는 것이다. 따라서 예시적 펩티드 서열은 다른 성분 또는 분자와 접합될 수 있다.
특정 실시예에서, 본 발명의 펩티드 서열의 아미노- 또는 카르복시- 말단은 융합 접합체 (또는 융합 분자) 를 형성하기 위하여 면역글로불린 Fc 영역 (예를 들어, 사람 Fc) 과 융합될 수 있다. Fc 융합 접합체는 생물약제의 전신성 반감기를 증가시킬 수 있고, 따라서 상기 생물 약제는 지속된 활성을 갖거나 적은 투여 빈도를 가질 수 있다. Fc는 혈관 주(line) 인 내피 세포 내의 신생아 Fc 수용체(FcRn)에 결합하고, 결합 시 Fc 융합 분자는 순환 내에서 더 오래 유지되고, 분해로부터 보호되며, 순환으로 재-방출된다. 이 Fc 결합은 내생적 IgG 가 이 것의 긴 혈장 반감기를 유지하는 메커니즘이 될 것으로 생각된다. 잘 알려진 검증된 Fc 융합 약물은 약동학, 용해도 및 생산 효율을 증진시키기 위해 항체의 Fc 부위에 연결된 생물 약제의 두 복사본으로 구성된다. 더 최근의 Fc 융합 기술은 전통적인 Fc 융합 접합체와 비교하여 생물 약제의 약동학 및 약역학적 특성을 최적화하기 위하여 항체의 Fc 영역에 생물 약제의 단일 복사본을 연결한다.
접합 변형은 두번째 분자의 추가 또는 보완 기능 또는 활성과 함께 활성을 유지하는 펩티드 서열을 생성하기 위해 사용될 수있다. 예를 들어, 펩티드 서열은 분자, 예를 들어 in vivo 에서 용해도, 저장성, 유통 반감기 또는 안정성, 면역원성의 감소, in vivo 에서 지연된 또는 조절된 방출 등을 용이하게 하기 위하여 분자에 접합 될 수있다. 다른 기능 또는 활성은 비 접합된 펩티드 서열에 관한 독성을 감소시키는 접합체, 비접합된 펩티드 서열보다 더 효율적으로 세포 또는 기관을 표적화하는 접합체, 또는 본원에 개시된 장애 또는 질병(예를 들어, 당뇨)과 관련된 원인 또는 효과에 추가 대응하기 위한 약물을 포함한다.
단백질 치료제의 임상 효과는 짧은 혈장 반감기 및 분해에 대한 감수성에 의해 제한될 수 있다. 다양한 치료 단백질의 연구 결과는 임의의 다양한 비 단백질성 중합체, 예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 폴리프로필렌 글리콜, 또는 폴리옥실알킬렌(예를 들어, 전형적으로 단백질과 비 단백질성 중합체 (예를 들어 PEG) 모두에 공유적으로 결합된 연결 모이어티를 통해, 참조)에 펩티드 서열을 접합 또는 연결한 것을 포함하는 다양한 변형이 반감기를 연장할 수 있다는 것을 보여준다. 이러한 PEG-접합 생체 분자는 더 나은 물질적 및 열적 안정성, 효소적 분해에 대한 감수성으로부터의 보호, 증가된 용해도, 증가된 in vivo 순환 반감기 및 감소된 제저율, 감소된 면역원성 및 항원성 및 감소된 독성을 포함하는 임상적으로 유용한 특징을 가지고 있다는 것을 보여준다.
본 발명의 펩티드 서열에 접합하기에 적합한 PEG는 일반적으로 실온에서 물에 수용성이며, 일반 식 R(O-CH2-CH2)nO-R을 가지고, 여기서 R은 수소 또는 예컨대 알킬 또는 알칸올기(alkanol group) 같은 보호기이며, 여기서 n은 1 내지 1000의 정수이다. R이 보호기인 경우, 일반적으로 1 ~ 8 개의 탄소를 갖는다. 펩티드 서열에 접합된 PEG는 선형 또는 분지형 일 수있다. 분지형 PEG 유도체, "star-PEGs" 및 다수의 팔을 가진 PEG가 본 발명에 포함된다. 본 발명에 사용되는 PEG의 분자량은 임의의 특정한 범위로 제한되지 않으나, 어떤 실시예는 500내지 20,000 사이의 분자량을 가지고, 반면 다른 실시예는 4000 내지 10000 사이의 분자량을 가진다.
본 발명은 접합체의 조성물을 포함하고, 여기에서 PEG들은 다른 “n”값을 가지며, 따라서 다양한 다른 PEG들이 특정 비율로 존재한다. 예를 들어, 일부 조성물은 n = 1, 2, 3, 4의 접합체의 혼합물을 포함한다. 일부 조성물에서, 상기 접합체의 비율은 n = 1 인 경우 18-25%, n = 2 인 경우 접합체의 비율은 50-66%, n = 3 인 경우 접합체의 비율은 12-16% 그리고 n = 4 인 경우 접합체의 비율은 5 %까지이다. 이러한 조성물은 당해 분야에서 알려진 반응 조건과 정제 방법에 의해 생산될 수 있다.
PEG는 본 발명의 펩티드 서열에 직접 또는 간접적으로 (예를 들어, 중간체를 통해) 결합할 수 있다. 예를 들어, 일 실시 예에서, PEG는 말단 반응기("스페이서")를 통해 결합한다. 상기 스페이서는 예를 들어, 하나 또는 그 이상의 펩티드 서열의 자유 아미노 또는 카르복시기 및 폴리에틸렌 글리콜 사이의 결합을 매개하는 말단 반응기이다. 자유아미노기에 결합할 수 있는 스페이서를 갖는 PEG는 N-하이드록시 숙시닐이미드와 폴리에틸렌 글리콜의 숙신산 에스터 활성화에 의해 제조될 수 있는 N-하이드록시숙시닐이미드 폴리에틸렌 글리콜을 포함한다. 자유 아미노기에 결합될 수 있는 다른 활성화된 폴리에틸렌 글리콜은 시아누르산 염화물과 폴리에틸렌 글리콜 모노메틸 에테르의 반응에 의해 제조될 수 있는 2,4-bis(O-메톡시폴리에틸렌글리콜)-6-클로로-s-트리아진이다. 자유 카복실기에 결합된 활성화된 폴리에틸렌 글리콜은 폴리옥시에틸렌다이아민(polyoxyethylenediamine)을 포함한다.
스페이서를 갖는 PEG와 하나 또는 그 이상의 발명 펩티드 서열의 접합은 다양한 통상적인 방법으로 수행될 수 있다. 예를 들어, 접합 반응은 4:1 부터 30:1 의 단백질 시약의 몰비를 이용하여 30분 내지 20 시간 동안 4 ℃ 내지 실온의 온도, pH 5 내지 10인 용액에서 수행될 수 있다. 반응 조건은 대부분 원하는 정도의 치환을 생산하는 반응쪽으로 직접 선택할 수있다. 일반적으로, 낮은 온도, 낮은 pH (예, pH= 5), 및 짧은 반응 시간은 부착된 PEG의 수를 감소시키는 경향이 있는 반면, 높은 온도, 중성 내지 높은 pH (예, pH ≥ 7), 및 긴 반응 시간은 부착된 PEG 수를 늘릴 수 있다. 당업계에 공지된 다양한 방법이 반응을 종결하기 위해 사용될 수있다. 일부 실시예에서, 반응은 반응 혼합물의 산성화 및 예를 들어 -20℃에서의 냉동화에 의해서 종료된다.
예시된 펩티드 서열의 아서열, 서열변이체 및 변형된 형태(표 1-8 및 도 1에 열거된 펩티드 포함)를 포함하는 본발명의 펩티드 서열은 추가적으로 단백질과 같이 크고, 서서히 대사되는 거대 분자; 다당류, 예컨대 세파로오스, 아가로오스, 셀룰로오스, 셀룰로오스 구슬과 같은; 아미노산 중합체, 예컨대 폴리글루타민산, 폴리라이신과 같은; 아미노산 공중합체; 불활성화된 바이러스 입자; 불활성화된 박테리아 독소, 예컨대 디프테리아, 파상풍, 콜레라, 류코톡신 분자; 불활성화된 박테리아; 및 수지상세포에 대한 접합을 포함한다. 원하는 경우, 이러한 접합된 형태는 본 발명의 펩티드 서열에 대한 항체를 생산하는데 사용될 수있다,
접합을 위한 추가의 적합한 성분 및 분자는 예를 들어, 티로글로불린; 예컨대 인간 혈청 알부민 (HSA)과 같은 알부민; 파상풍 변이체독소; 디프테리아 변이체독소; 예컨대 폴리(D-라이신:D-글루탐산)과 같은 폴리아미노산; 로타바이러스의 VP6 폴리펩티드; 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌, 인플루엔자 바이러스 핵 단백질; 열쇠구멍 삿갓조개 헤모시 아닌 (Keyhole Limpet Hemocyanin ; KLH); 및 B 형 간염 바이러스 코어 단백질과 표면 항원; 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다.
본 발명의 펩티드 서열과 알부민의 융합은 예를 들어, 유전자 조작에 의해 달성될 수 있으므로, HSA (인간 혈청 알부민)을 암호화하는 DNA, 또는 이의 단편은 펩티드 서열을 암호화하는 DNA에 연결된다. 그 후, 적당한 숙주는 융합 폴리펩티드를 발현하기 위하여 예를 들어, 적합한 플라스미드 형태의 융합된 뉴클레오티드 서열로 형질 전환 또는 형질 감염될 수 있다. 발현은, in vitro 유래 예를 들어, 원핵 또는 진핵 세포, in vivo 유래, 예를 들어 형질전환체의 유기체 내에서 수행할 수 있다. 본 발명의 일부 실시 예에서, 융합 단백질의 발현은, 포유 동물 세포주 예를 들어, CHO 세포주에서 수행된다.
알부민에 표적단백질 또는 펩티드를 유전적으로 융합하기 위한 또 다른 수단은 Albufuse ®(Novozymes Biopharma A/S; Denmark)로 알려진 기술을 포함하고, 상기 접합된 치료펩티드 서열은 흔히 체내에서의 더 나은 흡수를 가지고 더욱 효과적이다. 상기 기술은 Albuferon® (Human Genome Sciences)을 상업적으로 생산하기 위하여 활용되고 있으며, 알부민 및 인터페론 α-2B의 조합은 C 형 간염 감염을 치료하는 데 사용된다.
또 다른 실시 예는 하나 또는 그 이상의 인간 도메인 항체 (dAb)의 사용을 수반한다. dAbs 는 인간항체 (IgG)의 최소 기능 연결단위이고 유리한 안정성과 용해도 특성을 갖는다. 상기 기술은 HAS 접합된 dAb(들)(그에 의하여 "AlbudAb"를 형성, 예를들면, EP1517921B, WO2005/118642 및 WO2006/051288 참조) 및 목적 분자 (예를 들어, 본 발명의 펩티드 서열)를 포함한다. AlbudAbs는 펩티드의 혈청반감기 증가에 사용되는 현재의 기술보다 미생물 발현계 내, 예컨대 박테리아 또는 효모 내에서의 제조가 종종 더 작고 더 쉽다. HSA는 약 3주의 반감기를 가지고, 얻어진 접합된 분자는 반감기를 향상시킨다. dAb 기술의 사용은 또한 목적 분자의 효능을 향상시킬 수 있다.
접합에 대하여 추가적인 적합한 구성요소와 분자는 그들의 분리 또는 정제에 적합한 것들을 포함한다. 특정한 비 제한적인 예는 결합 분자들, 예컨대, 비오틴 (비오틴 - 아비딘 특정 결합 쌍), 항체, 수용체, 리간드, 렉틴, 또는 예를 들어, 플라스틱 또는 폴리스티렌 비즈, 플레이트 또는 비즈, 자석 비즈, 테스트 스트립, 세포막을 포함하는 고체지지를 포함하는 분자를 포함한다.
양이온 교환 크로마토 그래피와 같은 정제 방법은 그들의 다양한 분자량으로 효과적으로 접합체를 나누는, 전하 차이에 의한 접합체의 분리에 사용될 수 있다. 예를 들어, 양이온 교환 칼럼이 로드될 수 있고, 그 후 pH ~ 4, ~ 20 mM인 아세트산 나트륨으로 세척되고, 그 후 pH 3~5.5, 바람직하게는 ~4.5 에서 완충된 NaCl 선형 농도 구배(0M~0.5M)를 이용하여 용출될 수 있다. 양이온 교환 크로마토그래피에 의해 얻어진 분획의 함량은 통상적인 방법, 예를 들면, 질량분석기, SDS-PAGE, 또는 분자량에 의해 분자 집단을 분리하는 다른 공지의 방법을 사용하여 분자량에 의해 동정될 수 있다. 분획은 그 후 원하는 수의 PEG가 부착된 것을 갖는 접합체를 함유하는 것에 맞춰 확인되고, 비변형된 단백질 서열과 다른 수의 PEG 들이 부착된 것을 갖는 접합체로부터 정제된다.
계속 다른 실시예에서, 발명의 펩티드 서열은 이에 제한되지 않으나 택솔, 사이토칼라신 B, 그라미시딘 D, 미토마이신, 에토포시드, 테노포시드, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 콜히친, 독소루비신, 다우노루비신 및 이들의 유사체 또는 상동체를 포함하는 세포독성제, 화학제(예를 들어, 면역독소 또는 화학치료제)와 연결된다. 다른 화학제는, 예를 들어, 항대사제(예를 들어, 메토트랙세이트, 6-머캅토푸린, 6-티오구아닌, 시타라빈, 5-플루오우라실 데카바진(5-fluorouracil decarbazine); 알킬화제 (예를 들어, 메클로레타민, 카무스틴(carmustine) 및 로무스틴(lomustine), cyclothosphamide, 부설판, 디브로모만니톨, 스트렙토조토신, 미토마이신 C 및 시스플라틴); 항생제(예를 들어, 블레오마이신); 및 항-세포분열제 (예를 들어,빈크리스틴 및 빈블라스틴) 을 포함한다. 세포독소는 본 발명의 펩티드와 당 분야에 알려지고 본원에 기술된 링커를 이용하여 접합될 수 있다.
또한 컨쥬게이션에 적합한 구성요소와 분자는 분석에서 검출에 적합한 것들을 포함한다. 특정한 비 제한적인 예는 방사성 동위원소 (예를 들어, 125I; 35S, 32P; 33P )와 같은 검출가능한 라벨, 검출가능한 산물 생성 효소 (예를 들어, 루시퍼라아제, β-갈락토시다아제, 홀스 라디시 퍼록시다아제 및 알칼라인 포스파타아제), 형광 단백질, 발색 단백질, 염료(예를 들어, 형광 아이쏘사이오사아네이트); 형광 방출 금속(예,152Eu); 화학발광화합물 (예를 들어, 루미놀 및 아크리디눔 염);생물발광화합물(예를 들어, 루시페린); 및 형광 단백질을 포함한다. 간접적인 라벨은 펩티드 서열에 부착된 표지된 또는 검출가능한 항체를 포함하고 여기에서 항체가 검출될 수 있다.
특정 실시예에서, 본 발명의 펩티드 서열은 진단 또는 치료제로서 유용한 세포 독성 방사성 의약품 (방사성 면역접합(radioimmunoconjugates))을 생성하는 방사성 동위 원소에 접합된다. 이러한 방사성 동위 원소의 예로는 요오드 13 인듐11 ', 이트륨 90 및 루테늄177 을 포함하며, 이에 한정되지는 않는다. 방사성 면역접합의 제조 방법은 당업계에 공지되어 있다. 상용인 방사성 면역접합의 예는 이브리투모맙, 튜세탄, 토시투모맙(tositumomab)을 포함한다.
본 발명의 펩티드 서열의 순환 반감기 연장, 안정성의 증가 및 클리어런스 감소, 또는 면역원성이나 알레르기 유발원을 변형시키기 위하여 본 발명에 포함되는 다른 수단 및 방법은 hesylation에 의한 펩티드서열 변형을 포함하고, 이는 분자의 특성을 변형시키기 위해 다른 분자들과 연결된 하이드록시에틸 전분 유도체를 이용한다. 다양한 hesylation의 측면은, 예를 들어, 미국 특허 출원 제 2007 / 0134197 및 2006 / 0258607 에 기술되어 있다.
본 발명의 펩티드 서열의 변형에 사용된 상기의 임의의 구성 요소와 분자는 링커를 통해 임의로 접합될 수 있다. 적절한 링커는 변형된 펩티드 서열 및 연결된 구성 요소 및 분자 사이에서 어느 정도의 움직임을 허용하는 일반적으로 충분한 길이인“유연한 링커”를 포함한다. 링커 분자의 길이는 대체적으로 약 6-50 원자 길이이다. 링커 분자는 예를 들어, 또한 아릴 아세틸렌, 2-10의 단량체 단위로 구성된 에틸렌 글리콜 올리고머, 다이아민, 이산, 아미노산, 또는 이들의 조합이 될 수 있다. 적절한 링커는 손쉽게 선택될 수 있으며, 예컨대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 10-20, 20-30, 30-50의 아미노산(예를 들어, Gly)과 같이 임의의 적절한 길이가 될 수 있다.
예시적인 유연한 링커는 글리신 중합체 (G)n, 글리신-세린 중합체(예를 들어, (GS)n, GSGGSn 및 GGGSn, 이때 n은 1 이상의 정수), 글리신-알라닌 중합체, 알라닌 - 세린 중합체 및 기타 유연한 링커들을 포함한다. 글리신 및 글리신-세린 중합체는 상대적으로 구조화 되지 않았으며, 그에 따라 구성 요소들 사이에서 중립적인 연결(neutral tether) 역할을 할 수 있다. 예시적인 유연한 링커는 GGSG, GGSGG, GSGSG, GSGGG, GGGSG 및 GSSSG를 포함하며, 이에 제한되지 않는다.
표 1-8 및 도 1에 열거된 서열의 아서열, 서열 변이체 및 변형된 형태 뿐만 아니라 표 1-8 및 도 1에 열거된 FGF19 및 FGF21 변이체 및 아서열 및 FGF19/FGF21 융합체 및 키메라를 포함하는 본 발명의 펩티드 서열은 본원에서 기술된 하나 또는 그 이상의 활성을 갖는다. 활성의 한 예는 당 저감 활성이다. 또 다른 활성의 예는, 예를 들어 FGF 19에 비해, 간세포 암종(HCC)의 형성 또는 자극을 감소시키는 것이다. 활성의 추가적인 예는 예를 들어, FGF 21에 비해, 지질(예를 들어, 트리글리세라이드, 콜레스트롤, 비-HDL)의 저감 또는 감소 또는 HDL 증가 활성이다. 또 다른 활성의 예는, 예를 들어 FGF 21에 비해, 감소된 활성의 제지방 근육 질량의 저감 또는 축소이다. 또 다른 활성의 예는 섬유아세포 성장인자 수용체-4(FGFR4)에 결합하는 것 또는 FGFR4을 활성화시키는 것이고, 예를 들어, FGFR4에 대한 FGF19의 결합친화도와 유사하거나 보다 큰 친화력으로 FGFR4에 결합하는 펩티드 서열; 및 FGFR4를 활성화시키는 FGF19와 유사하거나 보다 큰 정도나 양으로 FGFR4를 활성화시키는 펩티드 서열이다. 활성의 또 다른 예는, 예를 들어, FGF19에 비해, 알도-케토 환원효소 유전자 발현의 하향 조절 또는 감소를 포함하고; FGF21에 비해, Slc1a2 유전자 발현의 상향 조절 또는 증가를 포함한다.
보다 자세하게, 표 1-8 및 도 1에 열거된 서열의 아서열, 서열 변이체 및 변형된 형태 뿐만 아니라 표 1-8 및 도 1에 열거된 FGF19 및 FGF21 변이체 및 아서열 및 FGF19/FGF21 융합체 및 키메라를 포함하는 본 발명의 펩티드 서열은 하기 활성을 갖는 서열들을 포함한다: FGF19에 비해 감소된 간세포성 암종(HCC)의 형성을 갖는 펩티드 서열, 또는 FGF 19의 아미노산 16-20의 WGDPI 서열이 GQV, GDI, WGPI, WGDPV, WGDI, GDPI, GPI, WGQPI, WGAPI, AGDPI, WADPI, WGDAI, WGDPA, WDPI, WGDI, WGDP 또는 FGDPI 중 어느 것으로 치환된 것을 갖는FGF19 서열 변이체; FGF19에 비해, 더 큰 당 저감 활성을 갖는 펩티드 서열, 또는 FGF19의 아미노산 16-20의 WGDPI 서열이 GQV, GDI, WGPI, WGDPV, WGDI, GDPI, GPI, WGQPI, WGAPI, AGDPI, WADPI, WGDAI, WGDPA, WDPI, WGDI, WGDP 또는 FGDPI 중 어느 것으로 치환된 것을 갖는 FGF19 서열 변이체; FGF19에 비해 더 작은 지질 증가 활성(예를 들어, 적은 트리글리세라이드, 콜레스트롤, 비-HDL) 또는 더 큰 HDL 증가 활성을 갖는 펩티드 서열 또는 FGF 19의 아미노산 16-20의 WGDPI 서열이 GQV, GDI, WGPI, WGDPV, WGDI, GDPI, GPI, WGQPI, WGAPI, AGDPI, WADPI, WGDAI, WGDPA, WDPI, WGDI, WGDP 또는 FGDPI 중 어느 것으로 치환된 것을 갖는 FGF19 서열 변이체; 및 FGF21에 비해 적은 제지방 질량 감소 활성을 갖는 펩티드 서열.
보다 자세하게, 표 1-8 및 도 1에 열거된 상기 서열들의 아서열, 변이체 및 변형된 형태뿐만 아니라 표 1-8 및 도 1에 열거된 FGF19 및 FGF21 변이체 및 아서열 및 FGF19/FGF21 융합체 및 키메라를 포함하는 본 발명의 펩티드 서열들은 하기 활성을 갖는 펩티드 서열들을 포함한다: 섬유아세포 성장 인자 수용체-4(FGFR4)에 결합, 또는 FGFR4를 활성화시키는 펩티드서열, 예컨대 FGFR4에 대한 FGF19의 결합친화력과 유사하거나 더 큰 친화력을 가지고 FGFR4에 결합하는 펩티드 서열; FGFR4를 활성화시키는 FGF19와 유사하거나 더 큰 정도나 양으로 FGFR4를 활성화시키는 펩티드 서열; 예를 들어 FGF19에 비해, 알도-케토 환원 효소 유전자 발현을 하향조절 또는 감소시키는 펩티드 서열; 및 FGF21에 비해 Slc1a2(solute carrier family 1, member 2) 유전자발현을 상향조절 또는 증가시키는 펩티드 서열.
활성은, 예컨대, 예를 들어, 간세포 암종(HCC)의 형성 또는 종양 형성, 당 저감 활성, 지질증가활성, 또는 제지방 질량 감소 활성과 같은 활성들은 예컨대 db/db 마우스와 같은 동물 내에서 확인될 수 있다. FGFR4 에 대한 결합 또는 FGFR4의 활성화의 측정은 본원에 개시되어 있는 분석(예를 들어, 실시예 1 참조) 또는 당업자에게 공지되어 있는 분석을 통해 확인할 수 있다.
펩티드 서열 언급에 사용되는 용어 "결합" 또는 "결합된"은 분자 수준에서 펩티드 서열의 상호작용을 의미한다. 그러므로, FGFR4에 결합하는 펩티드 서열은 FGFR4 서열의 전부 또는 일부에 결합한다. 특이적하고 선택적인 결합은 당업계에 공지된 방법(예를 들어, 경쟁적 결합, 면역침강, ELISA, 유동세포계수법, 웨스턴 블랏)을 사용하여 비-특이적 결합과 구별될 수 있다.
