JP6254524B2 - 代謝障害及び疾患の治療のための組成物、使用及び方法 - Google Patents

代謝障害及び疾患の治療のための組成物、使用及び方法 Download PDF

Info

Publication number
JP6254524B2
JP6254524B2 JP2014519191A JP2014519191A JP6254524B2 JP 6254524 B2 JP6254524 B2 JP 6254524B2 JP 2014519191 A JP2014519191 A JP 2014519191A JP 2014519191 A JP2014519191 A JP 2014519191A JP 6254524 B2 JP6254524 B2 JP 6254524B2
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
peptide
subject
composition
fgf19
diabetes
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
JP2014519191A
Other languages
English (en)
Other versions
JP2014527402A (ja
JP2014527402A5 (ja
Inventor
リング レイ
リング レイ
エー．リンドウト ダーリン
エー．リンドウト ダーリン
Original Assignee
エヌジーエム バイオファーマシューティカルス，インコーポレーテッド
エヌジーエム バイオファーマシューティカルス，インコーポレーテッド
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by エヌジーエム バイオファーマシューティカルス，インコーポレーテッド, エヌジーエム バイオファーマシューティカルス，インコーポレーテッド filed Critical エヌジーエム バイオファーマシューティカルス，インコーポレーテッド
Publication of JP2014527402A publication Critical patent/JP2014527402A/ja
Publication of JP2014527402A5 publication Critical patent/JP2014527402A5/ja
Application granted granted Critical
Publication of JP6254524B2 publication Critical patent/JP6254524B2/ja
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/18—Growth factors; Growth regulators
    • A61K38/1825—Fibroblast growth factor [FGF]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/13—Amines
    • A61K31/14—Quaternary ammonium compounds, e.g. edrophonium, choline
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/13—Amines
    • A61K31/155—Amidines (), e.g. guanidine (H2N—C(=NH)—NH2), isourea (N=C(OH)—NH2), isothiourea (—N=C(SH)—NH2)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/18—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for pancreatic disorders, e.g. pancreatic enzymes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/04—Anorexiants; Antiobesity agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/06—Antihyperlipidemics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • A61P5/48—Drugs for disorders of the endocrine system of the pancreatic hormones
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • A61P5/48—Drugs for disorders of the endocrine system of the pancreatic hormones
    • A61P5/50—Drugs for disorders of the endocrine system of the pancreatic hormones for increasing or potentiating the activity of insulin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/08—Vasodilators for multiple indications
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/12—Antihypertensives
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
    • C07K14/50—Fibroblast growth factor [FGF]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/74—Synthetic polymeric materials
    • A61K31/785—Polymers containing nitrogen
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/5082—Supracellular entities, e.g. tissue, organisms
    • G01N33/5088—Supracellular entities, e.g. tissue, organisms of vertebrates
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/66—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving blood sugars, e.g. galactose

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Emergency Medicine (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)

Description

(関連出願)
本出願は、2011年7月1日に出願された特許出願第61/504,128号、及び2011年8月4日に出願された特許出願第61/515,126号の優先権を請求するものであり、これら両出願は、それらの全体が明白に引用により本明細書中に組み込まれている。
(発明の分野)
本発明は、グルコース降下活性を有する、線維芽細胞増殖因子19(FGF19)のタンパク質及びペプチド配列(及びペプチド模倣体)の変種、並びに線維芽細胞増殖因子19(FGF19)及び／又は線維芽細胞増殖因子21(FGF21)のタンパク質及びペプチド配列(及びペプチド模倣体)の融合体、並びに線維芽細胞増殖因子19(FGF19)及び／又は線維芽細胞増殖因子21(FGF21)のタンパク質及びペプチド配列(及びペプチド模倣体)の融合体の変種、並びに高血糖症及び他の障害の治療の方法及び治療における使用に関する。
(緒言)
糖尿病は、膵β細胞からのインスリン産生の欠如(I型)又はインスリン抵抗性若しくは不充分なインスリン産生(II型)によって引き起こされる衰弱性代謝疾患である。β細胞は、食後の放出のためにインスリンを製造し且つ貯蔵するよう特化された内分泌細胞である。インスリンは、グルコースの血液からそれが必要とされる組織への輸送を促進するホルモンである。糖尿病患者は、血液グルコースレベルを頻繁にモニタリングしなければならず、且つ多くは生存のための毎日複数回のインスリン注射を必要とする。しかしそのような患者は、インスリン注射により理想的なグルコースレベルに達することは稀である(Turner, R.C.らの文献、JAMA, 281:2005 (1999))。更に長期にわたるインスリンレベルの上昇は、高血糖ショック及びインスリンに対する体の反応の脱感作などの、有害な副作用を生じ得る。結果的に、糖尿病患者は、心臓血管疾患、腎疾患、失明、神経損傷及び創傷治癒障害などの、長期合併症を依然発症する(英国前向き糖尿病試験(UKPDS)グループ, Lancet, 352:837 (1998))。
肥満外科手術が、可能性のある糖尿病治療として提唱されている。その手術後の消化管ホルモン分泌の変化は、糖尿病状態の解消に寄与することが想定されている。その基礎となる分子機構はまだ解明されていないが、グルカゴン様ペプチド1(GLP-1)が、可能性のある候補と推定されている(Rubino, F.の文献、Diabetes Care, 32 Suppl 2:S368(2009))。FGF19は、遠位小腸において高度に発現され、FGF19のトランスジェニック過剰発現は、グルコースホメオスタシスを改善する(Tomlinson, E.の文献、Endocrinology, 143(5):1741-7(2002))。ヒトにおける血清FGF19レベルは、胃バイパス手術後に上昇する。FGF19の増大した発現及び分泌は、手術後に経験した糖尿病寛解を少なくとも一部説明することができる。
従って、ヒトにおける糖尿病、プレ糖尿病、インスリン抵抗性、高インスリン血症、耐糖能異常又はメタボリック症候群などの高血糖状態、並びに上昇したグルコースレベルに関連した他の障害及び疾患の代替治療の必要性が存在する。本発明は、この必要性を満足し、且つ関連する利点を提供する。
(概要)
本発明は、一部、グルコース降下活性などの1種以上の活性を有する、線維芽細胞増殖因子19(FGF19)ペプチド配列の変種、線維芽細胞増殖因子19(FGF19)及び／又は線維芽細胞増殖因子21(FGF21)ペプチド配列の融合体、並びに線維芽細胞増殖因子19(FGF19)及び／又は線維芽細胞増殖因子21(FGF21)ペプチド配列の融合体(キメラ)の変種を基にしている。そのようなFGF19及び／又はFGF21ペプチド配列の変種及び融合体(キメラ)は、肝細胞癌(HCC)形成又はHCC腫瘍形成を増加又は誘導することのない配列を含む。そのようなFGF19及び／又はFGF21ペプチド配列の変種及び融合体(キメラ)は、脂質プロファイルの実質的上昇又は増加を誘導しない配列も含む。
一実施態様において、キメラペプチド配列は、少なくとも7個のアミノ酸残基を有するN-末端領域であって、該N-末端領域が、第一のアミノ酸位置及び最後のアミノ酸位置を有し、ここで該N-末端領域が、DSSPL又はDASPH配列を有するもの；並びに、FGF19の一部を有するC-末端領域であって、ここで該C-末端領域が、第一のアミノ酸位置及び最後のアミノ酸位置を有し、ここで該C-末端領域がFGF19のアミノ酸残基16-29(WGDPIRLRHLYTSG)を含み、且つここで該W残基が、C-末端領域の第一のアミノ酸位置に対応しているもの：を含むか又はこれらからなる。
別の実施態様において、キメラペプチド配列は、FGF21の一部を有するN-末端領域であって、ここで該N-末端領域が、第一のアミノ酸位置及び最後のアミノ酸位置を有し、ここで該N-末端領域が、GQV配列を有し、且つここで該V残基が、N-末端領域の最後のアミノ酸位置に対応しているもの；並びに、FGF19の一部を含むC-末端領域であって、該C-末端領域が、第一のアミノ酸位置及び最後のアミノ酸位置を有し、ここで該C-末端領域が、FGF19のアミノ酸残基21-29(RLRHLYTSG)を含み、且つここで該R残基が、C-末端領域の第一の位置に対応しているもの：を含むか又はこれらからなる。
更なる実施態様において、キメラペプチド配列は、配列番号:100[FGF21]の一部を含むN-末端領域であって、該N-末端領域が、第一のアミノ酸位置及び最後のアミノ酸位置を有し、ここで該N-末端領域が、アミノ酸残基GQVを含む配列番号:100[FGF21]の少なくとも5個の(又はそれよりも多い)隣接アミノ酸を含み、且つここで該V残基が、N-末端領域の最後のアミノ酸位置に対応しているもの；並びに、配列番号:99[FGF19]の一部を含むC-末端領域であって、該C-末端領域が、第一のアミノ酸位置及び最後のアミノ酸位置を有し、ここで該C-末端領域が、配列番号:99[FGF19]のアミノ酸残基21-29のRLRHLYTSGを含み、且つここで該R残基が、C-末端領域の第一の位置に対応しているもの：のいずれかを含むか又はそれからなる。特定の態様において、該N-末端領域は、アミノ酸残基GQVを含む配列番号:100[FGF21]の少なくとも6個の隣接アミノ酸(又はそれよりも多い、例えば7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、20〜25、25〜30、30〜40、40〜50、50〜75、75〜100個の隣接アミノ酸)を含む。
追加の実施態様において、ペプチド配列は、参照型又は野生型FGF19と比べ、1以上のアミノ酸置換、挿入又は欠失を有する、線維芽細胞増殖因子19(FGF19)配列の変種；参照型又は野生型FGF21と比べ、1以上のアミノ酸置換、挿入又は欠失を有する、線維芽細胞増殖因子21(FGF21)配列の変種；FGF21配列の一部に融合されたFGF19配列の一部；又は、FGF21配列の一部に融合されたFGF19配列の一部であって、ここで該FGF19及び／若しくはFGF21配列部分が、参照型又は野生型FGF19及び／若しくはFGF21と比べ、1以上のアミノ酸置換、挿入若しくは欠失を有するもの：のいずれかを含むか又はそれからなる。
また更なる実施態様において、ペプチド配列又はキメラペプチド配列は、配列番号:99[FGF19]のカルボキシ末端のアミノ酸21-194に融合された配列番号:100[FGF21]のアミノ末端のアミノ酸1-16を含むか又はこれらからなるか、或いは該ペプチド配列は、配列番号:100[FGF21]のカルボキシ末端のアミノ酸147-181に融合された配列番号:99[FGF19]のアミノ末端のアミノ酸1-147を有する(M41)か、或いは該ペプチド配列は、配列番号:100[FGF21]のカルボキシ末端のアミノ酸17-181に融合された配列番号:99[FGF19]のアミノ末端のアミノ酸1-20を有する(M44)か、或いは該ペプチド配列は、配列番号:99[FGF19]のカルボキシ末端のアミノ酸148-194に融合された配列番号:100[FGF21]のアミノ末端のアミノ酸1-146を有する(M45)か、或いは該ペプチド配列は、配列番号:99[FGF19]のカルボキシ末端のアミノ酸148-194に融合された配列番号:100[FGF21]の内部アミノ酸17-146に融合された配列番号:99[FGF19]のアミノ末端のアミノ酸1-20を有する(M46)。
また追加の実施態様において、ペプチド配列又はキメラペプチド配列は、配列番号:99[FGF19]のアミノ酸16-20のWGDPI配列に対応するWGDPI配列モチーフを有するか、或いは、置換された、変異された又は非存在のFGF19のアミノ酸16-20のFGF19 WGDPI配列に対応するWGDPI配列モチーフを有するか、或いは該WGDPI配列モチーフは、置換された、変異された又は非存在の1個以上のアミノ酸を有するか；又は、アミノ酸16-20においてFGF19 WGDPI配列について置換されたGQV、GDI、WGPI、WGDPV、WGDI、GDPI、GPI、WGQPI、WGAPI、AGDPI、WADPI、WGDAI、WGDPA、WDPI、WGDI、WGDP又はFGDPIのいずれかを有するFGF19変種配列から区別される。
より更なる実施態様において、ペプチド配列又はキメラペプチド配列は、アミノ酸残基VHYGを含むか又はこれらからなるN-末端領域を有し、ここで該N-末端領域は、アミノ酸残基DASPHVHYGを含むか、又は該N-末端領域は、アミノ酸残基DSSPLVHYGを含むか、又は該N-末端領域は、アミノ酸残基DSSPLLQを含むか、又は該N-末端領域は、アミノ酸残基DSSPLLQFGGQVを含む。特定の態様において、該Gは、該N-末端領域の最後の位置に対応するか、又は該Q残基は、該N-末端領域の最後のアミノ酸位置であるか、又は該V残基は、該N-末端領域の最後の位置に対応する。
更に追加の実施態様において、ペプチド配列又はキメラペプチド配列は、Rが該N-末端領域の第一のアミノ酸位置である、RHPIP；又は、Hが該N-末端領域の第一のアミノ酸位置である、HPIP(例えば、HPIPは、該N-末端領域の最初の4個のアミノ酸残基である)；又は、Rが該N-末端領域の第一のアミノ酸位置である、RPLAF；又は、Pが該N-末端領域の第一のアミノ酸位置である、PLAF；又は、Rが該N-末端領域の第一のアミノ酸位置である、R：を含むか又はこれからなるか、或いは、下記配列のいずれか1つをN-末端領域に有する：MDSSPL、MSDSSPL、SDSSPL、MSSPL又はSSPL。
他の実施態様において、ペプチド配列又はキメラペプチド配列は、該N-末端領域の第一の位置に、"M"残基、"R"残基、"S"残基、"H"残基、"P"残基、"L"残基又は"D"残基を有する。代りの実施態様において、ペプチド配列又はキメラペプチド配列は、該N-末端領域の第一のアミノ酸位置に、"M"残基又は"R"残基を有さない。
更に他の実施態様において、ペプチド配列又はキメラペプチド配列は、該N-末端領域の第一及び第二の位置にMR配列を、又は該N-末端領域の第一及び第二の位置にRM配列を、又は該N-末端領域の第一及び第二の位置にRD配列を、又は該N-末端領域の第一及び第二の位置にDS配列を、又は該N-末端領域の第一及び第二の位置にMD配列を、又は該N-末端領域の第一及び第二の位置にMS配列を、又は該N-末端領域の第一から第三の位置にMDS配列を、又は該N-末端領域の第一から第三の位置にRDS配列を、又は該N-末端領域の第一から第三の位置にMSD配列を、又は該N-末端領域の第一から第三の位置にMSS配列を、又は該N-末端領域の第一から第三の位置にDSS配列を、又は該N-末端領域の第一から第四の位置にRDSS配列を、又は該N-末端領域の第一から第四の位置にMDSS配列を、又は該N-末端領域の第一から第五の位置にMRDSS配列を、又は該N-末端領域の第一から第五の位置にMSSPL配列を、又は該N-末端領域の第一から第六の位置にMDSSPL配列を、又は該N-末端領域の第一から第七の位置にMSDSSPL配列を有する。
更に別の実施態様において、ペプチド配列又はキメラペプチド配列は、C-末端に配列番号:99[FGF19]のアミノ酸残基30-194の追加を有し、配列番号:99[FGF19]の約残基194に対応するC-末端領域の最後の位置を有するキメラポリペプチドを生じる。更なる他の実施態様において、キメラペプチド配列又はペプチド配列は、該ペプチドのC-末端に配置されたか、或いはアミノ末端の"R"残基が該ペプチドIから欠失されている、FGF19配列(例えば、配列番号:99)の全て又は一部を含む。
より特定の実施態様において、キメラペプチド配列又はペプチド配列は、M1-M98変種ペプチド配列のいずれか、又はM1-M98変種ペプチド配列のいずれかの部分配列若しくは断片を含む又はからなる。
追加の特定の実施態様において、キメラペプチド配列又はペプチド配列は、長さが約20〜約200個のアミノ酸残基のN-末端又はC-末端領域を有する。更に特定の実施態様において、キメラペプチド配列又はペプチド配列は、少なくとも1つのアミノ酸欠失を有する。また更なる特定の実施態様において、キメラペプチド配列若しくはペプチド配列、又はそれらの部分配列若しくは断片は、アミノ末端、カルボキシ末端又は内部に1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20又はそれよりも多いアミノ酸欠失を有する。特定の非限定的態様において、アミノ酸の置換又は欠失は、FGF19のアミノ酸位置8-20(AGPHVHYGWGDPI)のいずれかである。
より特定の実施態様において、キメラペプチド配列又はペプチド配列は、約5〜10、10〜20、20〜30、30〜40、40〜50、60〜70、70〜80、80〜90、90〜100個又はそれよりも多いアミノ酸のアミノ酸配列を含むか又はこれらからなる。より特定の実施態様において、キメラペプチド配列又はペプチド配列は、FGF19又はFGF21の約5〜10、10〜20、20〜30、30〜40、40〜50、50〜60、60〜70、70〜80、80〜90、90〜100個又はそれよりも多いアミノ酸のアミノ酸配列を含むか又はこれらからなる。
更に特定の実施態様において、キメラペプチド配列及びペプチド配列は、特定の機能又は活性を有する。一態様において、キメラペプチド配列又はペプチド配列は、FGFR4が媒介した活性を維持するか又は増加する。追加の態様において、キメラペプチド配列又はペプチド配列は、線維芽細胞増殖因子受容体4(FGFR4)に結合するか若しくはFGFR4を活性化するか、又は線維芽細胞増殖因子受容体4(FGFR4)に検出可能に結合しないか若しくはFGFR4を活性化しないか、又はFGFR4に関するFGF19結合親和性よりもより少ない、同等若しくはより大きい親和性でFGFR4に結合するか、又はFGF19がFGFR4を活性化するよりも少ない、同等若しくはより大きい程度又は量までFGFR4を活性化する。更なる態様において、キメラペプチド配列又はペプチド配列は、FGF19、又はFGF19のアミノ酸16-20においてWGDPI配列について置換されたGQV、GDI、WGPI、WGDPV、WGDI、GDPI、GPI、WGQPI、WGAPI、AGDPI、WADPI、WGDAI、WGDPA、WDPI、WGDI、WGDP若しくはFGDPIのいずれかを有するFGF19変種配列と比べ、低下された肝細胞癌(HCC)形成を有し、並びに／又はFGF19、又はFGF19のアミノ酸16-20においてWGDPI配列について置換されたGQV、GDI、WGPI、WGDPV、WGDI、GDPI、GPI、WGQPI、WGAPI、AGDPI、WADPI、WGDAI、WGDPA、WDPI、WGDI、WGDP若しくはFGDPIのいずれかを有するFGF19変種配列と比べ、より大きいグルコース降下活性を有し、並びに／又はFGF19、又はFGF19のアミノ酸16-20においてWGDPI配列について置換されたGQV、GDI、WGPI、WGDPV、WGDI、GDPI、GPI、WGQPI、WGAPI、AGDPI、WADPI、WGDAI、WGDPA、WDPI、WGDI、WGDP若しくはFGDPIのいずれかを有するFGF19変種配列と比べ、より少ない脂質増加活性を有し、並びに／又はFGF19、又はFGF19のアミノ酸16-20においてWGDPI配列について置換されたGQV、GDI、WGPI、WGDPV、WGDI、GDPI、GPI、WGQPI、WGAPI、AGDPI、WADPI、WGDAI、WGDPA、WDPI、WGDI、WGDP若しくはFGDPIのいずれかを有するFGF19変種配列と比べ、より少ないトリグリセリド、コレステロール、非-HDL又はHDL増加活性を有し、並びに／又はFGF21と比べ、より少ない除脂肪量(lean mass)低下活性を有する。そのような機能及び活性は、例えばdb/dbマウスにおいて、インビトロ又はインビボにおいて確認することができる。
更に追加の実施態様において、キメラペプチド配列及びペプチド配列は、単離若しくは精製され、並びに／又はキメラペプチド配列及びペプチド配列は、組成物中に含まれることができる。一実施態様において、キメラペプチド配列又はペプチド配列は、医薬組成物中に含まれる。そのような組成物は、不活性成分又は他の活性成分の組合せを含む。一実施態様において、医薬組成物などの組成物は、キメラペプチド配列又はペプチド配列、及びグルコース降下剤を含有する。
より更なる実施態様において、該キメラペプチド配列又はペプチド配列をコードしている核酸分子が提供される。そのような分子は更に、インビトロ、細胞内若しくはインビボにおいて該ペプチドをコードしている核酸分子の発現をもたらす、機能可能な連結で発現制御エレメント、又は核酸分子を含むベクター(例えばウイルスベクター)を更に含むことができる。該キメラペプチド配列及びペプチド配列を発現する形質転換細胞又は宿主細胞も、提供される。
任意のキメラペプチド配列又はペプチド配列の投与又は送達を含む治療の使用及び方法も、提供される。特定の実施態様において、対象の治療の使用又は方法は、本発明のペプチド配列により治療可能な疾患又は障害を有する対象、若しくは有するリスクのある対象などの対象へ、本発明のキメラペプチド又はペプチド配列を、該疾患若しくは障害を治療するのに有効な量で、投与することを含む。更なる実施態様において、方法は、本発明のキメラペプチド又はペプチド配列を、高血糖状態(例えば、インスリン-依存性(I型)糖尿病、II型糖尿病、又は妊娠性糖尿病などの糖尿病)、インスリン抵抗性、高インスリン血症、耐糖能異常又はメタボリック症候群を有する対象、又は肥満症であるか若しくは望ましくない体質量(body mass)を有する対象などの、対象へ投与することを含む。
前記方法及び使用の特定の態様において、キメラペプチド配列又はペプチド配列は、対象におけるグルコース代謝を改善するのに有効な量で、対象へ投与される。より特定の態様において、対象は、投与前に、100mg/dlより大きい空腹時血漿グルコースレベルを有するか、又は6％を上回るヘモグロビンA1c(HbA1c)レベルを有する。
更なる実施態様において、対象の治療の使用又は方法は、低下したグルコースレベル、増加したインスリン感受性、低下したインスリン抵抗性、低下したグルカゴン、耐糖能若しくはグルコース代謝若しくはホメオスタシスの改善、改善した膵臓機能、又は低下したトリグリセリド、コレステロール、IDL、LDL若しくはVLDLレベル、又は血圧低下、血管内膜厚の減少、又は体質量若しくは体重増加の減少を意図するか又はこれらを生じる。
実質的肝細胞癌(HCC)活性を伴わずにグルコース降下活性を有するキメラペプチド配列及びペプチド配列などの、キメラペプチド配列又はペプチド配列を分析及び／又は同定する方法も、提供される。一実施態様において、方法は：a)候補キメラペプチド配列又はペプチド配列を提供すること；b)該候補ペプチド配列を被験動物(例えば、db/dbマウス)へ投与すること；c)該候補ペプチド配列の投与後、該動物のグルコースレベルを測定し、該候補ペプチド配列がグルコースレベルを低下するかどうかを決定すること：を含む。特定の態様において、該キメラペプチド配列又はペプチド配列はまた、動物におけるHCCの誘導(例えば、被験動物由来の肝組織試料の評価)、又はHCC活性に相関するマーカーの発現について分析され、ここで候補ペプチドは、グルコース降下活性を有し、且つ実質的HCC活性を有さない。そのような方法は、該候補を、同じく任意に実質的肝細胞癌(HCC)活性を伴うことなく、グルコース降下活性を有するものとして同定する。
(図面の説明)
図1は、FGF19及びFGF21のタンパク質配列、並びに代表的変種配列、すなわち変種M5、変種M1、変種M2、変種M69、変種M3、変種M48、変種M49、変種M50、変種M51、変種M52、変種M53及び変種M70のペプチド配列を示す。FGF21の3つの追加の対立遺伝子型(多形体)、すなわちM71、M72及びM73も示している。
図2は、FGF21(影なし)とFGF19(灰色影)タンパク質配列の間の代表的ドメイン交換、並びに生じた融合体(キメラ)配列を示す。該融合体(キメラ)中に存在するFGF21及びFGF19の各々由来のアミノ酸領域は、数字で示している。該キメラ配列の各々に関するグルコース降下及び脂質上昇を示している。
図3A-3Iは、グルコース降下及び体重のデータを示している。A)変種M5；B)変種M1；C)変種M2及び変種M69；D)変種M3；E)変種M48及び変種M49；F)変種M51及び変種M50；G)変種M52ペプチド；H)変種M53ペプチド；並びに、I)変種M70ペプチド配列は全て、db/dbマウスにおいて、グルコース降下(すなわち、抗-糖尿病)活性を有する。マウスには、FGF19、FGF21、選択された変種を発現しているAAVベクターを注射し、且つ食塩水及びGFPが陰性対照であった。
図4A-4Iは、FGF19、FGF21、又はA)変種M5；B)変種M1；C)変種M2及び変種M69；D)変種M3；E)変種M48及び変種M49；F)変種M51及び変種M50；G)変種M52ペプチド；H)変種M53ペプチド；並びに、I)変種M70ペプチド配列を発現しているAAVベクターを注射したdb/dbマウスの血清脂質プロファイル(トリグリセリド、総コレステロール、HDL及び非-HDL)を示している。変種M5ペプチド配列は脂質を増加又は上昇しなかったのに対し、FGF19、M1、M2及びM69は脂質を増加し且つ上昇した。全ての変種の血清レベルは同等であった。食塩水及びGFPが陰性対照であった。
図5A-5Iは、A)変種M5；B)変種M1；C)変種M2及び変種M69；D)変種M3；E)変種M48及び変種M49；F)変種M51及び変種M50；G)変種M52；H)変種M53ペプチド；並びに、I)変種M70ペプチド配列に関する、肝細胞癌(HCC)-関連データを示している。FGF19とは対照的に、全ての変種は、肝細胞癌(HCC)形成又はHCC腫瘍形成を有意に増加も誘導もしなかった。HCCスコアは、変種-注射したマウスに由来した肝臓全体の表面上のHCC結節の数を、野生型FGF19-注射したマウスからのHCC結節の数により除算して、記録した。
図6A-6Iは、A)変種M5；B)変種M1；C)変種M2及び変種M69；D)変種M3；E)変種M48及び変種M49；F)変種M51及び変種M50；G)変種M52；H)変種M53ペプチド；並びに、I)変種M70ペプチド配列に関する、除脂肪量又は脂肪量(fat mass)データを示している。M2、M5及びM69を除き、これらの変種ペプチド配列は、FGF21とは対照的に、除脂肪量又は脂肪量を低下した。
図7A-7Bは、組換えA)変種M5；及びB)変種M69ポリペプチドの注射は、ob/obマウスにおいて、血液グルコースを低下することを明らかにしている、図面データを示している。
図8は、アルド-ケト還元酵素ファミリー1、メンバーC18(Akr1C18)及び溶質担体ファミリー1、メンバー2(slc1a2)の肝臓発現は、HCC活性に相関するようにみえることを示唆するデータを示している。
(詳細な説明)
本発明は、グルコースのレベルを降下するか又は低下することができるキメラ配列及びペプチド配列を提供する。一実施態様において、キメラペプチド配列は、少なくとも7個のアミノ酸残基を有するN-末端領域並びに第一のアミノ酸位置及び最後のアミノ酸位置を有するN-末端領域であって、ここで該N-末端領域が、DSSPL又はDASPH配列を有するもの；並びに、FGF19の一部を有するC-末端領域並びに第一のアミノ酸位置及び最後のアミノ酸位置を有するC-末端領域であって、ここで該C-末端領域がFGF19のアミノ酸残基16-29(WGDPIRLRHLYTSG)を含み、且つ該W残基が、C-末端領域の第一のアミノ酸位置に対応しているもの：を含むか又はこれらからなる。
別の実施態様において、キメラペプチド配列は、FGF21の一部を有するN-末端領域並びに第一のアミノ酸位置及び最後のアミノ酸位置を有するN-末端領域であって、ここで該N-末端領域が、GQV配列を有し、且つ該V残基が、N-末端領域の最後のアミノ酸位置に対応しているもの；並びに、FGF19の一部を有するC-末端領域並びに第一のアミノ酸位置及び最後のアミノ酸位置を有するC-末端領域であって、ここで該C-末端領域が、FGF19のアミノ酸残基21-29(RLRHLYTSG)を含み、且つ該R残基が、C-末端領域の第一の位置に対応しているもの：を含むか又はこれらからなる。
更なる実施態様において、ペプチド配列は、参照型又は野生型FGF19と比べ、1以上のアミノ酸の置換、挿入又は欠失を有する線維芽細胞増殖因子19(FGF19)配列変種を含むか又はこれからなる。追加の実施態様において、ペプチド配列は、参照型又は野生型FGF21と比べ、1以上のアミノ酸の置換、挿入又は欠失を有する線維芽細胞増殖因子21(FGF21)配列変種を含むか又はこれからなる。また追加の実施態様において、ペプチド配列は、FGF21配列の一部に融合されたFGF19配列の一部を含むか又はこれからなる。更なる追加の実施態様において、ペプチド配列は、FGF21配列の一部に融合されたFGF19配列の一部であって、ここで該FGF19及び／又はFGF21配列部分が、参照型又は野生型FGF19及び／又はFGF21と比べ、1以上のアミノ酸置換、挿入若しくは欠失を有するものを含むか又はこれからなる。
本発明はまた、線維芽細胞増殖因子19(FGF19)及び／又は線維芽細胞増殖因子21(FGF21)ペプチド配列の変種及び融合体を使用し治療可能な代謝障害を有するか又は有するリスクのある対象を治療する方法及び使用を提供する。一実施態様において、方法は、線維芽細胞増殖因子19(FGF19)及び／又は線維芽細胞増殖因子21(FGF21)ペプチド配列の1以上の変種又は融合体を、該障害を治療するのに有効な量で、対象と接触させるか又は投与することを含む。別の実施態様において、方法は、線維芽細胞増殖因子19(FGF19)及び／又は線維芽細胞増殖因子21(FGF21)ペプチド配列の変種又は融合体をコードしている1以上の核酸分子(例えば、任意にベクターを含む、該ペプチド配列をコードしている核酸と機能可能に連結された発現制御エレメント)を、該障害を治療するのに有効な量で、対象と接触させるか又は投与することを含む。
本発明のペプチドの作用の基礎となる機序の理解は、本発明を実践するには必要ではないが、特定の理論又は仮説に結びつけられるものではないが、本発明のペプチドは、肥満外科手術が、例えばグルコースホメオスタシス及び体重減少に対し有する効果を少なくとも一部は模倣していると考えられる。肥満外科手術後の胃腸管ホルモン分泌(例えば、グルカゴン様ペプチド1(GLP-1))の変化は、例えば糖尿病状態の回復の原因であると考えられる。FGF19は、遠位小腸において高度に発現され、且つFGF19のトランスジェニック過剰発現は、グルコースホメオスタシスを改善する。ヒトにおけるFGF19のレベルは、胃バイパス手術後も上昇するので、上昇したFGF19は、肥満外科手術後に観察された糖尿病寛解に関与しているであろう。
代表的参照型又は野生型FGF19配列を、下記に示す：
Figure 0006254524
代表的参照型又は野生型FGF21配列を、下記に示す：
Figure 0006254524
 FGF21対立遺伝子変種は、図1に図示している(例えば、M70、M71及びM72)。
用語「ペプチド」、「タンパク質」及び「ポリペプチド」配列は、アミド結合若しくは同等物により共有結合された2個以上のアミノ酸、又はアミノ酸の化学修飾及び誘導体を含む「残基」を意味するよう本明細書において互換的に使用される。ペプチドの全て又は一部を形成するアミノ酸は、既知の21種の天然のアミノ酸からであってよく、これらはそれらの1文字略語又は一般的3文字略語の両方で示される。本発明のペプチド配列において、従来のアミノ酸残基は、それらの従来の意味を有する。従って「Leu」はロイシンであり、「Ile」はイソロイシンであり、「Nle」はノルロイシンであるなどである。
インビボにおいてグルコースを低下又は降下する、本明細書記載の参照型FGF19及びFGF21ポリペプチドとは異なるペプチド配列が、本明細書において例示されている(表1-8及び図1)。非限定的な特定の例は、FGF19のカルボキシ末端アミノ酸21-194に融合されたFGF21のアミノ末端アミノ酸1-16を持つペプチド配列；FGF21のカルボキシ末端アミノ酸147-181に融合されたFGF19のアミノ末端アミノ酸1-147を持つペプチド配列；FGF21のカルボキシ末端アミノ酸17-181に融合されたFGF19のアミノ末端アミノ酸1-20を持つペプチド配列；FGF19のカルボキシ末端アミノ酸148-194に融合されたFGF21のアミノ末端アミノ酸1-146を持つペプチド配列；及び、FGF19のカルボキシ末端アミノ酸148-194に融合されたFGF21の内部アミノ酸17-146に融合されたFGF19のアミノ末端アミノ酸1-20を持つペプチド配列である。
追加の特定のペプチド配列は、FGF19のアミノ酸16-20のWGDPI配列に対応するWGDPI配列モチーフを有するか、FGF19のアミノ酸16-20のWGDPI配列に対応するWGDPI配列モチーフを欠いているか、又はFGF19のアミノ酸16-20のFGF19 WGDPI配列に対応する置換された(すなわち、変異された)WGDPI配列モチーフを有する。
本発明の特定のペプチド配列は、FGF19及びFGF21とは異なる配列(例えば、本明細書に示したもの)、及びアミノ酸16-20においてFGF19 WGDPI配列について置換されたGQV、GDI、WGPI、WGDPV、WGDI、GDPI、GPI、WGQPI、WGAPI、AGDPI、WADPI、WGDAI、WGDPA、WDPI、WGDI、WGDP又はFGDPIのいずれかを有するFGF19変種配列も含む。従って、野生型FGF19及びFGF21(例えば、各々、配列番号:99及び配列番号:100として本明細書に示したもの)は、除外される配列であり、且つFGF19のアミノ酸16-20においてWGDPI配列について置換されたGQV、GDI、WGPI、WGDPV、WGDI、GDPI、GPI、WGQPI、WGAPI、AGDPI、WADPI、WGDAI、WGDPA、WDPI、WGDI、WGDP又はFGDPIのいずれかを有するFGF19も同じく、除外されてよい。しかしこの除外は、例えば、配列が例としてGQV、GQV、GDI、若しくはGPIのいずれかを有するFGF19に融合された3つのFGF21残基、又はWGPI、WGDI、GDPI、WDPI、WGDI、若しくはWGDPのいずれかに融合された2つのFGF21残基を有する場合には適用されない。
ペプチド配列の特定の非限定的例は、M1-M98(配列番号:1-98)として本明細書において特定された配列変種の全て又は一部を含むか又はそれらからなる。ペプチド配列のより特定する非限定的例は：
Figure 0006254524
Figure 0006254524
Figure 0006254524
として示す配列の全て又は一部を含むか又はそれらからなるか、或いは前記ペプチド配列のいずれかについて、R末端残基は欠失されてよい。
ペプチド配列の更なる特定の非限定的例は：
Figure 0006254524
 を含むか又はそれらからなる。
ペプチド配列の追加の特定の非限定的例は、N-末端に、下記のいずれかの全て又は一部を含む又はからなるペプチド配列を有し：
Figure 0006254524
 ：且つ前記ペプチド配列のいずれかについて、アミノ末端R残基は欠失されてよい。
本発明のペプチド配列は加えて、FGF19、又はFGF19のアミノ酸16-20においてWGDPI配列について置換されたGQV、GDI、WGPI、WGDPV、WGDI、GDPI、GPI、WGQPI、WGAPI、AGDPI、WADPI、WGDAI、WGDPA、WDPI、WGDI、WGDP若しくはFGDPIのいずれかを有するFGF19変種配列と比べ、肝細胞癌(HCC)の誘導若しくは形成の低下若しくは非存在を伴うものを含む。本発明のペプチド配列はまた、FGF19、又はFGF19のアミノ酸16-20においてWGDPI配列について置換されたGQV、GDI、WGPI、WGDPV、WGDI、GDPI、GPI、WGQPI、WGAPI、AGDPI、WADPI、WGDAI、WGDPA、WDPI、WGDI、WGDP若しくはFGDPIのいずれかを有するFGF19変種配列と比べ、より大きいグルコース降下活性を伴うものも含む。本発明のペプチド配列は更に、FGF19、又はFGF19のアミノ酸16-20においてWGDPI配列について置換されたGQV、GDI、WGPI、WGDPV、WGDI、GDPI、GPI、WGQPI、WGAPI、AGDPI、WADPI、WGDAI、WGDPA、WDPI、WGDI、WGDP若しくはFGDPIのいずれかを有するFGF19変種配列と比べ、より少ない脂質(例えば、トリグリセリド、コレステロール、非-HDL又はHDL)増加活性を伴うものを含む。
典型的には、本発明のペプチド配列中のアミノ酸又は残基の数は、合計約250個未満(例えば、アミノ酸又はそれらの模倣体)であろう。様々な特定の実施態様において、残基の数は、約20個から最大約200個までの残基(例えば、アミノ酸又はそれらの模倣体)を含む。追加の実施態様において、残基の数は、約50個から最大約200個までの残基(例えば、アミノ酸又はそれらの模倣体)を含む。更なる実施態様において、残基の数は、長さが約100個から最大約195個までの残基(例えば、アミノ酸又はそれらの模倣体)を含む。
アミノ酸又は残基は、例えばグルタルアルデヒド、N-ヒドロキシスクシンイミドエステル、二官能性マレイミド、又はN,N'-ジシクロヘキシルカルボジイミド(DCC)により形成されるものを含む、アミド化学結合により、又は非天然及び非-アミド化学結合により、連結され得る。非-アミド結合は、例えば、ケトメチレン、アミノメチレン、オレフィン、エーテル、チオエーテルなどを含む(例えば、Spatolaの文献、「アミノ酸、ペプチド及びタンパク質の化学及び生化学(Chemistry and Biochemistry of Amino Acids, Peptides and Proteins)」、第7巻、267-357頁(1983)の「ペプチド及び主鎖修飾(Peptide and Backbone Modifications)」、Marcel Decker社、NYを参照されたい)。従って、本発明のペプチドがFGF19配列の一部及びFG21配列の一部を含む場合、これら2つの部分は、アミド結合によって互いに連結される必要はないが、任意の他の化学部分により連結されるか又はリンカー部分を介して一緒に複合され得る。
本発明はまた、例示されたペプチド配列が少なくとも検出可能若しくは測定可能な活性若しくは機能を保持する限りは、前述のペプチド配列の部分配列、変種及び修飾形を含む(表1-8及び図1に列記されたFGF19及びFGF21の変種及び部分配列、並びに表1-8及び図1に列記されたFGF19/FGF21の融合体及びキメラを含む)。例えば、特定の例示された変種ペプチドは、C-末端部分に、例えば該変種の"TSG"アミノ酸残基に続けて、FGF19 C-末端配列：
Figure 0006254524
 を有する。
同じく特定の例示された変種ペプチド、例えば、アミノ末端にFGF21配列の全て又は一部を有するものは、N-末端に配置された"R"残基を有し、これは省略することができる。同様に、特定の例示された変種ペプチドは、N-末端に配置された"M"残基を含み、これは"R"残基などの省略された残基に追加(append)されるか又はそれと更に置換されることができる。より特定すると、様々な実施態様において、ペプチド配列はN-末端に、RDSS、DSS、MDSS又はMRDSSを含む。更に細胞において、"M"残基が"S"残基に隣接する場合、"M"残基は切断され、その結果"M"残基はペプチド配列から欠失されるのに対し、"M"残基が"D"残基に隣接する場合は、"M"残基は切断されないでよい。従って例として、様々な実施態様において、ペプチド配列は、N-末端に残基MDSSPL、MSDSSPL(切断されSDSSPLへ)及びMSSPL(切断されSSPLへ)を伴うものを含む。
従って、本発明の「ペプチド」、「ポリペプチド」及び「タンパク質」配列は、部分配列、変種又は修飾形(例えば、融合体又はキメラ)が少なくとも検出可能な活性又は機能を保持する限りは、表1-8及び図1に列記されたFGF19及びFGF21の変種及び部分配列、並びに表1-8及び図1に列記されたFGF19/FGF21融合体及びキメラの、部分配列、変種及び修飾形を含む。
本明細書において使用される用語「修飾する」及びその文法上の変形は、組成物が、ペプチド配列などの参照の組成物に関して逸脱していることを意味する。そのような修飾されたペプチド配列、核酸及び他の組成物は、参照の修飾されないペプチド配列、核酸、若しくは他の組成物と比べ、より大きい若しくはより少ない活性若しくは機能を有するか、又は異なる機能若しくは活性を有するか、或いは検出アッセイ及び／又はタンパク質精製において使用するための抗体を誘発するように、療法のために処方されたタンパク質において望ましい特性(例えば、血清半減期)を有する。例えば、本発明のペプチド配列は、血清半減期を増加するように、タンパク質のインビトロ及び／又はインビボ安定性を増大するようになど修飾されることができる。
本明細書に例示されたペプチド配列のそのような部分配列、変種及び修飾形(例えば、表1-8及び図1に列記されたペプチド配列)の特定の例は、アミノ末端、カルボキシ末端又は内部への又はそれらからの、1個以上のアミノ酸の置換、欠失及び／又は挿入／付加を含む。一例は、アミノ酸残基のペプチド配列内の別のアミノ酸残基との置換である。別のものは、1個以上のアミノ酸残基のペプチド配列からの欠失、又は1個以上のアミノ酸残基のペプチド配列への挿入若しくは付加である。
置換、欠失又は挿入／付加された残基の数は、ペプチド配列の1個以上のアミノ酸(例えば、1〜3、3〜5、5〜10、10〜20、20〜30、30〜40、40〜50、50〜60、60〜70、70〜80、80〜90、90〜100、100〜110、110〜120、120〜130、130〜140、140〜150、150〜160、160〜170、170〜180、180〜190、190〜200、200〜225、225〜250個又はそれよりも多い)である。従って、FGF19又はFGF21配列は、置換、欠失又は挿入／付加された少数又は多数のアミノ酸(例えば、1〜3、3〜5、5〜10、10〜20、20〜30、30〜40、40〜50、50〜60、60〜70、70〜80、80〜90、90〜100、100〜110、110〜120、120〜130、130〜140、140〜150、150〜160、160〜170、170〜180、180〜190、190〜200、200〜225、225〜250個、又はそれよりも多い)を有することができる。加えて、FGF19アミノ酸配列は、FGF21由来のアミノ酸の約1〜3、3〜5、5〜10、10〜20、20〜30、30〜40、40〜50、50〜60、60〜70、70〜80、80〜90、90〜100、100〜110、110〜120、120〜130、130〜140、140〜150、150〜160、160〜170、170〜180、180〜190、190〜200、200〜225、225〜250個又はそれよりも多いアミノ酸配列を含む又はそれらからなるか；或いは、FGF21アミノ酸又は配列は、FGF19由来のアミノ酸の約1〜3、3〜5、5〜10、10〜20、20〜30、30〜40、40〜50、50〜60、60〜70、70〜80、80〜90、90〜100、100〜110、110〜120、120〜130、130〜140、140〜150、150〜160、160〜170、170〜180、180〜190、190〜200、200〜225、225〜250個、又はそれよりも多いアミノ酸配列を含むか又はそれらからなることができる。
置換の具体例は、L-残基についてのD残基の置換を含む。従って、残基はL-異性体配置で記されているが、D-異性体が検出可能又は測定可能な機能の不在に繋がらない限りは、本発明のペプチド配列のいずれか特定の位置又は全ての位置でのD-アミノ酸が含まれる。
追加の具体例は、非保存的置換及び保存的置換である。「保存的置換」は、生物学的、化学的又は構造的に類似した残基による、1個のアミノ酸の置き換えである。生物学的に類似とは、その置換は、生物活性、例えばグルコース降下活性が同等であることを意味する。構造的に類似とは、アミノ酸が、アラニン、グリシン及びセリンなど類似した長さの側鎖を有するか、又は類似したサイズを有するか、或いは第一、第二又は追加のペプチド配列の構造が維持されることを意味する。化学的に類似とは、残基が同じ電荷を有するか、又は親水性及び疎水性の両方であることを意味する。特定の例は、イソロイシン、バリン、ロイシン若しくはメチオニンなどの1個の疎水性残基の別のものとの置換、又はアルギニンのリジンとの、グルタミン酸のアスパラギン酸との、又はグルタミンのアスパラギンとの、セリンのトレオニンとなどの置換のように、1個の極性残基の別のものとの置換を含む。慣習的アッセイを使用し、部分配列、変種又は修飾形は、グルコース降下活性などの活性を有するかどうかを決定することができる。
本明細書に例示されているペプチド配列の部分配列、変種及び修飾形(例えば、表1-8及び図1に列記されたペプチド配列)の特定の例は、参照型ペプチド配列(例えば、表1-8及び図1のいずれかのペプチド配列)に50％〜60％、60％〜70％、70％〜75％、75％〜80％、80％〜85％、85％〜90％、90％〜95％、又は96％、97％、98％、若しくは99％の同一性を有する。用語「同一性」及び「相同性」及びそれらの文法上の変形は、2種以上の言及された実体が同じであることを意味する。従って、2つのアミノ酸配列が同一である場合、これらは同一のアミノ酸配列を有する。「同一の区域、領域又はドメイン」とは、2種以上の言及された実体の一部が同じであることを意味する。従って2つのアミノ酸配列が1つ以上の配列領域にわたり同一又は相同である場合、これらはこれらの領域において同一性を共有している。
2つの配列間の同一性の程度は、当該技術分野において公知のコンピュータプログラム及び数学的アルゴリズムを用い、評価することができる。配列同一性(相同性)の割合を計算するそのようなアルゴリズムは、一般に、比較領域にわたる配列ギャップ及びミスマッチを考慮している。例えば、BLAST(例えば、BLAST 2.0)検索アルゴリズム(例えば、Altschulらの文献、J. Mol. Biol. 215:403 (1990)参照、NCBIにより公に入手可能)は、下記の例証的検索パラメータを有する：ミスマッチ-2；ギャップオープン5；ギャップイクステンション2。ペプチド配列比較のためのBLASTPアルゴリズムは、典型的には、PAM100、PAM 250、BLOSUM 62又はBLOSUM 50などのスコアリングマトリックスと組合せて使用される。FASTA(例えば、FASTA2及びFASTA3)並びにSSEARCH配列比較プログラムもまた、同一性の程度を定量するために使用される(Pearsonらの文献、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85:2444 (1988)；Pearsonの文献、Methods Mol Biol. 132:185 (2000)；及び、Smithらの文献、J. Mol. Biol. 147:195 (1981))。Delaunay-ベースのトポロジーマッピングを使用する、タンパク質の構造類似性を定量するためのプログラムもまた開発されている(Bostickらの文献、Biochem Biophys Res Commun. 304:320 (2003))。