펩티드 및 펩티도미메틱은 당업계에 공지된 방법을 이용하여 생산하거나 단리시킬 수 있다. 펩티드는 화학적 방법을 이용해 전체 또는 부분을 합성시킬 수 있다 (예를 들어, Caruthers (1980). Nucleic Acids Res. Symp. Ser. 215; Horn (1980); 및 Banga, A.K., Therapeutic Peptides and Proteins, Formulation, Processing and Delivery Systems (1995) Technomic Publishing Co., Lancaster, PA 참조). 펩티드 합성은 다양한 고체상 기술을 이용해 수행할 수 있으며 (예를 들어, Roberge Science 269:202 (1995); Merrifield, Methods Enzymol. 289:3 (1997) 참조), 제작사의 설명에 따라 예를 들어, ABI 431A 펩티드 합성기(Perkin Elmer)를 사용하여 자동으로 합성될 수도 있다. 펩티드 및 펩티도메미틱은 또한 혼합적인 방법론을 사용하여 합성될 수도 있다. 합성잔기 및 폴리펩티드 융합 미메틱은 당업계에 공지된 다양한 절차 및 방법론을 통해 합성될 수 있다(예를 들어, Organic Syntheses Collective Volumes, Gilman, et al. (Eds) John Wiley & Sons, Inc., NY 참조). 변형된 펩티드는 화학적 변형 방법을 통해 생산될 수 있다(예를 들어, Belousov, Nucleic Acids Res. 25:3440 (1997); Frenkel, Free Radic. Biol. Med. 19:373 (1995); 및 Blommers, Biochemistry 33:7886 (1994) 참조). 펩티드 서열 변이체, 유도체, 치환체 및 변형체는 또한 예컨대 올리고뉴클레오티드-매개(위치-지향성) 돌연변이, 알라닌 스캐닝, 및 PCR 기반 돌연변이 생성과 같은 기법을 사용하여 생성될 수도 있다. 위치-지향성 돌연변이(Carter et al., Nucl. Acids Res., 13:4331 (1986); Zoller et al., Nucl. Acids Res. 10:6487 (1987)), 카세트 돌연변이 (Wells et al., Gene 34:315 (1985)), 제한선택 돌연변이(Wells et al., Philos. Trans. R. Soc. London SerA 317:415 (1986)) 및 기타 기술들은 발명 펩티드 서열, 변이체, 융합체 및 키메라, 및 이들의 변이체, 유도체, 치환체 및 변형체를 생산하기 위하여 복제된 DNA에서 수행될 수 있다.
"합성된" 또는 "제조된" 펩티드 서열은 인간의 손에 의한 조작을 포함한 임의의 방법에 의해 만들어진 펩티드이다. 이러한 방법은 이에 제한되지 않으나, 앞서 언급한 것 예컨대 화학적 합성, 재조합 DNA 기술, 더욱 큰 분자의 생화학적 또는 효소적 절편 및 앞서 언급한 것들의 조합을 포함한다.
예시된 펩티드 서열의 아서열, 서열 변이체 및 변형된 형태(예, 표1-8 및 도 1에 열거된 서열) 를 포함하는 본 발명의 펩티드 서열은 또한 키메라 분자를 형성하기 위해 변형될 수 있다. 본 발명에 따르면, 이종 도메인을 포함하는 펩티드 서열이 제공된다. 이러한 도메인은 펩티드 서열의 아미노-말단 또는 카르복시-말단에 추가될 수 있다. 이종 도메인은 또한 펩티드 서열 내에 위치될 수 있으며 및/또는 대안적으로 FGF19 및/또는 FGF21 유래 아미노산 서열에 의해 측면화될 수 있다.
"펩티드"라는 용어는 또한 펩티드의 이량체 또는 다량체(올리고머)도 포함한다. 본 발명에 따르면, 예시된 펩티드 서열들(예를 들어, 표 1 내지 8 및 도 1에 열거된 서열) 의 아서열, 변이체 및 변형된 형태 뿐만 아니라 예시된 펩티드 서열의 이량체 또는 다량체 또한 포함된다.
본 발명은 또한 표 1-8 및 도 1에 열거된 서열의 아서열, 서열 변이체 및 변형된 형태를 포함하는 본 발명의 펩티드 서열을 암호화하는 핵산 분자 및 상기 펩티드를 암호화하는 핵산을 포함하는 벡터를 제공한다. 따라서, "핵산"은 상기 언급한 것들이 최소한 검출 또는 측정 가능한 활성 또는 기능을 유지하는 한, 예시된 펩티드 서열의 기능적 아서열, 서열 변이체들 및 변형된 형태를 암호화하는 것 뿐만 아니라 본원에서 개시된 예시된 펩티드 서열을 암호화하는 것들을 포함한다. 예를 들어, 약간의 당 저감 또는 감소 활성을 보유한 본원에 개시된 예시된 서열의 아서열, 변이체 또는 변형된 형태(예를 들어, 표 1-8 및 도 1에 열거된 서열)는 정상 당 항상성를 제공하고 또는 만성 또는 급성 in vivo 고혈당증과 연관된 조직병리학적 상태를 감소시킨다.
본원에서 유전자, 폴리뉴클레오티드, 뉴클레오티드 서열, 프라이머, 올리고뉴클레오티드 또는 프로브로 언급될 수도 있는 핵산은 임의 길이의 천연의 또는 변형된 퓨린- 및 피리미딘-함유 중합체, 폴리리보뉴클레오티드 또는 폴리데옥시리보뉴클레오티드 또는 혼합된 폴리리보-폴리데옥시리보 뉴클레오티드 및 그들의 α-아노머형태를 말할 수 있다. 두개 또는 그 이상의 퓨린- 및 피리미딘-함유 중합체들은 일반적으로 인산에스테르 결합 또는 그들의 유사체에 의해서 결합된다. 상기 용어들은 데옥시리보핵산 (DNA) 및 리보핵산 (RNA)을 포함하는 모든 형태의 핵산을 언급하기 위해 상호 교환적으로 사용될 수 있다. 핵산은 단일가닥, 이중가닥, 3중, 선형 또는 원형이 될 수 있다. 핵산은 게놈 DNA 및 cDNA를 포함한다. RNA 핵산은 mRNA, rRNA, tRNA 또는 안티센스와 스플라이싱되거나 스플라이싱되지 않을 수 있다. 핵산은 뉴클레오티드 유사체 및 유도체 뿐만 아니라 자연적 발생물, 합성물도 포함한다.
유전 암호의 축퇴에 따른 결과로서, 핵산 분자는 본 발명의 펩티드 서열을 암호화하는 핵산분자에 대한 서열의 축퇴를 포함한다. 따라서, 본원에 예시된 펩티드 서열의 아서열, 변이체 및 변형된 형태를 포함하는 펩티드 서열(표1-8 및 도면1에 열거된 서열)을 암호화하는 축퇴된 핵산 서열이 제공된다. 핵산 서열을 언급하기 위해 사용된 "상호보완적인”이란 용어는, 100% 상호보완적임을 나타낸 영역, 즉 불일치 없이 100% 염기쌍을 나타냄을 의미한다.
핵산은 다양한 공지된 표준 클로닝 및 화학 합성 방법 중 임의의 것을 사용하여 제조 할 수 있으며, 위치-특이적 돌연변이 또는 당업자에게 공지된 다른 재조합 기술에 의해 의도적으로 변경될 수 있다. 폴리 뉴클레오티드의 순도는 시퀀싱, 겔 전기 영동, UV 분광 분석을 통해 확인할 수 있다.
핵산은 핵산 구조물로 삽입될 수 있고, 핵산의 발현은 본원에서 "발현카세트" 라고 나타낸 "발현조절요소"에 의해 영향을 받거나 또는 조절될 수 있다. 상기 용어 "발현조절요소"는 작동가능하게 연결된 핵산서열의 발현을 조절하거나 영향을 주는 하나 또는 그 이상의 핵산서열요소를 지칭한다. 발현조절요소는 적절한 프로모터, 인핸서, 전사종결인자, 유전자 사일렌서, 단백질 암호화 유전자 앞의 개시 코돈 (즉, ATG) 등을 포함할 수 있다.
핵산서열에 작동가능하게 연결된 발현조절요소가 적절한 경우, 전사 및 핵산서열의 번역을 제어한다. 상기 용어 "작동가능하게 연결된"은 의도한 방식으로 기능하도록 허용하는 관계에 있는 참조된 구성요소의 병렬배치를 지칭한다. 일반적으로, 발현 조절요소는 유전자의 5 '또는 3' 끝에 병렬되어 있지만 인트론일 수도 있다.
발현 조절 요소는 구조적으로 전사를 활성화시키는, 유도성 (즉, 활성화를 위한 외부신호 또는 자극을 요구) 또는 유전자의 발현을 활성화하는(즉, 전사를 중단하는 신호를 요구; 신호가 더 이상 존재하지 않을 때, 전사는 활성화되거나 "활성화됨") 요소를 포함한다. 또한 본 발명의 발현 카세트에는 특정 세포-타입 또는 조직에 대한 조절 가능한 유전자 발현을 주기에 충분한 조절 요소들이 포함된다(즉, 조직-특이적 조절 요소). 일반적으로, 이러한 요소는 암호화 서열의 상류 또는 하류 (즉, 5 '및 3') 에 위치한다. 프로모터는 일반적으로 암호화 서열의 5 '에 위치된다. 재조합 DNA 또는 합성 기술에 의해 생산된 프로모터는, 본 발명의 폴리 뉴클레오티드의 전사를 위해 제공하는데 사용될 수있다. "프로모터는" 일반적으로 직접 전사에 충분한 최소한의 서열 요소를 의미한다.
핵산은 숙주세포로의 형질전환 및 차후의 발현 및/또는 유전적 조작을 위해 플라스미드에 삽입될 수 있다. 플라스미드는 숙주세포에 안정적으로 전달될 수 있는 핵산이다; 플라스미드는 핵산의 발현을 구동하기 위한 발현조절요소를 선택적으로 구성으로 할 수 있다. 본 발명의 목적을 위해, 벡터는 플라스미드와 동의어이다. 플라스미드 및 벡터는 일반적으로 적어도 세포에서 전파를 위한 복제원점 및 프로모터를 포함한다. 플라스미드 및 벡터는 또한 숙주세포 내에 발현을 위한 발현조절요소를 포함할 수 있고, 그래서 예를 들어, 펩티드 서열을 암호화하는 핵산의 발현 및/또는 유전적 조작, 숙주 세포 및 유기체(예를 들어, 치료를 필요로 하는 대상) 내에서의 펩티드 서열의 발현 또는 펩티드 서열의 생산에 유용하다.
여기에서 사용된 용어 "전이유전자"는 기교에 의해 세포 또는 유기체 내로 도입된 폴리 뉴클레오티드를 의미한다. 예를 들어, 전이유전자를 갖는 세포, 상기 전이유전자는 유전적 조작 또는 세포의 "형질전환"에 의해서 도입된다. 전이유전자가 도입된 이들의 세포 또는 자손은 "형질전환된 세포" 또는 "형질 전환체"라고 지칭된다. 일반적으로, 전이유전자는 형질 전환 자손에 포함되거나 상기 세포로부터 발달된 유기체의 한 부분이 된다. 전달유전자는 염색체 DNA 내로 삽입되거나 또는 자기 복제 플라스미드, YAC, 미니크로모좀(minichromosome) 등으로 유지 될 수있다.
박테리아계 프로모터는 T7 및 박테리오파지 λ의 pL 과 같은 유도성 프로모터, plac, ptrp, ptac (ptrp-lac 혼성 프로모터) 및 테트라사이클린 반응 프로모터를 포함한다. 곤충세포계 프로모터는 구조적 또는 유도성 프로모터를 포함한다(예를 들어, ecdysone). 포유류 세포 구조적 프로모터는 SV40, RSV, 소유두종 바이러스(bovine papilloma virus; BPV) 및 다른 바이러스 프로모터, 또는 포유류 세포의 게놈 (예를 들어, 메탈로티오네인 IIA 프로모터(metallothionein IIA promoter; 열 충격 프로모터) 또는 포유류 바이러스 (예를 들어, 아데노 바이러스 후기 프로모터; 유도성 마우스 유방 종양 바이러스 긴 말단 반복) 에서 유래된 유도성 프로모터를 포함한다. 대안적으로, 레트로 바이러스 게놈은 적절한 숙주세포에서 펩티드 서열의 도입 및 직접적 발현을 위해 유전적으로 변형될 수 있다.
in vivo 전달을 포함하는 본 발명의 방법 및 용도로서, 발현 시스템은 추가적으로 in vivo 용도를 위해 설계된 벡터를 포함한다. 특정 비 제한적인 예는 아데노바이러스 벡터(미국 특허번호 5,700,470 및 5,731,172), 아데노 -연관 벡터(미국 특허 5,604,090), 단순 헤르페스 바이러스 벡터(미국 특허 No.　5,501,979), 레트로 바이러스 벡터(미국특허 5,624,820, 5,693,508 및 5,674,703), BPV 벡터 (미국특허 5,719,054), CMV 벡터(미국특허 No. 5,561,063) 및 파르보 바이러스, 로타 바이러스, 노워크 바이러스와 렌티 바이러스 벡터(예를 들어, 미국특허 6,013,516)를 포함한다. 벡터는 줄기세포를 포함하는 장관의 세포에 유전자를 전달하는 것을 포함한다 (Croyle 등, Gene Ther. 5:645 (1998); S.J. Henning, Adv. Drug Deliv. Rev. 17:341 (1997), 미국특허 5,821,235 및 6,110,456). 이들 벡터의 대부분은 인간 연구에 승인되었다.
효모벡터는 구조적 및 유도성 프로모터를 포함한다(예를 들어, Ausubel 등, In: Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 2, Ch. 13, ed., Greene Publish. Assoc. & Wiley Interscience, 1988; Grant 등 Methods in Enzymology, 153:516 (1987), eds. Wu & Grossman; Bitter Methods in Enzymology, 152:673 (1987), eds. Berger & Kimmel, Acad. Press, N.Y.; 및, Strathern 등, The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces (1982) eds. Cold Spring Harbor Press, Vols. I and II ). 예컨대 ADH 또는 LEU2 와 같은 구조적 효모 프로모터 또는 예컨대 GAL 과 같은 유도성 프로모터들이 사용될 수 있다(R. Rothstein In: DNA Cloning, A Practical Approach, Vol.11, Ch. 3, ed. D.M. Glover, IRL Press, Wash., D.C., 1986). 외래 핵산 서열을 효모 염색체로, 예를 들어 상동성 재조합을 통해 통합 하는 것을 촉진하는 벡터들은 당업계에 공지되어 있다. 효모 인공염색체(YAC)는 삽입될 폴리뉴클레오티드가 기존의 벡터보다 너무 큰 경우(예를 들어, 약 12 Kb보다 큰 경우) 에 일반적으로 사용된다.
발현벡터는 또한 선택압에 대하여 저항성을 부여하는 선택가능 마커 또는 동정가능한 마커(예를 들어, 베타-갈락토시다아제)를 포함할 수 있으며, 이에 따라 벡터를 갖는 세포가 선택되고, 성장 및 증식될 수 있도록 한다. 대안적으로, 선택가능한 마커는 펩티드 서열을 암호화하는 핵산을 포함하는 첫번째 벡터와 숙주 세포로 공동-감염된 두번째 벡터 상에 있을 수 있다. 선택시스템은 각각 tk-, hgprt_ 또는 aprt_ 세포에서 쓰이는, 단순포진바이러스 티미딘 키나아제 유전자(Wigler 등, Cell 11:223 (1977)), 하이포 잔틴 - 구아닌 포스포리보실트랜스퍼라아제 유전자 (Szybalska 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 48:2026 (1962)), 및 아데닌 포스포리보실트랜스퍼라아제(Lowy 등, Cell 22:817 (1980)) 유전자를 포함하지만 그에 제한되지 않는다. 또한, 항 대사물질 저항은 메토트랙세이트에 대한 저항성을 부여하는 dhfr (O'Hare 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:1527 (1981)) ; 마이코페놀산에 대한 저항성을 부여하는 gpt 유전자(Mulligan 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:2072 (1981)); 아미노글리코시드 G-418에 대한 저항성을 부여하는 neomycin 유전자 (Colberre-Garapin 등, J. Mol. Biol. 150:1(1981)); puromycin; 하이그로마이신 유전자에 대한 저항성을 부여하는 hygromycin 유전자(Santerre 등, Gene 30:147 (1984))에 대한 선택의 기초하여 사용될 수 있다. 추가 선택 유전자는 세포가 트립토판 대신 인돌을 활용할 수 있게 하는 trpB; 히스티딘 대신 히스티놀(histinol)을 활용할 수 있게 하는 hisD (Hartman 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:8047 (1988)); 및 오르니틴 탈탄산효소 억제제, 2-(디플로로메틸)-DL0오르니틴, DFMO에 저항성을 부여하는 ODC(오르니틴 탈탄산효소)(McConlogue (1987) In: Current Communications in Molecular Biology, Cold Spring Harbor Laboratory)를 포함한다.
본 발명에 따르면, 본원에서 개시된 FGF19 및/또는 FGF21의 변이체 또는 융합체를 생산하는 형질전환세포(들) 및 숙주세포 (in vitro, ex vivo 및 in vivo)가 제공되고, 여기에서 FGF19 및/또는 FGF21의 변이체 또는 융합체의 발현은 FGF19 및/또는 FGF21의 변이체 또는 융합체를 암호화하는 핵산에 의하여 부여된다. 본 발명의 펩티드 서열을 발현하는 형질전환 및 숙주 세포는 일반적으로 본 발명의 펩티드 서열을 암호화하는 핵산을 포함한다. 일 실시예에서, 형질전환 또는 숙주세포는 원핵세포이다. 다른 실시예에서, 형질전환 또는 숙주세포는 진핵세포이다. 다양한 측면에서, 상기 진핵세포는 효모 또는 포유류 세포(예를 들어, 인간, 영장류 등)이다.
본원에서 사용되는 "형질전환" 또는 "숙주" 세포는 암호화된 펩티드 서열의 발현을 전달 및/또는 전사될 수 있도록 핵산이 도입되는 세포이다. 상기 용어는 숙주 세포의 임의의 자손 또는 서브 클론을 포함한다.
형질 전환 및 숙주 세포는 예컨대 박테리아 및 효모와 같은 미생물; 및 식물, 곤충 및 포유동물 세포를 포함하나 그에 제한되지 않는다. 예를 들면, 재조합 박테리오파지 핵산, 플라스미드 핵산 또는 코스미드 핵산발현 벡터로 형질전환된 박테리아; 재조합 효모 발현벡터로 형질전환된 효모; 재조합 바이러스 발현벡터(예를 들어, 콜리 플라워 모자이크 바이러스, CaMV; 담배 모자이크 바이러스, TMV)로 감염된 또는 재조합 플라스미드 발현벡터(예를 들어, Ti 플라스미드)로 형질전환된 식물세포계; 재조합 바이러스 발현벡터(예를 들어, 바쿨로 바이러스)에 감염된 곤충 세포계; 및 재조합 바이러스 발현벡터(예를 들어, 레트로 바이러스, 아데노 바이러스, 우두 바이러스)에 감염되거나, 일시적이고 안정적인 전파 또는 발현을 위해 설계된 형질전환 동물 세포계가 있다.
유전자 치료 용도 및 방법을 위해, 형질 전환된 세포는 대상 내로 할 수 있다. 대상 내 세포는 in vivo 에서 본원에 개시된 발명 펩티드 서열을 암호화하는 핵산으로 형질전환될 수 있다. 대안적으로, 세포는 in vitro 에서 전이유전자 또는 폴리뉴클레오티드로 형질전환되고 그 다음 치료 효과를 위하여 대상의 조직에 이식될 수 있다. 대안적으로 일차 세포 단리 또는 수립된 세포주는 FGF19 및/또는 FGF21 변이체 또는 이들의 융합/키메라 서열(또는 변이체), 예컨대 FGF19의 전부 또는 일부 또는 FGF21의 전부 또는 일부를 포함하는 키메라 펩티드 서열을 암호화하는 전이유전자 또는 폴리뉴클레오티드로 형질전환될 수 있고, 그 후 선택적으로 대상의 조직에 이식된다.
펩티드 서열의 발현을 위한 비 제한적인 표적 세포, 특히 in vivo 에서의 발현은 췌장 세포 (섬 세포), 근육 세포, 점막 세포와 내분비 세포를 포함한다. 이러한 내분비 세포는 FGF19 및/또는 FGF21의 변이체, 또는 예컨대 FGF19의 전부 또는 일부 또는 FGF21의 전부 또는 일부를 포함하는 키메라 펩티드 서열과 같은 이들의 융합/키메라 서열 (또는 변이체)의 유도가능한 생산(분비)를 제공할 수 있다. 형질전환을 위한 추가적인 세포는 줄기세포 또는 기타 다능성 또는 만능세포, 예를 들어, 다양한 췌장 세포 (섬세포), 근육 세포, 점막 세포 및 내분비 세포로 분화되는 전구 세포를 포함한다. 줄기세포 표적은 본 발명의 펩티드 서열의 장기적인 발현을 제공한다.
여기에서 사용되는 용어 “배양”은 세포에서 관해서 언급될 때, in vitro 에서의 세포 성장을 의미한다. 이러한 세포의 특정 예는 대상으로부터 단리되고, 성장되고 조직 배양 내 성장에 대하여 적합한 세포이다. 또 다른 예는 in vitro 에서 유전적으로 조작되고, 다시 동일 또는 다른 대상에 이식된 세포이다.
용어 “단리”는 세포에서 언급될 때, 자연적으로 나타나는 in vivo 환경에서 분리된 세포를 말한다. "배양된”및 ”분리된”세포는 사람의 손에 의하여 예컨대 유전적 형질전환과 같이 조작될 수 있다. 이 용어는 세포분열시 발생하는 돌연변이로 인해 부모 세포와 동일하지 않은 자손 세포를 포함하는 임의의 자손세포를 포함한다. 이 용어는 전체의 인간은 포함하지 않는다.
본 발명의 펩티드 서열을 암호화하는 핵산은 안정적인 발현을 위해 전체 유기체 세포로 도입 될 수 있다. 인간이 아닌 형질전환 동물을 포함하는 이러한 유기체는 전체 동물 내에서의 펩티드 발현의 효과 및 치료 이점에 대한 연구에 유용하다. 예를 들어, 본원에서 개시된 바와 같이, 마우스에서의 FGF19 및/또는 FGF21의 변이체 또는 본원에서 개시된 바와 같은 FGF19의 전부 또는 일부, 또는 FGF21의 전부 또는 일부를 포함하는 키메라 펩티드 서열과 같은 그들의 융합체/키메라 서열(또는 변이체)의 생산은 당을 낮추고 항-당뇨성이다.
특정 질병(예를 들어, 당뇨병, 퇴행성 질환, 암 등)이 발달하거나 발달에 대해 감수성이 있는 마우스 주들은 또한 질병 감수성 마우스 내에서의 치료 단백질 발현의 효과를 연구하기 위하여 본원에서 개시된 치료 단백질들을 도입하기에 유용하다. 특정 질병 또는 생리학적인 상태에 감수성이 있는 형질감염 및 유전적 동물 모델들, 예컨대 스트렙토 조토신(STZ)-유발 당뇨병(STZ) 마우스은 본원에 개시된 FGF19 및/또는 FGF21의 변이체, 예컨대 FGF19의 전부 또는 일부, 또는 FGF21의 전부 또는 일부를 포함하는 키메라 펩티드 서열과 같은 이들의 융합체/키메라(변이체)서열을 발현하는데 적절한 표적이다. 그러므로 본 발명에 따르면, FGF19 및/또는 FGF21의 변이체, 또는 예컨대 FGF19의 전부 또는 일부 또는 FGF21의 전부 또는 일부를 포함하는 키메라 펩티드 서열과 같은 이들의 융합체/키메라(변이체)서열을 생산하는 비-인간 형질전환 동물이 제공되며, 이들의 생산은 동물에서 자연적으로 발생하지 않으며, 이는 동물의 체세포 또는 생식 세포 내에 존재하는 전이 유전자에 의해서 수여되는 것이다.
용어 "형질 전환 동물"은 그들의 체세포 또는 생식 세포주들이 준세포 수준에서 의도적인 유전적 조작, 예컨대 재조합 바이러스를 이용한 감염 또는 미세주입에 의해서 직접적 또는 간접적으로 유전적 정보 수여를 겪은, 동물을 말한다. 용어 "형질 전환"은 본원에서 기술된 바와 같은 유전적으로 조작된 형질전환 동물로부터 획득한 세포 또는 조직(즉, "형질전환세포", "형질전환조직")을 추가적으로 포함한다. 본 맥락에서, "형질전환동물"은 고전적인 이종교배 또는 in vitro 수정에 의해 생산된 동물은 포함하지 않으며, 오히려 하나 또는 그 이상의 세포가 핵산분자를 받은 동물을 나타낸다. 발명된 형질전환 동물은 전이유전자에 대해서 이형 또는 동형접합이 될 수 있다. 쥐, 양, 돼지 및 개구리를 포함하는 형질전환동물 생산하기 위한 방법은 당업계에 잘 알려져 있고(예를 들어,미국 특허 5,721,367, 5,695,977, 5,650,298, 및 5,614,396 참조), 예를 들어 추가적으로 포함된다.