本明細書に例示されたペプチド配列の部分配列、変種及び修飾形(例えば、表1-8及び図1に列記された配列)を含む本発明のペプチド配列において、「アミノ酸」又は「残基」は、従来のα-アミノ酸に加え、少なくとも1つの側鎖が本明細書に定義されたアミノ酸側鎖部分である、β-アミノ酸、α,αジ置換アミノ酸及びN-置換アミノ酸を含む。「アミノ酸」は更に、N-アルキルα-アミノ酸を含み、ここで該N-末端アミノ基は、C1〜C6の線状又は分岐したアルキル置換基を有する。従って用語「アミノ酸」は、天然のタンパク質アミノ酸の立体異性体及び修飾型、非タンパク質のアミノ酸、翻訳後修飾されたアミノ酸(例えば、グリコシル化、リン酸化、エステル又はアミド切断などにより)、酵素的に修飾された又は合成されたアミノ酸、誘導体化されたアミノ酸、アミノ酸を模倣するようデザインされた構築物若しくは構造、修飾された側鎖部分を伴う、天然の部分から誘導体化された、又は合成された若しくは非天然のアミノ酸などを含む。修飾され且つ通常でないアミノ酸は、本発明のペプチド配列に含まれる(例えば、「合成ペプチド：使用指針(Synthetic Peptides: A User's Guide)」：Hrubyらの文献、Biochem. J. 268:249 (1990)；及び、Toniolo C.の文献、Int. J. Peptide Protein Res. 35:287 (1990)を参照されたい)。
加えて、アミノ酸の保護基及び修飾基が含まれる。本明細書において使用される用語「アミノ酸側鎖部分」は、任意のアミノ酸の任意の側鎖を含み、この用語「アミノ酸」は本明細書において定義されている。従ってこれは、天然のアミノ酸中の側鎖部分を含む。これは更に、天然のタンパク質アミノ酸の立体異性体及び修飾型、非タンパク質アミノ酸、翻訳後修飾されたアミノ酸、酵素的に修飾された若しくは合成されたアミノ酸、誘導体化されたアミノ酸、アミノ酸を模倣するようデザインされた構築物若しくは構造などの中の側鎖部分などの、本明細書に示し且つ当業者に公知のような、修飾された天然のアミノ酸中の側鎖部分を含む。例えば、本明細書に開示された又は当業者に公知の任意のアミノ酸の側鎖部分は、この定義に含まれる。
「アミノ酸側鎖部分の誘導体」は、アミノ酸側鎖部分の定義内に含まれる。誘導体化されたアミノ酸側鎖部分の非限定的例は、例えば、(a)存在するアルキル、アリール、又はアラルキル鎖への1個以上の飽和又は不飽和の炭素原子の付加；(b)側鎖中の炭素の別の原子、好ましくは酸素又は窒素との置換；(c)メチル(-CH3)、メトキシ(-OCH3)、ニトロ(-NO2)、ヒドロキシル(-OH)、又はシアノ(-C=N)を含む、側鎖の炭素原子への末端基の付加；(d)ヒドロキシ基、チオール基又はアミノ基を含む側鎖部分に関して、好適なヒドロキシ、チオール又はアミノ保護基の付加；或いは、(e)環構造を含む側鎖部分に関して、直接又はエーテル連結を介して結合したヒドロキシル、ハロゲン、アルキル、又はアリール基を含む、1個以上の環置換基の付加：を含む。アミノ基に関して、好適な保護基は、当業者に公知である。提供されたそのような誘導体化は、最終ペプチド配列において所望の活性を提供する(例えば、グルコース降下、改善されたグルコース又は脂質の代謝、抗-糖尿病活性、実質的HCC形成若しくは腫瘍形成の非存在、除脂肪量又は脂肪量の実質的調節の非存在など)。
「アミノ酸側鎖部分」は、そのような誘導体化を全て含み、且つ特定の非限定的例としては、γ-アミノ酪酸、12-アミノドデカン酸、α-アミノイソ酪酸、6-アミノヘキサン酸、4-(アミノメチル)-シクロヘキサンカルボン酸、8-アミノオクタン酸、ビフェニルアラニン、Boc-t-ブトキシカルボニル、ベンジル、ベンゾイル、シトルリン、ジアミノ酪酸、ピロールリジン、ジアミノプロピオン酸、3,3-ジフェニルアラニン、オルソニン(orthonine)、シトルリン、1,3-ジヒドロ-2H-イソインドールカルボン酸、エチル、Fmoc-フルオレニルメトキシカルボニル、ヘプタノイル(CH3--(CH2).sub.5-C(=O)-)、ヘキサノイル(CH3-(CH2)4-C(=O)-)、ホモアルギニン、ホモシステイン、ホモリジン、ホモフェニルアラニン、ホモセリン、メチル、メチオニンスルホキシド、メチオニンスルホン、ノルバリン(NVA)、フェニルグリシン、プロピル、イソプロピル、サルコシン(SAR)、tert-ブチルアラニン、及びベンジルオキシカルボニルが挙げられる。
前述のもの全てを含む、天然のタンパク質アミノ酸の立体異性体及び修飾型、非タンパク質アミノ酸、翻訳後修飾されたアミノ酸、酵素的に合成されたアミノ酸、誘導体化されたアミノ酸を含む非天然のアミノ酸、前述のいずれかから誘導されたα,αジ置換アミノ酸(すなわち、少なくとも1本の側鎖は、それが誘導された残基のものと同じである、α,αジ置換アミノ酸)、前述のいずれかから誘導されたβ-アミノ酸(すなわち、β-炭素の存在について以外は、それが誘導された残基と同じであるβ-アミノ酸)を含む単独のアミノ酸は、本明細書において「残基」と称することができる。α-アミノ酸の側鎖部分に加え、好適な置換基は、C1〜C6の線状又は分岐したアルキルを含む。Aibは、α,αジ置換アミノ酸の例である。α,αジ置換アミノ酸は、従来のL-及びD-異性体の言及を用いて称することができるが、そのような言及は便宜上であること、及びα-位置の置換基が異なる場合、そのようなアミノ酸は、必要に応じ、指定されたアミノ酸側鎖部分を伴う残基のL-又はD-異性体から誘導されたα,αジ置換アミノ酸と互換的に称することができることは理解されるべきである。従って、(S)-2-アミノ-2-メチル-ヘキサン酸は、L-Nle(ノルロイシン)から誘導されたα,αジ置換アミノ酸、又はD-Alaから誘導されたα,αジ置換アミノ酸のいずれかということができる。同様に、Aibは、Alaから誘導されたα,αジ置換アミノ酸ということができる。α,αジ置換されたアミノ酸が提供される場合は常に、それらの(R)及び(S)配置の全てを含むことは理解されるべきである。
「N-置換アミノ酸」は、任意にα-炭素位置にH以外の置換基が存在しない、アミノ酸側鎖部分が主鎖アミノ基に共有結合されているいずれかのアミノ酸を含む。サルコシンは、N-置換アミノ酸の例である。例として、サルコシン及びAlaのアミノ酸側鎖部分は、同じ、すなわちメチルである点において、サルコシンは、AlaのN-置換アミノ酸誘導体と称することができる。
本明細書に例示されたペプチド配列の部分配列、変種及び修飾形(例えば、表1-8及び図1に列記された配列)を含む、本発明のペプチド配列の共有的修飾は、本発明に含まれている。共有的修飾の一つの型は、標的化されたアミノ酸残基を、該ペプチドの選択された側鎖又はN-若しくはC-末端残基と反応することが可能である有機誘導体化剤と反応させることを含む。二官能性物質による誘導体化は、例えば、抗-ペプチド抗体を精製する方法においてしようするための、水-不溶性の支持体マトリックス又は表面にペプチドを架橋結合するために、又はその逆で、有用である。通常使用される架橋結合剤は、例えば1,1-ビス(ジアゾアセチル)-2-フェニルエタン、グルタルアルデヒド、N-ヒドロキシスクシンイミドエステル、例えば4-アジドサリチル酸とのエステル、3,3'-ジチオビス(スクシンイミジルプロピオネート)などのジスクシンイミジルエステルを含むホモ二官能性イミドエステル、ビス-N-マレイミド-1,8-オクタンなどの二官能性マレイミド及びメチル-3-[(p-アジドフェニル)ジチオ]プロピオイミダートなどの物質を含む。
他の修飾は、グルタミニル残基及びアスパラギニル残基の、各々、対応するグルタミル残基及びアスパルチル残基への脱アミド化、プロリン及びリジンの水酸化、セリル残基又はトレオニル残基のヒドロキシル基のリン酸化、リジン、アルギニン、及びヒスチジン側鎖のα-アミノ基のメチル化(T. E. Creightonの文献、「タンパク質：構造及び分子特性(Proteins: Structure and Molecular Properties)」、W.H. Freeman & Co.、サンフランシスコ、79-86頁(1983))、N-末端アミンのアセチル化、任意のC-末端カルボキシル基のアミド化などを含む
例示されたペプチド配列、並びに本明細書に例示されたペプチド配列の部分配列、変種及び修飾形(例えば、表1-8及び図1に列記された配列)はまた、安定性のための主鎖の変形、誘導体、及びペプチド模倣体を含むことができる。用語「ペプチド模倣体」は、ピペラジンコア分子、ケト-ピペラジンコア分子及びジアゼピンコア分子を含むが、これらに限定されるものではない、残基の模倣体である分子(「模倣体」と称する)を含む。別に指定しない限りは、本発明のペプチド配列のアミノ酸模倣体は、カルボキシル基及びアミノ基の両方、並びにアミノ酸側鎖に対応する基を含むか、又はグリシンの模倣体の場合は水素以外の側鎖は含まない。
例として、これらは、天然のアミノ酸の立体障害、表面電荷分布、極性などを模倣する化合物を含むが、生物学的システムにおいて安定性を付与するアミノ酸である必要はないであろう。例えば、プロリンは、適切なサイズ及び置換の他のラクタム又はラクトンにより置換されることができ；ロイシンは、アルキルケトン、N-置換アミドにより置換されることに加え、アルキル、アルケニル若しくは他の置換基を使用しアミノ酸側鎖の長さを変動させることができ、他のものは当業者に明らかであろう。そのような置換を行うのに必須の要素は、該分子をデザインするために使用した残基とおおまかに同じサイズ及び電荷及び立体配置の分子を提供することである。これらの修飾の緻密化は、該化合物を機能アッセイ(例えばグルコース降下アッセイ)又は他のアッセイにおいて分析し、且つ構造活性相関を比較することにより行われるであろう。そのような方法は、医化学及び創薬の分野の業者の範囲内である。
例示されたペプチド配列の部分配列、変種及び修飾形(例えば、表1-8及び図1に列記されたペプチドを含む)を含む、本発明のペプチド配列の別の修飾型は、グリコシル化である。本明細書において使用される「グリコシル化」は、広範に、1つ以上の糖部分(例えば、糖鎖)のタンパク質、脂質又は他の有機分子への存在、付加又は結合をいう。本明細書における用語「脱グリコシル化」の使用は、一般に、1つ以上の糖部分(例えば糖鎖)の除去又は欠失を意味することが意図される。加えて、この語句は、存在する様々な糖部分(例えば糖鎖)の種類及び割合(量)の変化に関与する、未変性タンパク質のグリコシル化における定性的変化を含む。
グリコシル化は、アミノ酸残基の修飾によるか、又は未変性の配列に存在又は非存在し得る1以上のグリコシル化部位の追加により、実現することができる。例えば、典型的な非グリコシル化残基は、グリコシル化され得る残基で置換することができる。グリコシル化部位の追加は、アミノ酸配列の変更により達成することができる。該ペプチド配列への変更は、例えば、1つ以上のセリン又はトレオニン残基(O-結合型グリコシル化部位について)又はアスパラギン残基(N-結合型グリコシル化部位について)の付加又は置換により行うことができる。N-結合型及びO-結合型オリゴ糖の構造と各型に認められる糖残基の構造は、異なってよい。両方に共通して認められる糖の一つの型は、N-アセチルノイラミン酸(以後シアル酸と称す)である。シアル酸は通常、N-結合型及びO-結合型の両オリゴ糖の末端残基であり、且つその陰性電荷のために、糖タンパク質に酸性特性をもたらし得る。
本発明のペプチド配列は、ヌクレオチド(例えばDNA)レベルでの変化により、特に該ペプチドをコードしているDNAを所望のアミノ酸に翻訳されるコドンが生じるように予め選択された塩基で変異することにより、任意に変更することができる。該ペプチド上の糖鎖の数を増加する別の手段は、グリコシドのポリペプチドへの化学的又は酵素的カップリングである(例えば、WO 87/05330参照)。脱グリコシル化は、基礎となるグリコシル化部位を除去することにより、化学的手段及び／又は酵素的手段によりグリコシル化を欠失することにより、又はグリコシル化されるアミノ酸残基をコードしているコドンの置換により実現することができる。化学的脱グリコシル化技術は公知であり、且つポリペプチド上の糖鎖の酵素的切断は、様々なエンドグリコシダーゼ及びエキソグリコシダーゼの使用により実現することができる。
様々な細胞株を使用し、グリコシル化されるタンパク質を生成することができる。非限定的例は、ジヒドロ葉酸レダクターゼ(DHFR)-欠損チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞であり、これは組換え糖タンパク質の生成に一般に使用される宿主細胞である。これらの細胞は、酵素β-ガラクトシドα-2,6-シアル酸転移酵素を発現せず、従ってα-2,6結合シアル酸をこれらの細胞において生成される糖タンパク質であるN-結合型オリゴ糖へ付加しない。
別の修飾型は、別のタンパク質(例えば、対象タンパク質と異なるアミノ酸配列を有するタンパク質)、又は担体分子などの、本発明のペプチド配列のN-及び／又はC-末端での1以上の追加の成分又は分子の複合(例えば連結)である。従って、例示的ペプチド配列は、別の成分又は分子との複合体であることができる。
いくつかの実施態様において、本発明のペプチド配列のアミノ末端又はカルボキシ末端は、免疫グロブリンFc領域(例えば、ヒトFc)に融合され、融合複合体(又は融合体分子)を形成することができる。Fc融合複合体は、生物薬剤の全身の半減期を増大することができ、その結果該生物薬剤製品は、延長された活性を有するか又は必要な投与頻度を減らすことができる。Fcは、血管を裏打ちしている内皮細胞内の胎児性Fc受容体(FcRn)に結合し、且つ結合時に、このFc融合分子は、分解及び循環への再放出から保護され、該分子をより長く循環内に維持する。このFc結合は、それにより内在性IgGがそのより長い血漿半減期を保持する機序であると考えられる。周知であり且つ検証されたFc融合薬物は、薬物動態、溶解度、及び製造効率を向上するために、抗体のFc領域へ連結された生物薬剤の2つのコピーからなる。より最近のFc-融合技術は、従来のFc-融合複合体と比べ、該生物薬剤の薬物動態特性及び薬力学特性を最適化するための、抗体のFc領域への生物薬剤の単独コピーに結びつけられている。
複合体修飾を使用し、第二分子の追加的又は相補的機能又は活性を伴う活性を維持するペプチド配列を作製することができる。例えば、溶解度、貯蔵、インビボ又は貯蔵半減期若しくは安定性、免疫原性の低下、インビボにおける遅延若しくは制御された放出を促進するために、例えばペプチド配列は、分子へ複合されることができる。他の機能又は活性は、複合されないペプチド配列に比べ毒性を低下する複合体、複合されないペプチド配列よりもより効率的にある種類の細胞又は臓器を標的化する複合体、又は本明細書に示した障害又は疾患(例えば糖尿病)に関連した原因又は作用に対抗するための薬物を含む。
タンパク質療法の臨床的有効性は、短い血漿半減期及び易分解性により限定されることがある。様々な治療的タンパク質の研究は、(例えば、典型的にはタンパク質及び非タンパク質性ポリマー(例えばPEG)の両方へ共有的に結合された連結部分を介して)ペプチド配列を様々な非タンパク質性ポリマー、例えばポリエチレングリコール(PEG)、ポリプロピレングリコール、又はポリオキシアルキレンへ複合又は連結することを含む様々な修飾は、半減期を延長することができることを示している。そのようなPEG-複合された生体分子は、より良い物理安定性及び温度安定性、酵素分解され易さに対する保護、増加した溶解度、より長いインビボ循環半減期及び減少したクリアランス、低下した免疫原性及び抗原性、並びに低下した毒性を含む、臨床上有益な特性を有することが示されている。
本発明のペプチド配列への複合に適したPEGは、一般に水中において室温で可溶性であり、且つ一般式R(O-CH2-CH2)nO-Rを有し、ここでRは水素又はアルキル基若しくはアルカノール基などの保護基であり、nは1〜1000の整数である。Rが保護基である場合、これは一般に1〜8個の炭素を有する。本ペプチド配列に複合されたPEGは、線形又は分岐型であることができる。分岐したPEG誘導体、「星型-PEG」及び多-アーム型PEGが、本発明に含まれる。本発明で使用されるPEGの分子量は、いずれか特定の範囲に限定されるものではないが、特定の実施態様は、分子量500〜20,000を有するのに対し、別の実施態様は、分子量4,000〜10,000を有する。
本発明は、PEGが異なる「n」値を有し、その結果様々な異なるPEGが特定の比で存在する複合体の組成物を含む。例えば、一部の組成物は、n＝1、2、3及び4である、複合体の混合物を含有する。一部の組成物において、n＝1である複合体の割合は18〜25％であり、n＝2である複合体の割合は50〜66％であり、n＝3である複合体の割合は12〜16％であり、且つn＝4である複合体の割合は最大5％である。そのような組成物は、当該技術分野において公知の反応条件及び精製方法により生成することができる。
PEGは、本発明のペプチド配列へ直接的又は間接的(例えば、中間体を介して)結合することができる。例えば、一実施態様において、PEGは、末端反応基(「スペーサー」)を介して結合する。スペーサーは、例えば、1種以上のペプチド配列の遊離のアミノ基又はカルボキシル基と、ポリエチレングリコールの間の結合を媒介する末端反応基である。遊離アミノ基に結合することができるスペーサーを有するPEGは、ポリエチレングリコールのコハク酸エステルのN-ヒドロキシスクシニルイミドによる活性化により調製することができる、N-ヒドロキシスクシニルイミドポリエチレングリコールを含む。遊離アミノ基に結合することができる別の活性化されたポリエチレングリコールは、ポリエチレングリコールモノメチルエーテルとシアヌル酸クロリドとの反応により調製することができる、2,4-ビス(O-メトキシポリエチレングリコール)-6-クロロ-s-トリアジンである。遊離カルボキシル基に結合する活性化されたポリエチレングリコールは、ポリオキシエチレンジアミンを含む。
1種以上の本発明のペプチド配列のスペーサーを有するPEGへの複合は、様々な従来の方法により実行することができる。例えばこの複合反応は、試薬のタンパク質に対するモル比4：1から30：1までを利用し、pH5〜10の溶液中で、温度4℃〜室温で、30分間〜20時間かけて実行することができる。反応条件は、主として所望の置換度の作製に向かう反応を指向するように選択することができる。概して、低い温度、低いpH(例えば、pH＝5)、及び短い反応時間は、結合されるPEGの数を減少する傾向があるのに対し、高い温度、中性から高いpH(例えば、pH≧7)、及び比較的長い反応時間は、結合されるPEGの数を増加する傾向がある。当該技術分野において公知の様々な方法を使用し、この反応を終結することができる。一部の実施態様において、この反応は、反応混合液の酸性化、及び例えば-20℃での凍結により終結される。
例示されたペプチド配列の部分配列、配列変種及び修飾形(表1-8及び図1に列記されたペプチドを含む)を含む本発明のペプチド配列は更に、タンパク質；セファロース、アガロース、セルロース、セルロースビーズなどの、多糖；ポリグルタミン酸、ポリリジンなどの、ポリマー性アミノ酸；アミノ酸コポリマー；失活されたウイルス粒子；ジフテリア、破傷風、コレラ由来のトキソイド、ロイコトキシン分子などの、失活された細菌性毒素；失活された細菌；及び、樹状細胞などの、大型のゆっくり代謝される巨大分子への複合を含む。そのような複合された形態は、望ましいならば、本発明のペプチド配列に対する抗体を産生するために使用することができる。
追加の複合に適した成分及び分子としては、例えば、チログロブリン；ヒト血清アルブミン(HSA)などの、アルブミン；破傷風トキソイド；ジフテリアトキソイド；ポリ(D-リジン：D-グルタミン酸)などの、ポリアミノ酸；ロタウイルスのVP6ポリペプチド；インフルエンザウイルスヘマグルチニン、インフルエンザウイルス核タンパク質；キーホールリンペットヘモシアニン(KLH)；及び、B型肝炎ウイルスコアタンパク質及び表面抗原；又は、前述の任意の組合せが挙げられる。
アルブミンの本発明のペプチド配列への融合は、例えば、HSA(ヒト血清アルブミン)をコードしているDNA又はそれらの断片が、ペプチド配列をコードしているDNAに連結されるなどの、遺伝子操作により実現することができる。その後好適な宿主を、融合体ポリペプチドを発現するように、例えば好適なプラスミドの形状で、この融合されたヌクレオチド配列により形質転換又はトランスフェクションすることができる。この発現は、インビトロの形態で、例えば原核細胞若しくは真核細胞において、又はインビボの形態で、例えばトランスジェニック生体において実行することができる。本発明の一部の実施態様において、融合タンパク質の発現は、哺乳動物の細胞株、例えばCHO細胞株において実行される。
標的タンパク質又はペプチドをアルブミンへ遺伝子融合する更なる手段は、Albufuse(登録商標)(Novozymes Biopharma社；デンマーク)として公知の技術を含み、且つこの複合された治療的ペプチド配列は頻繁に生体に取り込まれやすくなり、はるかにより有効となり始める。この技術は、C型肝炎感染症を治療するために使用されるアルブミンとインターフェロンα-2Bの組合せである、Albuferon(登録商標)(Human Genome Sciences社)を製造するために商業的に利用されている。
別の実施態様は、1種以上のヒトドメイン抗体(dAb)の使用を必然的に伴う。dAbは、ヒト抗体(IgG)の最も小さい機能性結合単位であり、且つ好ましい安定性及び溶解度の特徴を有する。この技術は、HSA及び関心対象の分子(例えば、本発明のペプチド配列)に複合されたdAbを必然的に伴う(これにより、「AlbudAb」が形成される；例えば、EP1517921B、WO2005/118642及びWO2006/051288参照)。AlbudAbは、ペプチドの血清半減期を延長するために使用される現在の技術よりも、細菌又は酵母などの微生物発現系における製造のために、より小さく且つより容易になることが多い。HSAは、半減期約3週間を有するので、得られる複合された分子は、その半減期を改善する。dAb技術の使用はまた、関心対象の分子の有効性を増強することができる。
追加の複合に適した成分及び分子は、単離又は精製に適したものを含む。特定の非限定的例としては、ビオチン(ビオチン−アビジン特異結合対)、抗体、受容体、リガンド、レクチンなどの結合性分子、又は例えばプラスチック又はポリスチレン製のビーズ、プレート又はビーズ、磁気ビーズ、試験小片、及び膜などの固形支持体を含む分子などが挙げられる。
陽イオン交換クロマトグラフィーなどの精製法を使用し、電荷差により複合体を分離することができ、これは複合体をそれらの様々な分子量に効果的に分離する。例えば、陽イオン交換カラムに装加し、且つその後〜20mM酢酸ナトリウム、pH〜4により洗浄し、その後pH3〜5.5、好ましくはpH〜4.5で緩衝された線形(0M〜0.5M)のNaCl勾配により溶離することができる。陽イオン交換クロマトグラフィーにより得られた画分の内容は、例えば、質量分析、SDS-PAGE、又は分子量により分子実体を分離する他の公知の方法などの、従来の方法を用い、分子量により同定することができる。次に、修飾されないタンパク質配列及び他の数の結合PEGを有する複合体を含まない、結合され精製されたPEGを所望の数有する複合体を含む画分が、状況に応じて同定される。
更に別の実施態様において、本発明のペプチド配列は、非限定的に、タキソール、サイトカラシンB、グラミシジンD、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、及びそれらの類似体又は相同体を含む細胞毒性薬を含む、化学物質(例えば、免疫毒素又は化学療法薬)に連結される。他の化学物質は、例えば、代謝拮抗薬(例えば、メトトレキセート、6-メルカプトプリン、6-チオグアニン、シタラビン、5-フルオロウラシルダカルバジン)；アルキル化剤(例えば、メクロレタミン、カルムスチン及びロムスチン、シクロトスファミド(cyclothosphamide)、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、マイトマイシンC、及びシスプラチン)；抗生物質(例えば、ブレオマイシン)；並びに、有糸分裂阻害剤(例えば、ビンクリスチン及びビンブラスチン)を含む。細胞毒素は、当該技術分野において公知であり且つ本明細書に記載のリンカー技術を使用し、本発明のペプチドへ複合することができる。
更に複合に適した成分及び分子は、アッセイにおける検出に適したものを含む。特定の非限定的例は、放射性同位体(例えば、125I；35S、32P；33P)、検出可能な生成物を生じる酵素(例えば、ルシフェラーゼ、β-ガラクトシダーゼ、ホースラディッシュペルオキシダーゼ及びアルカリホスファターゼ)、蛍光タンパク質、発色性タンパク質、色素(例えば、フルオレセインイソチオシアネート)；蛍光発光金属(例えば、152Eu)；化学発光化合物(例えば、ルミノール及びアクリジニウム塩)；生物発光化合物(例えば、ルシフェリン)；並びに、蛍光タンパク質などの、検出可能な標識を含む。間接的標識物は、ペプチド配列に結合している標識された又は検出可能な抗体を含み、ここで該抗体は検出され得る。
いくつかの実施態様において、本発明のペプチド配列は、放射性同位元素に複合され、診断薬又は治療薬として有用である、細胞傷害性放射性医薬(放射性免疫複合体)を作製する。そのような放射性同位元素の例は、ヨウ素13、インジウム1 1 '、イットリウム90、及びルテチウム177を含むが、これらに限定されるものではない。放射性免疫複合体を調製する方法は、当業者には公知である。市販されている放射性免疫複合体の例としては、イブリツモマブ、チウキセタン、及びトシツモマブが挙げられる。
本発明のペプチド配列の循環半減期を延長し、安定性を増加し、クリアランスを減少するか、又は免疫原性若しくはアレルゲン性を変更するために本発明に含まれる他の手段及び方法は、該分子の特徴を修飾するために、他の分子に連結されているヒドロキシエチルデンプン誘導体を利用する、HES化(hesylation)によるペプチド配列の修飾に関与している。HES化の様々な態様は、例えば、米国特許出願第2007/0134197号及び第2006/0258607号に説明されている。
本発明のペプチド配列を修飾するために使用される前述の成分及び分子のいずれかは、任意にリンカーを介して複合されてよい。好適なリンカーは、一般に修飾されたペプチド配列と連結された成分及び分子の間の動きを可能にするのに十分な長さである「可動性リンカー」を含む。これらのリンカー分子は一般に、長さ約6〜50個の原子である。これらのリンカー分子はまた、例えば、アリールアセチレン、2〜10のモノマー単位を含むエチレングリコールオリゴマー、ジアミン、二酸、アミノ酸、又はそれらの組合せであることもできる。好適なリンカーは、容易に選択することができ、且つ1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、10〜20、20〜30、30〜50個のアミノ酸(例えば、Gly)などのいずれか好適な長さであることができる。
例証的可動性リンカーは、グリシンポリマー(G)n、グリシン-セリンポリマー(例えば、(GS)n、GSGGSn、及びGGGSn、ここでnは少なくとも1の整数である)、グリシン-アラニンポリマー、アラニン-セリンポリマー、及び他の可動性リンカーを含む。グリシンポリマー及びグリシン-セリンポリマーは、比較的構造化されておらず(unstructured)、そのため成分間のニュートラルなテザーとして役立つことができる。可動性リンカーの例は、GGSG、GGSGG、GSGSG、GSGGG、GGGSG、及びGSSSGを含むが、これらに限定されるものではない。
表1-8及び図1に列記されたFGF19及びFGF21の変種及び部分配列並びにFGF19/FGF21融合体及びキメラに加え、表1-8及び図1に列記された配列の部分配列、配列変種及び修飾形を含む本発明のペプチド配列は、本明細書に示す1つ以上の活性を有する。活性の一例は、グルコース降下活性である。活性の別の例は、例えばFGF19と比べ、肝細胞癌(HCC)の低下した刺激又は形成である。活性の追加の例は、例えばFGF21と比べ、より低い又は低下した脂質(例えば、トリグリセリド、コレステロール、非-HDL)又はHDLの増加活性である。活性の更なる例は、例えばFGF21と比べ、より低い又は低下した除脂肪筋肉量(lean muscle mass)の低下活性である。活性のまた別の例は、線維芽細胞増殖因子受容体-4(FGFR4)への結合、又はFGFR4の活性化であり、例えば、FGFR4についてのFGF19結合親和性と同等又はより大きい親和性でFGFR4に結合するペプチド配列；並びに、FGFR4を活性化するFGF19と同等又はより大きい程度又は量までFGFR4を活性化するペプチド配列である。活性のまた更なる例は、例えばFGF19と比べ、アルド-ケト還元酵素遺伝子発現のダウンレギュレーション又は低下；FGF21と比べSlc1a2遺伝子発現のアップレギュレーション又は増加を含む。
より特定すると、表1-8及び図1に列記されたFGF19及びFGF21の変種及び部分配列並びにFGF19/FGF21融合体及びキメラに加え、表1-8及び図1に列記された配列の部分配列、配列変種及び修飾形を含む本発明のペプチド配列は、下記の活性を伴うものを含む：FGF19、又はFGF19のアミノ酸16-20においてWGDPI配列について置換されたGQV、GDI、WGPI、WGDPV、WGDI、GDPI、GPI、WGQPI、WGAPI、AGDPI、WADPI、WGDAI、WGDPA、WDPI、WGDI、WGDP又はFGDPIのいずれかを有するFGF19変種配列と比べ、低下した肝細胞癌(HCC)形成を有するペプチド配列；FGF19、又はFGF19のアミノ酸16-20においてWGDPI配列について置換されたGQV、GDI、WGPI、WGDPV、WGDI、GDPI、GPI、WGQPI、WGAPI、AGDPI、WADPI、WGDAI、WGDPA、WDPI、WGDI、WGDP又はFGDPIのいずれかを有するFGF19変種配列と比べ、より大きいグルコース降下活性を有するペプチド配列；FGF19、又はFGF19のアミノ酸16-20においてWGDPI配列について置換されたGQV、GDI、WGPI、WGDPV、WGDI、GDPI、GPI、WGQPI、WGAPI、AGDPI、WADPI、WGDAI、WGDPA、WDPI、WGDI、WGDP又はFGDPIのいずれかを有するFGF19変種配列と比べ、より少ない脂質増加活性(例えば、より少ないトリグリセリド、コレステロール、非-HDL)又はより多いHDL増加活性を有するペプチド配列；並びに、FGF21と比べ、より少ない除脂肪量低下活性を有するペプチド配列。
より特定すると、表1-8及び図1に列記されたFGF19及びFGF21の変種及び部分配列並びにFGF19/FGF21融合体及びキメラに加え、表1-8及び図1に列記された配列の部分配列、配列変種及び修飾形を含む本発明のペプチド配列は、下記の活性を伴うものを含む：線維芽細胞増殖因子受容体-4(FGFR4)に結合するか、又はFGFR4を活性化するペプチド配列、例えば、FGFR4についてのFGF19結合親和性と同等又はより大きい親和性でFGFR4に結合するペプチド配列；FGFR4を活性化するFGF19と同等又はより大きい程度又は量までFGFR4を活性化するペプチド配列；例えばFGF19と比べ、アルド-ケト還元酵素遺伝子発現をダウンレギュレーション又は低下するペプチド配列；並びに、FGF21と比べ溶質担体ファミリー1、メンバー2(Slc1a2)遺伝子発現をアップレギュレーション又は増加するペプチド配列。
例えば肝細胞癌(HCC)形成又は腫瘍形成、グルコース降下活性、脂質増加活性、又は除脂肪量低下活性などの活性は、db/dbマウスなどの動物において確認することができる。FGFR4への結合又はFGFR4の活性化の測定は、本明細書に開示されたアッセイ(例えば、実施例1参照)又は当業者に公知のアッセイにより確認することができる。
用語「結合する」又は「結合している」は、ペプチド配列に関して使用される場合、ペプチド配列が、分子レベルで相互作用することを意味する。従ってFGFR4に結合するペプチド配列は、FGFR4配列の全て又は一部に結合する。特異的及び選択的結合は、当該技術分野において公知のアッセイ(例えば、競合結合、免疫沈降、ELISA、フローサイトメトリー、ウェスタンブロット)を使用し、非特異的結合から区別することができる。
ペプチド及びペプチド模倣体は、当該技術分野において公知の方法を用い、生成し且つ単離することができる。ペプチドは、化学的方法を用い、全体又は一部を合成することができる(例えば、Caruthersの文献、(1980)、Nucleic Acids Res. Symp. Ser. 215；Hornの文献、(1980)；及び、Banga, A.K.の文献、「治療用ペプチド及びタンパク質、製剤、処理及び送達システム(Therapeutic Peptides and Proteins, Formulation, Processing and Delivery Systems)、(1995)、Technomic Publishing社、ランカスター、PAを参照されたい)。ペプチド合成は、様々な固相技術を使用し、実行することができ(例えば、Robergeの文献、Science 269:202 (1995)；Merrifieldの文献、Methods Enzymol. 289:3 (1997)参照)、且つ例えばABI 431Aペプチド合成装置(Perkin Elmer社)を製造業者の指示に従い使用し、自動合成を実行することができる。ペプチド及びペプチド模倣体はまた、コンビナトリアル的方法を用いて合成することもできる。合成残基及び模倣体を取り込んでいるポリペプチドは、当該技術分野において公知の様々な手順及び方法を用い、合成することができる(例えば、「有機合成(Organic Syntheses)」、累積版、Gilmanら(編集)、John Wiley & Sons社、NY参照)。修飾されたペプチドは、化学修飾法により生成することができる(例えば、Belousovの文献、Nucleic Acids Res., 25:3440 (1997)；Frenkelの文献、Free Radic. Biol. Med. 19:373 (1995)；及び、Blommersの文献, Biochemistry, 33:7886 (1994)参照)。ペプチド配列の変動、誘導体化、置換及び修飾は同じく、オリゴヌクレオチド-媒介型(部位特異的)変異誘発、アラニンスキャニング、及びPCRベースの変異誘発などの方法を用い、行うことができる。部位特異的変異誘発(Carterらの文献、Nucl. Acids Res., 13:4331 (1986)；Zollerらの文献、Nucl. Acids Res. 10:6487 (1987))、カセット変異誘発(Wellsらの文献、Gene 34:315 (1985))、制限部位選択変異誘発(Wellsらの文献、Philos. Trans. R. Soc. London SerA 317:415 (1986))及び他の技術を、本発明のペプチド配列、変種、融合体及びキメラ、並びにそれらの変動、誘導体化、置換及び修飾を生成するために、クローニングされたDNAについて実行することができる。
「合成された」又は「製造された」ペプチド配列とは、手作業による操作に関与する任意の方法により作製されたペプチドである。そのような方法は、前述のもの、例えば化学合成、組換えDNA技術、大型分子の生化学的又は酵素的断片化、及びそれらの組合せを含むが、これらに限定されるものではない。
例示されたペプチド配列の部分配列、配列変種及び修飾形(例えば、表1-8及び図1に列記された配列)を含む本発明のペプチド配列は、キメラ分子を形成するように、修飾することもできる。本発明に従い、異種ドメインを含むペプチド配列が提供される。そのようなドメインは、該ペプチド配列のアミノ末端又はカルボキシル-末端に付加することができる。異種ドメインはまた、該ペプチド配列内に配置されるか、並びに／又は代わりにFGF19及び／若しくはFGF21由来のアミノ酸配列の側方に位置することができる。
用語「ペプチド」はまた、ペプチドの二量体又は多量体(オリゴマー)も含む。本発明に従い、例示されたペプチド配列に加え、例示されたペプチド配列の部分配列、変種及び修飾形(例えば、表1-8及び図1に列記された配列)の二量体又は多量体(オリゴマー)も提供される。
本発明は更に、表1-8及び図1に列記された配列の部分配列、配列変種及び修飾形を含む本発明のペプチド配列をコードしている核酸分子、並びに該ペプチドをコードしている核酸を含むベクターを提供する。従って「核酸」は、本明細書に開示された例示されたペプチド配列をコードしているものに加え、例示されたペプチド配列の機能性部分配列、配列変種及び修飾形をコードしているものが、少なくとも検出可能な又は測定可能な活性又は機能を維持している限りは、これらを含む。例えば、グルコースを降下又は低下する能力の一部を維持する、本明細書に開示された例示されたペプチド配列の部分配列、変種又は修飾形(例えば、表1-8及び図1に列記された配列)は、正常なグルコースホメオスタシスを提供するか、又はインビボにおいて慢性若しくは急性高血糖症などに関連した組織病理学的状態を軽減する。
本明細書において遺伝子、ポリヌクレオチド、ヌクレオチド配列、プライマー、オリゴヌクレオチド又はプローブとも称される核酸は、任意の長さの天然の又は修飾されたプリン-及びピリミジン-含有ポリマー、ポリリボヌクレオチド又はポリデオキシリボヌクレオチド又は混合型ポリリボ-ポリデオキシリボヌクレオチド及びそれらのα-アノマー型のいずれかをいう。2種以上のプリン-及びピリミジン-含有ポリマーは典型的には、ホスホエステル結合により又はそれらの類似体によって連結される。これらの用語は、デオキシリボ核酸(DNA)及びリボ核酸(RNA)を含む、核酸の全ての型を意味するよう、互換的に使用される。これらの核酸は、単鎖、二重鎖、又は三重鎖、線状又は環状であることができる。核酸は、ゲノムDNA及びcDNAを含む。RNA核酸は、スプライシングされるか又はされないmRNA、rRNA、tRNA又はアンチセンスであることができる。核酸は、天然、合成のものに加え、ヌクレオチド類似体及び誘導体を含む。
遺伝暗号の縮重の結果として、核酸分子は、本発明のペプチド配列をコードしている核酸分子に関して縮重している配列を含む。従って、本明細書に例示されたペプチド配列の部分配列、変種及び修飾形(例えば、表1-8及び図1に列記された配列)を含む、ペプチド配列をコードしている縮重した核酸配列が提供される。用語「相補的」とは、核酸配列に関して使用する場合、言及された領域が、100％相補的であること、すなわちミスマッチのない100％の塩基対合を示すことを意味する。
核酸は、様々な公知の標準クローニング法及び化学合成法のいずれかを用いて、生成することができ、且つ部位特異的変異誘発又は当業者に公知の他の組換え技術により、意図的に変更することができる。ポリヌクレオチドの純度は、配列決定、ゲル電気泳動、UV分光法により決定することができる。
核酸は、「発現カセット」と本明細書において称される、そこでの核酸の発現が「発現制御エレメント」により影響されるか又は調節される核酸構築体に挿入されてよい。用語「発現制御エレメント」とは、機能的に連結されている核酸配列の発現を調節するか又は影響を及ぼす1以上の核酸配列エレメントをいう。発現制御エレメントは、タンパク質-コードしている遺伝子の前に、適宜、プロモーター、エンハンサー、転写ターミネーター、遺伝子サイレンサー、開始コドン(例えばATG)を含むことができる。
核酸配列に機能的に連結された発現制御エレメントは、核酸配列の転写及び適切ならば、翻訳を制御する。用語「機能的に連結された」とは、言及された成分が、それらの意図された様式で機能することを可能にする関係である隣接位置をいう。典型的には、発現制御エレメントは、遺伝子の5'末端又は3'末端に並置されるが、イントロン性であることもできる。
発現制御エレメントは、転写を構成的に活性化するエレメントを含み、これは、誘導性(すなわち、活性化のために外部シグナル又は刺激を必要とする)、又は抑制解除性(すなわち、転写を停止するためにシグナルを必要とする；該シグナルが最早存在しない場合は、転写は活性化又は「抑制解除」される)である。同じく遺伝子発現を特定の細胞型又は組織について制御可能とするのに十分である制御エレメント(すなわち、組織-特異性制御エレメント)も、本発明の発現カセット中に含まれる。典型的には、そのようなエレメントは、コード配列の上流又は下流(すなわち、5'側及び3'側)に位置する。プロモーターは一般に、コード配列の5'側に配置される。組換えDNA技術又は合成技術により作出されたプロモーターを使用し、本発明のポリヌクレオチドの転写を提供することができる。「プロモーター」は典型的には、転写を指示するのに十分である最小配列エレメントを意味する。
核酸は、宿主細胞への形質転換のために並びに引き続きの発現及び／又は遺伝子操作のためにプラスミドへ挿入することができる。プラスミドは、宿主細胞において安定して増殖することができる核酸であり；プラスミドは、該核酸の発現を駆動するための発現制御エレメントを任意に含んでよい。本発明の目的に関して、ベクターは、プラスミドと同義語である。プラスミド及びベクターは一般に、細胞及びプロモーターにおける増殖のために少なくとも複製起点を含む。プラスミド及びベクターはまた、例えば、宿主細胞における発現のための発現制御エレメントを含むことができ、その結果例えばペプチド配列をコードするか、宿主細胞及び生物(例えば、治療が必要な対象)においてペプチド配列を発現するか、又はペプチド配列を作出する核酸の発現及び／又は遺伝子操作に有用である。
本明細書において使用される用語「導入遺伝子」は、人工的に(by artifice)細胞又は生物へ導入されたポリヌクレオチドを意味する。例えば、導入遺伝子を有する細胞では、該導入遺伝子は、細胞の遺伝子操作又は「形質転換」により導入される。その中に導入遺伝子が導入された細胞又はそれらの子孫は、「形質転換された細胞」又は「形質転換体」と称される。典型的には、導入遺伝子は、形質転換体の子孫に含まれるか、又はその細胞から発生する生物の一部となり始める。導入遺伝子は、染色体DNAへ挿入されるか、又は自己複製プラスミド、YAC、ミニ染色体などとして維持される。
細菌系プロモーターは、T7、並びにバクテリオファージλのpL、plac、ptrp、ptac(ptrp-lacハイブリッドプロモーター)などの誘導性プロモーター及びテトラサイクリン反応性プロモーターを含む。昆虫細胞系プロモーターは、構成的又は誘導性プロモーター(例えば、エクジソン)を含む。哺乳動物細胞の構成的プロモーターは、SV40、RSV、ウシ乳頭腫ウイルス(BPV)及び他のウイルスプロモーター、又は哺乳動物細胞のゲノム由来の誘導性プロモーター(例えば、メタロチオネインIIAプロモーター；熱ショックプロモーター)、又は哺乳動物のウイルス由来の誘導性プロモーター(例えば、アデノウイルス後期プロモーター；誘導性マウス乳癌ウイルス末端反復配列(LTR))を含む。或いはレトロウイルスゲノムは、好適な宿主細胞にペプチド配列を導入し、且つ発現を指示するように、遺伝子修飾されることができる。
本発明の方法及び使用は、インビボ送達を含むので、発現系は更に、インビボ使用のためにデザインされたベクターを含む。特定の非限定的例としては、アデノウイルスベクター(米国特許第5,700,470号及び第5,731,172号)、アデノ随伴ウイルスベクター(米国特許第5,604,090号)、単純ヘルペスウイルスベクター(米国特許第5,501,979号)、レトロウイルスベクター(米国特許第5,624,820号、第5,693,508号及び第5,674,703号)、BPVベクター(米国特許第5,719,054号)、CMVベクター(米国特許第5,561,063号)、並びにパルボウイルス、ロタウイルス、ノーウォークウイルス及びレンチウイルスベクター(例えば、米国特許第6,013,516号参照)が挙げられる。ベクターは、幹細胞を含む腸管の細胞へ、遺伝子を送達するものを含む(Croyleらの文献、Gene Ther. 5:645 (1998)；S.J. Henningの文献、Adv. Drug Deliv. Rev. 17:341 (1997)、米国特許第5,821,235号及び第6,110,456号)。これらのベクターの多くは、臨床試験のために承認されている。