펩티드 서열, 펩티드 서열을 암호화하는 핵산, 벡터 및 펩티드 서열을 발현하는 형질전환된 숙주세포는 단리 및 정제된 형태를 포함한다. 상기 용어 "단리"는 발명 조성물의 변형제로 사용되는 경우, 환경 내의 하나 또는 그 이상의 성분으로부터 대체적으로 완전히 또는 적어도 부분적으로 단리된 조성물을 의미한다. 일반적으로 자연에 존재하는 조성물은, 분리되는 경우, 자연에서 일반적으로 연관있는 하나 또는 그 이상의 물질, 예를 들어 하나 또는 그 이상의 단백질, 핵산, 지질, 탄수화물 또는 세포막으로부터 실질적으로 자유로워진다. 용어 "단리”는 조성물의 대안적인 물리적 형태, 예컨대 변이체, 변형체 또는 유도체 형태, 융합체 및 키메라, 다량체/올리고머 등 또는 숙주세포에서 발현되는 형태를 배제하는 것은 아니다. 상기 용어 "단리"는 인간의 손에 의해 생성되는 임의의 하나의 내부 조합 형태(예를 들어, 약학 조성물, 조합 조성물 등)을 또한 배제하지 않는다.
"단리된(isolated)" 조성물은 또한, 오염물 또는 원치 않는 성분 또는 물질 등과 같은 것의 하나 또는 그 이상의 다른 물질의 일부, 실질적으로 다수, 또는 대부분 또는 전부가 제거되는 경우 "정제될(purified)" 수 있다. 본 발명의 펩티드 서열들은 대체로 공지되지 않았거나 또는 자연에 존재하는 것으로 여겨지지 않는 것이다. 그러나, 자연에 존재하는 조성물의 경우, 단리된 조성물은 일반적으로, 자연에서 전형적으로 연관된 다른 물질들의 일부, 실질적으로 다수 또는 대부분 또는 전부가 제거된 것일 수 있다. 따라서 자연에서 또한 나타나는 펩티드 서열의 단리는, 예를 들어, 단백질 라이브러리의 단백질 또는 게놈의 또는 cDNA 라이브러리 내의 핵산 등과 같은 수백만의 다른 서열들 중에 존재하는 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드를 포함하지 않는다. "정제된" 조성물은 하나 또는 그 이상의 다른 비활성 또는 활성 분자들과의 조합들을 포함한다. 예를 들어, 본 발명의 펩티드 서열은, 예를 들어, 당 저감 약물 또는 치료적 약제 등과 같은 다른 약물(drug) 또는 약제(agent)와 결합된다.
본원에서 사용된 바와 같이, 펩티드 서열, 펩티드 서열 암호화 핵산 등의 변형제로서 사용되는 경우, 용어 "재조합(recombinant)"은 상기 조성물들이 일반적으로 자연적으로 발생하지 않는 방식(즉, in vitro)으로 조작되었다는(즉, 가공되었다는) 것을 의미한다. 재조합 펩티드의 특정한 예는 본 발명의 펩티드 서열이 상기 펩티드 서열을 암호화하는 핵산으로 형질감염된 세포에 의하여 발현되는 경우가 될 것이다. 재조합 핵산의 특정한 예는 펩티드 서열을 암호화하는 핵산 (예를 들어, 게놈 또는 cDNA)이 5', 3' 또는 인트론 영역들과 함께 또는 이들 없이, 플라스미드 내로 복제되는 경우가 될 것이며, 여기에서 상기 유전자는 일반적으로 상기 유기체의 게놈 내에서 인접하는 것이다. 재조합 펩티드 또는 핵산의 다른 예는 FGF19의 일부 및 FGF21의 일부를 포함하는 키메라 펩티드 서열 등과 같은 잡종 또는 융합 서열이다.
본 발명에 따르면, 예시된 펩티드 서열의 아서열, 변이체 및 변형된 형태(표 1 내지 8 및 도 1에 나열된 FGF19 및 FGF21 변이체 및 아서열들, 및 표 1 내지 8 및 도 1에 나열된 FGF19/FGF21 융합체 및 키메라들을 포함) 를 포함하는 본 발명의 펩티드 서열의 혼합물 및 조성물이 제공된다. 하나의 실시예에 있어서, 혼합물은 하나 또는 그 이상의 펩티드 서열들 및 약학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제를 포함한다. 다른 실시예에 있어서, 혼합물은 하나 또는 그 이상의 펩티드 서열들 및 항-당뇨제, 또는 당 저감 약물 또는 치료제 등과 같은 보조약 또는 치료제들을 포함한다. 약물들 및 치료학적 제제들의 예들은 이하에서 규정된다. 약학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제 내의 하나 또는 그 이상의 펩티드 서열과 하나 또는 그 이상의 항-당뇨제, 또는 당 저감 약물 또는 치료제와 같은 조합들이 또한 제공된다. 예를 들어 당 저감 약물 또는 치료제 등과 같은 다른 약물 또는 약제와 본 발명의 펩티드 서열의 이러한 조합들은 예를 들어, 대상의 치료를 위한 본 발명의 방법 및 용도에 유용하다.
조합들은 또한 본 발명의 펩티드 서열 또는 핵산들을 폴리에스테르, 탄수화물, 폴리아민산, 하이드로겔, 폴리비닐피롤리돈, 에틸렌-비닐아세테이트, 메틸셀룰로오스, 카르복시메틸셀룰로오스, 프로타민설페이트, 또는 락타이드/글리콜리드 공중합체, 폴리락타이드/글리콜리드 공중합체, 또는 에틸렌비닐아세테이트 공중합체 등과 같은 중합체성 재료들 또는 입자들 내로 혼입; 예를 들어, 각각 하이드록시메틸셀룰로오스 또는 젤라틴-마이크로캡슐 또는 폴리(메틸메타크로레이트)마이크로캡슐의 사용에 의한 코아서베이션 기술에 의하거나 또는 계면중합에 의하여 제조되는 마이크로캡슐 내에의 포획; 예를 들어 유중수 에멀젼, 미셀, 혼성 미셀 및 리포좀을 포함하는 거대분자 복합체, 나노-캡슐, 마이크로스페어, 비드, 및 지질-기반 시스템(예를 들어, N-라우로일, N-올레일 등과 같은 N-지방아실기, 도데실아민, 올레오일아민 등과 같은 지방아민, 미국 특허 제6,638,513호 참조) 등과 같은 콜로이드 약물 전달 및 분배 시스템 내로의 혼입을 포함한다.
본원에 개시된 것과 같은, 예시화된 펩티드 서열들의 아서열, 변이체 및 변형된 형태들을 포함하는 본 발명의 펩티드들 (표 1 내지 8 및 도 1에 나열된 FGF19 및 FGF21 변이체 및 아서열들 및 표 1 내지 8 및 도 1에 나열된 FGF19/FGF21 융합체 및 키메라들을 포함)은 당 대사 조절 및 혈액으로부터 근육, 간 및 지방 등과 같은 핵심 대사 기관들으로의 당 전달을 용이하게 하는 데 사용될 수 있다. 이러한 펩티드 서열들은 당 내성 회복 및/또는 정상 당 항상성을 개선 또는 제공하기에 충분하거나 또는 유효한 양으로 생산될 수 있다.
본원에서 기술되는 바와 같이, 다양한 FGF19 및/ FGF21 변이체 및 융합 펩티드 서열의 마우스 투여는 당 수준을 성공적으로 감소시켰다. 더욱이, FGF19와는 대조적으로, 특정 펩티드 서열들은 마우스에서 HCC 형성 또는 종양형성을 자극하거나 또는 유발하지 않았다. 따라서, 예시화된 펩티드 서열들의 아서열, 변이체 및 변형된 형태들을 포함하는 본 발명의 펩티드들(표 1 내지 8 및 도 1에 나열된 FGF19 및 FGF21 변이체 및 아서열들 및 표 1 내지 8 및 도 1에 나열된 FGF19/FGF21 융합체 및 키메라들을 포함)을 동물 내로 직접 또는 간접적인 in vivo 또는 ex vivo 방법들(예를 들어, 변이체 또는 융합 펩티드, 상기 변이체 또는 융합 펩티드를 암호화하는 핵산 또는 상기 변이체 또는 융합 펩티드를 발현하는 형질전환된 세포 또는 유전자 치료 벡터)로 투여하는 것은 여러 장애들을 치료하는 데 사용될 수 있다.
따라서, 본 발명은 in vitro, ex vivo 및 in vivo (예를 들어, 대상에서 또는 내부에서) 방법 및 용도를 포함한다. 이러한 방법 및 용도는 본원에 개시된 본 발명의 임의의 상기 펩티드 서열들로 실시될 수 있다.
본 발명에 따르면, 장애를 갖거나 또는 가질 위험에 있는 대상을 치료하는 방법이 제공된다. 다양한 실시예들에 있어서, 방법은 표 1 내지 8 및 도 1에 나열된 FGF19 또는 FGF21 변이체, 융합체 또는 키메라 또는 표 1 내지 8 및 도 1에 나열된 FGF19 또는 FGF21 변이체, 융합체 또는 키메라의 아서열, 변이체 또는 변형된 형태와 같은 펩티드 서열을 상기 장애를 치료하는 데 유효한 양으로 대상에 투여하는 것을 포함한다.
본 발명의 펩티드들 및 방법 및 용도로 치료가능하거나, 예방가능한 등의 예시적인 장애들에는 대사질환 및 장애들이 포함된다. 질환 및 장애들의 비제한적인 예에는 하기의 것들이 포함된다: 1. 당뇨병(제1형 및 제2형), 임신성 당뇨병, 고혈당증, 인슐린 저항성, 비정상 당 대사, "당뇨병전증(pre-diabetes)" (공복혈당장애(IFG) 또는 내당능장애(IGT)) 및 예를 들어 췌장 β-세포 파괴 등과 같은 조직병리학적 변화들을 포함하는 고혈당 상태와 연관되거나 또는 그로부터 야기되는 다른 생리학적 장애들을 포함하는 당 활용 장애 및 이들과 연관되는 후유증. 치료를 위하여, 본 발명의 펩티드 서열들을 약 100㎎/㎗ 보다 높은 공복 혈장 당(Fasting plasma glucose; FPG) 수준을 갖는 대상들에 투여할 수 있다. 본 발명의 펩티드 서열들은 또한 신장 손상(예를 들어, 세관 손상 또는 신장병), 간 변성, 눈 손상(예를 들어, 당뇨망막병증 또는 백내장) 및 당뇨병성 족부 장애들을 포함하는 다른 고혈당-연관 장애들에 유용할 수 있다; 2. 예를 들어, 죽상동맥경화증, 관상동맥질환, 뇌혈관질환 등과 같은 지질이상혈증 및 이들의 후유증; 3. 대사증후군, 예컨대 비만 및 체질량증가(비알코올성 지방간 질환(NAFLD), 비알코올성 간질환(NASH), 및 다낭성난소증후군(PCOS) 등과 같으나 이로 제한되지 않는 이들의 동반 질환(co-morbid) 상태들을 포함)와 연관될 수 있고 그리고 또한 혈전증, 응고항진 상태 및 전혈전단계들(동맥 및 정맥), 고혈압, 심혈관 질환, 뇌졸증 및 심부전을 포함한다; 4. 죽상동맥경화증, 만성 염증성 장질환(예를 들어, 크론씨병 및 궤양성 대장염), 천식, 홍반성 낭창, 관절염 또는 다른 염증성 류마티스성 장애들을 포함하는 염증 반응들이 관여하는 장애 또는 상태들; 5. 예를 들어 지방육종, 고형암 및 신생물(neoplasms)을 포함하는 지방종성 종양, 지방세포 종양 등과 같은 세포 주기 또는 세포 분화 과정들의 장애들; 6. 알쯔하이머병, 다발성 경화증, 파킨슨씨병, 진행성다소성백질뇌염 및 길랑-바레 증후군을 포함하는 중추신경계 및 말초신경계의 신경퇴행성 질환 및/또는 탈수초성 장애 및/또는 신경염증성 진행 및/또는 다른 말초신경병증이 관여하는 신경계 질환들; 7. 홍반성-편평상피 피부질환을 포함하는 피부 및 피부학적 장애들 및/또는 상처 치료 과정의 장애들; 및 8. X 증후군(syndrome X), 골관절염 및 급성 호흡곤란 증후군 등과 같은 다른 장애들.
본원에서 사용된 바와 같이, 대상의 상태와 관련하여 사용되는 경우, 용어 "고혈당(hyperglycemic)" 또는 "고혈당증(hyperglycemia)"은 대상의 혈액 내에 당이 일시적 또는 만성적으로 비정상적인 높은 수준으로 존재하는 것을 의미한다. 상기 상태는 상기 대상이 당 불내성 또는 정상 대상들에서는 전형적으로 발견되지 않는 상승된 당 상태 (예를 들어, 당뇨병으로 발전할 위험이 있거나 또는 당뇨 대상들에서의 당 불내성의 당뇨병전증 대상들) 를 나타내는 것과 같이 당 대사 또는 흡수에서의 지연에 의해 야기될 수 있다. 정상혈당에 대한 공복 혈장 당(FPG) 수준들은 약 100㎎/㎗ 보다 낮고, 손상된 당 대사에서는 약 100 내지 126㎎/㎗이며, 그리고 당뇨병에서는 약 126㎎/㎗ 보다 높다.
본원에서 기술되는 바와 같이, 본 발명은 비만 또는 원치 않는 체질량(예를 들어, 상당 연령, 성별, 인종 등 적절한 상응 대상들과 비교하여 정상 체질량지수 또는 BMI 가 높음)을 방지하거나 (예를 들어, 특정 장애(들)를 가질 성향이 있는 대상들에서), 지연시키거나, 늦추거나 또는 이들의 진행, 발병을 억제하거나 또는 이들을 치료하는 (예를 들어, 개선하는) 방법들이 포함된다. 따라서, 여러 실시예들에 있어서, 예를 들어, 비만 또는 원치 않는 체질량 지수(비만의 동반 질환 상태들, 예를 들어, 폐쇄성수면무호흡증, 관절염, 암 (예를 들어, 유방암, 자궁내막암 및 결장암), 담석증 또는 고혈당증을 포함) 을 치료하기 위한 본 발명의 방법은 본원에서 기재된 바와 같은 본 발명의 펩티드 (예를 들어, 예로서 표 1 내지 8 또는 도 1에 기재된 바와 같은 F19 및/또는 FGF21의 변이체 또는 융합체) 를 비만 또는 원치 않는 체질량을 치료하기에 충분한 양으로 접촉시키거나 또는 투여하는 것을 포함한다. 특정 관점들에 있어서, 대상은 25 보다 높은, 예를 들어, 25 내지 30, 30 내지 35, 35 내지 40 또는 40 보다 높은 체질량지수를 갖는다.
더욱이, 본 발명에는 예를 들어, 플라그 형성, 혈관의 협착 또는 폐색, 고혈압, 뇌졸증 및 관상동맥질환의 증가된 위험을 야기할 수 있는 원치 않는 수준 또는 비정상적으로 상승된 혈청/혈장 LDL, VLDL, 트리글리세리드 또는 콜레스테롤, 이의 전부, 단독 또는 조합을 예방하거나 (예를 들어, 특정의 장애(들)을 가질 성향이 있는 대상들에서), 늦추거나 또는 이들의 진행, 발병을 억제하거나 또는 이들을 치료하는 방법들이 포함된다. 이러한 장애들은, 예를 들어, 예로서 유전적 소인 또는 식이(diet)에 기인할 수 있다.
용어 "대상(subject)"은 동물을 말한다. 전형적으로, 상기 동물은 본 발명의 펩티드 서열을 이용한 치료로 유익할 수 있는 포유동물이다. 특정 예로 영장류(예를 들어, 인간), 개, 고양이, 말, 소, 돼지 및 양이 포함된다.
대상들에는 장애, 예를 들어, 당뇨병 등과 같은 고혈당 장애를 갖는 대상들, 또는 장애를 갖지 않으나 상기 장애로 발전할 위험이 있을 수 있는 대상들, 예를 들어, 100㎎/㎗ 보다 높은, 예를 들어, 약 100 내지 126㎎/㎗ 사이의 FPG 수준을 갖는 당뇨병전증 대상들이 포함된다. 장애로 발전하는 위험이 있는 대상들에는, 예를 들어, 급성 또는 만성 고혈당증, 또는 원치 않는 체질량 또는 비만으로 발전한 가족력 또는 유전적 소인을 가질 수 있는 대상들뿐만 아니라, 그들의 식이가 급성 또는 만성 고혈당증(예를 들어, 당뇨병), 원치 않는 체질량 또는 비만으로의 발전에 기여할 수 있는 대상들이 포함된다.
본원에서 기술되는 바와 같이, 치료방법들은 본원에서 기재된 바와 같은 본 발명의 펩티드 (예를 들어, 예로서 표 1 내지 8 또는 도 1에 기술된 바와 같은 FGF19 및 또는 FGF21의 변이체 또는 융합체) 를 대상에서의 원하는 결과 또는 성과를 달성하기에 유효한 양으로 접촉시키거나 또는 투여하는 것을 포함한다. 원하는 성과 또는 결과를 가져오는 치료에는 대상에서 상기 상태의 하나 또는 그 이상의 증후군들의 중증도 또는 빈도의 감축, 감소 또는 예방, 예를 들어, 대상 상태의 개선 또는 "이로운 효과(beneficial effect)" 또는 "치료적 효과(therapeutic effect)"가 포함된다. 따라서, 치료는 상기 장애의 하나 또는 그 이상의 증후군들의 중증도 및 빈도를 감축시키거나 또는 감소시키거나 또는 예방하거나, 상기 장애의 진행 또는 악화를 안정화시키거나 또는 억제하고, 그리고 일부 경우들에 있어서는 상기 장애를 일시적으로 (예를 들어, 1 내지 6시간, 6 내지 12시간 또는 12 내지 24시간 동안), 중등 기간 동안(예를 들어, 1 내지 6일, 6 내지 12일, 12 내지 24일 또는 24 내지 48일) 또는 장기간(예를 들어, 1 내지 6주, 6 내지 12주, 12 내지 24주, 24 내지 48주, 또는 24 내지 48주 초과 동안) 역전시킬 수 있다. 따라서, 예를 들어, 고혈당 장애의 경우에 있어서, 치료는 혈당을 낮추거나 또는 감소시키고, 당 내성을 개선시키고, 당 대사를 개선시키고, 정상 혈당항상성을 제공하고, 인슐린 저항성을 낮추거나 또는 감소시키고, 인슐린 수준들을 낮추거나 감소시키거나 또는 대사증후군 또는 당뇨병 등과 같은 고혈당 장애와 연관되거나 그로부터 야기되는 조직병리학적 변화를 감축, 예방, 개선 또는 역전시킬 수 있다.
예를 들어, 펩티드 서열, 방법 또는 용도는 100㎎/㎗ 보다 높은, 예를 들어, 약 100 내지 125㎎/㎗, 또는 125㎎/㎗ 보다 높은 FPG 수준을 갖는 하나 또는 그 이상의 대상들에서, 5 내지 10%, 10 내지 20%, 20 내지 30% 또는 30 내지 50% 또는 그 이상으로, 또는 예를 들어 200㎎/㎗ 초과부터 200㎎/㎗ 미만까지로, 150㎎/㎗ 초과부터 150㎎/㎗ 미만까지, 125㎎/㎗ 초과부터 125㎎/㎗ 미만까지 등으로 당을 낮추거나 또는 감소시킬 수 있다. 게다가, 펩티드 서열, 방법 또는 용도는, 예를 들어, 약 5%, 6%, 7%, 8%, 9% 또는 10% 이상, 특히 5%, 6%, 또는 7%의 기준선 HbAIc 수준을 갖는 당뇨병전증 또는 당뇨병 (예를 들어, 제2형) 대상들에 대하여 당을 낮추거나 또는 감소시킬 수 있다.
고혈당 상태와 연관되는 조직병리학적 변화 개선의 비-제한적인 예에는, 예를 들어, 감축시키거나, 억제하거나, 감소시키거나 또는 제동시키는 것들이 포함된다: 췌장 세포들(예를 들어, β-세포들)의 파괴 또는 퇴화, 세관 석회화 또는 신장병 등과 같은 신장 손상, 간의 퇴화, 눈의 손상 (예를 들어, 당뇨망막병증, 백내장), 당뇨발, 입과 잇몸 등과 같은 점막 내의 궤양, 치주염, 과다 출혈, 손상 또는 상처들의 느리거나 또는 지연된 회복 (예를 들어, 당뇨성 종기를 야기), 피부 감염 및 다른 피부 장애, 심혈관 및 관상심장병, 말초혈관질환, 뇌졸증, 지질이상혈증, 고혈압, 비만 또는 앞서의 임의의 것들로 발전할 위험. 원치 않는 체질량 또는 비만의 개선에는, 예를 들어, 체질량의 감소 (BMI 또는 이와 같은 것에 의하여 반영되는 바와 같은) 또는 트리글리세리드, 콜레스테롤, LDL 또는 VLDL 수준들에서의 감소 등과 같은 연관 장애의 개선, 혈압의 감소, 혈관 내막 비후화의 감소, 심혈관 질환 또는 뇌졸증의 위험 감축 또는 감소, 안정시 심박수의 감소 등이 포함될 수 있다.
대상에 대한 용도 및/또는 대상을 치료하기 위한 "유효한 양(effective amount)" 또는 "충분한 양(sufficient amount)"은 단일 또는 다중 용량으로, 단독으로 또는 하나 또는 그 이상의 다른 조성물들(고혈당증 약물 또는 치료제들 등과 같은 치료제제들)과 조합으로, 치료, 방침 또는 치료요법제로, 임의의 시간(일시적, 중간 또는 장기간) 동안의 검출가능한 반응, 임의의 측정가능하거나 또는 검출가능한 정도 또는 임의의 기간(예를 들어, 수 시간, 수 일, 수 개월, 수 년 또는 치료된) 동안 대상에서 원하는 성과 또는 객관적이거나 또는 주관적인 잇점을 제공하는 양을 의미한다. 비록 상기 장애의 진행 또는 악화를 감소시키거나 또는 억제하는 것이 만족스러운 성과로 고려되더라도, 전형적으로 이러한 양들은 장애, 또는 하나, 복수개 또는 전체 이상 증후군들, 장애의 결과들 또는 합병증들을 측정가능한 정도로 개선하는데 유효한 양이다
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "개선하다(ameliorate)"는 대상의 장애 개선, 상기 장애의 중증도의 감소 또는 상기 장애의 진행 또는 악화의 억제(예를 들어, 상기 장애를 안정화시키는 것)를 의미한다. 고혈당 장애의 경우(예를 들어, 당뇨병, 인슐린 저항성, 당 불내성, 대사증후군 등)에 있어서, 예를 들어, 개선은 혈당을 낮추거나 또는 감소시키고, 인슐린 저항성을 감소시키고, 글루카곤을 감소시키고, 당 내성 또는 당 대사 또는 항상성을 증진시키는 것일 수 있다. 고혈당 장애에서의 개선에는 또한, 개선된 췌장 기능(예를 들어, β-세포/소섬 파괴의 억제 또는 예방 또는 β-세포 수 및/또는 기능의 향상), 본원에서 기술된 바와 같은 감염된 조직 또는 기관의 조직병리학적인 개선 등과 같은 상기 장애와 연관되거나 또는 그로부터 야기되는 병적 측면의 감소들이 포함된다. 원치 않는 체질량 또는 비만의 경우에 있어서, 예를 들어, 개선은 체중 증가의 감소, 체질량의 감소(예를 들어, 감소된 BMI로 반영되는 바와 같은) 또는, 예를 들어, 본원에서 기술된 바와 같은 원치 않는 체질량 비만과 연관되는 상태 (예를 들어, 혈당, 트리글리세리드, 콜레스테롤, LDL 또는 VLDL 수준들의 낮춤 또는 감소, 혈압의 감소, 혈관의 내막 비후화 감소 등)의 개선이 될 수 있다.