酵母ベクターは、構成的プロモーター及び誘導性プロモーターを含む(例えば、Ausubelらの文献、「分子生物学の最新プロトコール(Current Protocols in Molecular Biology)」、第2巻13章、Greene編集、Publish. Assoc. & Wiley Interscience社、1988；Grantらの文献、Methods in Enzymology, 153:516 (1987), Wu及びGrossman編集；Bitterの文献、Methods in Enzymology, 152:673 (1987), Berger及びKimmel編集, Acad. Press社、N.Y.；及び、Strathernらの文献、「酵母サッカロミセスの分子生物学(The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces)」、(1982) Cold Spring Harbor Press編集、第I巻及び第II巻を参照されたい)。ADH若しくはLEU2などの構成的酵母プロモーター又はGALなどの誘導性プロモーターを使用することができる(R. Rothsteinの文献、「DNAクローニング、実践法(DNA Cloning, A Practical Approach)」、第11巻3章、D.M. Glover編集、IRL Press社、ワシントンD.C.、1986)。例えば相同組換えを介し、外来核酸配列の酵母染色体への組み込みを促進するベクターは、当該技術分野において公知である。挿入されたポリヌクレオチドが、より一般的なベクターには大きすぎる(例えば約12Kbよりも大きい)場合には、酵母人工染色体(YAC)が典型的には使用される。
発現ベクターは同じく、選択圧に抵抗を付与する選択マーカー又は同定可能なマーカー(例えば、β-ガラクトシダーゼ)を含むこともでき、これにより該ベクターを有する細胞を選択、成長及び拡大することが可能である。或いは、選択マーカーは、ペプチド配列をコードしている核酸を含む第一のベクターにより、宿主細胞へ同時トランスフェクションされる第二のベクター上であることができる。選択システムは、各々、tk-細胞、hgprt-細胞又はaprt-細胞において利用することができる、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子(Wiglerらの文献、Cell, 11:223 (1977))、ヒポキサンチン-グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子(Szybalskaらの文献、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 48:2026 (1962))、及びアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子(Lowyらの文献、Cell, 22:817 (1980))を含むが、これらに限定されるものではない。加えて、代謝拮抗物質抵抗性は、メトトレキセートに対する抵抗性を付与するdhfr(O'Hareらの文献、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78:1527 (1981))；ミコフェノール酸に対する抵抗性を付与するgpt遺伝子(Mulliganらの文献、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78:2072 (1981))；アミノ配糖体G-418に対する抵抗性を付与するネオマイシン遺伝子(Colberre-Garapinらの文献、J. Mol. Biol. 150:1(1981))；ピューロマイシン；並びに、ヒグロマイシンに対する抵抗性を付与するヒグロマイシン遺伝子(Santerreらの文献、Gene, 30:147 (1984))の選択の基礎として使用することができる。追加の選択可能な遺伝子は、細胞がトリプトファンの代わりにインドールを利用することを可能にするtrpB；ヒスチジンの代わりにヒスチノール(histinol)を利用することを可能にするhisD(Hartmanらの文献、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85:8047 (1988))；及び、オルニチンデカルボキシラーゼインヒビターである2-(ジフルオロメチル)-DL-オルニチン(DFMO)に対する抵抗性を付与するODC(オルニチンデカルボキシラーゼ)(McConlogueの文献、(1987)、「分子生物学の最新情報(Current Communications in Molecular Biology)」、Cold Spring Harbor Laboratory)を含む。
本発明に従い、本明細書記載のFGF19及び／又はFGF21の変種又は融合体を生成する形質転換細胞(インビトロ、エクスビボ及びインビボ)並びに宿主細胞が提供され、ここでFGF19及び／又はFGF21の変種又は融合体の発現は、FGF19及び／又はFGF21の変種又は融合体をコードしている核酸により付与される。本発明のペプチド配列を発現する形質転換細胞及び宿主細胞は典型的には、本発明のペプチド配列をコードしている核酸を含む。一実施態様において、形質転換細胞又は宿主細胞は、原核細胞である。別の実施態様において、形質転換細胞又は宿主細胞は、真核細胞である。様々な態様において、真核細胞は、酵母又は哺乳動物(例えば、ヒト、霊長類など)の細胞である。
本明細書において使用される「形質転換」細胞又は「宿主」細胞は、それにコードされたペプチド配列の発現を増大及び／又は転写することができる核酸が導入される細胞である。この用語はまた、宿主細胞の子孫又はサブクローンを含む。
形質転換細胞及び宿主細胞は、細菌及び酵母などの微生物；並びに、植物、昆虫及び哺乳動物の細胞を含むが、これらに限定されるものではない。例えば、組換えバクテリオファージ核酸、プラスミド核酸若しくはコスミド核酸発現ベクターにより形質転換された細菌；組換え酵母発現ベクターにより形質転換された酵母；組換えウイルス発現ベクター(例えば、カリフラワーモザイクウイルス、CaMV；タバコモザイクウイルス、TMV)により感染された、若しくは組換えプラスミド発現ベクター(例えば、Tiプラスミド)により形質転換された、植物細胞システム；組換えウイルス発現ベクター(例えば、バキュロウイルス)により感染された昆虫細胞システム；並びに、組換えウイルス発現ベクター(例えば、レトロウイルス、アデノウイルス、ワクシニアウイルス)により感染された動物細胞システム、又は一過性又は安定した増殖又は発現のために操作された形質転換された動物細胞システムを含む。
遺伝子治療での使用及び方法のために、形質転換細胞は、対象内であることができる。対象内の細胞は、インビボにおいて、本明細書に示した本発明のペプチド配列をコードしている核酸により形質転換されることができる。或いは細胞は、インビトロにおいて、導入遺伝子又はポリヌクレオチドにより形質転換され、その後治療を実行するために、対象の組織に移植されることができる。或いは初代細胞単離株又は樹立された細胞株は、FGF19及び／若しくはFGF21の変種、又はFGF19の全て又は一部を含むか若しくはFGF21の全て又は一部を含むキメラペプチド配列などの、それらの融合体/キメラ配列(若しくは変種)をコードしている導入遺伝子又はポリヌクレオチドにより形質転換されることができ、その後任意に対象の組織に移植される。
ペプチド配列の発現のための、特にインビボにおける発現のための非限定的標的細胞は、膵細胞(島細胞)、筋肉細胞、粘膜細胞及び内分泌細胞を含む。そのような内分泌細胞は、FGF19及び／若しくはFGF21の変種、又はFGF19の全て又は一部を含む若しくはFGF21の全て又は一部を含むキメラペプチド配列などの、それらの融合体/キメラ配列(若しくは変種)の誘導的生成(分泌)を提供することができる。形質転換するための追加の細胞は、幹細胞、又は例えば多様な膵細胞(島細胞)、筋肉細胞、粘膜細胞及び内分泌細胞へと分化する始原細胞などの、他の多分化能細胞又は多能性細胞を含む。幹細胞の標的化は、本発明のペプチド配列のより長期の発現を提供する。
本明細書において使用される用語「培養された」とは、細胞に関して使用する場合、細胞がインビトロにおいて成長することを意味する。そのような細胞の特定の例は、対象から単離された細胞、及び組織培養物中で成長されるか又は成長のために順応された細胞である。別の例は、インビトロにおいて遺伝子操作された細胞、及び同じ又は異なる対象へと戻し移植された細胞である。
用語「単離された」とは、細胞に関して使用する場合、その天然のインビボ環境から分離される細胞を意味する。「培養された」細胞及び「単離された」細胞は、遺伝子形質転換など、手作業により操作されてよい。これらの用語は、細胞分裂時に生じる変異のために、親の細胞と同一でなくてよい子孫細胞を含む、該細胞の任意の子孫を含む。これらの用語は、ヒト全体を含まない。
本発明のペプチド配列をコードしている核酸は、安定した発現のために、生物全体の細胞へ導入することができる。非-ヒトトランスジェニック動物を含むそのような生物は、動物全体におけるペプチド発現の効果及び治療的便益の研究に有用である。例えば本明細書に開示されるように、マウスにおいて、FGF19及び／若しくはFGF21の変種、又は本明細書に示したFGF19の全て又は一部を含む若しくはFGF21の全て又は一部を含むキメラペプチド配列などの、それらの融合体/キメラ配列(若しくは変種)は、グルコースを降下し、且つ抗-糖尿病性である。
特定の疾患(例えば、糖尿病、変性疾患、癌など)を発症するか又は発症し易いマウス系統はまた、該疾患易罹患性のマウスにおいて、治療用タンパク質発現の効果を研究するために、本明細書において説明される治療用タンパク質を導入するために有用である。ストレプトゾトシン(STZ)-誘導性糖尿病(STZ)マウスなどの、特定の病態又は生理的状態に易罹患性であるトランスジェニック及び遺伝的動物モデルは、FGF19及び／若しくはFGF21の変種、又は本明細書に示したFGF19の全て又は一部を含む若しくはFGF21の全て又は一部を含むキメラペプチド配列などの、それらの融合体/キメラ配列(若しくは変種)を発現するのに適した標的である。従って本発明に従い、FGF19及び／若しくはFGF21の変種、又はFGF19の全て又は一部を含む若しくはFGF21の全て又は一部を含むキメラペプチド配列などの、それらの融合体/キメラ配列(若しくは変種)を生成する、非-ヒトトランスジェニック動物が提供され、その生成は、動物においては天然には生じず、これは動物の体細胞又は生殖細胞に存在する導入遺伝子によりもたらされる。
用語「トランスジェニック動物」とは、その動物の体細胞又は生殖系列細胞が、微量注入又は組換えウイルスによる感染などによる細胞下レベルでの計画的な遺伝子操作により、直接又は間接に受け取った遺伝情報を生じる動物をいう。用語「トランスジェニック」とは更に、本明細書に記載のように遺伝子操作されたトランスジェニック動物から得られた細胞又は組織(すなわち、「トランスジェニック細胞」、「トランスジェニック組織」)を含む。本文脈において、「トランスジェニック動物」は、古典的交雑又は体外受精により作出された動物は包含せず、むしろ1つ以上の細胞が核酸分子を受け取っている動物を意味する。発明のトランスジェニック動物は、その導入遺伝子に関してヘテロ接合又はホモ接合のいずれかであることができる。マウス、ヒツジ、ブタ及びカエルを含むトランスジェニック動物を作出する方法は、当該技術分野において周知であり(例えば、米国特許第5,721,367号、第5,695,977号、第5,650,298号、及び第5,614,396号参照)、従ってこれらは追加的に含まれる。
ペプチド配列、ペプチド配列をコードしている核酸、ペプチド配列を発現しているベクター及び形質転換された宿主細胞は、単離された及び精製された形態を含む。用語「単離された」は、発明の組成物の修飾語句として使用される場合、組成物が、環境中の1種以上の成分から、実質的に完全に又は少なくとも一部分離されていることを意味する。一般に天然に存在する組成物は、単離される場合、天然にそれらが通常会合している1種以上の物質、例えば1種以上のタンパク質、核酸、脂質、炭水化物又は細胞膜を実質的に含まない。用語「単離された」は、変種、修飾又は誘導体化された形態、融合体及びキメラ、多量体/オリゴマーなどの組成物の代替の生理的形態、又は宿主細胞において発現された形態を除外しない。用語「単離された」はまた、そのいずれかが手作業により作製される、その中に組合せで存在する形態(例えば、医薬組成物、組合せ組成物など)を除外しない。
「単離された」組成物はまた、夾雑物又は望ましくない物質若しくは材料などの、1種以上の他の材料の一部を、相当数、又はほとんど若しくは全てを含まない場合に、「精製される」ことができる。本発明のペプチド配列は一般に、天然に存在することは知られていないか又は存在するとは考えられていない。しかし、天然に存在する組成物に関して、単離された組成物は一般に、それが典型的には天然に会合している他の材料の一部を、相当数、又はほとんど若しくは全てを含まないであろう。従って、同じく天然に生じる単離されたペプチド配列は、例えば、タンパク質ライブラリーのタンパク質又はゲノムライブラリー若しくはcDNAライブラリー中の核酸などの、非常に多数の他の配列の中に存在するポリペプチド又はポリヌクレオチドを含まない。「精製された」組成物は、1以上の他の不活性分子又は活性分子との組合せを含む。例えば、本発明のペプチド配列は、例えば、グルコース降下薬又は治療薬などの、他の薬物又は薬剤と組合せた。
本明細書に使用される用語「組換え」は、ペプチド配列、ペプチド配列をコードしている核酸などの修飾語句として使用される場合、組成物が、一般に天然(例えばインビトロ)においては生じない様式で操作されている(すなわち、設計されている(engineered))ことを意味する。組換えペプチドの特定の例は、本発明のペプチド配列が、ペプチド配列をコードしている核酸でトランスフェクションされた細胞により発現されている場合である。組換え核酸の特定の例は、ペプチド配列をコードしている核酸(例えば、ゲノム又はcDNA)が、該遺伝子が生物のゲノムで通常近接している5'領域、3'領域又はイントロン領域を伴い又は伴わずに、プラスミドへクローニングされている場合である。別の組換えペプチド又は核酸の例は、FGF19の一部及びFGF21の一部を含むキメラペプチド配列などの、ハイブリッド又は融合体配列である。
本発明に従い、例示されたペプチド配列の部分配列、変種及び修飾形(表1-8及び図1に列記されたFGF19及びFGF21変種及び部分配列、並びに表1-8及び図1に列記されたFGF19/FGF21融合体及びキメラを含む)を含む、本発明のペプチド配列の組成物及び混合物が提供される。一実施態様において、混合物は、1種以上のペプチド配列及び医薬として許容し得る担体又は賦形剤を含有する。別の実施態様において、混合物は、1種以上のペプチド配列、並びに抗-糖尿病性若しくはグルコース降下性の薬物若しくは治療薬などの補助薬又は治療薬を含有する。薬物及び治療薬の例は、以下に示している。医薬として許容し得る担体又は賦形剤中の1種以上のペプチド配列の、1種以上の抗-糖尿病性若しくはグルコース降下性の薬物若しくは治療薬との組合せなども同じく、提供される。本発明のペプチド配列と、例えばグルコース降下性薬物又は治療薬などの別の薬物又は薬剤とのそのような組合せは、例えば対象の治療に関して、本発明の方法及び使用に従い有用である。
組合せはまた、本発明のペプチド配列又は核酸の、ポリエステル、炭水化物、ポリアミン酸(polyamine acid)、ヒドロゲル、ポリビニルピロリドン、エチレン-酢酸ビニル、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、硫酸プロタミン、又はラクチド/グリコリドコポリマー、ポリラクチド/グリコリドコポリマー、又はエチレン酢酸ビニルコポリマーなどの、粒子又は高分子物質への組み込み；例えば、各々、ヒドロキシメチルセルロース若しくはゼラチン-マイクロカプセル、又はポリ(メチルメタクリレート)マイクロカプセルを使用する、コアセルベーション技術によるか又は界面重合により調製されたマイクロカプセル中の捕獲；高分子複合体、ナノ-カプセル、ミクロスフェア、ビーズ、並びに例えば水中油型エマルション、ミセル、混合型ミセル、及びリポソームを含む脂質-ベースのシステム(例えば、N-ラウロイル、N-オレオイルなどのN-脂肪酸アシル基、ドデシルアミン、オレオイルアミンなどの脂肪酸アミンなど、米国特許第6,638,513号参照)などのコロイド薬物送達システム及び分散システム中への組み込みを含む。
本明細書に示されたような例示されたペプチド配列の部分配列、変種及び修飾形(表1-8及び図1に列記されたFGF19及びFGF21の変種及び部分配列、並びに表1-8及び図1に列記されたFGF19/FGF21融合体及びキメラを含む)を含む発明のペプチドは、グルコース代謝を調節し、且つ血液から筋肉、肝臓及び脂肪などの重要な代謝臓器へのグルコースの輸送を促進するために使用することができる。そのようなペプチド配列は、耐糖能を回復するのに及び／又はグルコースホメオスタシスを改善若しくは正常とするのに十分な量又は有効な量で生成され得る。
本明細書に記載されたように、マウスへの様々なFGF19及び/FGF21変種並びに融合体ペプチド配列の投与は、グルコースレベルをうまく低下した。更にFGF19とは対照的に、特定のペプチド配列は、マウスにおいてHCC形成又は腫瘍形成を刺激又は誘導しなかった。従って、例示されたペプチド配列の部分配列、変種及び修飾形(表1-8及び図1に列記されたFGF19及びFGF21の変種及び部分配列、並びに表1-8及び図1に列記されたFGF19/FGF21融合体及びキメラを含む)を含む発明のペプチドの、インビボ法又はエクスビボ法の直接又は間接のいずれかによる動物への投与(例えば、該変種若しくは融合体ペプチド、該変種若しくは融合体ペプチドをコードしている核酸、又は該変種若しくは融合体ペプチドを発現している形質転換された細胞若しくは遺伝子治療ベクターの投与)は、様々な障害の治療に使用することができる。
従って本発明は、インビトロ、エクスビボ及びインビボ(例えば、対象への又は対象における)の方法及び使用を含む。そのような方法及び使用は、本明細書に示した任意の本発明のペプチド配列により実践することができる。
本発明に従い、障害を有するか又は有するリスクのある対象を治療する方法が提供される。様々な実施態様において、方法は、表1-8及び図1に列記されたFGF19又はFGF21変種、融合体若しくはキメラ、又は表1-8及び図1に列記されたFGF19若しくはFGF21変種、融合体若しくはキメラの部分配列、変種若しくは修飾形などのペプチド配列を、該障害を治療するのに有効な量で対象へ投与することを含む。
発明のペプチド並びに方法及び使用により治療、予防などが可能な障害の例は、代謝疾患及び障害を含む。疾患及び障害の非限定的例は、以下を含む：1.糖尿病(I型及びII型)、妊娠性糖尿病、高血糖症、インスリン抵抗性、異常なグルコース代謝、「プレ糖尿病」(空腹時血糖異常(IFG)又は耐糖異常(IGT))を含む、グルコース利用障害及びそれに関連した後遺症、並びに例えば膵β-細胞破壊などの組織病理学的変化を含む高血糖状態に関連した若しくはその結果生じた他の生理的障害。治療のために、発明のペプチド配列は、約100mg/dlより大きい空腹時血漿グルコース(FPG)レベルを有する対象へ投与される。本発明のペプチド配列はまた、腎損傷(例えば、尿細管損傷又は腎症)、肝変性、眼損傷(例えば、糖尿病性網膜症又は白内障)、及び糖尿病による足の障害を含む、他の高血糖-関連障害においても有用であることができる；2.脂質異常症及び例えばアテローム性動脈硬化症、冠動脈疾患、脳血管障害などのそれらの後遺症；3.肥満症及び上昇した体質量(非限定的に非アルコール性脂肪肝疾患(NAFLD)、非アルコール性脂肪性肝炎(NASH)、及び多嚢胞卵巣症候群(PCOS)などのそれらの合併状態を含む)などの、メタボリック症候群に関連し得る他の状態を含み、並びにまた血栓症、凝固能亢進状態及び血栓形成促進性状態(動脈性及び静脈性)、高血圧、心臓血管疾患、脳卒中及び心不全も含む；4.アテローム性動脈硬化症、慢性炎症性腸疾患(例えば、クローン病及び潰瘍性大腸炎)、喘息、紅斑性狼瘡、関節炎、又は他の炎症性リウマチ障害を含む、炎症反応が関与した障害又は状態；5.例えば脂肪肉腫、固形癌及び新生物を含む脂肪細胞腫瘍、脂肪腫様癌腫などの、細胞周期又は細胞分化過程の障害；6.アルツハイマー病、多発性硬化症、パーキンソン病、進行性多巣性白質脳症及びギランバレー症候群を含む、中枢神経及び末梢神経の神経変性疾患及び／若しくは脱髄障害、並びに／又は神経炎症過程に関与した神経系疾患、並びに／又は他の末梢神経障害；7.紅斑性-扁平性皮膚症を含む、皮膚及び皮膚科的障害及び／又は創傷治癒過程の障害；並びに、8.X染色体症候群、変形性関節炎、及び急性呼吸窮迫症候群などの、他の障害。
本明細書に使用される用語「高血糖性」又は「高血糖症」は、対象の状態に関して使用される場合に、対象の血液中に存在する一過性又は慢性的に異常に高いグルコースレベルを意味する。この状態は、グルコースの代謝又は吸収の遅延により引き起こされ、結果的に対象は、典型的には正常対象においては認められない耐糖能異常又は上昇したグルコース状態を示す(例えば、糖尿病発症のリスクのあるグルコース-不耐性プレ糖尿病対象において、又は糖尿病対象において)。正常血糖に関する空腹時血漿グルコース(FPG)レベルは約100mg/dl未満であり、障害のあるグルコース代謝については約100〜126mg/dlであり、且つ糖尿病については約126mg/dl以上である。
本明細書に開示されたように、本発明は、肥満症又は望ましくない体質量(例えば、同等の年齢、性別、人種など、適切にマッチした対象と比べ、より大きい正常体質指数、又は「BMI」)の進行、発症を予防する(例えば、特定の障害を有する素因のある対象において)、遅延する、緩徐化する又は阻害するか、或いは治療する(例えば、改善する)方法を含む。従って様々な実施態様において、例えば、肥満症又は望ましくない体質量(例えば、閉塞性睡眠時無呼吸症、関節炎、癌(例えば、乳癌、子宮内膜癌、及び結腸癌)、胆石又は高血糖症などの、肥満症の合併状態を含む)の治療のための本発明の方法は、本明細書記載の本発明のペプチド(例えば、例として表1-8及び図1に列記されたFGF19及び／又はFGF21の変種又は融合体など)を、肥満症又は望ましくない体質量を治療するのに有効な量で、接触させるか又は投与することを含む。特定の態様において、対象は、25より大きい、例えば25〜30、30〜35、35〜40、又は40よりも大きい体質指数を有する。
更に本発明は、その全てが、単独で若しくは組合せで、例えば、血栓形成、血管の狭窄若しくは閉塞、並びに高血圧、脳卒中及び冠動脈疾患リスクの増大に繋がり得る、望ましくないレベルの又は異常に上昇した血清／血漿LDL、VLDL、トリグリセリド又はコレステロールの進行を予防する(例えば、特定の障害を有する素因のある対象において)、緩徐化する又は阻害するか、或いは発症を遅延するか、或いは治療する方法を含む。そのような障害は、例えば、例として遺伝性素因又は食事に起因し得る。
用語「対象」とは、動物をいう。典型的には、動物は、本発明のペプチド配列による治療から恩恵のある哺乳動物である。特定の例は、霊長類(例えばヒト)、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ブタ及びヒツジを含む。
対象は、障害、例えば糖尿病などの高血糖障害を有する対象、又は障害を有さないが障害を発症するリスクのある対象、例えば、100mg/dlより大きい、例えば約100〜126mg/dlのFPGレベルを有するプレ糖尿病対象などを含む。障害を発症するリスクのある対象は、例えばその食事が、急性又は慢性高血糖症(例えば糖尿病)、望ましくない体質量又は肥満症の発症に寄与し得る対象に加え、急性若しくは慢性高血糖症、又は望ましくない体質量若しくは肥満症の発症の家族歴若しくは遺伝性素因を有する対象を含む。
本明細書に開示されたように、治療方法は、本明細書に記した本発明のペプチド(例えば、例として表1-8及び図1に列記されたFGF19及び／又はFGF21の変種又は融合体)を、対象において望ましい転帰又は結果を実現するのに有効な量で接触させるか又は投与することを含む。望ましい転帰又は結果を生じる治療は、対象における該状態の1以上の症状の重症度又は頻度を減少、低下又は予防すること、例えば、対象の状態の改善又は「有益な効果」又は「治療効果」を含む。その結果治療は、一過性に(例えば、1〜6、6〜12、又は12〜24時間)、中期間(例えば、1〜6、6〜12、12〜24又は24〜48日間)、又は長期間(例えば、1〜6、6〜12、12〜24、24〜48週間、又は24〜48週間以上)にわたり、該障害の1以上の症状の重症度又は頻度を減少又は低下又は予防し、該障害の進行又は増悪を安定化又は阻害し、且つ場合によっては、該障害を逆行することができる。従って高血糖障害の場合、例えば治療は、血液グルコースを降下又は低下し、耐糖能を改善し、グルコース代謝を改善し、正常なグルコースホメオスタシスを提供し、インスリン抵抗性を降下又は低下し、インスリンレベルを降下又は低下するか、或いはメタボリック症候群又は糖尿病などの高血糖障害に関連した若しくはその結果である組織病理学的変化を減少、予防、改善又は逆行することができる。
例えば、ペプチド配列、方法又は使用は、100mg/dlより大きい、例えば約100〜125mg/dl、又は125mg/dlより大きいFPGレベルを有する1以上の対象において、5〜10％、10〜20％、20〜30％、又は30〜50％又はそれよりも多く、或いは例えば200mg/dl以上から200mg/dl未満に、150mg/dl以上から150mg/dl未満に、125mg/dl以上から125mg/dl未満になどグルコースを降下又は低下することができる。加えて、ペプチド配列、方法又は使用は、例えば、ベースラインHbAIcレベルを伴う、プレ糖尿病又は糖尿病(例えばII型)の対象に関して、約5％以上、6％、7％、8％、9％又は10％、特に5％、6％、又は7％グルコースを降下又は低下することができる。
高血糖状態に関連した組織病理学的変化の改善の非限定的例は、例えば、膵細胞(例えばβ-細胞)の破壊又は変性、尿細管石灰化若しくは腎症などの腎臓損傷、肝臓の変性、眼の損傷(例えば、糖尿病性網膜症、白内障)、糖尿病性足、口腔又は歯茎などの粘膜の潰瘍形成、歯周炎、過度の出血、損傷若しくは創傷の治癒の緩徐化若しくは遅延(例えば、これは糖尿病性カルブンケルに繋がる)、皮膚感染症及び多の皮膚障害、心臓血管系及び冠動脈性心臓病、末梢血管障害、脳卒中、脂質異常症、高血圧、肥満症、又は前述のいずれかの発症のリスクの減少、阻害、低下又は停止を含む。望ましくない体質量又は肥満症の改善は、例えば、体質量(BMIなどにより反映される)の低下、又はトリグリセリド、コレステロール、LDL若しくはVLDLレベルの減少、血圧低下、血管内膜厚の減少、心臓血管疾患、若しくは脳卒中の減少若しくはリスクの低下、休息時心拍数の減少などの、関連障害の改善を含むことができる。
使用及び／又は対象の治療のための「有効な量」又は「十分な量」は、単独で、又は1種以上の他の組成物(薬物などの治療薬又は高血糖症の治療)、治療、プロトコール、若しくは治療的レジメンの薬剤と組合せて、単回投与量又は反復投与量で、任意の期間(一過性、中期間又は長期間)の検出可能な反応を、測定可能な若しくは検出可能な程度の又は任意の期間(例えば、数時間、数日間、数ヶ月間、数年間又は治癒)にわたる望ましい転帰又は主観的若しくは客観的恩恵を対象へ、提供する量をいう。そのような量は典型的には、障害、又は1つ、複数若しくは全ての有害症状、該障害の帰結又は合併症を、測定可能な程度改善するのに有効であるが、該障害の進行又は増悪の低下又は阻害は、満足できる転帰であると考えられる。
本明細書において使用する用語「改善する」は、対象の障害の改善、該障害の重症度の低下、又は該障害の進行若しくは増悪の阻害(例えば、該障害の安定化)を意味する。高血糖障害(例えば、糖尿病、インスリン抵抗性、耐糖能異常、メタボリック症候群など)の症例において、例えば改善は、血液グルコースの降下若しくは低下、インスリン抵抗性の低下、グルカゴンの低下、耐糖能、若しくはグルコース代謝若しくはホメオスタシスの改善であることができる。高血糖障害の改善はまた、本明細書に示したような、改善された膵臓機能(例えば、β-細胞/島の破壊の阻害又は予防、又はβ-細胞の数及び／若しくは機能の増強)、罹患した組織若しくは臓器の組織病理の改善などの、該障害に関連した若しくは該障害から生じた病理の減少を含むことができる。望ましくない体質量又は肥満症の症例において、例えば改善は、体重増加の減少、体質量の低下(例えば低下したBMIで反映される)、又は例えば本明細書に示したような、望ましくない体質量肥満症に関連した状態の改善(例えば、血液グルコース、トリグリセリド、コレステロール、LDL又はVLDLレベルの降下又は低下、血圧低下、血管内膜厚の減少など)であることができる。
従って治療的便益又は改善は、該障害又は疾患に関連した症状、合併症、結果又は基礎となる原因のいずれか一つ、ほとんど又は全ての完全な除去を必要としない。従って、ある期間にわたり(数時間、数日間、数週間、数ヶ月など)、対象の状態の一過性、中期間若しくは長期間の漸増する改善、又は発生、頻度、重症度、進行若しくは期間の部分的減少、又は1以上の関連した有害症状若しくは合併症若しくは結果若しくは基礎となる原因の阻害若しくは逆行、該障害又は疾患の増悪若しくは進行(例えば、該状態、障害若しくは疾患の1以上の症状又は合併症の安定化)が存在する場合に、満足できるエンドポイントが達成される。
従って、本発明のペプチド配列により治療可能な障害の症例において、障害を改善するのに十分なペプチドの量は、該障害の種類、重症度及び程度、又は期間、望ましい治療効果又は転帰によって決まり、且つ当業者は容易に確定することができるであろう。同じく適量は、個々の対象(例えば、対象内の生物学的利用能、性別、年齢など)によって決まるであろう。例えば、対象における一過性の又は部分的な正常グルコースホメオスタシスの回復は、結果インスリンから完全に解放されることはないが、インスリン注射の用量又は頻度を低下することができる。
有効量は、例えば、1以上の関連する生理的効果を測定することにより、確定することができる。高血糖状態の症例における特定の非限定的例において、血液グルコースの降下若しくは低下又は耐糖能試験の改善を使用し、例示されたペプチド配列の部分配列、配列変種及び修飾形(例えば、表1-8及び図1に列記された配列)を含む、発明のペプチド配列の量が、高血糖状態を治療するのに有効であるかどうかを決定することができる。別の特定の非限定的例において、有効量は、FPGを任意のレベル(例えば、ベースラインレベル)に低下又は減少するのに十分な量であり、これは例えば、FPGレベルを200mg/dl以上から200mg/dl未満に低下するのに十分な量、FPGレベル175mg/dl〜200mg/dlを投与前レベル未満に低下するのに十分な量、FPGレベル150mg/dl〜175mg/dlを投与前レベル未満に低下するのに十分な量、FPGレベル125mg/dl〜150mg/dlを投与前レベル未満に低下するのに十分な量など(例えば、FPGレベルを125mg/dl未満に、120mg/dl未満に、115mg/dl未満に、110mg/dl未満などに低下するのに十分な量)である。HbAIcレベルの場合、有効量は、レベルを約10％超を9％へ、約9％超を8％へ、約8％超を7％へ、約7％超を6％へ、約6％超を5％へなど低下又は減少するのに十分な量を含む。より特定すると、HbAIcレベルの約0.1％、0.25％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1％、1.5％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、33％、35％、40％、45％、50％又はそれ以上だけの低下又は減少は、本発明に従い有効量である。望ましくない体質量又は肥満症の場合の更に別の特定の非限定的例において、有効量は、対象の体質指数(BMI)を減少又は低下、グルコースを減少又は低下、トリグリセリド、脂質、コレステロール、脂肪酸、LDL及び／若しくはVLDLの血清／血漿レベルを減少又は低下するのに十分な量である。また更なる特定の非限定的例において、量は、前述のパラメータを、例えば、約0.1％、0.25％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1％、1.5％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、33％、35％、40％、45％、50％、又はそれ以上だけ減少又は低下するのに十分な量である。
対象を治療するための本発明の方法及び使用は、高血糖障害などの対象の障害、又は望ましくない体質量若しくは肥満症の発達を予防するために、予防に関して適用可能である。或いは方法及び使用は、対象の治療時若しくは治療後に実践することができる。例えば、対象のインスリン又は他のグルコース降下薬若しくは治療薬を使用しグルコースを降下するための治療前、治療時又は治療後に、例えば本発明の方法又は使用を、例えば本発明のペプチド配列を、該対象へ投与することができる。加えて、本発明のペプチド配列などの組成物は、例えばグルコース降下薬又は治療薬などの、別の薬物又は薬剤と組合せることができる。
従って対象を治療するための本発明の方法及び使用は、別の治療の前に、実質的に同時に又は後に実践することができ、且つ別の型の療法で補助することができる。補助療法は、インスリン、インスリン感度増強剤及び他の薬物治療などの他のグルコース降下治療、食事制限(低糖質、低脂肪など)、体重減少手術(胃バイパス、胃切除術による胃容積の減少)、胃緊縛術、胃バルーン、胃スリーブなどを含む。例えば、高血糖障害又はインスリン抵抗性障害を治療するための本発明の方法又は使用は、対象においてグルコースを降下するか又はインスリン感受性を増大する薬物又は他の医薬組成物と組合せて使用することができる。糖尿病を治療するための薬物は、例えば、ビグアニド及びスルホニル尿素(例えば、トルブタミド、クロルプロパミド、アセトヘキサミド、トラザミド、グリベンクラミド及びグリピジド)、チアゾリジンジオン(ロシグリタゾン、ピオグリタゾン)、GLP-1類似体、ジペプチジルペプチダーゼ-4(DPP-4)阻害剤、ブロモクリプチン製剤(例えば、胆汁酸金属イオン封鎖剤(例えば、コレセベラム)、及びインスリン(追加-基礎アナログ製剤)、チアゾリジンジオン(TZD)併用又は非併用のメトホルミン(例えば、メトホルミン塩酸塩)、及びSGLT-2阻害剤を含む。食欲抑制剤も周知であり、且つ本発明の方法と組合せて使用することができる。補助療法は、発明の方法及び使用の前、同時に又は後に投与することができる。
例示されたペプチド配列の部分配列、配列変種及び修飾形(例えば、表1-8及び図1に列記された配列)を含む、本発明のペプチド配列は、単位投与量又は単位剤形に製剤することができる。特定の実施態様において、ペプチド配列は、例えば高血糖症のために治療が必要な対象を治療するのに有効な量である。単位投与量の例は、約25〜250、250〜500、500〜1000、1000〜2500又は2500〜5000、5000〜25,000、25,000〜50,000ng；約25〜250、250〜500、500〜1000、1000〜2500又は2500〜5000、5000〜25,000、25,000〜50,000μg；及び、約25〜250、250〜500、500〜1000、1000〜2500又は2500〜5000、5000〜25,000、25,000〜50,000mgの範囲である。
例示されたペプチド配列の部分配列、配列変種及び修飾形(例えば、表1-8及び図1に列記された配列)を含む、本発明のペプチド配列は、例えば有効量又は十分量で、単回投与量又は反復用量として意図された効果を提供するために、投与することができる。投与量の例は、約25〜250、250〜500、500〜1000、1000〜2500又は2500〜5000、5000〜25,000、25,000〜50,000pg/kg；約50〜500、500〜5000、5000〜25,000又は25,000〜50,000ng/kg；及び、約25〜250、250〜500、500〜1000、1000〜2500又は2500〜5000、5000〜25,000、25,000〜50,000μg/kgの範囲である。単回投与量又は反復投与量は、例えば、1日に複数回、連続する日、隔日、毎週又は断続的に(例えば、毎週2回、1、2、3、4、5、6、7若しくは8週毎に1回、又は2、3、4、5若しくは6ヶ月毎に1回)投与することができる。
例示されたペプチド配列の部分配列、配列変種及び修飾形(例えば、表1-8及び図1に列記された配列)を含む、本発明のペプチド配列を投与することができ、且つ方法は、任意の経路により、全身投与、局部(regional)投与又は局所投与により実践され得る。例えば、ペプチド配列は、非経口(例えば、皮下、静脈内、筋肉内、若しくは腹腔内)、経口(例えば、摂食、口腔内、若しくは舌下)、吸入、皮内、腔内、頭蓋内、経真皮(外用)、経粘膜的又は経直腸投与することができる。例示されたペプチド配列の部分配列、配列変種及び修飾形(例えば、表1-8及び図1に列記された配列)を含む、本発明のペプチド配列、並びに医薬組成物を含む本発明の方法は、(マイクロ)カプセル封入送達システムによるか又は投与のためのインプラントに包装するかで投与することができる。
本発明は更に、例示されたペプチド配列の部分配列、配列変種及び修飾形(例えば、表1-8及び図1に列記された配列)を含む、1又は複数の本発明のペプチド配列、並びに1種以上の医薬として許容し得る又は生理的に許容し得る希釈剤、担体又は賦形剤を含有する、「医薬組成物」を提供する。特定の実施態様において、1又は複数のペプチド配列は、治療的に許容し得る量で存在する。本医薬組成物は、本発明の方法及び使用に従い使用されてよい。従って例えば本医薬組成物は、本発明の治療方法及び使用を実践するために、エクスビボ又はインビボで対象へ投与することができる。
本発明の医薬組成物は、意図された投与方法又は投与経路と適合するように、製剤することができ；投与経路の例は、本明細書に示している。加えて、本医薬組成物は更に、本明細書に開示された他の治療的活性薬剤又は化合物(例えば、グルコース降下剤)、或いは本明細書に示した様々な疾患及び障害の治療又は予防に使用することができる当業者に公知の他の治療的活性薬剤又は化合物を含有してよい。
医薬組成物は典型的には、例示されたペプチド配列の部分配列、配列変種及び修飾形(例えば、表1-8及び図1に列記された配列)を含む、本発明のペプチド配列の少なくとも1種を治療的有効量、並びに1種以上の医薬として及び生理的に許容し得る製剤物質を含有する。好適な医薬として又は生理的に許容し得る希釈剤、担体又は賦形剤としては、抗酸化剤(例えば、アスコルビン酸及び硫酸水素ナトリウム)、保存剤(例えば、ベンジルアルコール、メチルパラベン、エチル又はn-プロピル、p-ヒドロキシ安息香酸エステル)、乳化剤、懸濁化剤、分散剤、溶媒、充填剤、増量剤、緩衝液、媒体、希釈剤、及び／又はアジュバントが挙げられるが、これらに限定されるものではない。例えば、好適な媒体は、恐らく非経口的投与のために医薬組成物において一般的な他の材料を補充した、生理食塩水又はクエン酸緩衝食塩水であってよい。中性の緩衝食塩水又は血清アルブミンと混合した食塩水は、更なる媒体の例である。当業者は、本発明において使用される医薬組成物及び剤形において使用することができる様々な緩衝液を容易に認めるであろう。典型的緩衝液としては、医薬として許容し得る弱酸、弱塩基、又はそれらの混合物が挙げられるが、これらに限定されるものではない。緩衝成分はまた、リン酸、酒石酸、乳酸、コハク酸、クエン酸、酢酸、アスコルビン酸、アスパラギン酸、グルタミン酸、及びそれらの塩などの水溶性材料を含む。
媒体中の主要な溶媒は、事実上水性又は非水性のいずれかであってよい。加えて媒体は、医薬組成物のpH、浸透圧、粘度、無菌性又は安定性を調節又は維持するために、他の医薬として許容し得る賦形剤を含有することができる。特定の実施態様において、医薬として許容し得る媒体は、水性緩衝液である。他の実施態様において、媒体は、例えば塩化ナトリウム及び／又はクエン酸ナトリウムを含む。
本発明の医薬組成物はまた、発明のペプチドの放出速度を調節又は維持するための他の医薬として許容し得る製剤物質を含むことができる。そのような製剤物質は、持続放出製剤の調製において当業者に公知のそれらの物質を含む。医薬として及び生理的に許容し得る製剤物質に関する更なる参照のために、例えば、「レミントン薬科学(Remington's Pharmaceutical Sciences)」、第18版(1990, Mack Publishing社、イーストン、Pa. 18042)、1435-1712頁；「メルクインデックス(The Merck Index)」、第12版(1996, Merck Publishing Group社、ホワイトハウス、NJ)；及び、「固形剤形の医薬原理(Pharmaceutical Principles of Solid Forms)」(1993, Technonic Publishing社、ランカスター、Pa.)を参照されたい。投与に適した追加の医薬組成物は、当該技術分野において公知であり、且つ本発明の方法及び組成物において利用可能である。
医薬組成物は、液剤、懸濁剤、ゲル剤、乳剤、固形剤、又は脱水若しくは凍結乾燥された散剤として、滅菌バイアル中に貯蔵されてよい。そのような組成物は、そのまま使用する形態、使用前に再構成が必要な凍結乾燥された形態、使用前に希釈が必要な液体形態、又は他の許容し得る形態のいずれかで貯蔵されてよい。一部の実施態様において、医薬組成物は、単回使用容器(例えば、単回使用バイアル、アンプル、注射器、又は自動噴射装置(例えばEpiPen(登録商標)に類似したもの))の中で提供されるのに対し、反復使用容器(例えば、反復使用バイアル)が他の実施態様において提供される。インプラント(例えば、埋め込み型ポンプ)及びカテーテルシステムを含む、いずれかの薬物送達装置を使用し、発明のペプチドを送達することができ、これらは両方共当業者に公知である。一般に皮下又は筋肉内に投与されるデポ注射剤も、発明のペプチドを規定された期間にわたり放出するために利用することができる。デポ注射剤は通常、固体-又は油-ベースのいずれかであり、且つ一般に本明細書に示した製剤成分の少なくとも1つを含有する。当業者は、デポ注射剤の可能性のある製剤及び使用について熟知している。
医薬組成物は、その意図された投与経路と適合するように製剤することができる。従って、医薬組成物は、非経口(例えば、皮下(s.c.)、静脈内、筋肉内、又は腹腔内)、皮内、経口(例えば、摂取)、吸入、腔内、頭蓋内、及び経真皮(外用)を含む経路による投与に適した担体、希釈剤、又は賦形剤を含む。
医薬組成物は、無菌の注射用水性又は油性の懸濁剤の形態であってよい。この懸濁剤は、本明細書に開示されたか又は当業者に公知の好適な分散剤又は湿潤剤及び懸濁化剤を用い、製剤されてよい。無菌の注射用調製品はまた、例えば1,3-ブタンジオール中の液剤のように、無毒の非経口的に許容し得る希釈剤又は溶媒中の無菌の注射用液剤又は懸濁剤であってもよい。利用することができる許容し得る希釈剤、溶媒及び分散媒は、水、リンゲル液、等張塩化ナトリウム溶液、クレモフォールEL(商標)(BASF社, Parsippany, NJ)又はリン酸緩衝食塩水(PBS)、エタノール、ポリオール(例えば、グリセロール、プロピレングリコール、及び液体ポリエチレングリコール)、並びにそれらの好適な混合物を含む。加えて、無菌の不揮発性油は、溶媒又は懸濁媒体として従来使用されている。この目的のために、合成モノ-又はジグリセリドを含む、任意の無刺激性の不揮発性油を使用することができる。更にオレイン酸などの脂肪酸の、注射用調製品における使用を認める。特定の注射用製剤の延長された吸収は、吸収を遅延する物質(例えば、アルミニウムモノステアレート又はゼラチン)を含有することにより、実現することができる。