따라서 치료학적 잇점 또는 개선은 상기 장애 또는 질환과 연관되는 증후군, 합병증, 결과 또는 내재하는 원인들의 어느 하나, 대부분 또는 전부의 완전한 치료일 필요는 없다. 따라서, 대상 상태의 일시적, 중기적, 또는 장기적인 증식의 개선 또는 일정 기간 동안 (수 시간, 수 일, 수 주, 수 개월 등)에 걸친 상기 장애 또는 질환과 연관된 하나 이상의 이상 증후군 또는 합병증 또는 결과 또는 내재하는 원인, 악화 또는 진전의 발생, 빈도, 중증도, 진전의 부분적인 감소 또는 지속기간, 또는 억제 또는 역전에서의 부분적인 감소(예를 들어, 상기 상태, 장애 또는 질환의 하나 이상의 증후군 또는 합병증의 안정화)가 존재하는 경우, 만족스러운 종결점이 달성된다.
따라서, 본 발명의 펩티드 서열에 의하여 치료가능한 장애의 경우에 있어서, 장애를 개선하기에 충분한 펩티드의 양은 상기 장애의 형태, 중증도 및 정도 또는 상기 장애의 지속기간, 치료적 효과 또는 원하는 성과에 의존적이며, 당해 기술분야에서 숙련된 자에게는 용이하게 인지될 수 있을 것이다. 적절한 양들은 또한 개별 대상 (예를 들어, 상기 대상에서의 생물학적 이용가능성, 성별, 연령 등)에 의존적일 수 있다. 예를 들어, 비록 인슐린으로부터의 완전히 자유로운 결과를 갖지 않더라도, 대상에서 정상 당 항상성의 일시적, 또는 부분적 회복은 인슐린 주입 투여량 또는 빈도를 감소시킬 수 있다.
예를 들어, 유효량은 하나 또는 그 이상의 적절한 생리학적 효과들을 측정함으로써 인지될 수 있다. 고혈당 상태인 경우의 특정한 비-제한적인 예에 있어서, 혈당의 저감 또는 감소 또는 당 내성 시험의 증가가 상기 예시화된 펩티드 서열들의 아서열, 서열 변이체들 및 변형된 형태들(예를 들어, 표 1 내지 8 및 도 1에 나열된 서열들)을 포함하는 본 발명의 펩티드 서열의 양이 고혈당 상태를 치료하기에 유효한 지 여부를 결정하는 데 사용될 수 있다. 다른 특정의 비-제한적인 예들에 있어서, 유효량은 FPG의 임의의 수준(예를 들어, 기준선 수준)을 감소시키거나 또는 낮추기에 충분한 양이며, 예를 들어, 여기에서 FPG 수준을 200㎎/㎗ 초과 내지 200㎎/㎗ 미만으로 감소시키기에 충분한 양, FPG 수준을 175㎎/㎗ 내지 200㎎/㎗ 사이에서 투여-전 수준 미만으로 감소시키기에 충분한 양, FPG 수준을 150㎎/㎗ 내지 175㎎/㎗ 사이에서 투여-전 수준 미만으로 감소시키기에 충분한 양, FPG 수준을 125㎎/㎗ 내지 150㎎/㎗ 사이에서 투여-전 수준 미만으로 감소시키기에 충분한 양 등(예를 들어, FPG 수준을 125㎎/㎗ 미만, 120㎎/㎗ 미만, 115㎎/㎗ 미만, 110㎎/㎗ 미만 등)이다. HbAIc 수준의 경우에 있어서, 유효량은 약 10% 내지 9% 초과로, 약 9% 내지 8% 초과로, 약 8% 내지 7% 초과로, 약 7% 내지 6% 초과로, 약 6% 내지 5% 초과 등으로 수준들을 감소시키거나 낮추기에 충분한 양이 포함된다. 특히, 약 0.1%, 0.25%, 0.4%, 0.5%, 0.6%, 0.7%, 0.8%, 0.9%, 1%, 1.5%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 20%, 30%, 33%, 35%, 40%, 45%, 50% 또는 그 이상으로의 HbAIc 수준의 감소 또는 감축이 본 발명에 따른 유효량이다. 원치 않는 체질량 또는 비만의 경우에서의 또 다른 특정한 비-제한적인 예들에 있어서는, 유효량은 대상의 체질량지수(BMI)의 감소 또는 감축, 당의 감소 또는 감축, 트리글리세리드, 지질, 콜레스테롤, 지방산, LDL 및/또는 VLDL의 혈청/혈장 수준들의 감소 또는 감축시키기에 충분한 양이다. 그렇지만 다른 특정한 비-제한적인 예에서, 양은 앞서 언급된 매개변수들 중의 임의의 것을, 예를 들어, 약 0.1%, 0.25%, 0.4%, 0.5%, 0.6%, 0.7%, 0.8%, 0.9%, 1%, 1.5%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 20%, 30%, 33%, 35%, 40%, 45%, 50% 또는 그 이상으로 감소시키거나 감축시키기에 충분한 양이다.
대상을 치료하기 위한 본 발명의 방법들 및 용도들은 고혈당 장애 또는 원치 않는 체질량 또는 비만의 발달 등과 같은 대상에서의 장애를 예방하기 위한 방지에 적용가능하다. 대안적으로, 방법들 및 용도들은 대상의 치료 동안 또는 후속하여 수행될 수 있다. 예를 들어, 인슐린 또는 다른 당 저감 약물 또는 치료제를 사용하여 당을 낮추기 위한 대상의 치료에 앞서, 치료 동안 또는 후속하여, 예를 들어, 본 발명의 방법 또는 용도, 예를 들어 본 발명의 펩티드 서열이 상기 대상에 투여될 수 있다. 게다가, 본 발명의 펩티드 서열 등과 같은 조성물은, 예를 들어, 당 저감 약물 또는 치료제 등과 같은 다른 약물 또는 약제와 조합될 수 있다.
따라서, 대상을 치료하기 위한 본 발명의 방법들 및 용도들은 다른 치료에 앞서, 실질적으로 그와 동시에 또는 후속하여 수행될 수 있고, 그리고 다른 형태의 치료법들을 보충할 수 있다. 보조 요법들에는 인슐린, 인슐린 감수성 증강제 등과 같은 다른 당 저감 치료들 및 다른 약물 치료들, 식이의 변화(당, 지방 저감 등), 체중 감소 수술 (위 우회술, 위 절제술에 의한 위 용적의 감소), 위밴드삽입술, 위내 풍선삽입술, 위슬리브 등이 포함된다. 예를 들어, 고혈당 또는 인슐린 저항 장애를 치료하기 위한 본 발명의 방법 또는 용도는 대상의 당을 낮추거나 또는 인슐린 감수성을 증가시키는 약물들 또는 다른 약학적 조성물들과 조합하여 사용될 수 있다. 당뇨병을 치료하기 위한 약물들에는, 예를 들어, 비구아니드 및 설포닐우레아(예를 들어, 톨부타미드, 클로르프로파미드, 아세토헥사미드, 톨라자미드, 글리벤클라미드 및 글리피지드), 티아졸리딘디온(로시글리타존, 피오글리타존), GLP-1 유사체, 디펩티딜 펩티다아제-4(DPP-4) 억제제, 브로모크립틴 제형(예를 들어, 또한 담즙산 격리제(예를 들어, 콜레세벨람) 및 인슐린(볼루스 및 바살 유사체), 티아졸리딘디온(TZD)과 함께 또는 이것이 없는 메트포르민(예를 들어, 메트포르민 염산염) 및 SGLT-2 억제제들이 포함된다. 식욕 억제 약물들 또한 잘 알려져 있고 그리고 본 발명의 상기 방법들과 조합하여 사용될 수 있다. 보조요법들은 본 발명의 방법들 및 용도들 이전에, 동시적으로 함께 또는 후속하여 투여될 수 있다.
상기 예시화된 펩티드 서열들의 아서열, 서열 변이체들 및 변형된 형태들(표 1 내지 8 및 도 1에 나열된 서열들)을 포함하는 본 발명의 펩티드 서열들은 단위 투여량 또는 단위 투여량 형태로 제형화될 수 있다. 특정의 실시예에 있어서, 펩티드 서열은, 예를 들어, 고혈당증으로 인하여 치료를 필요로 하는 대상을 치료하기에 유효한 양으로 존재한다. 예시적인 단위 투여량들은 25 내지 250, 250 내지 500, 500 내지 1000, 1000 내지 2500 또는 2500 내지 5000, 5000 내지 25,000, 25,000 내지 50,000ng; 약 25 내지 250, 250 내지 500, 500 내지 1000, 1000 내지 2500 또는 2500 내지 5000, 5000 내지 25,000, 25,000 내지 50,000㎍; 및 약 25 내지 250, 250 내지 500, 500 내지 1000, 1000 내지 2500 또는 2500 내지 5000, 5000 내지 25,000, 25,000 내지 50,000㎎의 범위 이내이다.
상기 예시화된 펩티드 서열들의 아서열, 서열 변이체들 및 변형된 형태들(표 1 내지 8 및 도 1에 나열된 서열들)을 포함하는 본 발명의 펩티드 서열들은, 예를 들어, 효과적이거나 또는 충분한 양의 단일 투여량 또는 다중 투여량들로서 의도하는 효과를 제공하도록 투여될 수 있다. 예시적인 투여량들은 약 25 내지 250, 250 내지 500, 500 내지 1000, 1000 내지 2500 또는 2500 내지 5000, 5000 내지 25,000, 25,000 내지 50,000pg/㎏; 약 50 내지 500, 500 내지 5000, 5000 내지 25,000 또는 25,000 내지 50,000ng/㎏; 및 약 25 내지 250, 250 내지 500, 500 내지 1000, 1000 내지 2500 또는 2500 내지 5000, 5000 내지 25,000, 25,000 내지 50,000㎍/㎏의 범위 이내이다. 단일 또는 다중 투여량들은, 예를 들어, 매일, 연속 일에, 격일로, 매주 또는 간헐적으로 수회(예를 들어, 매주 2회, 매 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8주에 1회 또는 매 2, 3, 4, 5 또는 6개월에 1회) 투여될 수 있다.
상기 예시화된 펩티드 서열들의 아서열, 변이체들 및 변형된 형태들(표 1 내지 8 및 도 1에 나열된 서열들)을 포함하는 본 발명의 펩티드 서열들이 투여될 수 있고, 그리고 방법들은 임의의 경로에 의하여 전신적, 국부적 또는 국소적 투여를 경유하여 수행되는 방법일 수 있다. 예를 들어, 펩티드 서열은 비경구적으로(예를 들어, 피하로, 정맥 내로, 근육 내로 또는 복강 내로), 경구로(예를 들어, 섭취, 구강으로 또는 설하로), 흡입, 피부 내로, 공강 내로, 두개 내로, 경피로(국소적으로), 경점막으로 또는 직장으로 투여될 수 있다. 상기 예시화된 펩티드 서열들의 아서열들, 변이체들 및 변형된 형태들(표 1 내지 8 및 도 1에 나열된 서열들)을 포함하는 본 발명의 펩티드 서열들 및 약학적 조성물들을 포함하는 본 발명의 방법들은 (마이크로)캡슐화된 전달시스템 또는 투여를 위하여 이식물 내로 포장된 것을 통하여 투여될 수 있다.
본 발명은 "약학적 조성물(pharmaceutical compositions)"들을 추가로 제공하며, 이는 상기 예시화된 펩티드 서열들의 아서열들, 변이체들 및 변형된 형태들(표 1 내지 8 및 도 1에 나열된 서열들)을 포함하는 본 발명의 펩티드 서열(또는 서열들) 및 하나 또는 그 이상의 약학적으로 허용가능한 또는 생리학적으로 허용가능한 희석제, 담체 또는 부형제를 포함한다. 특정의 실시예들에 있어서, 펩티드 서열 또는 서열들은 치료학적으로 허용가능한 양으로 존재한다. 상기 약학적 조성물들은 본 발명에 따른 방법들 및 용도들에 따라 사용될 수 있다. 그러므로 예를 들어, 상기 약학적 조성물들은 본 발명의 치료법들 및 용도들을 실행하기 위하여 대상에 ex vivo 또는 in vivo 로 투여될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물들은 의도하는 투여의 방법 또는 경로에 적합하도록 제형화될 수 있으며; 예시적인 투여의 경로들이 본원에서 기술된다. 게다가, 상기 약학적 조성물들은 본원에서 기술되는 바와 같은 여러 질환들 및 장애들의 치료 또는 예방에 사용될 수 있는, 본원에서 기술되거나 또는 당해 기술분야에서 숙련된 자들에게 공지된 다른 치료학적으로 활성인 약제들 또는 화합물들(예를 들어, 당 저감 약제들)을 더 포함할 수 있다.
약학적 조성물들은 전형적으로 상기 예시화된 펩티드 서열들의 아서열들, 변이체들 및 변형된 형태들(표 1 내지 8 및 도 1에 나열된 서열들)을 포함하는 본 발명의 상기 펩티드 서열들 중 적어도 하나를 치료학적으로 유효한 양으로 포함하고 그리고 하나 또는 그 이상의 약학적으로 그리고 생리학적으로 허용가능한 제형 약제들을 포함한다. 적절한 약학적으로 허용가능하거나 또는 생리학적으로 허용가능한 희석제, 담체 또는 부형들에는 항산화제(예를 들어, 아스코르빈산 및 소듐바이설페이트), 보존제 (예를 들어, 벤질알코올, 메틸파라벤, 에틸 또는 n-프로필, p-하이드록시벤조에이트), 유화제, 현탁제, 분산제, 용매, 충진제, 증량제, 완충제, 비히클, 희석제 및/또는 보조제들이 포함되나, 이들로 제한되는 것은 아니다. 예를 들어, 적절한 비히클은 가능하게는 비경구적 투여를 위한 약학적 조성물들에서 통상적인 다른 물질들로 보충된 생리학적 식염수 또는 구연산염 완충 염수일 수 있다. 중성으로 완충된 염수 또는 혈청 알부민과 혼합된 염수가 다른 예시적인 비히클들이다. 당해 기술분야에서 숙련된 자들에게는 본 발명에서 사용되는 약학적 조성물들 및 투여량 형태들에서 사용될 수 있는 다양한 완충제들이 쉽게 인식될 수 있을 것이다. 전형적인 완충제들에는 약학적으로 허용가능한 약산, 약염기 또는 이들의 혼합물들이 포함되나, 이들로 제한되는 것은 아니다. 완충성분들에는 또한 인산, 타르타르산, 젖산, 숙신산, 구연산, 초산, 아스코르빈산, 아스파르트산, 글루탐산 및 이들의 염들 등과 같은 수용성 물질들이 포함된다.
비히클 내의 주용매는 속성에 있어서 수성 또는 비-수성 중의 하나일 수 있다. 게다가, 상기 비히클은 상기 약학적 조성물의 pH, 삼투성, 점도, 살균도 또는 안정성을 조절하거나 또는 유지하기 위한 다른 약학적으로 허용가능한 부형제들을 포함할 수 있다. 특정의 실시예들에 있어서, 상기 약학적으로 수용가능한 비히클은 수성 완충제이다. 다른 실시예들에 있어서, 비히클은, 예를 들어, 염화나트륨 및/또는 구연산나트륨을 포함한다.
본 발명의 약학적 조성물들은 본 발명의 펩티드의 방출의 속도를 조절하거나 유지하기 위한 또 다른 약학적으로 허용가능한 제형화제들을 포함할 수 있다. 이러한 제형화제들에는 지연방출 제형들을 제조하는 숙련된 당업자에게는 공지된 그러한 물질들이 포함된다. 약학적으로 그리고 생리학적으로 수용가능한 제형화제들의 참고를 위하여는, 예를 들어, 문헌 Remington's Pharmaceutical Sciences, 18 판. (1990, Mack Publishing Co., Easton, Pa. 18042) 1435-1712 쪽, The Merck Index, 12 판. (1996, Merck Publishing Group, Whitehouse, NJ); 및 Pharmaceutical Principles of Solid Dosage Forms (1993, Technonic Publishing Co., Inc., Lancaster, Pa.)을 참조하라. 투여에 적절한 추가적인 약학적 조성물들은 당해 기술분야에서는 공지된 것이며, 본 발명의 상기 방법들 및 조성물들에 적용이 가능하다.
약학적 조성물은 용액, 현탁액, 겔, 에멀젼, 고체 또는 탈수되거나 또는 동결건조된 분말로서 멸균 바이알 내에 저장될 수 있다. 이러한 조성물들은 사용준비형(ready to use form), 사용에 앞서 재구성(reconstitution)이 필요한 동결건조형, 사용에 앞서 희석이 필요한 액체형 또는 다른 허용가능한 형태들로 저장될 수 있다. 일부 실시예들에 있어서, 약학적 조성물은 일회용 용기(예를 들어, 일회용 바이알, 앰플, 주사기 또는 자기 주사기(예를 들어, 에피펜®(Epipen®)과 유사한)로 제공되는 반면에, 다른 실시예들에 있어서는 다회용 용기(예를 들어, 다회용 바이알)로 제공된다. 이식물(implants)(예를 들어, 이식가능한 펌프) 및 카테터 시스템들을 포함하는 임의의 약물전달장치가 본 발명의 펩티드들을 전달하는 데 사용될 수 있고, 이것은 당 분야에 속하는 통상의 기술자에게 모두 알려져 있다. 일반적으로 피하로 또는 근육 내로 투여되는 데포 주사(depot injections)들이 또한 한정된 기간에 걸쳐 본 발명의 펩티드들을 방출하는 데 활용될 수 있다. 데포 주사들은 대개는 고형- 또는 오일-기반이고 그리고 일반적으로 본원에서 기술된 제형 성분들 중의 적어도 하나를 포함한다. 당해 기술분야에서 숙련된 자에게는 데포 주사들의 가능한 제형들 및 용도들에 친숙하다.
약학적 조성물은 의도하는 투여의 경로에 적합하게 되도록 제형화될 수 있다. 따라서, 약학적 조성물들은 비경구적(예를 들어, 피하로(s.c.), 정맥 내로, 근육 내로 또는 복강 내로), 피부 내로, 경구로(예를 들어, 섭취), 흡입, 공강 내로, 두개 내로 및 경피로(국소적으로)를 포함하는 경로들에 의한 투여에 적절한 담체들, 희석제들 또는 부형제들을 포함한다.
약학적 조성물들은 멸균의 주사가능한 수성 또는 유지성 현탁액의 형태일 수 있다. 이 현탁액은 본원에 개시 또는 당해 기술분야에서 숙련된 자들에게 공지된 적절한 분산 또는 적심제들 및 현탁제를 사용하여 제형화될 수 있다. 상기 멸균의 주사가능한 제제는 또한 비-독성의 비경구적으로-허용가능한 희석제 또는 용매 내의 멸균의 주사 가능한 용액 또는 현탁액, 예를 들어, 1,3-부탄디올 내의 용액이 될 수 있다. 사용될 수 있는 수용가능한 희석제들, 용제들 및 분산 매질에는 물, 링거액(Ringer's solution), 등장의 염화나트륨 용액, 크레모포어 이엘™(Cremophor EL™: 미합중국 뉴저지주 파시파니 소재 바스프사(BASF)) 또는 인산염 완충 염수(PBS), 에탄올, 폴리올(예를 들어, 글리세롤, 프로필렌글리콜 및 액체 폴리에틸렌글리콜), 및 적절한 이들의 혼합물들이 포함된다. 게다가, 멸균의, 불휘발성유들이 통상적으로 용제 또는 현탁 매질로 사용된다. 이러한 목적을 위하여, 합성 모노글리세라이드 또는 디글리세라이드들을 포함하는 임의의 무자극성의 불휘발성유가 사용될 수 있다. 더욱이, 올레산 등과 같은 지방산들이 주사가능한 제제들에서 사용되는 것을 발견하였다. 특정의 주사가능한 제형들의 흡수 연장이 흡수를 지연시키는 약제(예를 들어, 알루미늄모노스테아레이트 또는 젤라틴)를 포함함으로서 달성될 수 있다.
약학적 조성물들은, 예를 들어, 정제, 캡슐, 트로키, 로젠지, 수성 또는 유성 현탁액, 분산가능한 분말 또는 과립, 에멀젼, 경질 또는 연질 캡슐 또는 시럽, 용액, 마이크로비드 또는 엘릭시르로서 경구용으로 적절한 형태가 될 수 있다. 경구용으로 의도된 약학적 조성물들은 약학적 조성물들의 제조를 위하여 당해 기술분야에서 공지된 임의의 방법에 따라 제조될 수 있다. 이러한 조성물들은 약학적으로 세련되고 그리고 맛이 좋은 제제들을 제공하기 위하여 감미제, 향미제, 착색제 및 보존제 등과 같은 하나 또는 그 이상의 약제들을 포함할 수 있다. 본 발명의 펩티드로 구성된 정제는 정제들의 제조에 적절한 비-독성의 약학적으로 허용가능한 부형제들과의 혼합물일 수 있다. 이들 부형제들에는, 예를 들어, 탄산칼슘, 탄산나트륨, 락토오스, 인산칼슘 또는 인산나트륨 등과 같은 희석제; 과립화 및 붕해제, 예를 들어, 옥수수 녹말 또는 알긴산; 결합제, 예를 들어, 녹말, 젤라틴 또는 아카시아 및 활제, 예를 들어, 마그네슘스테아레이트, 스테아린산 또는 활석 들이 포함된다.
경구 투여에 적절한 정제, 캡슐 등은 코팅되지 않을 수 있거나 또는 이들은 공지된 기술들에 의하여 위장관 내에서의 붕해 및 흡수를 지연시키기 위하여 그리고 그에 의하여 장기간에 걸친 지연된 작용을 제공하도록 코팅될 수 있다. 예를 들어, 글리세릴모노스테아레이트 또는 글리세릴디스테아레이트 등과 같은 시간 지연 물질이 사용될 수 있다. 이들은 또한 당해 기술분야에서 공지된 기술들에 의하여 코팅되어 제어방출을 위한 삼투성 치료학적 정제를 형성할 수 있다. 투여된 조성물의 전달을 제어하기 위한 별도의 약제들에는 폴리에스테르, 폴리아민산, 하이드로겔, 폴리비닐피롤리돈, 폴리안하이드라이드, 폴리글리콜산, 에틸렌-비닐아세테이트, 메틸셀룰로오스, 카르복시메틸셀룰로오스, 프로타민설페이트 또는 락타이드/글리콜리드 공중합체, 폴리락타이드/글리콜리드 공중합체 또는 에틸렌비닐아세테이트 공중합체 등과 같은 생분해성 또는 생체적합성 입자 또는 중합체성 물질들이 포함된다. 예를 들어, 상기 경구 약제는 코아서베이션 기술에 의하여 또는 계면중합에 의하여, 각각 하이드록시메틸셀룰로오스 또는 젤라틴-마이크로캡슐 또는 폴리(메틸메타크로레이트) 마이크로캡슐의 사용에 의하여 제조된 마이크로캡슐 내에 또는 콜로이드 약물 전달 시스템 내에 포획될 수 있다. 콜로이드 분산 시스템에는 거대분자 복합체, 나노-캡슐, 마이크로스페어, 마이크로비드 및 유중수 에멀젼, 미셀, 혼성 미셀 및 리포좀을 포함하는 지질-기반 시스템이 포함된다. 이러한 제형들의 제조방법들은 당해 기술분야에서 숙련된 자들에게는 공지된 것이고 그리고 상용적으로 획득가능하다.
경구용 제형들은 경질 젤라틴 캡슐로서, 상기 활성성분이 비활성의 고체 희석제들, 예를 들어, 탄산칼슘, 인산칼슘, 카올린 또는 미결정 셀룰로오스와 혼합되는 것, 또는 연질 젤라틴 캡슐로서 상기 활성성분이 물 또는 오일 매질, 예를 들어, 땅콩유, 액상 파라핀 또는 올리브유와 혼합되는 것으로 제공될 수 있있다.