医薬組成物は、例えば、錠剤、カプセル剤、トローチ剤、舐剤、水性若しくは油性懸濁剤、分散可能な散剤若しくは顆粒剤、乳剤、硬若しくは軟カプセル剤、又はシロップ剤、液剤、マイクロビーズ又はエリキシル剤のような、経口使用に適した形態であってよい。経口使用が意図された医薬組成物は、医薬組成物の製造に関して当該技術分野において公知の任意の方法に従い調製することができる。そのような組成物は、医薬として洗練され且つ口当たりの良い調製品を提供するために、甘味剤、香味剤、着色剤及び保存剤などの物質を1種以上含有することができる。発明のペプチドを含有する錠剤は、錠剤の製造に適した無毒の医薬として許容し得る賦形剤との混合物であってよい。これらの賦形剤は、例えば炭酸カルシウム、炭酸ナトリウム、乳糖、リン酸カルシウム又はリン酸ナトリウムなどの、希釈剤；例えばトウモロコシデンプン、又はアルギン酸などの、造粒剤及び崩壊剤；例えばデンプン、ゼラチン又はアカシアゴムなどの、結合剤、並びに例えばステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸又はタルクなどの、滑沢剤を含む。
経口投与に適した錠剤、カプセル剤などは、コーティングされなくてよいか、又はこれらは、胃腸管中での崩壊及び吸収を遅延し、これにより長期にわたる持続作用を提供するために、公知の技術によりコーティングされてよい。例えば、グリセリルモノステアラート又はグリセリルジステアレートなどの時間遅延物質を使用することができる。これらはまた、制御放出のための浸透圧性治療用錠剤を形成するために、当該技術分野において公知の技術によりコーティングされてよい。追加の物質は、投与された組成物の送達を制御するために、ポリエステル、ポリアミン酸、ヒドロゲル、ポリビニルピロリドン、ポリ無水物、ポリグリコール酸、エチレン-酢酸ビニル、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、硫酸プロタミン、又はラクチド/グリコリドコポリマー、ポリラクチド/グリコリドコポリマー、又はエチレン酢酸ビニルコポリマーなどの、生分解性又は生体適合性粒子又は高分子物質を含む。例えば、経口薬剤は、各々、ヒドロキシメチルセルロース又はゼラチン-マイクロカプセル又はポリ(メチルメタクリレート)マイクロカプセル剤を使用する、コアセルベーション技術又は界面重合により調製したマイクロカプセル中に、或いはコロイド薬物送達システム中に捕獲することができる。コロイド分散システムは、高分子複合体、ナノ-カプセル、ミクロスフェア、マイクロビーズ、並びに水中油型エマルジョン、ミセル、混合型ミセル、及びリポソームを含む脂質-ベースのシステムを含む。そのような製剤の調製方法は、当業者に公知であり、且つ市販されている。
経口使用のための製剤はまた、活性成分が例えば炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、カオリン又は微晶質セルロースなどの不活性固形希釈剤と混合されている、硬ゼラチンカプセル剤として、或いは活性成分が水又は油性媒体、例えばピーナッツ油、流動パラフィン、若しくはオリーブ油と混合されている、軟ゼラチンカプセル剤としても提示される。
水性懸濁剤は、それらの製造に適した賦形剤との混合物中に活性物質を含有する。そのような賦形剤は、例えばカルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシ-プロピルメチルセルロース、アルギン酸ナトリウム、ポリビニル-ピロリドン、トラガカントガム及びアカシアゴムなどの懸濁化剤であり；分散剤又は湿潤剤は、天然のホスファチド、例えばレシチン、又はアルキレン酸化物の脂肪酸との縮合生成物、例えばポリオキシ-エチレンステアレート、又はエチレンオキシドの長鎖脂肪アルコールとの縮合生成物、例えばヘプタデカエチレンオキシセタノール、又はエチレンオキシドの脂肪酸及びヘキシトール由来の部分エステルとの縮合生成物、例えばポリオキシエチレンソルビトールモノオレエートなど、又はエチレンオキシドの脂肪酸及びヘキシトール無水物由来の部分エステルとの縮合生成物、例えばポリエチレンソルビタンモノオレエートであってよい。この水性懸濁剤は、1種以上の保存剤を含有することもできる。
油性懸濁剤は、活性成分を、植物油、例えば落花生油、オリーブ油、ゴマ油若しくはココナツ油、又は流動パラフィンなどの鉱油中に懸濁することにより、製剤することができる。油性懸濁剤は、増粘剤、例えば蜜ろう、固形パラフィン又はセチルアルコールなどを含有することができる。先に示したもののような甘味剤、及び香味剤を添加し、口当たりの良い経口調製品を提供することができる。
水の添加による水性懸濁液の調製に適した分散可能な散剤及び顆粒剤は、分散剤又は湿潤剤、懸濁化剤及び1種以上の保存剤との混合物中の活性成分を提供する。好適な分散剤又は湿潤剤及び懸濁化剤は、本明細書に例示されている。
本発明の医薬組成物はまた、水中油型エマルジョンの形態であることができる。油相は、植物油、例えばオリーブ油若しくは落花生油、又は鉱油、例えば流動パラフィン、又はそれらの混合物であってよい。好適な乳化剤は、天然のガム、例えばアカシアゴム又はトラガカントガム；天然のホスファチド、例えば大豆、レシチン、及び脂肪酸由来のエステル若しくは部分エステル；ヘキシトール無水物、例えばソルビタンモノオレエート；並びに、部分エステルのエチレンオキシドとの縮合生成物、例えばポリオキシエチレンソルビタンモノオレアートであってよい。
医薬組成物はまた、インプラント、リポソーム、ヒドロゲル、プロドラッグ及びマイクロカプセル封入された送達システムを含む、制御放出製剤などの、迅速な分解又は体からの排泄に対し、組成物を保護するための担体を含有することができる。例えば、グリセリルモノステアラート若しくはステアリン酸グリセリルの単独での、又はワックスとの組合せなどの遅延物質を使用することができる。注射用医薬組成物の延長された吸収は、例えばアルミニウムモノステアレート又はゼラチンなどの、吸収を遅延する物質を含有することにより実現することができる。微生物の作用の防止は、様々な抗菌剤及び抗真菌剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなどにより実現することができる。
本発明はまた、直腸投与のための坐剤の形態で、発明のペプチドを含んでいる。坐剤は、発明のペプチドを、常温では固形であるが、直腸温度では液体であり、従って直腸内で溶融し、薬物を放出する好適な非刺激性の賦形剤と混合することにより調製することができる。そのような材料は、カカオバター及びポリエチレングリコールを含むが、これらに限定されるものではない。
本発明に従い、実質的肝細胞癌(HCC)活性を伴わずにグルコース降下活性を有するペプチド(又は本明細書に示した部分配列、変種又は修飾形)を同定する方法が提供される。一実施態様において、方法は、ペプチド配列(又は本明細書に示した部分配列、変種又は修飾形)をグルコース降下活性についてスクリーニングする(例えば、アッセイするか又は測定する)こと；並びに、ペプチド配列(又は本明細書に示した部分配列、変種又は修飾形)をHCC活性、又はHCC活性に相関するマーカーの発現についてスクリーニングする(例えば、アッセイするか又は測定する)こと：を含む。グルコース降下活性及びそれにより低下されたか又は存在しないHCC活性を有するペプチドは、該ペプチドと同定する。特定の態様において、HCC活性と相関するマーカーは、脂質プロファイルを含み−FGF19と比べより少ない脂質増加活性を有するペプチドは、該ペプチドがHCC活性を低下したか又は活性が存在しないことを指摘し；或いは、HCC活性と相関するマーカーは、アルド-ケト還元酵素遺伝子発現を含み−FGF19と比べアルド-ケト還元酵素遺伝子発現をダウンレギュレート又は減少するペプチドは、該ペプチドがHCC活性を低下したか又は活性が存在しないことを指摘し；或いは、HCC活性のマーカー指標は、Slc1a2遺伝子発現を含み−FGF19と比べSlc1a2遺伝子発現をアップレギュレート又は増加するペプチドは、該ペプチドがHCC活性を低下したか又は活性が存在しないことを指摘している。
用語「アッセイする」及び「測定する」及びそれらの文法上の変形は、本明細書において互換的に使用され、且つ定性的決定若しくは定量的決定のいずれか、又は定性的決定及び定量的決定の両方をいう。これらの用語が検出に関して使用される場合、本明細書に示し且つ当該技術分野において公知の様々な方法を含む、相対量を確定する任意の手段が意図されている。例えば、遺伝子発現は、ノーザンブロット、ウェスタンブロット、免疫沈降アッセイによるか、又は発現されたタンパク質(例えば、アルド-ケト還元酵素若しくはSlc1a2)の活性、機能若しくは量を測定することにより、アッセイ又は測定することができる。
最も一般的な肝臓癌型であるHCCのリスク因子は、II型糖尿病(恐らく肥満症により増悪)を含む。II型糖尿病におけるHCCのリスクは、糖尿病の期間及び治療プロトコールに応じて、より大きくなる(非-糖尿病性リスクの〜2.5倍から〜7倍まで)。
様々な方法論を、HCCのスクリーニング及び診断において使用することができ、且つこれらは当業者に周知である。HCCの指標は、α-フェトプロテイン(AFP)又はdes-γカルボキシプロトロンビン(DCP)の上昇したレベルなどの、腫瘍マーカーの検出を含む。超音波、CT走査及びMRIを含む、多くの様々な走査技術及び造影技術も助けとなる。本発明に関して、ペプチド(例えば候補ペプチド)はHCC誘導の証拠を示すかどうかの評価は、例えば、野生型FGF19によるHCC結節の形成と比べ、ペプチドを投与したdb/dbマウスなどの動物モデルにおけるHCC結節形成を定量することにより、インビボおいて決定することができる。巨視的に、肝臓癌は、腫瘍結節(円形から楕円形の、灰色又は緑色の、境界がはっきりしているが被嚢されていない)が、1つの大きい塊又は複数の比較的小さい塊のいずれかとして出現する、結節性である。或いは、HCCは、拡散性であり且つ境界がはっきりせず且つ頻繁に門脈に浸潤している、浸潤性腫瘍として存在することができる。
1つ以上の前記技術の結果が、恐らくHCCが存在することを示した後で、肝組織試料の病理学的評価が一般に行われる。従って、ペプチド配列がHCC誘導の証拠を示すかどうかを決定するために、本発明の方法は更に、HCC試験において有用なインビボ動物モデル(例えばdb/dbマウス)由来の肝組織試料を評価することを含んでよい。顕微鏡評価により、病理学者は、HCCの4種の一般的構造的及び細胞学的型(パターン)のひとつが存在するかどうか(すなわち、線維層板型、偽腺状(腺様)、多形型(巨細胞)及び明細胞)を決定することができる。
本発明はまた、例示されたペプチド配列の部分配列、配列変種及び修飾形(例えば、表1-8及び図1に列記された配列)を含む本発明のペプチド配列に結合する抗体、及びそれらの断片の産生及び使用を含む。
本明細書において使用する用語「抗体」(Ab)及び「免疫グロブリン」(Ig)は、同じ構造特徴を有する糖タンパク質をいう。抗体は、抗原への結合特異性を示すが、免疫グロブリンは、抗体及び抗原特異性を欠くことがある他の抗体-様分子の両方を含む。
用語「抗体」は、それらが所望の生物活性を示すことを条件として、無傷のモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、少なくとも2つの無傷の抗体から形成された多重特異性抗体(例えば、二重特異性抗体)、並びにFab及びF(ab)'2を含む抗体結合断片を含む。基本的抗体構造単位は、四量体を含み、且つ各四量体は、2つの同一のポリペプチド鎖対により構成され、各対は、1本の「軽」鎖(約25kDa)及び1本の「重」鎖(約50〜70kDa)を有する。各鎖のアミノ末端部分は、抗原認識に主に寄与する約100〜110個又はそれよりも多いアミノ酸の可変領域を含む。対照的に、各鎖のカルボキシ末端部分は、エフェクター機能に主に寄与する定常領域を規定する。ヒト軽鎖は、κ及びλ軽鎖として分類されるのに対し、ヒト重鎖は、μ、λ、γ、α、又はεとして分類され、各々、抗体アイソタイプをIgM、IgD、IgA、及びIgEとして規定する。結合断片は、組換えDNA技術により、又は無傷の抗体の酵素的若しくは化学的切断により作製される。結合断片は、Fab、Fab'、F(ab')2、Fv、及び1本鎖抗体を含む。
各重鎖は、1つの末端で可変ドメイン(VH)に続けていくつかの定常ドメインを有する。各軽鎖は、1つの末端に可変ドメイン(VL)及びその他端に定常ドメインを有し；軽鎖の定常ドメインは、重鎖の第一の定常ドメインと並置され、且つ軽鎖可変ドメインは、重鎖の可変ドメインと並置される。軽鎖及び重鎖内で、可変領域及び定常領域は、約12個以上のアミノ酸の「J」領域により連結され、また重鎖は、約10個以上のアミノ酸の「D」領域を含む。これらの抗体鎖は全て、3つの超可変領域に連結された、比較的保存されたフレームワーク領域(FR)の同じ全体構造を示し、これらは全て相補性決定領域又はCDRと称される。各対の2本鎖のCDRは、フレームワーク領域により並置され、特異的エピトープへ結合することが可能である。軽鎖及び重鎖の両方は、N-末端からC-末端へ、ドメインFR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3及びFR4を含む。
無傷の抗体は、2つの結合部位を有し、且つ二価抗体又は二重特異性抗体以外は、2つの結合部位は同じである。二重特異性抗体又は二価抗体は、2つの異なる重鎖／軽鎖対及び2つの異なる結合部位を有する人工のハイブリッド抗体である。二重特異性抗体は、ハイブリドーマの融合又はFab'断片の連結を含む、様々な方法により作製することができる。
本明細書において使用される用語「モノクローナル抗体」とは、実質的に相同な抗体の集団から得られた抗体をいい、すなわちその集団を構成する個々の抗体は、少量で存在し得る可能性のある天然の突然変異以外は、同一である。モノクローナル抗体は、高度に特異性があり、単独の抗原性部位に対して向けられる。異なる決定基(エピトープ)に対し向けられる異なる抗体を含むポリクローナル抗体調製品とは対照的に、各モノクローナル抗体は、抗原上の単独の決定基に対し向けられている。
「中和抗体」は、それが結合する標的抗原のエフェクター機能を除外又は有意に低下することができる抗体分子である。
抗体結合断片は、無傷の抗体の酵素的又は化学的切断により産生することができる。酵素パパインによる抗体の消化は、「Fab」断片としても公知の2つの同一の抗原-結合断片と、抗原-結合活性を有さない「Fc」断片を生じる。酵素ペプシンによる抗体の消化は、抗体分子の2つのアームが依然連結され且つ2つの抗原結合部位を含むF(ab')2 断片を生じる。F(ab')2断片は、抗原と架橋する能力を有する。
用語「Fab」は、軽鎖の定常ドメイン及び重鎖のCH1ドメインを含む抗体の断片をいう。本明細書において使用される用語「Fv」は、抗原-認識部位及び抗原-結合部位の両方を維持している抗体の最小断片をいう。2本鎖Fv種において、この領域は、非共有的に会合している、1本の重鎖及び1本の軽鎖可変ドメインの二量体からなる。1本鎖Fv種において、1本の重鎖及び1本の軽鎖可変ドメインは、可動性ペプチドリンカーにより共有的に連結され、その結果軽鎖及び重鎖は、2本鎖Fv種中のものに類似した「二量体」構造で会合することができる。各可変ドメインの3つのCDRが相互作用し、VH-VL二量体の表面上の抗原-結合部位を規定することは、この立体配置においてである。6つのCDRは集合的に抗体に抗原-結合特異性を付与するが、単独の可変ドメイン(又は抗原に対し特異性のあるわずかに3つのCDRを含むFvの半分)であっても、抗原を認識し且つ結合する能力を有する。
用語「相補性決定領域」又は「CDR」とは、特異的リガンドとの接触をもたらし、且つその特異性を決定する、免疫受容体の一部をいう。用語「超可変領域」とは、抗原-結合に寄与する抗体のアミノ酸残基をいう。超可変領域は一般に、「相補性決定領域」若しくは「CDR」由来のアミノ酸残基及び／又は「超可変ループ」由来のそれらの残基を含む。
本明細書において使用される用語「エピトープ」とは、タンパク質抗原上の抗体への結合部位をいう。エピトープ決定基は通常、アミノ酸又は糖鎖などの分子の化学的に活性のある表面集団(groupings)に加え、特異的三次元構造及び電荷の特徴からなる。抗体は、解離定数が≦1μM、好ましくは≦100nM、及び最も好ましくは≦10nMである場合に、抗原に結合するといわれる。増大した平衡定数("KD")とは、エピトープと抗体の間により低い親和性が存在することを意味するのに対し、減少した平衡定数とは、エピトープと抗体の間により高い親和性が存在することを意味する。特定量以下のKDを伴う抗体とは、その抗体が、所定のKD又はそれよりも強力にエピトープへ結合することを意味する。KDは、エピトープと抗体の結合特徴を説明するが、「効力」は、抗体の機能に関する抗体それ自身の有効性を説明する。平衡定数と効力の間に、必ずしも相関関係は存在せず；従って例えば、相対的に低いKDは、高い効力を自動的に意味しない。
抗体に関して用語「選択的結合」とは、抗体が単独の物質へのみ結合することを意味するのではなく、第一の物質への該抗体のKDが、第二の物質への該抗体のKD未満であることを意味する。エピトープへ排他的に結合する抗体は、その単独のエピトープへのみ結合する。
ヒトへ投与される場合、齧歯類(マウス又はラット)の可変領域及び／又は定常領域を含む抗体は、例えば、体からの迅速なクリアランス、又は抗体に対する体の免疫応答の発生と時には関連付けられる。齧歯類由来の抗体の利用を避けるために、完全ヒト抗体を、ヒト抗体機能の齧歯類への導入により作製することができ、その結果該齧歯類は完全ヒト抗体を産生する。本明細書においては具体的に同定されないが、「ヒト」抗体と「完全ヒト」抗体は、本明細書において互換的に使用することができる。用語「完全ヒト」は、部分的にのみヒトである抗体を、全面的にヒト又は完全にヒトである抗体から識別する場合に有用であり得る。当業者は、完全ヒト抗体作製の様々な方法を知っている。
可能性のあるヒト抗-マウス抗体反応に対処するために、キメラ抗体又は他のヒト化抗体を利用することができる。キメラ抗体は、ヒト定常領域及びマウスの可変領域を有し、そのためヒト抗-キメラ抗体反応は、一部の患者において認められる。従って、可能性のあるヒト抗-マウス抗体反応又はヒト抗-キメラ抗体反応を避けるために、多量体酵素に対する完全ヒト抗体を提供することは有利である。
完全ヒトモノクローナル抗体は、例えば、当業者に公知の技術によるハイブリドーマ細胞株の作製により、調製することができる。他の調製方法は、CHO細胞などの、好適な哺乳動物の宿主細胞の形質転換のための特定の抗体をコードしている配列の使用に関与している。形質転換は、例えば、ウイルス内の(又はウイルスベクターへの)ポリヌクレオチドのパッケージング、及びウイルス(又はベクター)による宿主細胞の形質導入を含む、ポリヌクレオチドを宿主細胞へ導入するためのいずれか公知の方法によるか、又は当該技術分野において公知のトランスフェクション手順によることができる。異種ポリヌクレオチドを哺乳動物細胞へ導入する方法は、当該技術分野において周知であり、且つデキストラン-媒介性トランスフェクション、リン酸カルシウム沈降、ポリブレン-媒介性トランスフェクション、プロトプラスト融合、電気穿孔法、リポソーム中のポリヌクレオチドの封入、及びDNAの核への直接微量注入を含む。発現のための宿主として利用可能な哺乳動物細胞株は、当該技術分野において周知であり、CHO細胞、HeLa細胞、及びヒト肝細胞性癌細胞を含むが、これらに限定されない。
抗体は、診断及び／又は治療に使用することができる。例えば、抗体は、対象における本発明の1種以上のペプチドのレベルを検出し、且つ検出されたレベルを、標準対照レベル又は予め(例えば、何らかの罹患以前に)決定された対象におけるベースラインレベルのいずれかと比較することにより、診断薬として使用することができる。抗体は、1種以上の本発明のペプチドの活性を調節する治療薬として使用することができ、これにより状態又は障害に対する効果を有する。
本発明は、好適な包装材料に包装された、本発明のペプチド配列を、1種以上の治療薬、それらの組成物及び医薬組成物と任意に組合せて備えるが、これらに限定されるものではない、キットを提供する。キットは任意に、成分の説明又はその中の成分のインビトロ、インビボ、若しくはエクスビボにおける使用に関する指示を含む、ラベル又は添付文書を備える。指示の例は、血液グルコースの低下又は降下、高血糖症の治療、糖尿病の治療などに関する指示を含む。
キットは、例えば、2種以上のペプチド配列の単独で、又はペプチド配列の別の治療的に有用な組成物(例えば、ガストリン化合物などの抗-糖尿病薬)との組合せなど、そのような成分の集合を含むことができる。
用語「包装材料」とは、キットの成分を収容している物理的構造をいう。包装材料は、成分の無菌性を維持することができ、且つそのような目的のために通常使用される材料(例えば、紙、段ボール、ガラス、プラスチック、箔、アンプル、バイアル、チューブなど)で製造することができる。
本発明のキットは、ラベル又は添付文書を備えることができる。ラベル又は添付文書は、個別の、又は成分、キット若しくは包装材料(例えば箱)に付属された、又は例えばキット成分を含むアンプル、チューブ若しくはバイアルに付着された、「印刷物」、例えば紙又は厚紙を含む。ラベル又は添付文書は加えて、ディスク(例えば、ハードディスク、カード、メモリーディスク)、CD-若しくはDVD-ROM/RAM、DVD、MP3などの光学ディスク、磁気テープ、又はRAM及びROMなどの電子記憶媒体、又は磁気/光学記憶媒体などのこれらのハイブリッド、FLASH媒体又はメモリー型カードなどの、コンピュータで読み取り可能な媒体を含むことができる。
ラベル又は添付文書は、その中の1種以上の成分、投与量、活性成分の作用機序、薬物動態及び薬力学を含む臨床薬理の情報を確定することを含むことができる。ラベル又は添付文書は、製造業者の情報、ロット番号、製造業者の住所及び製造日時を確定する情報を含むことができる。
ラベル又は添付文書は、そのためにキットの成分が使用される状態、障害、疾患又は症状に関する情報を含むことができる。ラベル又は添付文書は、方法、治療プロトコール又は治療的レジメンにおいて1種以上のキット成分を使用する、臨床医に関する又は対象に関する指示を含むことができる。指示は、投薬の量、頻度又は期間、並びに本明細書に示した方法、治療プロトコール又は治療的レジメンのいずれかの実践に関する指示を含むことができる。指示の例は、本明細書に示したペプチド配列の治療又は使用に関する指示を含む。従って本発明のキットは追加的に、治療方法及び使用を含む本明細書に説明する本発明の方法及び使用のいずれかの実践に関するラベル又は指示を含むことができる。
ラベル又は添付文書は、予防的又は治療的恩恵などの、成分が提供することができるあらゆる恩恵に関する情報を含むことができる。ラベル又は添付文書は、特定の組成物の使用に適切でないような状況に関する対象又は臨床医への警鐘などの、可能性のある有害副作用に関する情報を含むことができる。有害副作用はまた、対象が、本組成物との不適合であり得る1種以上の他の医薬品の服用を有する、今後服用するか又は現在服用している場合、或いは対象が、該組成物と不適合である別の治療プロトコール又は治療的レジメンを有する、今後受けるか又は現在受けている場合に起こり得、その結果指示は、そのような不適合に関する情報を含むことができる。
発明のキットは加えて、他の成分を含むことができる。キットの各成分は、個別の容器に封入され、且つ様々な容器は全て単独の包装内にあることができる。発明のキットは、冷蔵のためにデザインされることができる。発明のキットは更に、本発明のペプチド配列を含むか、又はペプチド配列をコードしている核酸を含むようにデザインすることができる。キット内の細胞は、使用時まで、適切な貯蔵条件下で維持することができる。
別に規定しない限りは、本明細書において使用する全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の業者により通常理解されるものと同じ意味を有する。本明細書において説明した方法及び材料に類似した又は同等の方法及び材料を、本発明の実践又は試験に使用することができるが、好適な方法及び材料を本明細書に説明している。
本明細書に引用した全ての出願、刊行物、特許及び他の参考文献、GenBank引用及びATCC引用は、それらの全体が引用により組み込まれている。矛盾する場合、定義を含む本明細書が支配するであろう。本明細書に使用する単数形「ある(a, an, the)」は、別に文脈が明確に指示しない限りは、複数の言及を含む。従って例えば、「あるペプチド配列」又は「ある治療」の言及は、そのような配列、治療の複数を含むなどである。
本明細書において使用する数値は、本文書を通じ範囲の形式で提示されることが多い。範囲の形式の使用は、単に便宜上且つ簡潔さのためであり、別に文脈が明確に指示しない限りは、本発明の範囲の変動限界として解釈されるべきではない。従って、別に文脈が明確に指示しない限りは、範囲の使用は明確に、全ての可能性のある部分範囲、その範囲内の個々の数値全て、並びにそのような範囲内の整数及び範囲内の値の分数又は整数を含む全ての数値又は数値範囲を含む。範囲の幅に拘わらず、且つ本特許文書を通じた全ての文脈において、この解釈(construction)が適用される。従って例えば90〜100％の範囲の言及は、91〜99％、92〜98％、93〜95％、91〜98％、91〜97％、91〜96％、91〜95％、91〜94％、91〜93％などを含む。90〜100％の範囲の言及はまた、91％、92％、93％、94％、95％、95％、97％など、更には91.1％、91.2％、91.3％、91.4％、91.5％など、92.1％、92.2％、92.3％、92.4％、92.5％など、及びそれに類するものも含む。
加えて、1〜3、3〜5、5〜10、10〜20、20〜30、30〜40、40〜50、50〜60、60〜70、70〜80、80〜90、90〜100、100〜110、110〜120、120〜130、130〜140、140〜150、150〜160、160〜170、170〜180、180〜190、190〜200、200〜225、225〜250の範囲の言及は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20などを含む。更なる例において、25〜250、250〜500、500〜1000、1000〜2500又は2500〜5000、5000〜25,000、5000〜50,000の範囲の言及は、例えば、25、26、27、28、29・・・、250、251、252、253、254・・・、500、501、502、503、504・・・などの任意の数値又はその中の若しくはそのような数値を包含する範囲を含む。
同じく本明細書において使用されるように、連続する範囲が、本文書を通じて明らかにされる。連続する範囲の使用は、別の範囲を提供するための上側の範囲及び下側の範囲の組合せを含む。範囲の幅に拘わらず、且つ本特許文書を通じて全ての文脈において、この解釈が適用される。従って、例えば5〜10、10〜20、20〜30、30〜40、40〜50、50〜75、75〜100、100〜150などの連続する範囲の言及は、5〜20、5〜30、5〜40、5〜50、5〜75、5〜100、5〜150、及び10〜30、10〜40、10〜50、10〜75、10〜100、10〜150、及び20〜40、20〜50、20〜75、20〜100、20〜150などの範囲、及びそれに類するものを含む。
簡潔さを助けるために、ある種の略語を本明細書において使用する。一例は、アミノ酸残基を表す1文字略語である。アミノ酸及びそれらの対応する3文字及び1文字略語を、以下に示す：
Figure 0006254524
本発明は概して、多くの実施態様を説明するために肯定的文体を用い、本明細書において明らかにされている。本発明はまた具体的には、物質又は材料、方法の工程及び条件、プロトコール、手順、アッセイ又は分析などの、特定の対象物が、完全に又は一部除外されている実施態様を含む。従って、本発明は概して本発明が含まないものに関しては本明細書において記載しないが、それにもかかわらず本発明に明確に含まれない態様が、本明細書において開示されている。
本発明の多くの実施態様が説明されている。それにもかかわらず、本発明の精神及び範囲から逸脱しない限りは、様々な変更を行うことができることは理解されるであろう。従って以下の実施例は、請求項に説明された本発明の範囲を例示することを意図しており、範囲を限定することを意図するものではない。
(実施例)
(実施例1)
下記は、本明細書の試験において使用した様々な方法及び材料の説明である。
(動物) db/dbマウスは、Jackson Laboratory社(バーハーバー、ME)から購入した。マウスは、管理光(12時間明及び12時間暗のサイクル、暗午後6:30〜午前6:30)、温度(22±4℃)及び湿度(50％±20％)の条件下で、動物の福祉に関する指針(welfare guidelines)に従い飼育した。これらは、自在に水(オートクレーブにかけた蒸留水)を摂取し、且つ脂肪17kcal％、タンパク質23kcal％及び炭水化物60kcal％を含有する市販の飼料(Harlan Laboratories社、インディアナポリス、IN、Irradiated 2018 Teklad Global 18％ Protein Rodent Diet)を自由に摂食した。食餌が誘導した肥満症に関しては、C57BL6/Jマウス(Jackson Laboratory社)を、脂肪60kcal％、タンパク質20kcal％及び炭水化物20kcal％を含有する高脂肪食(D12492, Research Diet社、ニューブランズウィック、NJ、米国)で、16〜20週間飼育した。全ての動物試験は、NGM施設内動物の福祉と使用に関する委員会(IACUC)により承認された。
(DNA配列及びアミノ酸配列) ヒトFGF19(ホモサピエンスFGF19、GenBank寄託番号NM_005117.2)変種をコードしているORFのcDNA。
(cDNA(GenBank寄託番号NP_005108.1)によりコードされたタンパク質配列)
(PCR) FGF19 ORFを、ヒト小腸組織から調製した組換えDNA(cDNA)を用い、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)により増幅した。Phusion高忠実度DNAポリメラーゼの入ったPCR試薬キットは、New England BioLabs社(F-530L、イプスウィック、MA)から購入した。下記のプライマーを使用した：フォワードPCRプライマー：5' CCGACTAGTCACCatgcggagcgggtgtgtgg、及びリバースPCRプライマー：5' ATAAGAATGCGGCCGCTTACTTCTCAAAGCTGGGACTCCTC。
増幅されたDNA断片を、制限酵素SpeI及びNotIにより消化し(これらの制限部位は、各々5'又は3'PCRプライマーに含まれた)、その後同じ制限酵素で消化したAAV導入遺伝子ベクターにライゲーションした。発現に使用したベクターは、選択マーカー、並びにクローニングされたコード配列の挿入部位の5'側の強力な真核生物プロモーター、それに続く3'側の非翻訳領域及びウシ成長ホルモンのポリアデニル化した尾部で構成された発現カセットを含んだ。この発現構築体はまた、5'末端及び3'末端に、内部末端反復が側方に位置した。
(AAVの生成及び精製) AAV293細胞(Agilent Technologies社、サンタクララ、CAから入手)を、10％ウシ胎仔血清及び1×抗生物質-抗真菌溶液(Mediatech社、マナサス、VA)を補充したダルベッコ改変イーグル培地(DMEM、Mediatech社、マナサス、VA)において培養した。これらの細胞を、1日目に、150mm細胞培養プレートに、密度50％で播種し、且つ2日目に、以下の3種のプラスミド(各々20μg/プレート)により、リン酸カルシウム沈降法を用いトランスフェクションした：AAV導入遺伝子プラスミド、pHelperプラスミド(Agilent Technologies社)及びAAV2/9プラスミド(Gaoらの文献、J. Virol. 78:6381 (2004))。トランスフェクションの48時間後、細胞をプレートから掻取り、3000×gの遠心分離によりペレット化し、20mMトリス(pH8.5)、100mM NaCl及び1mM MgCl2を含有する緩衝液中に再懸濁させた。この懸濁液を、アルコールドライアイス浴中で凍結し、その後37℃の水浴中で解凍した。この凍結及び解凍サイクルを、3回繰り返し；Benzenase(Sigma-aldrich社、セントルイス、MO)を50ユニット/mlで添加し；デオキシコール酸を、最終濃度0.25％で添加した。37℃で30分間インキュベーションした後、細胞デブリを、5000×gで20分間の遠心分離によりペレット化した。上清中のウイルス粒子を、先に説明された様な(Zolotukhin S.らの文献、(1999) Gene Ther. 6:973)不連続イオジキサナール(Sigma-aldrich社、セントルイス、MO)勾配を用いて精製した。ウイルスストックを、Vivaspin 20(MWカットオフ100,000ダルトン、Sartorius Stedim Biotech社、オーバーニュ、仏国)を用いて濃縮し、且つ10％グリセロールを含むリン酸-緩衝食塩水(PBS)中に再懸濁し、-80℃で貯蔵した。ウイルスゲノムコピー数を決定するために、ウイルスストック2μlを、50ユニット/ml Benzonase、50mMトリス-HCl(pH7.5)、10mM MgCl2、及び10mM CaCl2を含有する溶液6μl中で、37℃で30分間インキュベーションした。
その後、2mg/mlプロテイナーゼK、0.5％ SDS及び25mM EDTAを含有する溶液15μlを添加し、この混合物を、55℃で、更に20分間インキュベーションし、ウイルスDNAを放出させた。ウイルスDNAを、ミニDNeasyキット(Qiagen社、バレンシア、CA)によりクリーニングし、且つ水40μlにより溶離した。ウイルスゲノムコピー(GC)は、定量的PCRを用いて決定した。
ウイルスストックを、PBSにより、望ましいGC/mlまで希釈した。ウイルス試験溶液(200μl)を、尾静脈注射によりマウスへ送達した。
(血液グルコースアッセイ) マウス尾断片(tail snip)中の血液グルコースを、ACCU-CHEK Activeメーターにより読み取るACCU-CHEK Active試験小片(Roche Diagnostics社、インディアナポリス、IN)を用い、製造業者の指示に従い測定した。
(脂質プロファイルアッセイ) マウス尾断片由来の全血を、平面の(plain)キャピラリーチューブ(BD Clay Adams SurePrep、Becton Dickenson社、スパークス、MD)に収集した。血清及び血液細胞を、Autocrit Ultra 3(Becton Dickinson社、スパークス、MD)においてチューブを回転することにより分離した。血清試料を、脂質プロファイル(トリグリセリド、総コレステロール、HDL、及び非-HDL)について、Integra 400 Clinical Analyzer(Roche Diagnostics社、インディアナポリス、IN)を、製造業者の指示に従い用いアッセイした。
(血清FGF19/FGF21/変種曝露レベルアッセイ) マウス尾断片由来の全血液(約50μl/マウス)を、平面のキャピラリーチューブ(BD Clay Adams SurePrep、Becton Dickenson社、スパークス、MD)に収集した。血清及び血液細胞を、Autocrit Ultra 3(Becton Dickinson社、スパークス、MD)においてチューブを回転することにより分離した。血清中のFGF19、FGF21、及び変種の曝露レベルを、EIAキット(Biovendor社)を製造業者の指示に従い用い、決定した。
(肝細胞癌(HCC)アッセイ) 肝臓標本を、AAV注射後6ヶ月のdb/dbマウスから採取した。HCCスコアを、変種-注射したマウス由来の全肝臓の表面上のHCC結節の数を、野生型FGF19-注射したマウス由来のHCC結節の数で除算し、記録した。
(肝臓遺伝子発現アッセイ) 肝臓標本を採取し、Trizol試薬(Invitrogen社)中でホモジナイズした。総RNAを製造業者の指示に従い抽出した。RNAを、DNase(Ambion社)で処理し、引き続きTaqmanプライマー及びApplied Biosystems社からの試薬を用い、定量的RT-PCRで分析した。肝臓中のアルド-ケト還元酵素及びslc1a2の相対mRNAレベルを、ΔΔCt法を用いて計算した。
(FGFR4結合及び活性アッセイ) 固相ELISA(結合)アッセイ及びERKリン酸化アッセイを、精製された組換えタンパク質を用いて行った。FGFR結合アッセイは、固相ELISAを用いて行った。簡単に述べると、96ウェルプレートを、2ug/ml抗-hFc抗体によりコーティングし、且つ1ug/ml FGFR1-hFc又はFGFR4-hFcと一緒にインキュベーションした。1ug/ml可溶性b-klotho及び20ug/mlヘパリンの存在下でのFGF19変種への結合を、ビオチニル化された抗-FGF19抗体(0.2ug/mL)、引き続きストレプトアビジン-HRPインキュベーション(100ng/mL)により検出した。FGFR4活性化アッセイに関して、Hep3B細胞を、FGF19変種により、37℃で10分間刺激し、その後直ちに溶解し、且つCis-Bio社から市販されているキットを用い、ERKリン酸化についてアッセイした。
(実施例2)
下記は、FGF19及びFGF21の様々な配列変種、並びにFGF19/FGF21融合体の構築体のグルコース降下活性を示す試験の説明である。
図2は、例示的FGF19/FGF21融合体の構築体、並びに該融合体ペプチドに存在するFGF19及びFGF21の各々由来のセグメントを図示している。これらのペプチドは、グルコース降下活性及び統計学的に有意な脂質上昇又は増加活性について分析した(表1-8及び図1)。
マウス(db/db)に、FGF19、FGF21又は変種を発現しているウイルスベクターを注射し、注射後分析した。各配列のグルコース-降下活性は、「+」符合で表した(「-」符合はグルコース降下活性なしを意味し、「+/-」符合は、変種が最低のグルコース-降下活性を維持することを意味する)；脂質上昇活性は、「+」符合により表した(「-」符合は、脂質上昇活性がないことを意味し、「+/-」符合は、変種が最低の脂質-上昇活性を維持することを意味する、図2)。
変種M5及び変種45(M45)と記したFGF21及びFGF19の2種の融合体は、グルコース降下活性を示し、統計学的に有意な脂質上昇又は増加活性は存在しなかった。同じくM1、M2及びM69と記した変種(図1)は、各々、グルコース降下活性を示した(図3B及び3C、表5)。FGF19及びFGF21に対する、M5、M1、M2及びM69のグルコース降下活性及び脂質上昇又は増加活性を比較するデータは、図3A-3C及び4A-4Cに図示した。
(実施例3)
下記は、肝細胞癌(HCC)形成により決定された、変種M5、M1、M2及びM69は腫瘍形成性でないこと、並びに変種M5、M2及びM69は同じく、除脂肪筋肉量及び脂肪量を低下しないことを示す試験の説明である。
動物(db/db)には、FGF19、FGF21、M5、M1、M2、又はM69を発現しているAAVベクターを注射するか、又は食塩水を注射し、注射後6ヶ月で分析した。データは、変種M5、M1、M2、及びM69は、(HCC)形成を有意に誘導しなかったことを示す(図5A-5C)。
動物(db/dbマウス)にも、FGF19、FGF21、M5、M1、M2、又はM69を発現しているウイルスベクターを注射するか、又は食塩水を注射し、除脂肪量及び脂肪量に対する効果について注射後6ヶ月で分析した。データは、FGF21とは対照的に、M5、M2及びM69ペプチドは、除脂肪量又は脂肪量の統計学的に有意な低下を引き起こさなかったこと、並びにM1ペプチドは、除脂肪量を低下したことを示す(図6A-6C)。
(実施例4)
下記は、脂質上昇活性及び腫瘍形成性について分析した25種の追加の変種ペプチドのデータのまとめである。このデータは明らかに、db/dbマウスにおける肝細胞癌(HCC)形成により決定した場合の、脂質上昇と腫瘍形成性の間の正の相関を示している。
表1〜3は、26種の異なる変種ペプチドに関するデータをまとめている。そのような例示された変種ペプチドは、C-末端位置に、例えば「TSG」アミノ酸残基の後に、下記のFGF19 C-末端配列を有する：
Figure 0006254524
 。注目すべきは、統計学的に有意な脂質上昇を引き起こさなかった変種ペプチド(合計7種、M5を含む)は、肝細胞癌(HCC)形成を誘導しなかった。対照的に、統計学的に有意な脂質上昇を引き起こした全ての変種ペプチド(合計17種)は、マウスにおける肝細胞癌(HCC)形成も引き起こした。このデータは、脂質上昇活性と肝細胞癌(HCC)形成の間に強い正の相関が存在することを示している。従って、脂質上昇活性を、動物における肝細胞癌(HCC)形成の指標及び／又は予測因子として使用することができる。
Figure 0006254524
Figure 0006254524
Figure 0006254524
(実施例5)
下記は、グルコース降下活性及び脂質上昇活性について分析した追加のFGF19変種ペプチドのデータのまとめである。
表4は、M5からM40と記されている、35種の追加のFGF19変種のペプチド「コア配列」を図示している。そのような例示された変種ペプチドは、C-末端位置に、例えばコア配列の「TSG」アミノ酸残基の後に、下記のFGF19 C-末端配列を有する：
Figure 0006254524
 。このデータは明らかに、変種M6、M7、M8、mM38及びM39は、db/dbマウスにおいて、グルコース降下活性の所望の特徴を有するが、統計学的に有意な脂質上昇活性は有さないことを示している。
Figure 0006254524
Figure 0006254524
Figure 0006254524
表5は、M1、M2及びM69と記された、3種の追加のFGF19変種のペプチド配列を図示する。このデータは明らかに、これら3種の変種は、db/dbマウスにおいてグルコース降下活性の望ましい特徴を有することを示している(図3B及び3C)。これら3種の変種は、db/dbマウスにおいて脂質を上昇するように見える(図4B及び4C)。
Figure 0006254524
(実施例6)
下記は、FGF19は、食餌が誘導した肥満症マウス及びob/obマウスにおいて体重を減少し、且つdb/dbマウスにおいて肝臓腫瘍形成活性及び体重を減少することを示すデータのまとめである。
マウスに、AAVベクター中のFGF19又はFGF21を注射した。体重は、注射後4週間記録した。
Figure 0006254524
Figure 0006254524
(実施例7)
下記は、変種M5ペプチド及び変種M69ペプチドは血液グルコースを低下することを示す試験である。
マウス(ob/ob)に、M5(0.1及び1mg/kg、s.c.)又はFGF19(1mg/kg、s.c.)、又は変種M69(0.1及び1mg/kg、s.c.)又はFGF19(1mg/kg、s.c.)を(皮下)注射した。血漿グルコースレベルを、注射後2、4、7、及び24時間に測定し、結果を図7に示した。M5(図7A)及び変種M69(図7B)は、野生型FGF19と類似したグルコース降下作用を示した。
(実施例8)
本実施例は、アルド-ケト還元酵素ファミリー1、メンバーC18(Akr1C18)及び溶質担体ファミリー1、メンバー2(slc1a2)の肝臓発現は、HCC活性と相関するように見えることを示す試験を説明している。
マウス(db/db)に、FGF19(HCC+)、FGF21(HCC-)、dN2(HCC-)又はM5(HCC-)を発現しているウイルスベクターを注射するか、又はGFPを注射した。肝臓試料を採取し、注射後2週間目に定量的RT-PCRにより分析した。図8に示したデータは、Akr1C18及びslc1a2の肝臓発現は、HCC活性と相関するように見えることを示している。
Figure 0006254524