수성 현탁액은 그의 제조에 적절한 부형제들과의 혼합물 내에 활성 물질을 포함한다. 이러한 부형제들은 현탁제들, 예를 들어, 소듐카르복시메틸셀룰로오스, 메틸셀룰로오스, 하이드록시-프로필메틸셀룰로오스, 소듐알지네이트, 폴리비닐-피롤리돈, 트라가간트검 및 아카시아검이고; 분산 또는 적심제들은 자연적으로-발생하는 인지질, 예를 들어, 레시틴, 또는 알킬렌옥사이드와 지방산의 축합생성물, 예를 들어, 폴리옥시-에틸렌 스테아레이트, 또는 에틸렌옥사이드와 장쇄 지방족 알코올의 축합 생성물, 예를 들어, 헵타데카에틸렌옥시세탄올, 또는 폴리옥시에틸렌솔비톨모노올레이트 등과 같은 지방산과 헥시톨로부터 유래된 부분 에스테르와 에틸렌옥사이드의 축합 생성물, 또는 지방산과 헥시톨 무수물로부터 유래된 부분 에스테르와 에틸렌옥사이드의 축합 생성물, 예를 들어, 폴리에틸렌소르비탄모노올레이트가 될 수 있다. 상기 수성 현탁액들은 또한 하나 또는 그 이상의 보존제들을 포함할 수 있다.
유성 현탁액은 상기 활성성분을 식물유, 예를 들어, 땅콩유, 올리브유, 참기름 또는 코코넛유 내에 또는 액상 파라핀 등과 같은 광물유 내에 현탁시키는 것에 의하여 제형화될 수 있다. 상기 유성 현탁액들은 증점제, 예를 들어, 봉밀랍, 경질 파라핀 또는 세틸알코올을 포함할 수 있다. 상기 기술한 바와 같은 감미제들 및 향미제들이 입에 맞는 경구 제제를 제공하기 위하여 추가될 수 있다.
수성 현탁액의 제조에 적절한, 물 첨가에 의하여 분산가능한 분말 및 과립들은 분산 또는 적심제, 현탁제 및 하나 또는 그 이상의 보존제들과의 혼합물 내에 상기 활성성분을 제공한다. 적절한 분산 또는 적심제들 및 현탁제들이 본원에 예시되어 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 또한 유중수형 에멀젼의 형태가 될 수 있다. 오일상은 식물유, 예를 들어, 올리브유 또는 땅콩유 또는 광물유, 예를 들어, 액상 파라핀 또는 이들의 혼합물이 될 수 있다. 적절한 유화제들은 자연적으로-발생하는 검, 예를 들어, 아카시아검 또는 트라가간트검; 자연적으로-발생하는 인지질, 예를 들어, 대두, 레시틴 및 지방산들로부터 유래되는 에스테르 또는 부분 에스테르; 헥시톨 무수물, 예를 들어, 소르비탄모노올레이트; 및 부분 에스테르와 에틸렌옥사이드의 축합 생성물, 예를 들어, 폴리옥시에틸렌소르비탄모노올레이트가 될 수 있다.
약학적 조성물들은 또한 담체, 예컨대 이식물, 리포좀, 하이드로겔, 전구약물 및 마이크로캡슐화된 전달 시스템들을 포함하는 제어방출제형 등을 신체로부터의 빠른 분해 또는 제거에 대하여 상기 조성물을 보호하도록 포함한다. 예를 들어, 글리세릴모노스테아레이트 또는 글리세릴스테아레이트 단독 또는 왁스와의 조합 등과 같은 시간 지연 물질이 사용될 수 있다. 흡수를 지연시키는 약제, 예를 들어, 알루미늄모노스테아레이트 또는 젤라틴을 포함시킴으로써 주사가능한 약학적 조성물들의 연장된 흡수가 달성될 수 있다. 여러 항균 및 항진균제들, 예를 들어, 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 아스코르빈산, 티메로살 등에 의하여 미생물들의 작용의 예방이 달성될 수 있다.
본 발명은 또한 직장 투여를 위한 좌약 형태에 본 발명의 펩티드들을 포함한다. 상기 좌약은 본 발명의 펩티드와 적절한 비-자극적인 첨가제와의 혼합에 의하여 제조될 수 있으며, 이것은 정상 온도에서는 고체이나 직장 온도에서는 액체이고, 따라서 직장에서 약물을 방출시키도록 용융된다. 이러한 물질들에는 코코아버터 및 폴리에틸렌글리콜이 포함되나, 이들로 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 따르면, 상당한 간세포 암종(HCC) 활성 없이 당 저감 활성을 갖는 펩티드(또는 본원에서 기술된 바와 같은 아서열, 변이체 및 변형된 형태)를 동정하는 방법이 제공된다. 하나의 실시예에 있어서, 방법에는: 당 저감 활성을 위한 펩티드 서열(또는 본 출원에서 규정되는 바와 같은 아서열, 변이체 또는 변형된 형태)을 스크리닝(예를 들어, 분석 또는 측정); 및 HCC 활성 또는 HCC 활성과 연관되는 마커(marker)의 발현에 대한 펩티드 서열(또는 본 출원에서 규정되는 바와 같은 아서열, 변이체 또는 변형된 형태)의 스크리닝(예를 들어, 분석 또는 측정)이 포함된다. 당 저감 활성을 가지며, 감소되거나 또는 HCC 활성이 없는 펩티드에 의하여 상기 펩티드를 동정한다. 특정의 관점들에 있어서, HCC 활성과 연관되는 상기 마커는 지질 프로파일- FGF19와 비교하여 적은 지질 증가 활성을 갖는 펩티드는 그 펩티드가 감소된 HCC 활성을 갖거나 또는 HCC 활성이 없음을 나타냄을 포함하거나; 또는 HCC 활성과 연관되는 상기 마커는 알도-케토 환원효소 유전자 발현- FGF19와 비교하여 알도-케토 환원효소 유전자 발현을 하향-조절(down-regulates)하거나 또는 감소시키는 펩티드는 그 펩티드가 감소된 HCC 활성을 갖거나 또는 HCC 활성이 없음을 나타냄을 포함하거나; 또는 HCC 활성을 나타내는 상기 마커가 Slc1a2 유전자 발현- FGF19와 비교하여 Slc1a2 유전자 발현을 상향-조절(up-regulates) 또는 증가시키는 펩티드는 그 펩티드가 감소된 HCC 활성을 갖거나 또는 HCC 활성이 없음을 나타내는 것을 포함한다.
용어들 "분석(assaying)" 및 "측정(measuring)" 및 이들의 문법적인 변형들은 본 출원에서 상호호환적으로 사용되며 정량적이거나 또는 정성적인 결정들 또는 정량적이고 그리고 정성적인 결정들 둘 다를 의미한다. 상기 용어들이 검출과 관련하여 사용되는 경우, 본원에서 기술되고 그리고 당해 기술분야에서 공지된 여러 방법들을 포함하여 상대량을 평가하는 임의의 수단들이 고려된다. 예를 들어, 노던 블럿(Northern blot), 웨스턴 블럿(Western blot), 면역침강분석에 의하거나 또는 발현된 단백질(예를 들어, 알도-케토 환원효소 또는 Slc1a2)의 활성, 기능 또는 양을 측정하는 것에 의하여 유전자 발현이 평가되거나 또는 측정될 수 있다.
간암의 가장 흔한 형태인 HCC에 대한 위험인자들에는 제2형 당뇨병(아마도 비만에 의해 악화된)이 포함된다. 제2형 당뇨병에서의 HCC의 위험은 당뇨병 및 치료 방침의 지속기간에 의존적으로 더 커진다(비-당뇨병성 위험의 약 2.5 내지 약 7배).
HCC의 스크리닝 및 진단에는 여러 방법론들이 사용될 수 있고 그리고 당해 기술분야에서 숙련된 자들에게 잘 알려져 있다. HCC에 대한 지시자들에는 상승된 알파-페토단백질(AFP) 또는 데스-감마카르복시프로트롬빈(DCP) 수준 등과 같은 종양 마커의 검출이 포함된다. 초음파, 컴퓨터 단층촬영(CT scans) 및 자기공명영상(MRI)을 포함하는 다수의 서로 다른 주사 및 영상화 기술들이 또한 유용하다. 본 발명과 관련하여, 펩티드(예를 들어, 후보 펩티드)가 HCC를 유발하는 증거를 나타내는 지의 여부의 평가는 in vivo 에서, 예를 들어, db/db 마우스 등과 같은 동물 모델에서, 야생형(wild type) FGF19에 의한 HCC 소결절 형성과 비교하여 펩티드가 투여된 동물 모델에서의 HCC 소결절을 정량하는 것에 의하여 결정될 수 있다. 거시적으로, 간암은 결절성일 수 있으며, 이 경우 종양 결절들(원형 내지 타원형(round-to-oval)의, 회색 또는 녹색의, 국한성이나 캡슐화되지는 않은)이 하나의 큰 덩어리 또는 복수의 보다 작은 덩어리들로 나타난다. 대안적으로, HCC는 확산되고 그리고 거의 국한되지 않으며 종종 간문맥들을 침윤하는 침윤성 종양으로서 존재할 수 있다.
간조직 시료들의 병리적 평가는 일반적으로 하나 또는 그 이상의 앞서 언급된 기술들의 결과들이 HCC의 존재가능성을 나타낸 후에 수행된다. 그러므로 본 발명의 방법은 펩티드 서열이 HCC를 유발하는 증거를 나타내는 지의 여부를 결정하기 위하여 HCC 연구에서 유용한 in vivo 동물모델(예를 들어, db/db 마우스) 유래의 간조직 시료를 평가하는 것을 더 포함한다. 미시적 평가에 의하여, 병리학자는 HCC의 4개의 일반적인 구조적 및 세포학적 형태들(패턴들)(즉, 섬유층판, 가성선(pseudoglandular)(선양(adenoid)), 다형성(거세포(giant cell) 및 투명세포) 중의 하나가 존재하는 지의 여부를 결정할 수 있다.
본 발명은 또한 상기 예시화된 펩티드 서열들의 아서열, 서열 변이체 및 변형된 형태들(표 1 내지 8 및 도 1에 나열된 펩티드들을 포함)을 포함하는 본 발명의 펩티드 서열들을 결합하는 항체들 및 그들 절편들의 생성 및 용도를 포함한다.
본 출원에서 사용된 바와 같이, 용어 "항체(antibodies)"(Abs) 및 "면역글로블린(immunoglobulins)"(Igs)들은 동일한 구조적 특징들을 갖는 당단백질을 의미한다. 항체는 항원에 대하여 결합 특이성을 나타내는 반면, 면역글로블린은 항체 및 항원 특이성을 결여할 수 있는 다른 항체-유사 분자 둘 다를 포함한다.
상기 용어 "항체"는 무손상(intact) 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 적어도 2개의 무손상 항체들로부터 형성되는 다특이성 항체(예를 들어, 양특이성 항체(bispecific antibodies)) 및 원하는 생물학적 활성을 나타내도록 제공하는 Fab 및 F(ab)'2를 포함하는 항체 결합 절편을 포함한다. 기본 항체 구조 단위에는 사량체(tetramer)가 포함되고, 그리고 각 사량체는 2개의 동일한 폴리펩티드쇄들의 쌍들로 이루어지고, 각 쌍의 하나는 "경쇄" (약 25 kDa) 및 하나는 "중쇄"(약 50 내지 70kDa)이다. 각 쇄의 아미노-말단부는 1차로 항원 인식을 담당하는 약 100 내지 110개 또는 그 이상의 아미노산 가변영역(variable region)을 포함한다. 대조적으로, 각 쇄의 카르복시-말단부는 1차로 효과기 기능을 담당하는 불변영역(constant region)을 한정한다. 인간 경쇄들은 카파(kappa) 및 람다(lambda) 경쇄들로 분류되는 한편, 인간 중쇄들은 뮤(mu), 델타(delta), 감마(gamma), 알파(alpha) 또는 입실론(epsilon)으로 분류되고 그리고 각각 IgM, IgD, IgA 및 IgE로 항체들의 동종형으로 정의된다. 결합 단편들은 재조합 DNA 기술들에 의하거나 또는 무손상 항체들의 효소적 또는 화학적 절단에 의하여 생성된다. 결합 단편들에는 Fab, Fab', F(ab')2, Fv 및 단쇄 항체들이 포함된다.
각 중쇄는 일측단부에 가변도메인(variable domain: VH)과 후속하는 다수의 불변도메인(constant domains)들을 갖는다. 각 경쇄는 일측단부에 가변도메인(VL) 및 타측단부에 불변도메인을 갖고; 상기 경쇄의 상기 불변도메인은 상기 중쇄의 제1 불변도메인과 정렬되고, 그리고 상기 경쇄 가변도메인은 상기 중쇄의 상기 가변도메인과 정렬된다. 경쇄와 중쇄들 내에서, 상기 가변영역들과 불변영역들은 약 12 또는 그 이상의 아미노산들의 "J" 영역에 의하여 또한 약 10개 이상의 아미노산들의 "D" 영역을 포함하는 상기 중쇄와 결합된다. 상기 항체쇄들 모두는 3개의 초-가변영역(hyper-variable regions)들에 의하여 결합되는, 상대적으로 보존된 프레임워크 영역(framework regions: FR)의 동일한 일반 구조를 나타내고, 이는 또한 상보성-결정영역(complementarity-determining regions)들 또는 CDRs로 불린다. 각 쌍의 상기 2개의 쇄들의 상기 상보성-결정영역들은 상기 프레임워크 영역들에 의하여 정렬되어 특이적인 에피토프에 결합하는 것을 가능하게 한다. N-말단으로부터 C-말단까지, 두 경쇄 및 중쇄들은 도메인 FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 및 FR4들을 포함한다.
무손상 항체는 2개의 결합자리들을 가지며, 양기능성 또는 양특이성 항체들에서를 제외하고는, 상기 2개의 결합자리들은 동일하다. 양특이성 또는 양기능성 항체는 2개의 서로 다른 중/경쇄쌍들 및 2개의 서로 다른 결합자리들을 갖는 인공의 하이브리드 항체이다. 양특이성 항체들은 하이브리도마들의 융합 또는 Fab' 단편들의 연결을 포함하는 다양한 방법들에 의하여 생산될 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "모노클로날 항체(monoclonal antibody)"는 실질적으로 동종의 항체들의 개체군(population)으로부터 수득되는 항체, 즉 상기 개체군에 포함된 개개 항체들에서 소량으로 존재할 수 있는 자연적으로 발생 가능한 돌연변이들을 제외하고는 동일한 항체를 의미한다. 모노클로날 항체들은 단일의 항원성 자리에 대하여 지향되는 고도로 특이적인 것이다. 서로 다른 결정자들(에피토프들)에 대하여 지향되는 서로 다른 항체들을 포함하는 폴리클로날 항체 제제들과는 대조적으로, 각 모노클로날 항체는 항원 상의 단일의 결정자에 대하여 지향된다.
"중화 항체(neutralizing antibody)"는 이것이 결합하는 표적 항원의 효과기 기능을 제거하거나 또는 명백하게 감소시킬 수 있는 항체 분자이다.
항체 결합 절편들은 무손상 항체들의 효소적 또는 화학적 절단에 의하여 생산될 수 있다. 파파인 효소를 이용한 항체들의 소화는 "Fab" 절편들 및 항원-결합 활성을 갖지 않는 "Fc" 절편으로 알려진 2개의 동일한 항원-결합 절편들을 생성한다. 펩신 효소를 이용한 항체들의 소화는 상기 항체 분자의 2개의 팔(arms)들이 결합된 채로 남아있고 2개의 항원 결합 자리들을 포함하는 F(ab')2 단편을 생성한다. 상기 F(ab')2 절편은 항원을 가교결합시키는 능력을 갖는다.
용어 "Fab"는 상기 경쇄의 불변도메인 및 상기 중쇄의 CH1도메인을 포함하는 항체의 절편을 의미한다. 용어 "Fv"는, 본 출원에서 사용되는 경우, 항원-인식 및 항원-결합 자리들 둘 다를 보유하는 항체의 최소 절편을 의미한다. 2-쇄 Fv 종(two-chain Fv species)들에 있어서, 이 영역은 비-공유 결합의 하나의 중쇄 및 하나의 경쇄 가변도메인의 이량체로 이루어진다. 단일-쇄 Fv 종(single-chain Fv species)들에 있어서, 하나의 중쇄 및 하나의 경쇄 가변도메인이 가요성의 펩티드 링커(flexible peptide linker)에 의하여 공유적으로 결합되어 상기 경쇄와 중쇄들이 2-쇄 Fv 종들의 그것과 유사한 "이량체성(dimeric)" 구조로 결합되도록 할 수 있다. 이러한 구성에서 각 가변도메인의 3개의 CDR들이 상호작용하여 상기 VH-VL 이량체의 표면 상의 항원-결합 자리를 한정한다. 6개의 CDR들이 집합적으로 상기 항체에 대한 항원-결합 특이성을 부여하는 한편으로, 심지어 단일 가변도메인(또는 항원에 대하여 특이적인 3개의 CDR들만을 포함하는 Fv의 절반)도 항원을 인식하고 그리고 결합하는 능력을 갖는다.
용어 "상보성결정영역들" 또는 "CDRs"은 특정의 리간드와 접촉하고 그리고 그의 특이성을 결정하는 면역 수용체들의 부분들을 의미한다. 용어 "초가변영역(hypervariable region)"은 항원-결합을 담당하는 항체의 아미노산 잔기들을 의미한다. 상기 초가변영역은 대체로 "상보성결정영역" 또는 "CDR" 유래의 아미노산 잔기들 및/또는 "초가변루프(hypervariable loop)" 유래의 그러한 잔기들을 포함한다.
본 출원에서 사용된 바와 같이, 용어 "에피토프(epitope)"는 단백질 항원들에 대한 항체들을 위한 결합자리들을 의미한다. 에피토프성 결정자들은 특정의 3차원의 구조적 및 하전 특성들뿐만 아니라 대개 아미노산 또는 당 측쇄 등과 같은 분자들의 화학적으로 활성인 표면 그룹화로 이루어진다. 해리상수가 1μM 이하(≤1μM), 바람직하게는 100μM 이하, 그리고 가장 바람직하게는 10nM 이하인 경우 항체가 항원에 결합한다고 한다. 증가된 평형상수(equilibrium constant: "K D ")는 상기 에피토프와 상기 항체 사이에 친화도가 덜한 반면에, 감소된 평형상수는 상기 에피토프와 상기 항체 사이에 더 높은 친화도가 존재한다는 것을 의미한다. 특정한 양 "이하(no more than)"의 K D 를 갖는 항체는 상기 항체가 주어진 K D 또는 그 이상을 갖는 상기 에피토프에 강하게 결합할 수 있다는 것을 의미한다. K D 가 에피토프 및 항체의 결합 특성들을 기술하는 반면에, "역가(potency)"는 상기 항체의 기능에 대한 상기 항체 자체의 효율성을 기술한다. 평형상수와 역가 사이에 필수적으로 상관관계가 존재하는 것은 아니며; 따라서, 예를 들어, 상대적으로 낮은 K D 가 자동적으로 높은 효율성을 의미하는 것은 아니다.
항체와 관련하여 용어 "선택적으로 결합(selectively binds)"은 상기 항체가 단일의 물질에만 결합한다는 것을 의미하는 것은 아니며, 오히려 제1 물질에 대한 상기 항체의 K D 가 제2 물질에 대한 상기 항체의 K D 보다 적다는 것을 의미한다. 하나의 에피토프에 배타적으로 결합하는 항체는 그 단일의 에피토프에만 결합한다.
인간에 투여되는 경우, 설치류(쥣과 동물(murine) 또는 랫트(rat)) 가변 및/또는 불변영역들로 구성된 항체들은 때때로, 예를 들어, 신체로부터의 빠른 제거율 또는 상기 항체에 대한 상기 신체의 면역 반응의 생성과 연관된다. 설치류-유래 항체들의 활용을 피하기 위하여, 인간 항체 기능을 설치류 내로 도입시켜 상기 설치류가 완전 인간 항체를 생성하도록 하는 것을 통해 완전 인간 항체들을 생산할 수 있다. 본원에서 특이적으로 정의하지 않는 한, "인간(human)" 및 "완전 인간(fully human)" 항체들은 본 출원에서 상호호환적으로 사용될 수 있다. 상기 용어 "완전 인간"은 완전한 또는 충분한 인간 유래 항체들과, 오직 부분적인 인간 항체들을 구별하는 경우에 유용할 수 있다. 당해 기술분야에서 숙련된 자는 완전 인간 항체들을 생성하는 여러 방법들을 인지하고 있다.
가능한 인간 항-마우스 항체 반응들을 설명하기 위하여, 키메라 또는 달리 인간화된 항체들이 활용될 수 있다. 키메라 항체들은 인간 불변영역 및 쥣과의 가변영역을 가지며, 그리고, 그에 의해서 인간 항-키메라 항체 반응들이 일부 환자들에서 관측될 수 있다. 그러므로, 가능한 인간 항-마우스 항체 또는 인간 항-키메라 항체 반응들을 피하기 위하여 다중 효소들에 대한 완전 인간 항체들을 제공하는 것이 유익하다.
완전 인간 모노클로날 항체들은, 예를 들어, 당해 기술분야에서 숙련된 자들에게 공지된 기술들에 의한 하이브리도마 세포주들의 생성에 의하여 제조될 수 있다. 다른 제조방법들에는 예컨대 중국 햄스터 난소세포(CHO 세포) 등과 같은 적절한 포유동물 숙주 세포의 형질전환을 위한 특정의 항체들을 암호화하는 서열들의 사용이 포함된다. 형질전환은, 예를 들어, 바이러스 내 (또는 바이러스성 벡터로의) 폴리뉴클레오티드 패키징 및 상기 바이러스(또는 벡터)를 수반하는 숙주 세포를 형질도입하는 것에 의하거나 또는 당해 기술분야에서 공지된 형질감염 절차를 포함하는, 숙주 세포로 폴리뉴클레오티드를 도입하기 위해 알려진 임의의 방법에 의하여 이루어질 수 있다. 이종의 폴리뉴클레오티드를 포유동물 세포 내로 도입하기 위한 방법들은 당해 기술분야에서는 잘 알려져 있으며, 덱스트란-매개 형질감염, 인산칼슘 침강, 폴리브렌-매개 형질감염, 원형질체 융합, 전기천공, 리포좀 내의 폴리뉴클레오티드(들)의 캡슐화 및 핵 내로의 DNA 직접적 현미주입이 포함된다. 발현을 위한 숙주들로부터 획득가능한 포유동물 세포주들은 당해 기술분야에서는 잘 알려져 있으며, 중국 햄스터 난소세포, 헬라세포(HeLa cells) 및 인간 간세포 암종 세포들이 포함되나, 이들로 제한되는 것은 아니다.
항체는 진단용으로 및/또는 치료용으로 사용될 수 있다. 예를 들어, 상기 항체는 대상 내 본 발명의 하나 또는 그 이상의 펩티드들의 수준을 검출하고 그리고 그 검출된 수준을 앞서 결정된(예를 들어, 임의의 질병에 앞서) 대상 내의 표준 대조 수준 또는 기준선 수준과 비교하는 것에 의하여 진단용으로 사용될 수 있다. 상기 항체는 본 발명의 하나 또는 그 이상의 펩티드들의 활성을 조절하고, 그에 의하여 상태 또는 장애에 대하여 효과를 갖도록 치료용으로 사용될 수 있다.
본 발명은 이에 제한되지 않으나 본 발명의 펩티드 서열, 선택적으로 하나 또는 그 이상의 치료제, 조성물 및 그들의 약학적 조성물의 조합을 포함하고, 적절한 포장 재료로 포장된 키트를 제공한다. 키트는 선택적으로 구성성분들의 설명 또는 그 안의 상기 구성성분들의 in vitro, in vivo, 또는 ex vivo 사용에 대한 지시들을 포함하는 라벨(label) 또는 포장 삽입물을 포함한다. 예시적인 지시들에는 혈당의 낮춤 또는 저감, 고혈당의 치료, 당뇨병의 치료 등에 대한 지시들이 포함된다.
키트는 이러한 구성성분들의 집합, 예를 들어, 2 또는 그 이상의 펩티드 서열들 단독 또는 펩티드 서열과 다른 치료학적으로 유용한 조성물(예를 들어, 가스트린 화합물 등과 같은 항-당뇨약)으로 구성될 수 있다.
용어 "포장 물질(packaging material)"은 상기 키트의 상기 구성성분들을 감싸는 물리적인 구조를 의미한다. 상기 포장 물질은 상기 구성성분들을 멸균상태로 유지시킬 수 있고, 그리고 이러한 목적들을 위하여 통상적으로 사용되는 물질(예를 들어, 종이, 골판지 섬유(corrugated fiber), 유리, 플라스틱, 포일(foil), 앰플, 바이알, 튜브 등)로 이루어질 수 있다.
본 발명의 키트는 라벨 또는 삽입물들을 포함할 수 있다. 라벨 또는 삽입물들은 구성성분, 키트 또는 포장물질(예를 들어, 상자)과는 별개로 또는 이들에 부착되거나, 또는, 예를 들어, 키트 구성성분으로 구성된 앰플, 튜브 또는 바이알에 부착된 "인쇄물(printed matter)", 예를 들어, 종이 또는 판지가 포함된다. 라벨 또는 삽입물들은 부가적으로 디스크(예를 들어, 하드디스크(hard disk), 카드(card), 메모리 디스크(memory disk)), CD- 또는 DVD-ROM/RAM, DVD, MP3, 자기테이프 등과 같은 광학 디스크 또는 RAM 및 ROM 과 같은 전자 저장매체 또는 자기/광학 저장매체와 같은 이들의 혼성체, 플래쉬 매체(FLASH media) 또는 메모리형 카드(memory type cards) 등과 같은 컴퓨터 판독가능한 매체를 포함할 수 있다.
라벨 또는 삽입물들에는 하나 또는 그 이상의 그 안의 구성성분들, 투여량, 작용 메카니즘 (MOA), 약동학, 약력학을 포함하는 활성 성분(들)의 임상적인 약물학의 동정 정보(identifying information)를 포함할 수 있다. 라벨 또는 삽입물들은 제조자 정보, 생산 번호(lot numbers), 제조자 주소 및 일자를 동정하는 정보를 포함할 수 있다.
라벨 또는 삽입물들은 키트 구성성분이 사용될 수 있는 상태, 장애, 질환 또는 증후군에 대한 정보를 포함할 수 있다. 라벨 또는 삽입물들은 방법, 치료 방침 또는 치료 요법에서 하나 또는 그 이상의 상기 키트 구성성분을 사용하기 위한 임상의에 대한 또는 대상에 대한 지시들을 포함할 수 있다. 지시들은 투여량, 빈도 또는 지속기간 및 본원에서 기술된 임의의 방법, 치료 방침 또는 치료 요법들 중의 임의의 것을 수행하기 위한 지시들을 포함할 수 있다. 예시적인 지시들에는 본원에서 기술된 바와 같은 펩티드 서열의 치료 또는 용도에 대한 지시들이 포함된다. 따라서 본 발명의 키트는 부가적으로 치료방법들 및 용도를 포함하여 본 출원에서 기술되는 본 발명의 상기 방법 및 용도들 중 임의의 것을 실행하기 위한 라벨 또는 지시들을 포함할 수 있다.
라벨 또는 삽입물들에는 예방 또는 치료적 잇점 등과 같이 구성성분이 제공할 수 있는 임의의 잇점에 대한 정보가 포함될 수 있다. 라벨 또는 삽입물들에는 특정의 조성물의 사용에 적절하지 않을 수 있는 상황들과 관련하여 상기 대상 또는 임상의에 대한 경고 등과 같은 잠재적인 부작용에 대한 정보가 포함될 수 있다. 부작용들은 또한 상기 대상이 상기 조성물과 불친화성일 수 있는 하나 또는 그 이상의 다른 약물들을 복용하였거나, 복용할 예정이거나 또는 현재 복용하고 있나, 또는 상기 대상이 상기 조성물과 불친화성일 수 있는 다른 치료 방침 또는 치료 요법을 받았거나, 받을 예정이거나 또는 현재 받고 있는 경우에 발생할 수 있으며, 따라서, 지시들은 이러한 불친화성과 관련된 정보를 포함할 수 있다.
본 발명의 키트는 부가적으로 다른 구성성분들을 포함할 수 있다. 상기 키트의 각 구성성분은 개개 용기 내에 내포될 수 있고 그리고 여러 용기들 모두가 단일의 포장 내에 존재할 수 있다. 본 발명의 키트는 냉장저장을 위하여 설계될 수 있다. 본 발명의 키트는 본 발명의 펩티드 또는 펩티드 서열을 암호화하는 핵산을 더 포함하도록 설계될 수 있다. 상기 키트 내의 세포들은 사용할 준비가 될 때까지 적절한 저장 조건 하에서 유지될 수 있다.
달리 정의하지 않는 한, 본원에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 통상적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다. 본원에서 기술되는 바와 유사하거나 또는 등가의 방법 및 재료들이 본 발명의 실시 또는 시험에서 사용될 수 있기는 하나, 적절한 방법 및 재료가 본원에서 기술된다.
본원에서 언급된 모든 출원들, 공개공보들, 특허들 및 다른 참조문헌들, 유전자은행(GenBank) 인용들 및 ATCC 인용들은 그들 전체가 참조로 포함된다. 충돌이 있는 경우, 정의들을 포함하여 본 상세한 설명에 따를 것이다. 본 출원에서 사용된 바와 같이, 단수 형태들 "하나(a)", "그리고(and)" 및 "그(the)"는 문맥에서 명백하게 달리 표시하지 않는 한, 복수의 대상들을 포함한다. 따라서, 예를 들어, "펩티드 서열(peptide sequence)" 또는 "치료(treatment)"는 복수의 이러한 서열들, 치료들 등등을 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 수치값들은 종종 본 출원을 통하여 일정한 범위 형식(range format)으로 제공된다. 일정한 범위 형식의 사용은 단순히 편의성 및 간결함을 위한 것이고 그리고 문맥에서 명백하게 달리 표시하지 않는 한 본 발명의 관점에 대한 융통성이 없는 제한으로 이해되어서는 안된다. 따라서, 문맥에서 명확하게 달리 표시하지 않는 한, 하나의 범위는 명확하게 모든 가능한 하위범위(subranges)들, 그 범위 내의 모든 개개 수치값들 및 이러한 범위들 내의 정수들을 포함하여 수치 범위들을 포함하여 수치 범위들 및 범위들 내의 상기 값들 또는 상기 정수들의 분수들을 포함한다. 이러한 구성은 상기 범위의 폭에 무관하게 그리고 본 특허 문서를 통하여 모든 문맥들 내에서 적용된다. 따라서, 예를 들어, 90 내지 100%의 범위에 대한 언급은 91 내지 99%, 92 내지 98%, 93 내지 95%, 91 내지 98%, 91 내지 97%, 91 내지 96%, 91 내지 95%, 91 내지 94%, 91 내지 93% 등등을 포함한다. 90 내지 100%의 범위에 대한 언급은 또한 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 95%, 97% 등과 마찬가지로 91.1%, 91.2%, 91.3%, 91.4%, 91.5% 등등 92.1%, 92.2%, 92.3%, 92.4%, 92.5% 등등을 포함한다.
게다가, 1 내지 3, 3 내지 5, 5 내지 10, 10 내지 20, 20 내지 30, 30 내지 40, 40 내지 50, 50 내지 60, 60 내지 70, 70 내지 80, 80 내지 90, 90 내지 100, 100 내지 110, 110 내지 120, 120 내지 130, 130 내지 140, 140 내지 150, 150 내지 160, 160 내지 170, 170 내지 180, 180 내지 190, 190 내지 200, 200 내지 225, 225 내지 250의 범위에 대한 언급은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 등을 포함한다. 다른 예들에 있어서, 25 내지 250, 250 내지 500, 500 내지 1000, 1000 내지 2500 또는 2500 내지 5000, 5000 내지 25,000, 5000 내지 50,000의 범위에 대한 언급은 이러한 값들, 예를 들어, 25, 26, 27, 28, 29... 250, 251, 252, 253, 254... 500, 501, 502, 503, 504... 내의 또는 이를 포함하는 임의의 수치값들 또는 범위를 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 일련의 범위들이 본 출원을 통하여 기술된다. 일련의 범위들의 사용에는 다른 범위를 제공하기 위하여 보다 높고 그리고 보다 낮은 범위들의 조합들이 포함된다. 이러한 구성은 상기 범위의 폭에 무관하게 그리고 본 특허 문서를 통하여 모든 문맥들 내에서 적용된다. 따라서, 예를 들어, 5 내지 10, 10 내지 20, 20 내지 30, 30 내지 40, 40 내지 50, 50 내지 75, 75 내지 100, 100 내지 150 등과 같은 일련의 범위들에 대한 언급에는 5 내지 20, 5 내지 30, 5 내지 40, 5 내지 50, 5 내지 75, 5 내지 100, 5 내지 150 그리고 10 내지 30, 10 내지 40, 10 내지 50, 10 내지 75, 10 내지 100, 10 내지 150 그리고 20 내지 40, 20 내지 50, 20 내지 75, 20 내지 100, 20 내지 150 등과 같은 범위들이 포함된다.
간결성을 위하여 특정의 약어들이 본 출원에서 사용된다. 하나의 예는 아미노산 잔기들을 표현하기 위한 단문자 약어이다. 상기 아미노산 들 및 그들의 대응하는 3 문자 및 단문자 약어들은 다음과 같다.
Figure pct00001
본원에서 본 발명은 대체로 여러 실시예들을 기술하기 위한 단정적인 언어를 사용하여 개시되었다. 본 발명은 또한 특히 예컨대 물질 또는 재료들, 방법 단계들 및 조건들, 방침들, 절차들, 평가 또는 분석 등과 같은 특정의 대상 문제가 전체로 또는 부분적으로 배제된 실시예들을 포함한다. 따라서, 비록 본 발명이 대체로 본 출원에서 본 발명이 포함하지 않는 개념들을 표현하지 않았더라도, 본 발명에 명백하게 포함되지 않는 관점들도 본 출원에서 기술된다.
본 발명의 다수의 실시예들이 기술되었다. 그럼에도 불구하고, 본 발명의 정신 및 관점으로부터 벗어남이 없이 여러 변형들이 만들어질 수 있다는 것이 이해된다. 따라서, 하기의 실시예들은 청구범위에서 기술된 본 발명의 관점을 설명하기 위하여 의도되는 것이고 제한하는 것이 아니다.
실시예
실시예 1
본원 연구에서 사용된 다양한 물질 및 방법에 대한 설명은 하기와 같다.
동물. db/db 마우스들은 Jackson Laboratory (Bar Habor, ME) 로부터 구입하였고, 이 마우스들은 복지 가이드라인에 따라 광 조절 (12시간 명조건 및 12시간 암조건의 사이클, 암조건 6:30 pm-6:30 am) , 온도 (22±4℃) 및 습도 (50% ± 20%) 조건하에서 유지시켰다. 그들을 자유롭게 물 (가압멸균된 증류수) 에 접근할 수 있도록 하였으며, 17 kcal% 지방, 23 kcal% 단백질 및 60 kcal% 탄수화물을 함유하는 시판 식이 (Harlan Laboratories, 인디애나폴리스, IN, 방사선 처리된 2018 Teklad 글로벌 18% 단백질 설치류 식이) 를 자유롭게 공급하였다. 식이-유도된 비만을 위하여, C57BL6/J 마우스들을 (Jackson Laboratory) 60 kcal% 지방, 20 kcal% 단백질 및 20 kcal% 탄수화물을 함유하는 고-지방 식이 (D12492, Research Diet, New Brunswick, NJ. USA) 상에서 16 - 20 주동안 유지시켰다. 모든 동물 연구들은 NGM 기관의 동물 보호 및 사용 위원회에서 승인받았다.
DNA 및 아미노산 서열. 인간 FGF 19 암호화 ORF 의 cNDA (호모 사피엔스 FGF 19, GenBank Accession No. NM_005117.2) 변이체들
cDNA 에 의해 암호화된 단백질 서열 (GenBank Accession No. NP_005108.1)
PCR. FGF19 ORF 를 인간 소장 조직으로부터 제조된 재조합 DNA (cDNA) 를 이용하는 중합효소연쇄반응 (PCR) 을 이용하여 증폭하였다. Phusion high-fidelity DNA 폴리머라아제를 갖는 PCR 시약 키트는 뉴잉글랜드 바이오랩 (F-530L, Ipswich, MA) 으로부터 구입하였다. 사용된 프라이머는 하기와 같다 : 정방향 PCR 프라이머: 5' CCGACTAGTCACCatgcggagcgggtgtgtgg 및 역방향 PCR 프라이며: 5' ATAAGAATGCGGCCGCTTACTTCTCAAAGCTGGGACTCCTC.
증폭된 DNA 절편들을 Spe I 및 Not I 제한효소 (제한 부위는 각각 5' 또는 3' PCR 프라이머 내에 포함됨) 를 이용하여 절단하였고, 그 후 동일한 제한효소로 절단된 AAV 전이유전자 벡터를 이용하여 연결시켰다. 실험에 사용된 벡터들은 복제된 암호화 서열 삽입을 위한 5' 부위의 강한 진핵 프로모터, 그 뒤에 이어지는 3' 비번역 영역 및 소 성장 호르몬 폴리아데닐화 꼬리로 구성된 발현 카세트 및 선택가능한 마커를 함유한다. 상기 발현 구조물은 또한 5' 및 3' 말단에서의 내부 말단 반복에 의하여 측면화된다.
AAV 의 생산 및 정제. AAV 293 세포 (Agilent Technologies 로부터 얻음, Santa Clara, CA) 들을 10 % 우태아 혈청 및 1x 항생-항진균 용액 (Mediatech, Inc. Manassas, VA) 이 보충된 DMEM 배지(DMEM, Mediatech, Inc. Manassas, VA) 에서 배양하였다. 세포들을 1일 째에 150 mm 세포 배양 플레이트 상에서 50 % 밀도로 도포시켰으며, 2일째에 하기 3 플라스미드 (각 플레이트 당 20 μg) 를 이용한 칼슘 포스페이트침전법을 이용하여 형질감염시켰다: AAV 전이유전자 플라스미드, pHelper 플라스미드 (Agilent Technologies) 및 AAV2/9 플라스미드 (Gao 등., J. Virol. 78:6381 (2004)). 형질감염 48 시간 후, 세포들을 플레이트에서 벗겨내고, 3000xg 에서 원심분리하여 펠렛화(pelleted)하고, 20 mM Tris pH 8.5, 100 mM NaCl 및 1mM MgCl2 를 함유하는 완충액에서 재현탁시켰다. 현탁액을 알코올 건조 얼음 욕조에서 동결시키고, 그 후 37℃ 수 욕조에서 해동시켰다. 동결 및 해동 사이클을 3회 반복하였다; Benzenase (Sigma-aldrich, St. Louis, MO) 50 units/ml 추가; 디옥시콜레이트(deoxycholate)를 최종 농도 0.25% 에서 추가. 37℃ 에서 30 분동안 배양 후, 세포 파편들을 5000 xg 에서 20분동안 원심분리하여 펠렛화하였다. 상청액 내 바이러스 입자들은 이전에 기술된 내용 (Zolotukhin S. et al (1999) Gene Ther. 6:973) 에 따라 discontinued iodixanal (Sigma-aldrich, St. Louis, MO) 구배를 이용하여 정제시켰다. 바이러스성 모액을 Vivaspin 20 (MW cutoff 100,000 Dalton, Sartorius Stedim Biotech, Aubagne, France) 을 이용하여 농축시켰으며, 10 % 글리세롤을 갖는 인산완충식염수 (PBS) 내에서 재-부유시키고 그 후 -80℃에서 저장하였다. 바이러스성 유전체(genome)의 복제수를 결정하기 위하여, 바이러스성 모액의 2㎕을 50 units/ml Benzonase, 50 mM Tris-HCl pH 7.5, 10 mM MgCl2 및 10 mM CaCl2 을 함유하는 용액 6㎕ 내에서 37 ℃로 30 분 동안 배양시켰다.
그 뒤에, 바이러스성 DNA의 방출을 위하여, 단백질 분해효소 K 2 mg/ml, 0.5% SDS 및 25 mM EDTA를 함유하는 용액 15㎕를 추가하고 혼합물을 추가적으로 20 분동안 55℃에서 배양하였다. 바이러스성 DNA 를 작은 DNeasy 키트 (Qiagen, Valencia, CA) 를 이용하여 세척시키고 40㎕의 물을 이용하여 용출시켰다. 바이러스성 유전체 복제 (genome copy; GC)는 정량적 PCR를 이용하여 결정하였다.
바이러스성 모액들을 PBS 를 이용하여 바람직한 GC/ml 까지 희석시켰다. 바이러스성 작동용액(working solution) (200㎕) 을 꼬리 정맥주사를 이용하여 마우스로 전달시켰다.
혈중 당 분석. 마우스 꼬리 절단 내 혈중 당을 아큐첵 활성 미터(Roche Diagnostics, Indianapolis, IN) 에 의하여 판독되는 아큐첵 활성 시험 스트립을 이용하여 제조사의 지시에 따라 측정하였다.
지질 프로파일 분석. 마우스의 꼬리 절단으로부터 전혈을 플레인 모세관으로 수집하였다(BD Clay Adams SurePrep, Becton Dickenson and Co. Sparks, MD). 혈청 및 혈액세포들을 오토서킷 울트라 3(Autocrit Ultra 3)( Becton Dickinson and Co. Sparks, MD) 내 튜브 회전을 통해 분리시켰다. 혈청 시료들의 지질 프로파일 (트리글리세라이드, 총 콜레스테롤, HDL, 및 비-HDL) 을 Integra 400 임상 분석기(Roche Diagnostics, Indianapolis, IN) 를 이용하여 제조사에 지시에 따라 분석하였다.
혈청 FGF 19 / FGF21/ 변이체 노출 수준 분석. 마우스 꼬리 절단으로부터 전혈 (약 50㎕/마우스)을 플레인 모세관으로 수집하였다 (BD Clay Adams SurePrep, Becton Dickenson and Co. Sparks, MD). 혈청 및 혈액 세포들을 오토서킷 울트라 3 (Becton Dickinson and Co. Sparks, MD) 내 튜브 회전을 통해 분리시켰다. 혈청 내 FGF19, FGF21 및 변이체 노출 수준을 EIA 키트 (Biovendor) 를 이용하여 제조사의 지시에 따라 결정하였다.
간세포 암종 (Hepatocellular carcinoma ; HCC) 분석. 간 표본을 AAV 주사 6개월 후의 db/db 마우스로부터 얻었다. HCC 스코어를 변이체-주사된 마우스들 유래의 전체 간 표면상의 HCC 결절 수를 야생형 FGF19-주사된 마우스 유래의 HCC 결절 수로 나눈 것으로 기록하였다.
간 유전자 발현 분석. 간 표본을 얻고 트리졸 시약 (인비트로젠) 내에서 균질화시켰다. 총 RNA를 제조사의 지시에 따라 추출하였다. RNA를 DNase (Ambion) 로 처리하고 그 후 어플라이드 바이오시스템즈의 태크맨 프라이머 및 시약을 이용한 정량적 RT-PCR 분석법을 수행하였다. 간에서의 알도-케토 환원효소 및 slcla2의 상대적 mRNA 수준을 ΔΔCt 방법을 이용하여 계산하였다.
FGFR 4 결합 및 활성 분석. 고체상 ELISA (결합) 및 ERK 인산화 분석을 정제된 재조합 단백질을 이용하여 수행하였다. FGFR 결합 분석은 고체상 ELISA를 이용하여 수행하였다. 간략하게, 96 웰 플레이트를 2 ug/ml 항-hFc 항체로 코팅시키고 1 ug/ml FGFR1-hFc 또는 FGFR4-hFc 와 함께 배양하였다. 1 ug/ml 가용성 b-클로토(b-klotho) 및 20 ug/ml 헤파린의 존재 하에서 FGF19 변이체들의 결합을 비오티닐화 항-FGF19 항체들 (0.2ug/mL) 에 의해 검출하였고, 그 후 스트렙타아비딘- HRP 배양 (100ng/mL)을 하였다. FGFR4 활성 분석을 위하여, Hep3B 세포들을 FGF19 변이체로 10 분동안 37℃에서 자극시켰으며, 그 후 즉시 이를 용해시키고 Cis-Bio 의 상용 키트를 이용하여 ERK 인산화에 대하여 분석하였다.
실시예 2
하기는 FGF19 및 FGF21, 그리고 FGF19/FGF21 융합 구조물의 다양한 변이체 서열들의 당(glucose) 저감 활성을 보여주는 연구에 대한 기술이다.
도 2 는 예시적인 FGF19/FGF21 융합 구조물, 그리고 융합 펩티드 내에 존재하는 FGF19 및 FGF21 각각으로부터 유래된 분절(segment)을 보여준다. 이들 펩티드들을 당 저감 활성 및 통계적으로 유의한 지질 상승 또는 증가 활성 (표 1 -8 및 도 1)에 대하여 분석하였다.
마우스 (db/db) 들에 FGF19, FGF21 또는 변이체들을 발현하는 바이러스성 벡터를 주입시키고, 주입 이후 분석하였다. 각 서열의 당-저감 활성을 "+" 기호 ("-" 기호는 당 저감 활성이 없는 것을 의미, "+/-" 기호는 변이체가 최소한의 당-저감 활성을 보유하는 것을 의미함)로 나타내고; 지질 증가 활성을 "+" 기호 ( "-" 기호는 지질 증가 활성이 없는 것을 의미, "+/-" 기호는 변이체가 최소한의 지질 증가 활성을 보유하는 것을 의미함, 도 2)로 나타내었다.
변이체 M5 및 변이체 45(M 45) 로 표시된 FGF21 및 FGF19의 두 개 융합체들은 당 저감 활성을 나타냈고, 통계적으로 유의한 지질 상승 또는 증가 활성은 부존재하는 것으로 나타났다. 변이체들은 각각 M1, M2 및 M69로 표시하였다(도 1, 당 저감 활성 또한 나타냄)(도 3B 및 3C, 표 5). FGF19 및 FGF21과 M5, M1, M2 및 M69 당 저감 활성 및 지질 상승 또는 증가 활성을 비교한 데이터들을 도 3A 내지 도 3C 및 4A 내지 4C 에 나타내었다.
실시예 3
하기는 변이체 M5, M1, M2 및 M69 들이 간세포 암종 (HCC) 형성에 의해서확인되는 것과 같이 발암성이 아니고, 또한 변이체 M5, M2 및 M69 들이 제지방 근육(lean muscle) 및 지방 질량을 감소시키지 않는다는 것을 보여주는 연구의 기술이다.
동물 (db/db) 들에 FGF19, FGF21, M5, M1, M2, 또는 M69를 발현시키는 AAC 벡터를 주입시키거나 염수(saline)를 주입시켰으며, 주입 6개월 이후에 분석하였다. 데이터들은 변이체 M5, M1, M2 및 M69 가 (HCC) 형성을 뚜렷하게 유도하지 않는다는 것을 가르킨다 (도 5A 내지 5C).
동물들 (db/db 마우스) 들에 또한 FGF19, FGF21, M5, M1, M2 또는 M69 를 발현시키는 바이러스성 벡터를 주입시키거나, 염수를 주입시켰으며, 주입 6개월 이후에 이것이 제지방 질량 및 지방 질량에 미치는 영향에 대하여 분석하였다. 데이터는 M5, M2 및 M69 펩티드들이, FGF21와 비교하여, 제지방 질량 또는 지방 질량에서 통계적으로 유의한 감소를 유발하지 않고, M1 펩티드는 제지방 질량을 감소시킨다는 것을 가르킨다(도 6A 내지 6C).
실시예 4
하기는 25 개 추가적인 변이체 펩티드들을 지질 증가 활성 및 종양형성에 대하여 분석한 데이터들의 요약이다. 상기 데이터는 분명하게 db/db 마우스에서의 간세포 암종 (HCC) 형성에 의해서 확인된 것과 같이 지질 증가와 종양 형성 사이의 양의 상관관계를 보여준다.