Claims (49)

  1. 配列番号：1、配列番号：2、配列番号：52、配列番号：53、配列番号：69、又は配列番号：70を含む又はそれからなるアミノ酸配列を有するキメラペプチド。
  2. 前記ペプチドが、約250個の未満のアミノ酸の長さである、請求項１記載のキメラペプチド。
  3. 前記ペプチドが、配列番号：1を含む又はそれからなるアミノ酸配列を有する、請求項１記載のキメラペプチド。
  4. 前記ペプチドが、配列番号：2を含む又はそれからなるアミノ酸配列を有する、請求項１記載のキメラペプチド。
  5. 前記ペプチドが、配列番号：52を含む又はそれからなるアミノ酸配列を有する、請求項１記載のキメラペプチド。
  6. 前記ペプチドが、配列番号：53を含む又はそれからなるアミノ酸配列を有する、請求項１記載のキメラペプチド。
  7. 配列番号：70を含むアミノ酸配列を有するキメラペプチド。
  8. 配列番号：70からなるアミノ酸配列を有するキメラペプチド。
  9. 配列番号：69を含むアミノ酸配列を有するキメラペプチド。
  10. 配列番号：69からなるアミノ酸配列を有するキメラペプチド。
  11. 前記ペプチドが、免疫グロブリンFc領域と融合されている、請求項１〜１０のいずれか一項記載のキメラペプチド。
  12. 請求項１〜１１のいずれか一項記載のキメラペプチドを含む、医薬組成物。
  13. グルコース降下剤を更に含む、請求項１２記載の医薬組成物。
  14. 請求項１〜１１のいずれか一項記載のキメラペプチドをコードしている核酸分子であって、インビトロ、細胞内又はインビボにおいて該ペプチドをコードしている核酸分子の発現をもたらす、機能可能な連結で発現制御エレメントを更に含む、前記核酸分子。
  15. 請求項１４記載の核酸分子を含む発現ベクターであって、該ベクターが、任意にウイルスベクターである、前記ベクター。
  16. 請求項１〜１１のいずれか一項記載のキメラペプチドを発現する、宿主細胞。
  17. 対象においてグルコースレベルを低下させるための医薬組成物であって、該対象に有効な量の請求項１〜１１のいずれか一項記載のペプチドを投与することを含む、前記組成物。
  18. 前記対象が、
    (i) 100mg/dlより大きい空腹時血漿グルコース（FPG）レベルを有するか；
    (ii) 125mg/dlより大きいFPGレベルを有するか；
    (iii) 100〜125mg/dlのFPGレベルを有するか；又は
    (iv) 6％を上回るヘモグロビンA1c（HbA1c）レベルを有する、
    請求項１７記載の組成物。
  19. 前記対象が、高血糖状態を有する、請求項１７記載の組成物。
  20. 前記高血糖状態が、糖尿病を含む、請求項１９記載の組成物。
  21. 前記糖尿病が、インスリン-依存性(I型)糖尿病、II型糖尿病、妊娠性糖尿病又はプレ糖尿病である、請求項２０記載の組成物。
  22. 前記対象が、インスリン抵抗性を有する、請求項１７記載の組成物。
  23. 前記対象が、高インスリン血症を有する、請求項１７記載の組成物。
  24. 前記対象が、耐糖能異常を有する、請求項１７記載の組成物。
  25. 前記対象が、メタボリック症候群を有する、請求項１７記載の組成物。
  26. 前記対象が、肥満症である、請求項１７記載の組成物。
  27. 前記対象が、非アルコール性脂肪肝疾患（NAFLD）を有する、請求項１７記載の組成物。
  28. 前記対象が、非アルコール性脂肪性肝炎（NASH）を有する、請求項１７記載の組成物。
  29. 対象においてグルコース代謝を改善させるための医薬組成物であって、該対象に有効な量の請求項１〜１１のいずれか一項記載のペプチドを投与することを含む、前記組成物。
  30. 前記対象が、高血糖状態を有する、請求項２９記載の組成物。
  31. 前記高血糖状態が、糖尿病を含む、請求項３０記載の組成物。
  32. 前記糖尿病が、インスリン-依存性(I型)糖尿病、II型糖尿病、妊娠性糖尿病又はプレ糖尿病である、請求項３１記載の組成物。
  33. 前記対象が、インスリン抵抗性を有する、請求項２９記載の組成物。
  34. 前記対象が、高インスリン血症を有する、請求項２９記載の組成物。
  35. 前記対象が、耐糖能異常を有する、請求項２９記載の組成物。
  36. 前記対象が、メタボリック症候群を有する、請求項２９記載の組成物。
  37. 前記対象が、肥満症である、請求項２９記載の組成物。
  38. 前記対象が、NAFLDを有する、請求項２９記載の組成物。
  39. 前記対象が、NASHを有する、請求項２９記載の組成物。
  40. 対象において高血糖状態を治療するための医薬組成物であって、該対象に有効な量の請求項１〜１１のいずれか一項記載のペプチドを投与することを含む、前記組成物。
  41. 対象において糖尿病を治療するための医薬組成物であって、該対象に有効な量の請求項１〜１１のいずれか一項記載のペプチドを投与することを含む、前記組成物。
  42. 前記糖尿病が、インスリン-依存性(I型)糖尿病である、請求項４１記載の組成物。
  43. 前記糖尿病が、II型糖尿病である、請求項４１記載の組成物。
  44. 前記糖尿病が、妊娠性糖尿病である、請求項４１記載の組成物。
  45. 前記糖尿病が、プレ糖尿病である、請求項４１記載の組成物。
  46. 対象においてインスリン抵抗性を治療するための医薬組成物であって、該対象に有効な量の請求項１〜１１のいずれか一項記載のペプチドを投与することを含む、前記組成物。
  47. 対象において高インスリン血症を治療するための医薬組成物であって、該対象に有効な量の請求項１〜１１のいずれか一項記載のペプチドを投与することを含む、前記組成物。
  48. 対象において耐糖能異常を治療するための医薬組成物であって、該対象に有効な量の請求項１〜１１のいずれか一項記載のペプチドを投与することを含む、前記組成物。
  49. 対象においてメタボリック症候群を治療するための医薬組成物であって、該対象に有効な量の請求項１〜１１のいずれか一項記載のペプチドを投与することを含む、前記組成物。
JP2014519191A 2011-07-01 2012-06-29 代謝障害及び疾患の治療のための組成物、使用及び方法 Active JP6254524B2 (ja)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201161504128P 2011-07-01 2011-07-01
US61/504,128 2011-07-01
US201161515126P 2011-08-04 2011-08-04
US61/515,126 2011-08-04
PCT/US2012/045087 WO2013006486A2 (en) 2011-07-01 2012-06-29 Compositions, uses and methods for treatment of metabolic disorders and diseases