표 1 내지 3은 26 개의 다른 변이체 펩티드들에 대한 데이터를 요약한다. 이러한 예시적인 변이체 펩티드들은 FGF19 C-말단 서열 : C 말단 부위, 예를 들어 "TSG" 아미노산 잔기 다음에 PHGLSSCFLRIRADGVVDCARGQSAHSLLEIKAVALRTVAIKGVHSVRYLCMGADGKMQGLLQYSEEDCAFEEEIRPDGYNVYRSEKHRLPVSLSSAKQRQLYKNRGFLPLSHFLPMLPMVPEEPEDLRGHLESDMFSSPLETDSMDPFGLVTGLEAVRSPSFEK 서열을 갖는다. 특히 통계적으로 유의한 지질의 증가를 유발하지 않는 변이체 펩티드 (M5 포함, 총 7)들은 감세포 암종 (HCC) 형성을 유도하지 않는다. 반면, 모든 통계적으로 유의한 지질의 증가를 유발하는 모든 변이체 펩티드 (총 17) 들은 역시 마우스에서 간세포 암종 (HCC)의 형성을 유발하였다. 이러한 데이터들은 지질 상승 활성 및 간세포 암종 (HCC) 형성 사이에 강한 양의 상관관계가 있음을 나타낸다. 따라서, 지질 증가 활성은 동물에서 간세포 암종 (HCC) 형성의 지표 및/또는 예측자로 사용할 수 있다.
표 1 : db/db 마우스에서 증가된 트리글리세라이드 및 콜레스테롤은 HCC 형성과 양의 상관관계를 나타냄.
Figure pct00002

표 2 : db/db 마우스에서 증가된 트리글리세라이드 및 콜레스테롤은 HCC 형성과 양의 상관관계를 나타냄.
Figure pct00003
표 3: db/db 마우스에서 증가된 트리글리세라이드 및 콜레스테롤은 HCC 형성과 양의 상관관계를 나타냄
Figure pct00004

실시예 5
하기는 추가적 FGF19 변이체 펩티드의 당 저감 활성 및 지질 증가 활성에 대하여 분석한 데이터 요약이다.
표 4는 M5 내지 M40으로 표시된 35 개 추가적 FGF19 변이체들의 펩티드 "중심서열(Core sequence)" 를 나타낸다. 이러한 예시적인 변이체 펩타이들은 C 말단 부위, 예를 들어 중심 서열의 " TSG" 아미노산 잔기 다음에, FGF19 C 말단 서열,PHGLSSCFLRIRADGVVDCARGQSAHSLLEIKAVALRTVAIKGVHSVRYLCMGADGKMQGLLQYSEEDCAFEEEIRPDGYNVYRSEKHRLPVSLSSAKQRQLYKNRGFLPLSHFLPMLPMVPEEPEDLRGHLESDMFSSPLETDSMDPFGLVTGLEAVRSPSFEK 를 갖는다. 이들 데이터들은 변이체 M6, M7, M8, mM38 및 M39 들이 db/db 마우스에서 원하는 당 저감 활성을 가지나 통계적으로 유의한 지질 증가 활성은 갖지 않는다는 것을 보여준다.
표 4 : 추가 변이체들 및 N-말단 도메인의 간략한 맵핑(Fine Mapping)
Figure pct00005
표 4a :
Figure pct00006
표 4b :
Figure pct00007
표 4c :
Figure pct00008
표 5는 M1, M2 및 M69로 표시된, 3개의 추가 FGF19 변이체들의 펩티드 서열을 나타낸다. 데이터들은 분명하게 이들 세개의 변이체들이 db/db 마우스에서 원하는 당 저감 활성 특징을 갖는다는 것을 보여준다(도 3B 및 3C). 이들 세개의 변이체들은 db/db 마우스에서 지질을 증가시키는 것으로 나타났다 (도 4B 및 4C).
표 5: 추가적 변이체들
Figure pct00009

실시예 6
하기는 FGF19가 식이-유도된 비만 마우스와 ob/ob 마우스에서 체질량을 감소시키고, 그리고 db/db 마우스에서 간 종양형성 활성 및 체질량을 감소시킨다는 것을 보여주는 데이터의 요약이다.
마우스들에 AAV 벡터 내 FGF19 또는 FGF21를 주입하였다. 체질량은 주입 4 주후에 기록하였다.
표 6. FGF19 은 식이-유도된 비만 마우스와 ob/ob 마우스에서 체질량을 감소시킴
Figure pct00010

표 7: FGF19, FGF 21 및 db/db 마우스에서 선택된 변이체들의 체질량 및 간 종양형성의 관계
Figure pct00011
실시예 7
하기는 변이체 M5 및 변이체 M69 펩티드가 혈당을 감소시킨다는 것을 보여주는 연구이다.
마우스 (ob/ob) 들에 M5 (0.1 및 1 mg/kg, s.c.) 또는 FGF19 (1 mg/kg, s.c.), 또는 변이체 M69 (0.1 및 1 mg/kg, s.c.) 또는 FGF19 (1 mg/kg, s.c.)를 주입(피하적으로)시켰다. 혈장 당 수준을 주입 후 2, 4, 7, 및 24 시간에 측정하였으며, 이들 결과를 도 7에 나타내었다. M5 (도 7A) 및 변이체 M69 (도 7B) 는 야생형 FGF19와 비교하여 유사한 당 저감 효과를 나타내었다.
실시예 8
본 실시예는 Akr1C18 (알도-케토 환원효소 패밀리 1 (aldo-keto reductase family 1), 멤버 C18) 그리고 slc1a2 (solute carrier family 1, member 2)의 간 발현이 HCC 활성과 관련있는 것으로 나타남을 보여주는 연구를 기술한다.
마우스 (db/db) 들에 FGF19 (HCC+), FGF21 (HCC-), dN2 (HCC-) 또는 M5 (HCC-) 를 발현하는 바이러스성 벡터를 주입하거나 GFP를 주입하였다. 주입 2주 후, 간 시료들을 수확하고 정량 RT-PCR 에 의하여 분석하였다. 도 8 에 나타낸, 이 데이터는 Akr1C18 및 slc1a2 의 간 발현이 HCC 활성과 관련이 있는 것으로 나타났다는 것을 보여준다.
표 8. 3T3L1 지방세포 신호전달 분석에서의 FGF19 변이체들의 요약
Figure pct00012

Claims (74)

  1. a) 7개 이상의 아미노산 잔기를 포함하는 N-말단 영역, 첫째 아미노산 위치 및 마지막 아미노산 위치를 갖는 상기 N-말단 영역에서, 상기 N-말단 영역은 DSSPL 또는 DASP를 포함하며; 그리고
    b) 서열번호 99 [FGF19] 일부를 포함하는 C-말단 영역, 첫째 아미노산 위치 및 마지막 아미노산 위치를 갖는 상기 C-말단 영역에서, 상기 C-말단 영역은 서열번호 99 [FGF19]의 16 내지 29 아미노산 잔기, WGDPIRLRHLYTSG 를 포함하며, 여기에서 W 잔기는 C-말단 영역의 첫번째 아미노산 위치에 상응하는 것; 을 포함하는 키메라 펩티드 서열.
  2. a) 서열번호 100 [FGF21] 의 일부를 포함하는 N-말단 영역, 첫째 아미노산 위치 및 마지막 아미노산 위치를 갖는 상기 N-말단 영역에서, 상기 N-말단 영역은 아미노산 잔기 GQV를 포함하며, 그리고 여기에서 V 잔기는 N-말단 영역의 마지막 아미노산 위치에 상응하는; 그리고
    b) 서열번호 99 [FGF19] 일부를 포함하는 C-말단 영역, 첫째 아미노산 위치 및 마지막 아미노산 위치를 갖는 상기 C-말단 영역에서, 상기 C-말단 영역은 서열번호 99 [FGF19] 의 21 내지 29 아미노산 잔기, RLRHLYTSG를 포함하며, 여기에서 R 잔기는 C-말단 영역의 첫번째 위치에 상응하는 것; 을 포함하는 키메라 펩티드 서열.
  3. a) 서열번호 100 [FGF21] 의 일부를 포함하는 N-말단 영역, 첫째 아미노산 위치 및 마지막 아미노산 위치를 갖는 상기 N-말단 영역에서, 상기 N-말단 영역은 서열번호 100[FGF21]의 아미노산 잔기 GQV를 포함하는 5개 이상의 연속된 아미노산 잔기를 포함하며, 그리고 여기에서 V 잔기는 N-말단 영역의 마지막 아미노산 위치에 상응하는; 그리고
    b) 서열번호 99 [FGF19] 일부를 포함하는 C-말단 영역, 첫째 아미노산 위치 및 마지막 아미노산 위치를 갖는 상기 C-말단 영역에서, 상기 C-말단 영역은 서열번호 99 [FGF19] 의 21 내지 29 아미노산 잔기, RLRHLYTSG를 포함하며, 여기에서 R 잔기는 C-말단 영역의 첫번째 위치에 상응하는 것; 을 포함하는 키메라 펩티드 서열.
  4. 제3항에 있어서, 상기 N-말단 영역은 서열번호 100 [FGF21]의 아미노산 잔기 GQV를 포함하는 6개 이상의 연속적인 아미노산 잔기를 포함하는 것인 펩티드 서열.
  5. 제3항에 있어서, 상기 N-말단 영역은 서열번호 100 [FGF21]의 아미노산 잔기 GQV를 포함하는 7개 이상의 연속적인 아미노산 잔기를 포함하는 것인 펩티드 서열.
  6. a) 참조 또는 야생형 FGF19와 비교하여 하나 또는 그 이상의 아미노산 치환, 삽입 또는 결실을 갖는 섬유아세포 성장인자 19 (FGF19) 서열 변이체;
    b) 참조 또는 야생형 FGF21과 비교하여 하나 또는 그 이상의 아미노산 치환, 삽입 또는 결실을 갖는 섬유아세포 성장인자 21 (FGF21) 서열 변이체;
    c) FGF21 서열의 일부와 융합한 FGF19 서열의 일부; 또는
    d) FGF21 서열의 일부와 융합한 FGF19 서열의 일부로, 상기 FGF19 및/또는 FGF21 서열 일부들은 참조 또는 야생형 FGF19 및/또는 FGF21과 비교하여 하나 또는 그 이상의 아미노산 치환, 삽입 또는 결실을 갖는 것 중 어느 것을 포함하거나 또는 그로 구성된 펩티드 서열.
  7. 제6항에 있어서, 상기 펩티드 서열은 서열번호 100 [FGF21] 의 아미노 말단 아미노산 1 내지 16 과 서열번호 99 [FGF19] 의 카르복시-말단 아미노산 21 내지 194가 융합된 것을 갖거나, 또는 상기 펩티드 서열은 서열번호 99 [FGF19] 의 아미노 말단 아미노산 1 내지 147 과 서열번호 100 [FGF21] 의 카르복시-말단 아미노산 147 내지 181이 융합된 것(M41)을 갖거나, 또는 상기 펩티드 서열은 서열번호 99 [FGF19] 의 아미노 말단 아미노산 1 내지 20 과 서열번호 100 [FGF21] 의 카르복시-말단 아미노산 17 내지 181이 융합된 것 (M44)을 갖거나, 또는 상기 펩티드 서열은 서열번호 100 [FGF21] 의 아미노 말단 아미노산 1 내지 146 과 서열번호 99 [FGF19] 의 카르복시-말단 아미노산 148 내지 194이 융합된 것(M45) 을 갖거나, 또는 상기 펩티드 서열은 서열번호 99 [FGF19] 의 아미노 말단 아미노산 1 내지 20 과 서열번호 100 [FGF21] 의 내부 아미노산 17 내지 146이 융합되고 이에 서열번호 99 [FGF19] 의 카르복시-말단 아미노산 148 내지 194 가 융합된 것(M46)을 갖는 펩티드 서열.
  8. 제1항, 제2항 또는 제6항에 있어서, 상기 펩티드 서열은 서열번호 99 [FGF19]의 16 내지 20 아미노산인 WGDPI 서열에 상응하는 WGDPI 서열 모티프를 갖는 키메라 펩티드 서열 또는 펩티드 서열.
  9. 제8항에 있어서, 상기 펩티드 서열은 FGFR4 매개 활성을 유지하거나 증가시키는 키메라 펩티드 서열 또는 펩티드 서열.
  10. 제1항, 제2항 또는 제6항에 있어서, 상기 펩티드 서열은 FGF19의 16 내지 20 아미노산의 FGF19 WGDPI 서열에 상응하는 WGDPI 서열 모티프가 치환, 돌연변이 또는 결실된 것을 갖는 키메라 펩티드 서열 또는 펩티드 서열.
  11. 제10항에 있어서, 상기 WGDPI 서열은 하나 또는 그 이상의 아미노산이 치환, 돌연변이 또는 결실된 것인 키메라 펩티드 서열 또는 펩티드 서열.
  12. 제1항, 제2항 또는 제6항에 있어서, 상기 펩티드 서열은 아미노산 16 내지 20의 FGF19 WGDPI 서열이 GQV, GDI, WGPI, WGDPV, WGDI, GDPI, GPI, WGQPI, WGAPI, AGDPI, WADPI, WGDAI, WGDPA, WDPI, WGDI, WGDP 또는 FGDPI 중 어느 것으로 치환된 것을 갖는 FGF 19 변이체 서열로 구별되는 것인, 키메라 펩티드 서열 또는 펩티드 서열.
  13. 제1항 내지 제3항 또는 제6항 중 어느 항에 있어서, 상기 N-말단 또는 C-말단 영역은 약 20 부터 약 200 까지 길이의 아미노산 잔기인, 키메라 펩티드 서열 또는 펩티드 서열.
  14. 제1항에 있어서, 상기 N-말단 영역은 아미노산 잔기 VHYG 를 포함하거나, 상기 N-말단 영역은 아미노산 잔기 DASPHVHYG 를 포함하거나, 또는 상기 N-말단 영역은 아미노산 잔기 DSSPLVHYG 를 포함하는 키메라 펩티드 서열.
  15. 제14항에 있어서, 상기 G 는 N-말단 영역의 마지막 위치에 상응하는 키메라 펩티드 서열.
  16. 제1항 또는 제6항에 있어서, 상기 N-말단 영역은 아미노산 잔기 DSSPLLQ를 포함하고, 그리고 상기 Q 잔기는 N-말단 영역의 마지막 아미노산 위치인 키메라 펩티드 서열.
  17. 제15항 또는 제16항에 있어서, 상기 N-말단 영역은 추가적으로 하기를 포함하는 키메라 펩티드 서열: RHPIP, 상기 R은 N-말단 영역의 첫번째 아미노산 위치; 또는 HPIP, 상기 H는 N-말단 영역의 첫번째 아미노산 위치; 또는 RPLAF, 상기 R은 N-말단 영역의 첫번째 아미노산 위치; 또는 PLAF, 상기 P는 N-말단 영역의 첫번째 아미노산 위치; 또는 R, 상기 R은 N-말단 영역의 첫번째 아미노산 위치.
  18. 제1항 내지 제3항 또는 제6항 중 어느 항에서, 상기 펩티드 서열은 M1 내지 M98 변이체 펩티드 서열이거나, 또는 M1 내지 M98 변이체 펩티드 서열 중에서 어느 것의 아서열 또는 절편 중 어느 서열을 포함하거나 이로 구성된, 키메라 펩티드 서열 또는 펩티드 서열.
  19. 제1항 내지 제3항 또는 제6항 중 어느 항에서, 상기 펩티드 서열은
    RDSSPLVHYGWGDPIRLRHLYTSGPHGLSSCFLRIRADGVVDCARGQSAHSLLEIKAVALRTVAIKGVHSVRYLCMGADGKMQGLLQYSEEDCAFEEEIRPDGYNVYRSEKHRLPVSLSSAKQRQLYKNRGFLPLSHFLPMLPMVPEEPEDLRGHLESDMFSSPLETDSMDPFGLVTGLEAVRSPSFEK (M69);
    RDSSPLLQWGDPIRLRHLYTSGPHGLSSCFLRIRADGVVDCARGQSAHSLLEIKAVALRTVAIKGVHSVRYLCMGADGKMQGLLQYSEEDCAFEEEIRPDGYNVYRSEKHRLPVSLSSAKQRQLYKNRGFLPLSHFLPMLPMVPEEPEDLRGHLESDMFSSPLETDSMDPFGLVTGLEAVRSPSFEK(M52);
    HPIPDSSPLLQFGGQVRLRHLYTSGPHGLSSCFLRIRADGVVDCARGQSAHSLLEIKAVALRTVAIKGVHSVRYLCMGADGKMQGLLQYSEEDCAFEEEIRPDGYNVYRSEKHRLPVSLSSAKQRQLYKNRGFLPLSHFLPMLPMVPEEPEDLRGHLESDMFSSPLETDSMDPFGLVTGLEAVRSPSFEK (M5);
    HPIPDSSPLLQFGGQVRQRYLYTDDAQQTEAHLEIREDGTVGGAADQSPESLLQLKALKPGVIQILGVKTSRFLCQRPDGALYGSLHFDPEACSFRELLLEDGYNVYQSEAHSLPLHLPGNKSPHRDPAPRGPARFLPLPGLPPALPEPPGILAPQPPDVGSSDPLSMVGPSQGRSPSYAS (M71);
    HPIPDSSPLLQFGGQVRQRYLYTDDAQQTEAHLEIREDGTVGGAADQSPESLLQLKALKPGVIQILGVKTSRFLCQRPDGALYGSLHFDPEACSFRELLLEDGYNVYQSEAHGLPLHLPGNKSPHRDPAPRGPARFLPLPGLPPAPPEPPGILAPQPPDVGSSDPLSMVGPSQGRSPSYAS (M72);
    HPIPDSSPLLQFGGQVRQRYLYTDDAQQTEAHLEIREDGTVGGAADQSPESLLQLKALKPGVIQILGVKTSRFLCQRPDGALYGSLHFDPEACSFRELLLEDGYNVYQSEAHGLPLHLPGNKSPHRDPAPRGPARFLPLPGLPPALPEPPGILAPQPPDVGSSDPLSMVVQDELQGVGGEGCHMHPENCKTLLTDIDRTHTEKPVWDGITGE (M73);
    RPLAFSDASPHVHYGWGDPIRLRHLYTSGPHGLSSCFLRIRADGVVDCARGQSAHSLLEIKAVALRTVAIKGVHSVRYLCMGADGKMQGLLQYSEEDCAFEEEIRPDGYNVYRSEKHRLPVSLSSAKQRQLYKNRGFLPLSHFLPMLPMVPEEPEDLRGHLESDMFSSPLETDSMDPFGLVTGLEAVRSPSFEK (M1);
    RPLAFSDSSPLVHYGWGDPIRLRHLYTSGPHGLSSCFLRIRADGVVDCARGQSAHSLLEIKAVALRTVAIKGVHSVRYLCMGADGKMQGLLQYSEEDCAFEEEIRPDGYNVYRSEKHRLPVSLSSAKQRQLYKNRGFLPLSHFLPMLPMVPEEPEDLRGHLESDMFSSPLETDSMDPFGLVTGLEAVRSPSFEK (M2);
    RPLAFSDAGPHVHYGWGDPIRLRHLYTSGPHGLSSCFLRIRADGVVDCARGQSAHSLLEIKAVALRTVAIKGVHSVRYLCMGADGKMQGLLQYSEEDCAFEEEILEDGYNVYRSEKHRLPVSLSSAKQRQLYKNRGFLPLSHFLPMLPMVPEEPEDLRGHLESDMFSSPLETDSMDPFGLVTGLEAVRSPSFEK (M3);
    RDSSPLLQFGGQVRLRHLYTSGPHGLSSCFLRIRADGVVDCARGQSAHSLLEIKAVALRTVAIKGVHSVRYLCMGADGKMQGLLQYSEEDCAFEEEIRPDGYNVYRSEKHRLPVSLSSAKQRQLYKNRGFLPLSHFLPMLPMVPEEPEDLRGHLESDMFSSPLETDSMDPFGLVTGLEAVRSPSFEK (M48);
    RPLAFSDSSPLLQFGGQVRLRHLYTSGPHGLSSCFLRIRADGVVDCARGQSAHSLLEIKAVALRTVAIKGVHSVRYLCMGADGKMQGLLQYSEEDCAFEEEIRPDGYNVYRSEKHRLPVSLSSAKQRQLYKNRGFLPLSHFLPMLPMVPEEPEDLRGHLESDMFSSPLETDSMDPFGLVTGLEAVRSPSFEK (M49);
    RHPIPDSSPLLQFGDQVRLRHLYTSGPHGLSSCFLRIRADGVVDCARGQSAHSLLEIKAVALRTVAIKGVHSVRYLCMGADGKMQGLLQYSEEDCAFEEEILEDGYNVYRSEKHRLPVSLSSAKQRQLYKNRGFLPLSHFLPMLPMVPEEPEDLRGHLESDMFSSPLETDSMDPFGLVTGLEAVRSPSFEK (M50);
    RHPIPDSSPLLQFGGNVRLRHLYTSGPHGLSSCFLRIRADGVVDCARGQSAHSLLEIKAVALRTVAIKGVHSVRYLCMGADGKMQGLLQYSEEDCAFEEEIRPDGYNVYRSEKHRLPVSLSSAKQRQLYKNRGFLPLSHFLPMLPMVPEEPEDLRGHLESDMFSSPLETDSMDPFGLVTGLEAVRSPSFEK (M51);
    MDSSPLLQWGDPIRLRHLYTSGPHGLSSCFLRIRADGVVDCARGQSAHSLLEIKAVALRTVAIKGVHSVRYLCMGADGKMQGLLQYSEEDCAFEEEIRPDGYNVYRSEKHRLPVSLSSAKQRQLYKNRGFLPLSHFLPMLPMVPEEPEDLRGHLESDMFSSPLETDSMDPFGLVTGLEAVRSPSFEK (M53); 및
    MRDSSPLVHYGWGDPIRLRHLYTSGPHGLSSCFLRIRADGVVDCARGQSAHSLLEIKAVALRTVAIKGVHSVRYLCMGADGKMQGLLQYSEEDCAFEEEIRPDGYNVYRSEKHRLPVSLSSAKQRQLYKNRGFLPLSHFLPMLPMVPEEPEDLRGHLESDMF된 SSPLETDS16MDPFGLVTGLEAVRSPSFEK (M70), 또는
    앞서 언급한 펩티드 서열 중 어느 서열의 아서열 또는 절편, 또는 앞서 말한 펩티드 서열 중 임의의 서열로 여기에서 R 말단 잔기가 제거된 서열 중 어느 것을 포함하거나 이를 구성으로 하는, 키메라 펩티드 서열 또는 펩티드 서열.
  20. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 N-말단 영역은 아미노산 잔기 DSSPLLQFGGQV를 포함하고, 그리고 상기 V 잔기는 N-말단 영역의 마지막 위치에 상응하는 것인, 키메라 펩티드 서열.
  21. 제1항 내지 제3항 또는 제6항 중 어느 항에 있어서, 상기 아미노산 잔기 HPIP 들은 N-말단 영역의 처음 4 개의 아미노산 잔기인, 키메라 펩티드 서열 또는 펩티드 서열.
  22. 제1항 내지 제3항, 제6항 또는 제19항 중 어느 항에 있어서, 상기 N-말단 영역의 첫번째 위치는 R 잔기, 또는 상기 N-말단 영역의 첫번째 위치는 M 잔기, 또는 상기 N-말단 영역의 첫번째 및 두번째 위치는 MR 서열, 또는 상기 N-말단 영역의 첫번째 및 두번째 위치는 RM 서열, 또는 상기 N-말단 영역의 첫번째 및 두번째 위치는 RD 서열, 또는 상기 N-말단 영역의 첫번째 및 두번째 위치는 DS 서열, 또는 상기 N-말단 영역의 첫번째 및 두번째 위치는 MD 서열, 또는 상기 N-말단 영역의 첫번째 및 두번째 위치는 MS 서열, 또는 상기 N-말단 영역의 첫번째 내지 세번째 위치는 MDS 서열, 또는 상기 N-말단 영역의 첫번째 내지 세번째 위치는 RDS 서열, 또는 상기 N-말단 영역의 첫번째 내지 세번째 위치는 MSD 서열, 또는 상기 N-말단 영역의 첫번째 내지 세번째 위치는 MSS 서열, 또는 상기 N-말단 영역의 첫번째 내지 세번째 위치는 DSS 서열, 또는 상기 N-말단 영역의 첫번째 내지 네번째 위치는 RDSS 서열, 또는 상기 N-말단 영역의 첫번째 내지 네번째 위치는 MDSS 서열, 또는 상기 N-말단 영역의 첫번째 내지 다섯번째 위치는 MRDSS 서열, 또는 상기 N-말단 영역의 첫번째 내지 다섯번째 위치는 MSSPL 서열, 또는 상기 N-말단 영역의 첫번째 내지 여섯번째 위치는 MDSSPL 서열, 또는 상기 N-말단 영역의 첫번째 내지 일곱번째 위치는 MSDSSPL 서열인, 키메라 펩티드 서열 또는 펩티드 서열.