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2017115205A Division JP6634402B2 (ja) 2011-07-01 2017-06-12 代謝障害及び疾患の治療のための組成物、使用及び方法

Publications (3)

Publication Number Publication Date
JP2014527402A JP2014527402A (ja) 2014-10-16
JP2014527402A5 JP2014527402A5 (ja) 2015-08-13
JP6254524B2 true JP6254524B2 (ja) 2017-12-27

Family

ID=47437648

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2014519191A Active JP6254524B2 (ja) 2011-07-01 2012-06-29 代謝障害及び疾患の治療のための組成物、使用及び方法
JP2017115205A Active JP6634402B2 (ja) 2011-07-01 2017-06-12 代謝障害及び疾患の治療のための組成物、使用及び方法

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2017115205A Active JP6634402B2 (ja) 2011-07-01 2017-06-12 代謝障害及び疾患の治療のための組成物、使用及び方法

Country Status (27)

Country Link
US (9) US8951966B2 (ja)
EP (3) EP3597666A3 (ja)
JP (2) JP6254524B2 (ja)
KR (1) KR102077721B1 (ja)
CN (3) CN105601748B (ja)
AU (1) AU2012279237B2 (ja)
BR (1) BR112013033175B1 (ja)
CA (1) CA2835607C (ja)
CL (1) CL2013003416A1 (ja)
CO (1) CO6940374A2 (ja)
DK (1) DK2726511T3 (ja)
ES (1) ES2748038T3 (ja)
HK (1) HK1198297A1 (ja)
HR (1) HRP20191713T1 (ja)
HU (1) HUE045629T2 (ja)
IL (2) IL229903B (ja)
LT (1) LT2726511T (ja)
MX (1) MX349869B (ja)
MY (1) MY163674A (ja)
PE (1) PE20141727A1 (ja)
PL (1) PL2726511T3 (ja)
PT (1) PT2726511T (ja)
RU (1) RU2697762C2 (ja)
SG (1) SG10201806648TA (ja)
UA (1) UA118744C2 (ja)
WO (1) WO2013006486A2 (ja)
ZA (2) ZA201308421B (ja)

Families Citing this family (54)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JOP20190083A1 (ar) 2008-06-04 2017-06-16 Amgen Inc بولي ببتيدات اندماجية طافرة لـfgf21 واستخداماتها
US8535912B2 (en) * 2009-10-15 2013-09-17 Genentech, Inc. Chimeric fibroblast growth factors with altered receptor specificity
AU2011239386B2 (en) 2010-04-16 2015-03-19 Salk Institute For Biological Studies Methods for treating metabolic disorders using FGF
CN105601748B (zh) 2011-07-01 2021-08-27 恩格姆生物制药公司 用于代谢病症和疾病治疗的组合物、应用和方法
WO2013131091A1 (en) 2012-03-02 2013-09-06 New York University Chimeric fgf21 proteins with enhanced binding affinity for beta-klotho for the treatment of type ii diabetes, obesity and related metabolic disorders
US9657075B2 (en) 2012-06-07 2017-05-23 New York University Chimeric fibroblast growth factor 23 proteins and methods of use
US9474785B2 (en) 2012-06-07 2016-10-25 New York University Chimeric fibroblast growth factor 19 proteins and methods of use
US9464126B2 (en) 2012-06-07 2016-10-11 New York University Chimeric fibroblast growth factor 21 proteins and methods of use
US9283241B2 (en) * 2012-07-10 2016-03-15 Clemson University Treatment to render implants resistant to diabetes
WO2014085365A2 (en) * 2012-11-28 2014-06-05 Ngm Biopharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for treatment of metabolic disorders and diseases
US9290557B2 (en) 2012-11-28 2016-03-22 Ngm Biopharmaceuticals, Inc. Compositions comprising variants and fusions of FGF19 polypeptides
CN105008548B (zh) * 2012-12-27 2020-11-27 恩格姆生物制药公司 用于调节胆汁酸体内稳态以及治疗胆汁酸紊乱和疾病的方法
US9273107B2 (en) 2012-12-27 2016-03-01 Ngm Biopharmaceuticals, Inc. Uses and methods for modulating bile acid homeostasis and treatment of bile acid disorders and diseases
WO2014130659A1 (en) * 2013-02-22 2014-08-28 New York University Chimeric fibroblast growth factor 23 proteins and methods of use
US20160120959A1 (en) * 2013-03-14 2016-05-05 The Board Of Regents Of The University Of Oklahoma Use of Klotho Nucleic Acids or Proteins for Treatment of Diabetes and Diabetes-Related Conditions
US20150104494A1 (en) * 2013-10-11 2015-04-16 Ohio State Innovation Foundation Methods for repair of ear canal tissue defects
WO2015061331A1 (en) 2013-10-21 2015-04-30 Salk Institute For Biological Studies Chimeric fibroblast growth factor (fgf) 2/fgf1 peptides and methods of use
US9925241B2 (en) 2013-10-21 2018-03-27 Salk Institute For Biological Studies Mutated fibroblast growth factor (FGF) 1 and methods of use
NZ718962A (en) 2013-10-28 2019-12-20 Ngm Biopharmaceuticals Inc Cancer models and associated methods
ES2808340T3 (es) 2014-01-24 2021-02-26 Ngm Biopharmaceuticals Inc Anticuerpos que se unen al dominio de beta klotho 2 y procedimientos de uso de los mismos
WO2015121457A1 (en) * 2014-02-13 2015-08-20 Westphal Sören Fgf-8 for use in treating diseases or disorders of energy homeostasis
US20170065678A1 (en) 2014-03-11 2017-03-09 Novartis Ag Methods of treating metabolic disorders associated with lipodystrophies and defects in insulin production or signaling
US10398758B2 (en) 2014-05-28 2019-09-03 Ngm Biopharmaceuticals, Inc. Compositions comprising variants of FGF19 polypeptides and uses thereof for the treatment of hyperglycemic conditions
WO2015195509A2 (en) * 2014-06-16 2015-12-23 Ngm Biopharmaceuticals, Inc. Methods and uses for modulating bile acid homeostasis and treatment of bile acid disorders and diseases
EP3194430A1 (en) 2014-09-16 2017-07-26 Universitat Autònoma De Barcelona Adeno-associated viral vectors for the gene therapy of metabolic diseases
WO2016048995A2 (en) * 2014-09-23 2016-03-31 Salk Institute For Biological Studies Fgf19 truncations and mutants and uses thereof
IL251834B2 (en) 2014-10-23 2023-09-01 Ngm Biopharmaceuticals Inc Pharmaceutical compositions containing peptide variants and methods of using them
WO2016073855A1 (en) 2014-11-07 2016-05-12 Ngm Biopharmaceuticals, Inc. Methods for treatment of bile acid-related disorders and prediction of clinical sensitivity to treatment of bile acid-related disorders
EP3108893A1 (en) * 2015-06-25 2016-12-28 Universite Claude Bernard - Lyon 1 Novel therapeutic use of fgf19
JP6951318B2 (ja) * 2015-07-15 2021-10-20 プロージット ソウル バイオテクノロジー （ベイジン） カンパニー リミテッド 融合ポリペプチドおよび使用方法
US10800843B2 (en) 2015-07-29 2020-10-13 Ngm Biopharmaceuticals, Inc. Beta klotho-binding proteins
CA3002400A1 (en) 2015-10-30 2017-05-04 Salk Institute For Biological Studies Treatment of steroid-induced hyperglycemia with fibroblast growth factor (fgf) 1 analogs
CA3082794A1 (en) 2015-11-09 2017-05-18 Ngm Biopharmaceuticals Inc. Methods for treatment of bile acid-related disorders
MX2018014475A (es) 2016-05-25 2019-05-23 Univ Texas Métodos y composiciones para el tratamiento de trastornos secretorios.
CN107759696A (zh) 2016-08-19 2018-03-06 安源医药科技（上海）有限公司 人白介素7融合蛋白及其制备方法
EP3502143A4 (en) 2016-08-19 2020-07-15 Ampsource Biopharma Shanghai Inc. BINDING PEPTIDE FOR THE CONSTRUCTION OF A FUSION PROTEIN
CN106279437B (zh) 2016-08-19 2017-10-31 安源医药科技（上海）有限公司 高糖基化人凝血因子viii融合蛋白及其制备方法与用途
EP3503882A4 (en) 2016-08-26 2020-07-29 NGM Biopharmaceuticals, Inc. METHOD FOR TREATING FIBROBLAST GROWTH FACTOR-19-MEDIATED CARCINOMAS AND TUMORS
JP2020530977A (ja) * 2017-05-24 2020-11-05 ウニベルシダッド アウトノマ デ バルセロナ 線維芽細胞増殖因子２１（ｆｇｆ２１）コーディング配列を含むウイルス発現コンストラクト
KR20200037750A (ko) * 2017-05-24 2020-04-09 유니버시타트 아우토노마 데 바르셀로나 섬유아세포 성장 인자 21 (ｆｇｆ21) 코딩 서열을 포함하는 바이러스 발현 컨스트럭트
CA3069143A1 (en) * 2017-07-06 2019-01-10 Yale University Compositions and methods for treating or preventing endocrine fgf-linked diseases
JP6852939B2 (ja) * 2017-09-04 2021-03-31 ８９バイオ リミテッド８９Ｂｉｏ Ｌｔｄ． 変異体ｆｇｆ−２１ペプチドコンジュゲート及びその使用
KR102105623B1 (ko) 2017-11-22 2020-04-29 가천대학교 산학협력단 칼슘 및 포스파티딜이노시톨 포스페이트의 결합을 이용하여 질환 치료 후보물질을 스크리닝하는 방법
KR102054561B1 (ko) 2017-11-22 2019-12-10 가천대학교 산학협력단 C2 도메인 및 Akt 인산화 도메인 단편의 융합 단백질 및 이의 용도
CN113603794B (zh) * 2018-01-11 2024-01-16 安源医药科技（上海）有限公司 用于调节血糖和脂质的增效型双功能蛋白
US11524029B2 (en) 2018-08-13 2022-12-13 Viscera Labs, Inc. Therapeutic composition and methods
US11590161B2 (en) 2018-08-13 2023-02-28 Viscera Labs, Inc. Therapeutic composition and methods
CA3120923A1 (en) * 2018-11-26 2020-06-04 Universitat Autonoma De Barcelona Fibroblast growth factor 21 (fgf21) gene therapy
US11427623B1 (en) 2019-05-28 2022-08-30 89Bio Ltd. Methods of treatment using mutant FGF-21 peptide conjugates
US11542309B2 (en) 2019-07-31 2023-01-03 Salk Institute For Biological Studies Fibroblast growth factor 1 (FGF1) mutant proteins that selectively activate FGFR1B to reduce blood glucose
WO2021139744A1 (en) 2020-01-11 2021-07-15 Beijing Ql Biopharmaceutical Co., Ltd. Conjugates of fusion proteins of glp-1 and fgf21
US11981718B2 (en) 2020-05-27 2024-05-14 Ampsource Biopharma Shanghai Inc. Dual-function protein for lipid and blood glucose regulation
CN112851791B (zh) * 2021-03-12 2021-10-22 江南大学 一种新型抗代谢紊乱的fgf类似物及其应用
WO2024097875A1 (en) * 2022-11-02 2024-05-10 Shattuck Labs, Inc. Fusion proteins for the treatment of nonalcoholic steatohepatitis