  23. 제1항 내지 제3항 또는 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 C-말단 영역의 마지막 위치는 서열번호 99 [FGF19]의 약 194 잔기에 상응하는 것인, 키메라 펩티드 서열 또는 펩티드 서열.
  24. 제1항 내지 제3항 또는 제6항 중 어느 항에 있어서,
    상기 펩티드 서열은 하기를 포함하거나 이로 구성된 키메라 펩티드 서열 또는 펩티드 서열:
    HPIPDSSPLLQFGGQVRLRHLYTSGPHGLSSCFLRIRADGVVDCARGQSAHSLLEIKAVALRTVAIKGVHSVRYLCMGADGKMQGLLQYSEEDCAFEEEIRPDGYNVYRSEKHRLPVSLSSAKQRQLYKNRGFLPLSHFLPMLPMVPEEPEDLRGHLESDMFSSPLETDSMDPFGLVTGLEAVRSPSFEK 또는 이들의 아서열 또는 절편; 또는
    DSSPLLQFGGQVRLRHLYTSGPHGLSSCFLRIRADGVVDCARGQSAHSLLEIKAVALRTVAIKGVHSVRYLCMGADGKMQGLLQYSEEDCAFEEEIRPDGYNVYRSEKHRLPVSLSSAKQRQLYKNRGFLPLSHFLPMLPMVPEEPEDLRGHLESDMFSSPLETDSMDPFGLVTGLEAVRSPSFEK, 또는 이들의 아서열 또는 절편;
    RPLAFSDASPHVHYGWGDPIRLRHLYTSGPHGLSSCFLRIRADGVVDCARGQSAHSLLEIKAVALRTVAIKGVHSVRYLCMGADGKMQGLLQYSEEDCAFEEEIRPDGYNVYRSEKHRLPVSLSSAKQRQLYKNRGFLPLSHFLPMLPMVPEEPEDLRGHLESDMFSSPLETDSMDPFGLVTGLEAVRSPSFEK, 또는 이들의 아서열 또는 절편;
    RPLAFSDSSPLVHYGWGDPIRLRHLYTSGPHGLSSCFLRIRADGVVDCARGQSAHSLLEIKAVALRTVAIKGVHSVRYLCMGADGKMQGLLQYSEEDCAFEEEIRPDGYNVYRSEKHRLPVSLSSAKQRQLYKNRGFLPLSHFLPMLPMVPEEPEDLRGHLESDMFSSPLETDSMDPFGLVTGLEAVRSPSFEK, 또는 이들의 아서열 또는 절편;
    DSSPLVHYGWGDPIRLRHLYTSGPHGLSSCFLRIRADGVVDCARGQSAHSLLEIKAVALRTVAIKGVHSVRYLCMGADGKMQGLLQYSEEDCAFEEEIRPDGYNVYRSEKHRLPVSLSSAKQRQLYKNRGFLPLSHFLPMLPMVPEEPEDLRGHLESDMFSSPLETDSMDPFGLVTGLEAVRSPSFEK, 또는 이들의 아서열 또는 절편인 키메라 펩티드 서열 또는 펩티드 서열.
  25. 제18항, 제19항 또는 제24항에 있어서, 상기 이들의 아서열 또는 절편은 아미노 말단, 카르복시-말단 또는 내부에서 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 또는 그 이상의 아미노산 결실을 갖는, 키메라 펩티드 서열 또는 펩티드 서열.
  26. 제1항, 제2항 또는 제6항에 있어서, 상기 언급한 N-말단 영역, 또는 언급한 C-말단 영역은 약 5 내지 10, 10 내지 20, 20 내지 30, 30 내지 40, 40 내지 50, 60 내지 70, 70 내지 80, 80 내지 90, 90 내지 100 또는 이 이상 아미노산의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된, 키메라 펩티드 서열.
  27. 제3항 또는 제6항에 있어서, 상기 FGF19 서열 일부, 또는 상기 FGF21 서열 일부는 FGF19 또는 FGF21의 약 5 내지 10, 10 내지 20, 20 내지 30, 30 내지 40, 40 내지 50, 50 내지 60, 60 내지 70, 70 내지 80, 80 내지 90, 90 내지 100 또는 그 이상의 아미노산의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 것인, 펩티드 서열.
  28. 제1항, 제3항 또는 제6항 중 어느 항에 있어서, 상기 언급한 N-말단 영역, 또는 언급한 C-말단 영역, 또는 언급한 FGF19 서열 일부, 또는 언급한 FGF21 서열 일부는 링커 또는 스페이서에 의하여 연결된 것인, 키메라 펩티드 서열 또는 펩티드 서열.
  29. 제1항 내지 제3항 또는 제6항 중 어느 항에 있어서, 상기 펩티드 서열의 N-말단은 하기 중 임의의 것: HPIPDSSPLLQFGGQVRLRHLYTSG (M5); DSSPLLQFGGQVRLRHLYTSG (M6); RPLAFSDSSPLLQFGGQVRLRHLYTSG (M7); HPIPDSSPLLQWGDPIRLRHLYTSG (M8); HPIPDSSPLLQFGWGDPIRLRHLYTSG (M9); HPIPDSSPHVHYGWGDPIRLRHLYTSG (M10); RPLAFSDAGPLLQWGDPIRLRHLYTSG (M11); RPLAFSDAGPLLQFGWGDPIRLRHLYTSG (M12); RPLAFSDAGPLLQFGGQVRLRHLYTSG (M13); HPIPDSSPHVHYGGQVRLRHLYTSG (M14); RPLAFSDAGPHVHWGDPIRLRHLYTSG (M15); RPLAFSDAGPHVHWGDPIRLRHLYTSG (M16); RPLAFSDAGPHVGWGDPIRLRHLYTSG (M17); RPLAFSDAGPHYGWGDPIRLRHLYTSG (M18); RPLAFSDAGPVYGWGDPIRLRHLYTSG (M19); RPLAFSDAGPVHGWGDPIRLRHLYTSG (M20); RPLAFSDAGPVHYWGDPIRLRHLYTSG (M21); RPLAFSDAGPHVHGWGDPIRLRHLYTSG (M22); RPLAFSDAGPHHGWGDPIRLRHLYTSG (M23); RPLAFSDAGPHHYWGDPIRLRHLYTSG (M24); RPLAFSDAGPHVYWGDPIRLRHLYTSG (M25); RPLAFSDSSPLVHWGDPIRLRHLYTSG (M26); RPLAFSDSSPHVHWGDPIRLRHLYTSG (M22); RPLAFSDAGPHVWGDPIRLRHLYTSG (M28); RPLAFSDAGPHVHYWGDPIRLRHLYTSG (M29); RPLAFSDAGPHVHYAWGDPIRLRHLYTSG (M30); RHPIPDSSPLLQFGAQVRLRHLYTSG (M31); RHPIPDSSPLLQFGDQVRLRHLYTSG (M32); RHPIPDSSPLLQFGPQV RLRHLYTSG (M33); RHPIPDSSPLLQFGGAVRLRHLYTSG (M34); RHPIPDSSPLLQFGGEVRLRHLYTSG (M35); RHPIPDSSPLLQFGGNVRLRHLYTSG (M36); RHPIPDSSPLLQFGGQARLRHLYTSG (M37); RHPIPDSSPLLQFGGQIRLRHLYTSG (M38); RHPIPDSSPLLQFGGQT RLRHLYTSG (M39);RHPIPDSSPLLQFGWGQPVRLRHLYTSG (M40); DAGPHVHYGWGDPIRLRHLYTSG (M74); VHYGWGDPIRLRHLYTSG (M75); RLRHLYTSG (M77); 또는 앞서 언급한 펩티드 서열 중 어느 것에서, 상기 아미노 말단 R 잔기가 제거된 것을 포함하거나 이로 구성된, 키메라 펩티드 서열 또는 펩티드 서열.
  30. 제1항 내지 제3항 또는 제6항 중 어느 항에 있어서, 상기 펩티드 서열의 N-말단은 하기 중 임의의 것: RHPIPDSSPLLQFGWGDPIRLRHLYTSG; RHPIPDSSPLLQWGDPIRLRHLYTSG; RPLAFSDAGPLLQFGWGDPIRLRHLYTSG; RHPIPDSSPHVHYGWGDPIRLRHLYTSG; RPLAFSDAGPLLQFGGQVRLRHLYTSG; RHPIPDSSPHVHYGGQVRLRHLYTSG; RPLAFSDAGPHVHYGGDIRLRHLYTSG; RDSSPLLQFGGQVRLRHLYTSG; RPLAFSDSSPLLQFGGQVRLRHLYTSG; RHPIPDSSPLLQFGAQVRLRHLYTSG; RHPIPDSSPLLQFGDQVRLRHLYTSG; RHPIPDSSPLLQFGPQVRLRHLYTSG; RHPIPDSSPLLQFGGAVRLRHLYTSG; RHPIPDSSPLLQFGGEVRLRHLYTSG; RHPIPDSSPLLQFGGNVRLRHLYTSG; RHPIPDSSPLLQFGGQARLRHLYTSG; RHPIPDSSPLLQFGGQIRLRHLYTSG; RHPIPDSSPLLQFGGQTRLRHLYTSG; RHPIPDSSPLLQFGWGQPVRLRHLYTSG; 또는 앞서 언급한 펩티드 서열 중 어느 것에서 상기 아미노 말단 R 잔기가 제거된 것을 포함하거나 이로 구성되는, 키메라 펩티드 서열 또는 펩티드 서열.
  31. 제29항 또는 제30항에 있어서, 상기 펩티드 서열은 C-말단에서 서열번호 99 [FGF19]의 30 내지 194 아미노산 잔기 추가를 더 포함하고, 결과적으로 키메라 폴리펩티드인, 키메라 폴리펩티드 서열 또는 펩티드 서열.
  32. 제29항 또는 제30항 중 어느 항에서, 상기 펩티드 서열은 하기에 나타낸 FGF19 서열의 전부 또는 일부:
    펩티드의 C-말단에 위치된 PHGLSSCFLRIRADGVVDCARGQSAHSLLEIKAVALRTVAIKGVHSVRYLCMGADGKMQGLLQYSEEDCAFEEEIRPDGYNVYRSEKHRLPVSLSSAKQRQLYKNRGFLPLSHFLPMLPMVPEEPEDLRGHLESDMFSSPLETDSMDPFGLVTGLEAVRSPSFEK,
    또는 상기 아미노산 말단의 "R" 잔기가 펩티드로부터 결실된 것을 추가로 포함하는 것인, 키메라 펩티드 서열 또는 펩티드 서열.
  33. 제1항 내지 제3항 또는 제6항 중 어느 항에 있어서, 상기 아서열은 하나 이상의 아미노산 결실을 갖는 키메라 펩티드 서열 또는 펩티드 서열의 아서열.
  34. 제33항에 있어서, 상기 아서열은 아미노 말단, 카르복시-말단 또는 내부에서 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 또는 그 이상의 아미노산 결실을 갖는 것인, 아서열.
  35. 제6항에 있어서, 상기 참조 또는 야생형 FGF19 서열은 하기에 나타낸 바와 같은 것인 펩티드 서열:
    RPLAFSDAGPHVHYGWGDPIRLRHLYTSGPHGLSSCFLRIRADGVVDCARGQSAHSLLEIKAVALRTVAIKGVHSVRYLCMGADGKMQGLLQYSEEDCAFEEEIRPDGYNVYRSEKHRLPVSLSSAKQRQLYKNRGFLPLSHFLPMLPMVPEEPEDLRGHLESDMFSSPLETDSMDPFGLVTGLEAVRSPSFEK (서열번호 99).
  36. 제6항에 있어서, 상기 참조 또는 야생형 FGF21 서열은 하기에 나타낸 바와 같은 것인 펩티드 서열:
    RHPIPDSSPLLQFGGQVRQRYLYTDDAQQTEAHLEIREDGTVGGAADQSPESLLQLKALKPGVIQILGVKTSRFLCQRPDGALYGSLHFDPEACSFRELLLEDGYNVYQSEAHGLPLHLPGNKSPHRDPAPRGPARFLPLPGLPPALPEPPGILAPQPPDVGSSDPLSMVGPSQGRSPSYAS (서열번호 100).
  37. 제1항 내지 제3항 또는 제6항 중 어느 항에 있어서, 상기 N-말단 영역 첫번째 아미노산 위치는 "M" 잔기, "R" 잔기, "S" 잔기, "H" 잔기, "P" 잔기, "L" 잔기 또는 "D" 잔기이며, 또는 상기 펩티드 서열은 N-말단 영역의 첫번째 아미노산 위치에 "M" 잔기 또는 "R" 잔기를 갖지 않는 것인, 키메라 펩티드 서열 또는 펩티드 서열.
  38. 제1항 내지 제3항 또는 제6항 중 어느 항에 있어서, 상기 N-말단 영역은 하기 서열들 중 어느 하나를 포함하는 것인, 키메라 펩티드 서열 또는 펩티드 서열: MDSSPL, MSDSSPL, SDSSPL, MSSPL 또는 SSPL.
  39. 제1항 내지 제3항 또는 제6항 중 어느 항에 있어서, 상기 펩티드 서열은 FGF19 와 비교하여 간세포 암종(HCC) 형성이 감소되거나 또는 FGF19의 16 내지 20 아미노산인 WGDPI 서열이 GQV, GDI, WGPI, WGDPV, WGDI, GDPI, GPI, WGQPI, WGAPI, AGDPI, WADPI, WGDAI, WGDPA, WDPI, WGDI, WGDP 또는 FGDPI 중 어느 것으로 치환된 것을 갖는 FGF19 변이체 서열인, 키메라 펩티드 서열 또는 펩티드 서열.
  40. 제1항 내지 제3항 또는 제6항에 있어서, 상기 펩티드 서열은 FGF19 와 비교하여 높은 당(glucose) 저감 활성을 갖거나, 또는 FGF19의 16 내지 20 아미노산의 WGDPI 서열이 GQV, GDI, WGPI, WGDPV, WGDI, GDPI, GPI, WGQPI, WGAPI, AGDPI, WADPI, WGDAI, WGDPA, WDPI, WGDI, WGDP 또는 FGDPI 중 어느 것으로 치환된 것을 갖는 FGF19 변이체 서열인, 키메라 펩티드 서열 또는 펩티드 서열.
  41. 제1항 내지 제3항 또는 제6항에 있어서, 상기 펩티드 서열은 FGF19 와 비교하여 적은 지질 증가 활성을 가지거나, 또는 FGF19의 16 내지 20 아미노산의 WGDPI 서열이 GQV, GDI, WGPI, WGDPV, WGDI, GDPI, GPI, WGQPI, WGAPI, AGDPI, WADPI, WGDAI, WGDPA, WDPI, WGDI, WGDP 또는 FGDPI 중에서 어느 것으로 치환된 것을 갖는 FGF19 변이체 서열인, 키메라 펩티드 서열 또는 펩티드 서열.
  42. 제1항 내지 제3항 또는 제6항에 있어서, 상기 펩티드 서열은 FGF 19와 비교하여 적은 트리글리세라이드, 콜레스테롤, 비-HDL 또는 HDL 증가 활성을 갖거나 또는 FGF19의 16 내지 20 아미노산 WGDPI 서열이 GQV, GDI, WGPI, WGDPV, WGDI, GDPI, GPI, WGQPI, WGAPI, AGDPI, WADPI, WGDAI, WGDPA, WDPI, WGDI, WGDP 또는 FGDPI 중에서 어느 것으로 치환된 것을 갖는 FGF19 변이체 서열인, 키메라 펩티드 서열 또는 펩티드 서열.
  43. 제1항 내지 제3항 또는 제6항 중 어느 항에 있어서, 상기 펩티드 서열은 FGF21 과 비교하여 적은 제지방 질량(lean mass) 감소 활성을 갖는 것인, 키메라 펩티드 서열 또는 펩티드 서열.
  44. 제39항 내지 제43항 중 어느 항에 있어서, 상기 간세포 암종 (HCC) 형성,당 저감 활성, 지질 증가 활성, 또는 제지방 질량 감소 활성은 db/db 마우스에서 알아낸 것인, 키메라 펩티드 서열 또는 펩티드 서열.
  45. 제1항 내지 제3항 또는 제6항 중 어느 항에 있어서, 상기 펩티드 서열은 섬유아세포 성장 인자 수용체 4 (FGFR4) 에 결합하거나 또는 FGFR4 를 활성화시키거나, 또는 검출불가능하게 섬유아세포 성장 인자 수용체 4 (FGFR4)에 결합하거나 또는 FGFR4 를 활성화시키는, 키메라 펩티드 서열 또는 펩티드 서열.
  46. 제1항 내지 제3항 또는 제6항 중 어느 항에 있어서, 상기 펩티드 서열은 FGFR4에 대한 FGF19 결합 친화도보다 낮은 친화도를 가지고, 비슷하거나 높게 FGFR4와 결합하는 것인, 키메라 펩티드 서열 또는 펩티드 서열.
  47. 제1항 내지 제3항 또는 제6항 중 어느 항에 있어서, 상기 펩티드 서열은 FGF19 활성화 FGFR4 보다 적은 정도 또는 양으로, 이와 비슷하거나 이보다 높게 FGFR4 를 활성화시키는 것인, 키메라 펩티드 서열 또는 펩티드 서열.
  48. 제1항 내지 제3항 또는 제6항 중 어느 항에 있어서, 상기 펩티드 서열은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10 개 아미노산 치환, 결실 또는 삽입을 갖는 것인, 키메라 펩티드 서열 또는 펩티드 서열.
  49. 제48항에 있어서, 상기 아미노산 결실이 N- 또는 C- 말단 또는 내부인 것인, 키메라 펩티드 서열 또는 펩티드 서열.
  50. 제48항에 있어서, 상기 아미노산 치환 또는 결실은 FGF19의 8 내지 20 위치의 아미노산 (AGPHVHYGWGDPI) 중 어느 곳인, 키메라 펩티드 서열 또는 펩티드 서열.
  51. 제1항 내지 제3항 또는 제6항 중 어느 항에 있어서, 상기 펩티드 서열은 하나 또는 그 이상의 L-아미노산, D-아미노산, 비-자연적으로 발생한 아미노산, 또는 아미노산 미메틱, 유도체 또는 유사체를 포함하는, 키메라 펩티드 서열 또는 펩티드 서열.
  52. 제1항 내지 제51항 중 어느 항의 키메라 펩티드 서열 또는 펩티드 서열을 포함하는 조성물.
  53. 제1항 내지 제51항 중 어느 항의 키메라 펩티드 서열 또는 펩티드 서열을 포함하는 약학적 조성물.
  54. 제1항 내지 제51항 중 어느 항의 키메라 펩티드 서열 또는 펩티드 서열과 당 저감제를 포함하는 약학적 조성물.
  55. 제1항 내지 제51항 중 어느 항에 있어서, 상기 펩티드 서열은 단리되고 정제된 것인, 키메라 펩티드 서열 또는 펩티드 서열.
  56. 제1항 내지 제51항 중 어느 항의 키메라 펩티드 서열 또는 펩티드 서열을 암호화하는 핵산 분자.
  57. 제56항에 있어서, in vitro, 세포 내 또는 in vivo 에서 펩티드를 암호화하는 핵산 분자를 발현시키는 작동가능한 연결 내의 발현 조절 요소를 추가로 포함하는 핵산 분자.
  58. 제56항 또는 제57항의 핵산 분자를 포함하는 벡터.
  59. 제58항에 있어서, 상기 벡터는 바이러스성 벡터를 포함하는 벡터.
  60. 제1항 내지 제51항 중 어느 항의 키메라 펩티드 서열 또는 펩티드 서열을 발현하는 형질전환체 또는 숙주세포.
  61. 키메라 펩티드 서열 또는 펩티드 서열을 장애를 치료하기 위한 효과적인 양으로 대상에 투여하는 것을 포함하는, 제1항 내지 제51항 중 어느 항의 키메라 펩티드 서열 또는 펩티드 서열에 의하여 치료할 수 있는 질환 또는 장애를 갖거나 또는 가질 위험이 있는 대상을 치료하는 방법.
  62. 제61항에 있어서, 상기 질환 또는 장애는 고혈당증 상태, 인슐린 저항성, 고인슐린혈(hyperinsulinemia), 당불내성(glucose intolerance) 또는 대사증후군(metabolic syndrome) 을 포함하는 것인 방법.
  63. 제62항에 있어서, 상기 고혈당증 상태는 당뇨병을 포함하는 방법.
  64. 제62항에 있어서, 상기 고혈당증 상태는 인슐린-의존적(I)당뇨병, Ⅱ형 당뇨병, 또는 임신성 당뇨병을 포함하는 것인 방법.
  65. 제61항에 있어서, 상기 장애는 비만 또는 원하지 않는 체질량을 포함하는 것인, 방법.
  66. 청구항 제1항 내지 제51항 중 어느 항의 키메라 또는 펩티드 서열을 대상 내 당 대사를 증진하는데 효과적인 양으로 대상에게 투여하는 것을 포함하는, 그들을 필요로 하는 대상에서 당 대사를 증진시키는 방법.
  67. 제63항에 있어서, 상기 대상은 100mg/dl 보다 높은 공복 혈장 당 수준 또는 6% 초과의 헤모글로빈 A1c (HbA1c) 수준을 갖는 것인, 방법.
  68. 제63항 또는 제67항의 방법에 있어서, 상기 방법은 결과적으로 당 수준을 감소시키고, 인슐린 민감도를 증가시키고, 인슐린 저항성을 감소시키고, 글루카곤을 감소시키고, 당 내성 또는 당 대사 또는 항상성을 증진시키고, 췌장 기능을 증진시키고, 트리글리세라이드, 콜레스테롤, IDL, LDL 또는 VLDL 수준을 감소시키고, 혈압을 낮추고, 혈관 내막의 두께를 감소시키고, 또는 체질량 또는 무게 증가를 감소시키는 것인 방법.
  69. 상당한 간세포 암종 (HCC) 활성을 갖지 않으면서, 당 저감 활성을 갖는 펩티드 서열을 확인하기 위한 하기를 포함하는 방법:
    a) 후보 펩티드 서열을 제공;
    b) 실험 동물에 후보 펩티드 서열을 투여;
    c) 상기 후보 펩티드 서열이 당 수준을 감소시키는지 여부를 결정하기 위하여 후보 펩티드 서열 투여 후, 상기 동물의 당 수준을 측정; 및
    d) 동물에서 후보 펩티드 서열의 HCC 유도, 또는 HCC 활성과 관련이 있는 마커의 발현을 분석하고, 그렇게 함으로써 당 저감 활성을 갖고 그리고 상당한 HCC 활성을 갖지 않는 후보 펩티드가 상당한 간세포 암종 (HCC) 활성을 갖지 않으면서 당 저감 활성을 갖는 펩티드 서열인 것으로, 후보 펩티드 서열을 확인하는 방법.
  70. 제69항에 있어서, 상기 실험동물은 db/db 마우스인 방법.
  71. 제69항에 있어서, 추가적으로 HCC 유도 증거를 나타내는 후보 펩티드 서열인지를 결정하기 위하여 실험 동물 유래의 간 조직 시료를 평가하는 것을 포함하는, 방법.
  72. 제69항에 있어서, 상기 HCC 활성과 관련있는 마커는 지질 프로파일을 포함하고, 그리고 상기 FGF19와 비교하여 적은 지질 증가 활성은 상기 펩티드가 상당한 HCC 활성을 갖지 않는다는 것을 가리키는 것인 방법.
  73. 제69항에 있어서, 상기 HCC 활성과 관련있는 마커는 알도-케토 환원효소 유전자 발현을 포함하고, 그리고 상기 FGF19와 비교하여 상향조절 또는 증가된 알도-케토 환원효소 유전자 발현은 상기 펩티드가 상당한 HCC 활성을 갖지 않는다는 것을 가르키는 것인 방법.
  74. 제69항에 있어서, 상기 HCC 활성을 나타내는 마커는 Slc1a2 유전자 발현을 포함하고, 그리고 상기 FGF21 과 비교하여 하향 조절 또는 감소된 Slc1a2 유전자 발현은 상기 펩티드가 상당한 HCC 활성을 갖지 않는다는 것을 가르키는 것인 방법.
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