Family Cites Families (197)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0272253A4 (en) 1986-03-07 1990-02-05 Massachusetts Inst Technology METHOD FOR IMPROVING GLYCOPROTE INSTABILITY.
US5273876A (en) 1987-06-26 1993-12-28 Syntro Corporation Recombinant human cytomegalovirus containing foreign gene
JPH04503306A (ja) 1989-02-01 1992-06-18 ザ・ジェネラル・ホスピタル・コーポレーション 単純ヘルペスウイルス１型発現ベクター
US5614396A (en) 1990-06-14 1997-03-25 Baylor College Of Medicine Methods for the genetic modification of endogenous genes in animal cells by homologous recombination
CA2090473A1 (en) 1990-08-29 1992-03-01 Robert M. Kay Homologous recombinatin in mammalian cells
GB9105383D0 (en) 1991-03-14 1991-05-01 Immunology Ltd An immunotherapeutic for cervical cancer
WO1993019660A1 (en) 1992-04-03 1993-10-14 Baylor College Of Medicine Gene therapy using the intestine
WO1994012629A1 (en) 1992-12-02 1994-06-09 Baylor College Of Medicine Episomal vectors for gene therapy
EP0705334A1 (en) 1993-06-14 1996-04-10 Basf Aktiengesellschaft Tight control of gene expression in eucaryotic cells by tetracycline-responsive promoters
EP0728202A4 (en) 1993-11-12 1997-04-23 Univ Case Western Reserve EPISOMIC EXPRESSION VECTOR FOR HUMAN GENE THERAPY
US5731172A (en) 1994-03-09 1998-03-24 Sumitomo Pharmaceuticals Company, Ltd. Recombinant adenovirus and process for producing the same
US5604090A (en) 1994-06-06 1997-02-18 Fred Hutchinson Cancer Research Center Method for increasing transduction of cells by adeno-associated virus vectors
US5693508A (en) 1994-11-08 1997-12-02 Chang; Lung-Ji Retroviral expression vectors containing MoMLV/CMV-IE/HIV-TAR chimeric long terminal repeats
JP3770333B2 (ja) 1995-03-15 2006-04-26 大日本住友製薬株式会社 組換えｄｎａウイルスおよびその製造方法
US6110456A (en) 1995-06-07 2000-08-29 Yale University Oral delivery or adeno-associated viral vectors
US5695977A (en) 1995-08-31 1997-12-09 Genetic Information Research Institute Site directed recombination
US6013516A (en) 1995-10-06 2000-01-11 The Salk Institute For Biological Studies Vector and method of use for nucleic acid delivery to non-dividing cells
JP4162267B2 (ja) 1996-08-27 2008-10-08 カイロン コーポレイション Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清型Ｂ複合糖質およびその使用法
US20020012961A1 (en) 1999-04-15 2002-01-31 Genentech, Inc. Fibroblast growth factor- 19
US20060246540A1 (en) 1997-08-26 2006-11-02 Ashkenazi Avi J Secreted and transmembrane polypeptides and nucleic acids encoding the same
US20020042367A1 (en) 1997-11-25 2002-04-11 Genentech, Inc. Fibroblast growth factor-19 (FGF-19) nucleic acids and polypeptides and methods of use for the treatment of obesity and related disorders
US20030113718A1 (en) 1997-09-17 2003-06-19 Genentech, Inc. Secreted and transmembrane polypeptides and nucleic acids encoding the same
KR100502596B1 (ko) 1997-09-17 2005-07-22 제넨테크, 인크. 분비 폴리펩티드와 막횡단 폴리펩티드 및 이들을 코딩하는핵산
US20030049676A1 (en) 1997-09-17 2003-03-13 Genentech, Inc. Secreted and transmembrane polypeptides and nucleic acids encoding the same
US6806352B2 (en) 1997-09-17 2004-10-19 Genentech, Inc. Secreted and transmembrane polypeptides and nucleic acids encoding the same
US20020155543A1 (en) 1997-11-25 2002-10-24 Genentech, Inc. Fibroblast growth factor-19 (FGF-19) nucleic acids and polypeptides and methods of use for the treatment of obesity and related disorders
US20040126852A1 (en) 1997-11-25 2004-07-01 Genentech, Inc. Fibroblast growth factor-19 (FGF-19) nucleic acids and polypeptides and methods of use for the treatment of obesity
US20050026832A1 (en) 1997-11-25 2005-02-03 Genentech, Inc. Fibroblast growth factor-19 (FGF-19) nucleic acids and polypeptides and methods of use for the treatment of obesity and related disorders
WO2000060085A1 (en) 1999-04-02 2000-10-12 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Fibroblast growth factor-20
US7390879B2 (en) 1999-06-15 2008-06-24 Genentech, Inc. Secreted and transmembrane polypeptides and nucleic acids encoding the same
US7129072B1 (en) 1999-08-30 2006-10-31 New York University Crystal of fibroblast growth factor receptor 1 in complex with fibroblast growth factor
US7459540B1 (en) 1999-09-07 2008-12-02 Amgen Inc. Fibroblast growth factor-like polypeptides
WO2001018209A1 (en) 1999-09-10 2001-03-15 Curagen Corporation Fibroblast growth factor polypeptide and nucleic acids encoding same
US6797695B1 (en) 1999-10-22 2004-09-28 Kyoto University Human FGF-20 gene and gene expression products
CA2392103A1 (en) 1999-11-18 2001-05-25 Chiron Corporation Human fgf-21 gene and gene expression products
US6716626B1 (en) 1999-11-18 2004-04-06 Chiron Corporation Human FGF-21 nucleic acids
DE10160151A1 (de) 2001-01-09 2003-06-26 Ribopharma Ag Verfahren zur Hemmung der Expression eines vorgegebenen Zielgens
AU2631001A (en) 2000-01-05 2001-07-16 Zymogenetics Inc. Novel fgf homolog zfgf11
US20020081663A1 (en) 2000-01-05 2002-06-27 Conklin Darrell C. Novel FGF homolog ZFGF11
US20010044525A1 (en) 2000-01-05 2001-11-22 Conklin Darrell C. Novel FGF Homolog zFGF12
EP1246843A1 (en) 2000-01-05 2002-10-09 ZymoGenetics, Inc. Novel fgf homolog zfgf12
AU3976701A (en) 2000-02-15 2001-08-27 Amgen, Inc. Fibroblast growth factor-23 molecules and uses thereof
US20060160181A1 (en) 2000-02-15 2006-07-20 Amgen Inc. Fibroblast Growth Factor-23 molecules and uses thereof
US20030211576A1 (en) 2000-02-22 2003-11-13 Genentech, Inc. Secreted and transmembrane polypeptides and nucleic acids encoding the same
WO2001066596A2 (en) 2000-03-08 2001-09-13 Chiron Corporation Human fgf-23 gene and gene expression products
EP2075255A1 (en) 2000-03-08 2009-07-01 Novartis Vaccines and Diagnostics, Inc. Human FGF-23 gene and gene expression products
WO2001072957A2 (en) 2000-03-31 2001-10-04 Nobuyuki Itoh Fibroblast growth factor-like molecules and uses thereof
US20030065140A1 (en) 2000-04-03 2003-04-03 Vernet Corine A.M. Novel proteins and nucleic acids encoding same
JP2002112772A (ja) 2000-07-10 2002-04-16 Takeda Chem Ind Ltd 新規ポリペプチドおよびそのｄｎａ
EP1303536B1 (en) 2000-07-19 2010-03-17 Advanced Research And Technology Institute, Inc. Novel fibroblast growth factor (fgf23) and methods for use
AU2001271973A1 (en) 2000-07-20 2002-02-05 Kevin P. Baker Compositions and methods for the diagnosis and treatment of disorders involving angiogenesis
US20070037165A1 (en) 2000-09-08 2007-02-15 Applera Corporation Polymorphisms in known genes associated with human disease, methods of detection and uses thereof
US6812339B1 (en) 2000-09-08 2004-11-02 Applera Corporation Polymorphisms in known genes associated with human disease, methods of detection and uses thereof
US7265210B2 (en) 2000-09-15 2007-09-04 Genentech, Inc. Anti-PRO9821 antibodies
IL139380A0 (en) 2000-10-31 2001-11-25 Prochon Biotech Ltd Active variants of fibroblast growth factor
AU2002230531A1 (en) 2000-11-22 2002-06-03 Bayer Corporation Use of fgf-19 for inhibiting angiogenesis
US20020151496A1 (en) 2000-12-08 2002-10-17 Bringmann Peter W. Novel fibroblast growth factors
DE10100587C1 (de) 2001-01-09 2002-11-21 Ribopharma Ag Verfahren zur Hemmung der Expression eines Zielgens
DE10100588A1 (de) 2001-01-09 2002-07-18 Ribopharma Ag Verfahren zur Hemmung der Expression eines Zielgens
US7164007B2 (en) 2001-06-20 2007-01-16 Genentech, Inc. Anti-PR020044 antibodies
WO2003080803A2 (en) 2002-03-21 2003-10-02 Smithkline Beecham Corporation Methods of using farnesoid x receptor (fxr) agonists
US6987121B2 (en) 2002-04-25 2006-01-17 Smithkline Beecham Corporation Compositions and methods for hepatoprotection and treatment of cholestasis
JP2005528905A (ja) 2002-06-07 2005-09-29 ジェネンテック・インコーポレーテッド 腫瘍の診断と治療のための組成物と方法
EP1517921B1 (en) 2002-06-28 2006-06-07 Domantis Limited Dual specific ligands with increased serum half-life
US20050250684A1 (en) 2002-09-18 2005-11-10 Eli Lilly And Company Patent Division Method for reducing morbidity and mortality in critically ill patients
US20050181375A1 (en) 2003-01-10 2005-08-18 Natasha Aziz Novel methods of diagnosis of metastatic cancer, compositions and methods of screening for modulators of metastatic cancer
DK1641483T3 (da) 2003-06-12 2008-06-02 Lilly Co Eli Fusionsproteiner
CN103880955A (zh) * 2003-07-18 2014-06-25 安姆根有限公司 肝细胞生长因子的特异性结合物
EA200601121A1 (ru) 2003-12-10 2006-10-27 Эли Лилли Энд Компани Мутеины фактора роста фибробластов 21
SG151261A1 (en) 2004-03-11 2009-04-30 Fresenius Kabi De Gmbh Conjugates of hydroxyalkyl starch and a protein, prepared by reductive amination
US7576190B2 (en) 2004-05-13 2009-08-18 Eli Lilly And Company FGF-21 fusion proteins
WO2005118642A2 (en) 2004-06-01 2005-12-15 Domantis Limited Bispecific fusion antibodies with enhanced serum half-life
JP2006016323A (ja) 2004-06-30 2006-01-19 Hiroshima Industrial Promotion Organization 生理活性バイオマテリアル
PL1789442T3 (pl) 2004-09-02 2010-02-26 Lilly Co Eli Muteiny czynnika wzrostu fibroblastów 21
WO2006028714A1 (en) 2004-09-02 2006-03-16 Eli Lilly And Company Muteins of fibroblast growth factor 21
CN101724071A (zh) 2004-10-08 2010-06-09 杜门蒂斯有限公司 抗肿瘤坏死因子受体1的单域抗体及其使用方法
JP2008517625A (ja) 2004-10-29 2008-05-29 ジェネンテック・インコーポレーテッド 分泌されたタンパク質をコードする遺伝子の破壊、それに関連する組成物および方法
NZ554895A (en) 2004-11-03 2009-06-26 Almac Diagnostics Ltd Transcriptome microarray technology and methods of using the same
US7655627B2 (en) 2004-12-14 2010-02-02 Eli Lilly And Company Muteins of fibroblast growth factor 21
US20060275794A1 (en) 2005-03-07 2006-12-07 Invitrogen Corporation Collections of matched biological reagents and methods for identifying matched reagents
AR052741A1 (es) 2005-04-08 2007-03-28 Noxxon Pharma Ag Acidos nucleicos de union a ghrelin
CA2614039C (en) 2005-07-22 2015-10-13 Five Prime Therapeutics, Inc. Compositions and methods of treating disease with fgfr fusion proteins
CA2620082A1 (en) 2005-08-24 2007-03-01 Genizon Biosciences Inc. Genemap of the human genes associated with crohn's disease
US20090312265A1 (en) 2006-02-10 2009-12-17 Dermagen Ab Novel antimicrobial peptides and use thereof
US20100055730A1 (en) 2006-05-05 2010-03-04 Anny Usheva-Simidjiyska Methods for the Diagnosis and Treatment of Female Infertility Using Molecular Markers
WO2008021196A2 (en) 2006-08-09 2008-02-21 The Mclean Hospital Corporation Methods and compositions for the treatment of medical disorders
AU2007293465A1 (en) 2006-09-01 2008-03-13 American Type Culture Collection Compositions and methods for diagnosis and treatment of Type 2 Diabetes
WO2008052796A1 (en) 2006-11-03 2008-05-08 U3 Pharma Gmbh Fgfr4 antibodies
EP2457996B1 (en) 2007-01-03 2016-08-31 NeoStem Oncology, LLC Stem cell growth media and methods of making and using same
PL2068909T3 (pl) 2007-03-30 2012-09-28 Ambrx Inc Modyfikowane polipeptydy fgf-21 i ich zastosowanie
SI2550972T1 (en) 2007-04-02 2018-05-31 Genentech, Inc. An antibody called Klotho-beta agonist for use in the treatment of diabetes mellitus or insulin resistance
EP2036539A1 (en) 2007-09-11 2009-03-18 Novo Nordisk A/S Stable formulations of amylin and its analogues
US20120142546A1 (en) 2007-12-10 2012-06-07 The Johns Hopkins University Hypomethylated genes in cancer
EP2080812A1 (en) 2008-01-18 2009-07-22 Transmedi SA Compositions and methods of detecting post-stop peptides
TW200936156A (en) 2008-01-28 2009-09-01 Novartis Ag Methods and compositions using Klotho-FGF fusion polypeptides
US8420088B2 (en) 2008-01-28 2013-04-16 Novartis Ag Methods and compositions using FGF23 fusion polypeptides
US20090226459A1 (en) 2008-01-29 2009-09-10 Cold Spring Harbor Laboratory Role of fgf-19 in cancer diagnosis and treatment
NZ579566A (en) 2008-03-19 2013-01-25 Ambrx Inc Modified fgf-21 polypeptides and their uses
WO2009117622A2 (en) 2008-03-19 2009-09-24 Ambrx, Inc. Modified fgf-23 polypeptides and their uses
EP2257814B1 (en) 2008-03-21 2012-08-29 Podiceps B.v. Diagnostic of pre-symptomatic metabolic syndrome
CN101591653B (zh) 2008-05-27 2013-07-31 中国人民解放军军事医学科学院野战输血研究所 低表达cyp7a1的肝细胞及其构建方法
JOP20190083A1 (ar) 2008-06-04 2017-06-16 Amgen Inc بولي ببتيدات اندماجية طافرة لـfgf21 واستخداماتها
MX2010014228A (es) 2008-06-18 2011-03-29 Abbott Laboratories Star Metodos y productos de diagnostico del p/gf-1 acompañante.
FR2933702A1 (fr) 2008-07-08 2010-01-15 Sanofi Aventis Antagonistes specifiques du recepteur fgf-r4
WO2010006214A1 (en) 2008-07-09 2010-01-14 Ambrx, Inc. Fgf-21 neutralizing antibodies and their uses
CN102171343B (zh) 2008-08-04 2017-07-14 戊瑞治疗有限公司 Fgfr细胞外结构域酸性区突变蛋白
UA105016C2 (uk) 2008-10-10 2014-04-10 Амген Інк. Fgf21 мутанти і їх застосування
WO2010065439A1 (en) 2008-12-05 2010-06-10 Eli Lilly And Company Variants of fibroblast growth factor 21
US20110268794A1 (en) 2009-01-09 2011-11-03 Camilleri Michael L Methods and materials for delivering bile acids
US20120035105A1 (en) 2009-01-09 2012-02-09 Sdg, Inc. Insulin Therapies for the Treatment of Diabetes, Diabetes Related Ailments, and/or Diseases or Conditions Other Than Diabetes or Diabetes Related Ailments
US20100274362A1 (en) 2009-01-15 2010-10-28 Avner Yayon Cartilage particle tissue mixtures optionally combined with a cancellous construct
ES2730800T3 (es) 2009-02-03 2019-11-12 Amunix Pharmaceuticals Inc Polipéptidos recombinantes extendidos y composiciones que comprenden los mismos
EP2427207B1 (en) 2009-05-05 2017-08-16 Amgen, Inc Fgf21 mutants and uses thereof
KR101860572B1 (ko) 2009-05-05 2018-05-24 암젠 인크 Ｆｇｆ２１ 돌연변이체 및 이의 용도
US8461111B2 (en) 2009-05-20 2013-06-11 Florida State University Research Foundation Fibroblast growth factor mutants having improved functional half-life and methods of their use
US10241093B2 (en) 2009-05-28 2019-03-26 The Cleveland Clinic Foundation Trimethylamine-containing compounds for diagnosis and prediction of disease
WO2010139741A1 (en) 2009-06-04 2010-12-09 Novartis Ag Fgf-21 for treating cancers
US20120172298A1 (en) 2009-06-11 2012-07-05 Novo Nordisk A/S Glp-1 and fgf21 combinations for treatment of diabetes type 2
CA2764835A1 (en) * 2009-06-17 2010-12-23 Amgen Inc. Chimeric fgf19 polypeptides and uses thereof
CN101993485B (zh) 2009-08-20 2013-04-17 重庆富进生物医药有限公司 促胰岛素分泌肽类似物同源二聚体及其用途
US8535912B2 (en) 2009-10-15 2013-09-17 Genentech, Inc. Chimeric fibroblast growth factors with altered receptor specificity
US8889621B2 (en) 2009-10-30 2014-11-18 New York University Inhibiting binding of FGF23 to the binary FGFR-Klotho complex for the treatment of hypophosphatemia
UA109888C2 (uk) 2009-12-07 2015-10-26 ІЗОЛЬОВАНЕ АНТИТІЛО АБО ЙОГО ФРАГМЕНТ, ЩО ЗВ'ЯЗУЄТЬСЯ З β-КЛОТО, РЕЦЕПТОРАМИ FGF І ЇХНІМИ КОМПЛЕКСАМИ
US20110312881A1 (en) 2009-12-21 2011-12-22 Amunix, Inc. Bifunctional polypeptide compositions and methods for treatment of metabolic and cardiovascular diseases
EP2359843A1 (en) 2010-01-21 2011-08-24 Sanofi Pharmaceutical composition for treating a metabolic syndrome
US20110195077A1 (en) 2010-01-29 2011-08-11 Novartis Ag Methods and compositions using fgf23 fusion ppolypeptides
JP2013523184A (ja) 2010-04-15 2013-06-17 アムジエン・インコーポレーテツド ヒトＦＧＦ受容体およびβ−ＫＬＯＴＨＯ結合性タンパク質
AU2011239386B2 (en) 2010-04-16 2015-03-19 Salk Institute For Biological Studies Methods for treating metabolic disorders using FGF
JP2013533227A (ja) 2010-06-08 2013-08-22 ノヴォ ノルディスク アー／エス Ｆｇｆ２１類似体および誘導体
EP2595647A1 (en) 2010-07-20 2013-05-29 Novo Nordisk A/S N-terminal modified fgf21 compounds
CN103221039A (zh) 2010-09-09 2013-07-24 三叶草私人有限公司 血管生成抑制剂的气道给药
US8993727B2 (en) 2010-09-22 2015-03-31 Amgen Inc. Carrier immunoglobulins and uses thereof
CN102464712A (zh) 2010-11-11 2012-05-23 重庆富进生物医药有限公司 缺失型人成纤维细胞生长因子21变异体及其偶联物
US9023791B2 (en) 2010-11-19 2015-05-05 Novartis Ag Fibroblast growth factor 21 mutations
JP5613547B2 (ja) 2010-12-14 2014-10-22 株式会社スクウェア・エニックス タスクベースの並列プログラミング言語
JP2014501762A (ja) 2010-12-22 2014-01-23 マルケイディア バイオテック， インコーポレイテッド Ｇｉｐおよびｇｌｐ−１受容体活性グルカゴン系ペプチドにより代謝障害および肥満を治療するための方法
WO2012086809A1 (ja) 2010-12-24 2012-06-28 独立行政法人産業技術総合研究所 ヒトfgf19活性の正確で高感度な測定方法ならびにヒトfgf19活性の制御剤
EP2694092B1 (en) 2011-04-08 2017-01-04 Amgen Inc. Method of treating or ameliorating metabolic disorders using growth differentiation factor 15 (gdf-15)
WO2012140650A2 (en) 2011-04-12 2012-10-18 Hepacore Ltd. Conjugates of carboxy polysaccharides with fibroblast growth factors and variants thereof
US20140189893A1 (en) 2011-05-10 2014-07-03 Amgen Inc. Method of identifying compounds that specifically modulate the interaction of fgfr1 and beta klotho
BR112013026266A2 (pt) 2011-05-16 2020-11-10 Genentech, Inc método de tratamento, anticorpos isolado e anti-fgfr1, ácido nucleico isolado, célula hospedeira, método de produção de um anticorpo, formulação farmacêutica, uso do anticorpo e método de tratamento de diabetes em um indivíduo
US9574002B2 (en) 2011-06-06 2017-02-21 Amgen Inc. Human antigen binding proteins that bind to a complex comprising β-Klotho and an FGF receptor
KR20140039278A (ko) 2011-06-08 2014-04-01 드노보 바이오파마 (항주) 리미티드 코포레이션 레티노이드 x 수용체 모듈레이터 활성 예측 방법 및 조성물
EP2723391B1 (en) 2011-06-24 2018-06-13 University of Miami Fibroblast growth factor receptor inhibition for the treatment of disease
CN105601748B (zh) 2011-07-01 2021-08-27 恩格姆生物制药公司 用于代谢病症和疾病治疗的组合物、应用和方法
EP2548570A1 (en) 2011-07-19 2013-01-23 Sanofi Pharmaceutical composition for treating a metabolic syndrome
WO2013027191A1 (en) 2011-08-25 2013-02-28 Novartis Ag Methods and compositions using fgf23 fusion polypeptides
MX2014002260A (es) 2011-08-31 2014-08-18 Amgen Inc Factor de crecimiento de fibroblasto 21 para usar en el tratamiento de diabetes tipo 1.
US9458214B2 (en) 2011-09-26 2016-10-04 Novartis Ag Dual function fibroblast growth factor 21 proteins
JO3476B1 (ar) 2011-09-26 2020-07-05 Novartis Ag بروتينات مندمجة لعلاج الاضطرابات الايضية
AR087973A1 (es) 2011-10-04 2014-04-30 Lilly Co Eli Variantes del factor 21 del crecimiento de fibroblastos
CN103127503B (zh) 2011-11-23 2017-11-10 上海医学生命科学研究中心有限公司 拮抗和/或阻断IL‑6/IL‑6R/gp130信号通路在抗肝癌治疗中的用途
EP2804630B1 (en) 2012-01-18 2017-10-18 F. Hoffmann-La Roche AG Methods of using fgf19 modulators
WO2013131091A1 (en) 2012-03-02 2013-09-06 New York University Chimeric fgf21 proteins with enhanced binding affinity for beta-klotho for the treatment of type ii diabetes, obesity and related metabolic disorders
JP2013194049A (ja) 2012-03-23 2013-09-30 Kazuo Todokoro ヒト造血幹細胞を増幅させるための組成物及び方法
AU2013243946A1 (en) 2012-04-02 2014-10-30 Moderna Therapeutics, Inc. Modified polynucleotides for the production of membrane proteins
EP2844273B1 (en) 2012-04-16 2018-01-31 Tel HaShomer Medical Research Infrastructure and Services Ltd. Klotho variant polypeptides and uses thereof in therapy
WO2013173158A1 (en) 2012-05-15 2013-11-21 Eli Lilly And Company Therapeutic uses of fibroblast growth factor 21 proteins
US9474785B2 (en) 2012-06-07 2016-10-25 New York University Chimeric fibroblast growth factor 19 proteins and methods of use
US9464126B2 (en) 2012-06-07 2016-10-11 New York University Chimeric fibroblast growth factor 21 proteins and methods of use
US9657075B2 (en) 2012-06-07 2017-05-23 New York University Chimeric fibroblast growth factor 23 proteins and methods of use
WO2013188182A1 (en) 2012-06-11 2013-12-19 Eli Lilly And Company Fibroblast growth factor 21 variants
TWI513705B (zh) 2012-06-11 2015-12-21 Lilly Co Eli 纖維母細胞生長因子２１蛋白質
SG11201500125QA (en) 2012-07-11 2015-02-27 Blueprint Medicines Corp Inhibitors of the fibroblast growth factor receptor
AR092076A1 (es) 2012-08-22 2015-03-18 Lilly Co Eli Proteinas homodimericas
CA2880929A1 (en) 2012-09-07 2014-03-13 Sanofi Fusion proteins for treating a metabolic syndrome
US9290557B2 (en) 2012-11-28 2016-03-22 Ngm Biopharmaceuticals, Inc. Compositions comprising variants and fusions of FGF19 polypeptides
WO2014085365A2 (en) 2012-11-28 2014-06-05 Ngm Biopharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for treatment of metabolic disorders and diseases
CN105008548B (zh) 2012-12-27 2020-11-27 恩格姆生物制药公司 用于调节胆汁酸体内稳态以及治疗胆汁酸紊乱和疾病的方法
US9273107B2 (en) 2012-12-27 2016-03-01 Ngm Biopharmaceuticals, Inc. Uses and methods for modulating bile acid homeostasis and treatment of bile acid disorders and diseases
WO2014130659A1 (en) 2013-02-22 2014-08-28 New York University Chimeric fibroblast growth factor 23 proteins and methods of use
WO2014152090A1 (en) 2013-03-14 2014-09-25 Georgetown University Compositions and treatments of metabolic disorders using fgf binding protein 3 and fgf 19
WO2014152089A1 (en) 2013-03-14 2014-09-25 Georgetown University Compositions and treatments of metabolic disorders using fgf binding protein 3
US9789160B2 (en) 2013-03-14 2017-10-17 Georgetown University Treatments for lowering glucose levels using FGF binding protein 3
WO2014149699A1 (en) 2013-03-15 2014-09-25 Eli Lilly And Company Bifunctional protein
US9835631B2 (en) 2013-04-15 2017-12-05 Nordic Bioscience A/S Combined biomarker measurement of fibrosis
US9925241B2 (en) 2013-10-21 2018-03-27 Salk Institute For Biological Studies Mutated fibroblast growth factor (FGF) 1 and methods of use
NZ718962A (en) 2013-10-28 2019-12-20 Ngm Biopharmaceuticals Inc Cancer models and associated methods
ES2808340T3 (es) 2014-01-24 2021-02-26 Ngm Biopharmaceuticals Inc Anticuerpos que se unen al dominio de beta klotho 2 y procedimientos de uso de los mismos
WO2015171928A2 (en) 2014-05-07 2015-11-12 Joslin Diabetes Center, Inc. Methods and compositions for induction of ucp1 expression
US10398758B2 (en) 2014-05-28 2019-09-03 Ngm Biopharmaceuticals, Inc. Compositions comprising variants of FGF19 polypeptides and uses thereof for the treatment of hyperglycemic conditions
WO2015195509A2 (en) 2014-06-16 2015-12-23 Ngm Biopharmaceuticals, Inc. Methods and uses for modulating bile acid homeostasis and treatment of bile acid disorders and diseases
WO2016048995A2 (en) 2014-09-23 2016-03-31 Salk Institute For Biological Studies Fgf19 truncations and mutants and uses thereof
IL251834B2 (en) 2014-10-23 2023-09-01 Ngm Biopharmaceuticals Inc Pharmaceutical compositions containing peptide variants and methods of using them
WO2016073855A1 (en) 2014-11-07 2016-05-12 Ngm Biopharmaceuticals, Inc. Methods for treatment of bile acid-related disorders and prediction of clinical sensitivity to treatment of bile acid-related disorders
EP3108893A1 (en) 2015-06-25 2016-12-28 Universite Claude Bernard - Lyon 1 Novel therapeutic use of fgf19
JP6903640B2 (ja) 2015-09-24 2021-07-14 ジェネンテック， インコーポレイテッド てんかんの治療方法
CA3082794A1 (en) 2015-11-09 2017-05-18 Ngm Biopharmaceuticals Inc. Methods for treatment of bile acid-related disorders
EP3503882A4 (en) 2016-08-26 2020-07-29 NGM Biopharmaceuticals, Inc. METHOD FOR TREATING FIBROBLAST GROWTH FACTOR-19-MEDIATED CARCINOMAS AND TUMORS
WO2018044778A1 (en) 2016-08-29 2018-03-08 NGM Biopharmaceuticals, Inc Methods for treatment of bile acid-related disorders
KR102340750B1 (ko) 2017-03-03 2021-12-21 에이치엘비테라퓨틱스 주식회사 티모신 베타 4를 유효성분으로 포함하는 안정화된 외용 제제
CN108619490A (zh) 2017-03-22 2018-10-09 天士力医药集团股份有限公司 一种长效化突变的人源成纤维生长因子的新用途
WO2018195390A1 (en) 2017-04-21 2018-10-25 Ngm Biopharmaceuticals, Inc. Methods of treating gastrointestinal motility -related disorders using variants and fusions of fgf19/fgf21 polypeptides
CA3069143A1 (en) 2017-07-06 2019-01-10 Yale University Compositions and methods for treating or preventing endocrine fgf-linked diseases
TW202011029A (zh) 2018-04-04 2020-03-16 美商建南德克公司 偵測及定量fgf21之方法
WO2020176703A1 (en) 2019-02-28 2020-09-03 Ngm Biopharmaceuticals, Inc. Non-invasive biomarkers for use in the treatment of non-alcoholic steatohepatitis and other bile acid-related disorders
US20200390858A1 (en) 2019-04-17 2020-12-17 Ngm Biopharmaceuticals, Inc. Combination Therapy for Modulating Bile Acid Homeostasis and Treatment of Bile Acid Disorders and Diseases

Also Published As

Publication number Publication date
CN105601748A (zh) 2016-05-25
RU2697762C2 (ru) 2019-08-20
JP2014527402A (ja) 2014-10-16
US20160168215A1 (en) 2016-06-16
EP3597666A2 (en) 2020-01-22
CN103649127A (zh) 2014-03-19
JP2017222651A (ja) 2017-12-21
WO2013006486A9 (en) 2013-08-15
US9670260B2 (en) 2017-06-06
CL2013003416A1 (es) 2014-11-14
MX349869B (es) 2017-08-17
US9751924B2 (en) 2017-09-05
EP4306165A3 (en) 2024-04-17
HK1198297A1 (en) 2015-03-27
US9580483B2 (en) 2017-02-28
US20160168216A1 (en) 2016-06-16
UA118744C2 (uk) 2019-03-11
US8951966B2 (en) 2015-02-10
US20180355007A1 (en) 2018-12-13
IL274469A (en) 2020-06-30
US11065302B2 (en) 2021-07-20
MY163674A (en) 2017-10-13
ZA201508231B (en) 2017-08-30
PT2726511T (pt) 2019-10-14
ES2748038T3 (es) 2020-03-12
AU2012279237B2 (en) 2016-09-29
BR112013033175B1 (pt) 2023-04-25
WO2013006486A2 (en) 2013-01-10
HUE045629T2 (hu) 2020-01-28
KR102077721B1 (ko) 2020-02-14
US20170327551A1 (en) 2017-11-16
AU2012279237A1 (en) 2013-05-16
NZ617746A (en) 2016-07-29
US20220088140A1 (en) 2022-03-24
EP4306165A2 (en) 2024-01-17
MX2013013833A (es) 2014-06-11
CA2835607C (en) 2021-07-20
EP3597666A3 (en) 2020-04-22
WO2013006486A3 (en) 2013-10-03
CN113683705A (zh) 2021-11-23
US10413590B2 (en) 2019-09-17
US9089525B1 (en) 2015-07-28
CA2835607A1 (en) 2013-01-10
US20240050530A1 (en) 2024-02-15
CN103649127B (zh) 2021-03-19
CN105601748B (zh) 2021-08-27
EP2726511B1 (en) 2019-08-07
KR20140039322A (ko) 2014-04-01
BR112013033175A2 (pt) 2020-10-20
PE20141727A1 (es) 2014-11-26
CO6940374A2 (es) 2014-05-09
EP2726511A4 (en) 2015-12-02
ZA201308421B (en) 2016-01-27
US20130023474A1 (en) 2013-01-24
LT2726511T (lt) 2019-11-11
DK2726511T3 (da) 2019-09-23
EP2726511A2 (en) 2014-05-07
PL2726511T3 (pl) 2019-12-31
JP6634402B2 (ja) 2020-01-22
SG10201806648TA (en) 2018-09-27
IL229903B (en) 2021-08-31
RU2014103487A (ru) 2015-08-10
HRP20191713T1 (hr) 2019-12-27
US20150284442A1 (en) 2015-10-08

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP6254524B2 (ja) 代謝障害及び疾患の治療のための組成物、使用及び方法
US11066454B2 (en) Compositions comprising variants and fusions of FGF19 polypeptides
JP6936366B2 (ja) 胆汁酸に関係した障害の治療方法
JP6403685B2 (ja) 胆汁酸ホメオスタシス調整並びに胆汁酸障害及び疾患の治療の方法
EP2925775B1 (en) Compositions and methods for treatment of metabolic disorders and diseases
US20200054714A1 (en) Methods and Compositions for the Treatment of Metabolic Disorders and Diseases

Legal Events

Date Code Title Description
A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20150114

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20150622

A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20150622

A977 Report on retrieval

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A971007

Effective date: 20160421

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20160426

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20160722

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20161024

A02 Decision of refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02

Effective date: 20170214

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20170612

A911 Transfer to examiner for re-examination before appeal (zenchi)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A911

Effective date: 20170720

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20170815

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20170830

TRDD Decision of grant or rejection written
A01 Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01

Effective date: 20171121

A61 First payment of annual fees (during grant procedure)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61

Effective date: 20171130

R150 Certificate of patent or registration of utility model

Ref document number: 6254524

Country of ref document: JP

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250